CN109694915A

CN109694915A - 一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用

Info

Publication number: CN109694915A
Application number: CN201910015108.0A
Authority: CN
Inventors: 王维民; 张德印; 张小雪; 李冲; 喇永富; 李国泽
Original assignee: Gansu Agricultural University
Current assignee: Gansu Agricultural University
Priority date: 2019-01-08
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2019-04-30
Anticipated expiration: 2039-01-08
Also published as: CN109694915B

Abstract

本发明提供了一种与绵羊尾脂重相关的分子标记，以及该分子标记的检测方法和应用。本发明通过对绵羊ADRA2A基因进行PCR扩增和序列分析，发现在扩增片段的第217位存在一个C/A多态性位点，进一步使用KASPar引物对对161只湖羊的多态性位点进行检测和建立最小二乘模型，对基因型与尾脂重进行关联分析，最终确定了本发明扩增的ADRA2A基因片段可以作为与绵羊尾脂重相关的分子标记。本发明的分子标记可用于低脂型绵羊的育种和低脂型优质肉羊新品种的培育，为绵羊肉质的遗传改良提供了基因工程手段，具有重大的实际应用价值。

Description

一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记制备技术领域，具体涉及ADRA2A基因片段作为影响绵羊尾脂重的分子标记及其应用。

背景技术

绵羊是最早被驯化的草食家畜，可追溯到11000年前的中石器时代末期。在漫长的驯化过程中，动物的行为习惯、体型外貌以及重要的经济性状因受到人工选择和自然环境影响而发生了很大变化。研究表明，野生绵羊最早属于瘦尾羊，但由于人工驯化和自然选择，瘦尾羊部分进化为脂尾型绵羊。绵羊脂尾(臀)性状是在恶劣自然环境中生存的必需性状，在天寒地冻、营养匮乏等恶劣生态环境下，脂尾型绵羊能够消耗脂肪提供能量来维持自身的新陈代谢，起到“保命”作用(刘真.肥尾和瘦尾羊全基因组选择信号检测[D].中国农业科学院,2015)。但近些年随着人们生活水平的不断提高以及对危害人类健康的心血管等疾病的高度关注，人们对肉品质的要求也越来越高，都喜欢使用高蛋白、低脂肪、低胆固醇的肉类，高脂肉类逐渐受到冷落，脂尾(臀)型绵羊品种也越来越不受消费者欢迎。此外，随着规模化养殖以及牧民定居点不断扩建、牧草种植等配套设施的不断完善，过多的尾脂沉积对绵羊自身已无太大意义，而且从养殖成本考虑，生产1kg脂肪消耗的饲草可产生2kg瘦肉，显然过多的脂肪沉积也会增加养殖成本。因此在肉羊生产实践中，通过遗传改良减少绵羊尾部脂肪沉积是提高生产效益的有效途径，对低脂肉用绵羊的培育具有重要的理论价值与实际意义。

目前对绵羊脂肪沉积候选基因的研究已经取得显著的进展，其中PDGFD、PPARG等基因已被确定对绵羊脂肪沉积具有显著的影响。

血小板源生长因子D基因(Platelet-derived growth factor D gene，PDGFD)是血小板源性生长因子家族蛋白的一员,它最早是在人类血小板中被检测并纯化出来。PDGFD具有广泛的生理作用，其作用机理复杂，主要富集在脂类生物合成、磷脂代谢、细胞形态发生、生殖过程及细胞调节等生物学过程，与动物的生长发育以及脂肪沉积密切相关。研究表明，PDGF基因能够促进脂肪前体细胞增殖并抑制其分化(Artemenko et al.2005；et al.2008)。实时定量PCR研究表明，PDGFD在人类脂肪组织中的表达量比除甲状腺组织之外的其他组织都要高(La Rochelle et al.2001)。此外，刘真等研究发现在肥瘦尾之间，呼伦贝尔羊PDGFD基因表达量显著高于藏羊，并且通过相对定量验证PDGFD基因与尾部脂肪沉积密切相关(刘真.肥尾和瘦尾羊全基因组选择信号检测[D].中国农业科学院,2015)。

PPARG属于过氧化物酶体增殖物激活受体家族的一员，是诱导脂肪分化的充分且必需条件，能够启动脂肪细胞的分化。有学者研究发现，PPARG可以促进纤维母细胞转化成脂肪细胞，以及在小鼠上敲出该基因并给饲喂高脂肪食物的情况下，发现小鼠的体重和体脂肪含量显著低于对照组并有棕色脂肪沉积。此外，PPARG可促使小脂肪细胞生成、参与调节脂蛋白酯酶、乙酰-CoA合成酶、脂肪酸结合蛋白及脂肪酸转运蛋白等的表达；PPARG在蛋白质、葡萄糖及脂质的代谢过程中也具有重要调控作用，能够调控细胞增殖、细胞周期和生长发育过程中部分相关基因的表达。这些研究表明，PPARG与脂肪细胞的生长分化过程密切相关。

肾上腺素能受体(Alpha-2A-adrenceptor,ADRA2A)编码基因为ADRA2A，该基因全长3876bp，有一个外显子，共编码450个氨基酸，是G蛋白偶联受体亚家族的成员,它由三个同源性较高的亚型组成:α2A、α2B和α2C。这些受体主要调节由交感神经和肾上腺素能神经元释放的神经递质，因此在中枢神经系统功能调解中起着重要的作用(李天洁.FOXO1、HNF4A和ADRA2A基因多态性与2型糖尿病遗传易感性的研究[D].北京协和医学院,2011)。目前对该基因的研究发现，在人类医学上其可能与肥胖症，注意力缺陷多动症，精神分裂症，烟草依赖等多种疾病的易感性有显著相关性。在关于动物生长性状方面的研究比较少，本发明通过测序对ADRA2A基因进行SNPs扫描，探讨其不同基因型与绵羊尾脂重的关联性，旨在为绵羊肉质的遗传改良方面提供基因素材，加速我国自主知识产权的低脂型优质肉羊新品种的培育进程。

通过以上资料我们可以得出ADRA2A基因对绵羊尾脂沉积有重要的作用。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了绵羊ADRA2A基因的扩增、SNP筛查、KASPar SNP检测及与性状关联分析。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用。本发明的分子标记从绵羊ADRA2A基因中扩增得到，其具体核苷酸序列如SEQID NO:1所示。通过扩增绵羊ADRA2A基因的DNA序列并测序，分析扩增产物的多态性，从而可以建立针对绵羊尾脂重分子标记的检测方法，并可将该分子标记应用于低脂型绵羊的培育中。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

一方面，本发明提供了一种与绵羊尾脂重相关的分子标记，该分子标记通过对绵羊ADRA2A基因进行扩增而获得，具体的，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，GGTGGTCATCGGCGTGTTCGTGGTGTGCTGGTTCCCCTTCTTCTTCACCTACACGCTCACGGCCATCGGCTGCTCCGTGCCGCCCACGCTCTTCAAGTTCTTCTTCTGGTTCGGCTACTGCAACAGCTCGCTGAACCCGGTCATATACACCATCTTCAATCACGACTTCCGCCGCGCCTTCAAGAAGATCCTCTGCCGGGGGGACAGGAAGCGGATMGTGTGAGTGTGGAGTCCGCTCCCGGAGAACAGACTTGCGCTGACTGCAGGCAGCTGGGATCCAGGGGGCGCGTCTACGTGGTCCTGCCAAAACCCGGGTCCAGCCTGTTCCTAGTTTCTTGGCCCCAGGATAGCTCTGCCGCTTCTTGCGGGCATCTGCGCTCTCCTACCTGAGAAAAGAACTGGCTGGGAGGG，其中M表示C或A，由于上述序列在第217位碱基处有一个C/A碱基突变，从而导致了绵羊ADRA2A基因的C/A多态性。

第二方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的引物对，任何可特异性扩增本发明分子标记或包含上述多态性位点的片段的引物均适用于对该分子标记进行检测，优选地，所述检测分子标记的引物对的核苷酸序列为：

正向引物M-F：5＇-GGTGGTCATCGGCGTGTT-3＇(SEQ ID NO:2)；

反向引物M-R：5＇-CCCTCCCAGCCAGTTCTTT-3＇(SEQ ID NO:3)。

此外，本发明的引物对可以为KASPar引物对，优选地，所述KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测AlleleA的正向引物A1：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCGGACTCCACACTCACACT(SEQ ID NO:4)；

用于检测AlleleC的正向引物A2:

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGGACTCCACACTCACACG(SEQ ID NO:5)；

通用反向引物C：CGCGCCTTCAAGAAGATCCTCTG(SEQ ID NO:6)。

第三方面，本发明提供了一种检测上述分子标记的试剂盒，所述试剂盒中包含了本发明第二方面的引物对或KASPar引物对。

第四方面，本发明提供了一种检测与绵羊尾脂重相关的分子标记的方法，所述分子标记如SEQ ID NO:1所示，所述方法包括利用本发明的引物对或试剂盒对绵羊ADRA2A基因进行检测，具体的，本发明的检测方法包括如下步骤:

a)使用本发明的引物对、KASPar引物对或者包含上述引物对的试剂盒，对绵羊基因组DNA或cDNA进行扩增；

b)对步骤a)获得的扩增产物的多态性位点进行鉴定。

其中，在步骤b)中，任何SNP分型方法均可适用于对本发明中分子标记的检测，上述SNP分型的方法包括但不限于直接测序法、探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。

在本发明的分子标记序列和多态性位点已知的情况下，针对该多态性位点设计相应的探针，以及利用上述SNP分型方法进行对分子标记和多态性位点进行检测均属于本领域中较为常规且成熟的技术，针对该多态性位点设计的探针也可包含于本发明的第三方面的试剂盒中。

更为具体的，本发明中利用上述引物对检测与绵羊尾脂重相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对绵羊ADRA2A基因进行PCR扩增，

b)对上述PCR扩增产物进行测序和序列分析，从而通过多态性位点的碱基类型确定基因型。

此外，本发明还涉及利用KASPar引物对检测与绵羊尾脂重相关分子标记的方法，包括如下步骤：

a)以绵羊血液为样品提取基因组DNA，利用SEQ ID NO:4-6所示的引物对进行高通量水浴PCR扩增；

b)扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型结果。

第五方面，本发明提供了上述分子标记、引物对、试剂盒或检测方法在在绵羊尾脂重检测中的应用，通过使用上述引物对、试剂盒或检测方法对待测绵羊的ADRA2A基因进行检测，并分析多态性的类型，从而可以确定待测绵羊属于高脂型还是低脂型。

第六方面，本发明提供了上述分子标记、引物对、试剂盒或检测方法在绵羊育种中的应用，通过利用本发明的引物对或试剂盒对ADRA2A基因进行扩增和检测，确定待测样品的基因型，从而可以从中选育中低脂型绵羊品种。

寻找基因的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。本发明通过对绵羊ADRA2A基因进行PCR扩增和测序，发现在扩增片段的第217位存在一个C/A多态性位点，并通过检测161只湖羊的多态性和建立的最小二乘模型，确定了一种与绵羊尾脂重相关的分子标记，该分子标记可以用于低脂型绵羊的选育和低脂型优质肉羊新品种的培育，具有重大的实际应用价值。

本发明通过设计KASPar引物对分子标记进行检测，KASP是竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR)的缩写，该技术不需要针对每个SNP位点都去合成特异的荧光探针，而是基于自己独特的ARM PCR原理，让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，大大降低了试剂的成本，同时还保留了Taqman探针法金标准的准确性，为本发明的分子标记的检测提供了一种简便、准确、低成本的操作方法。

附图说明

图1.本发明中用于作为分子标记的绵羊ADRA2A基因片段的凝胶电泳图。其中，1-10泳道：ADRA2A扩增结果；M泳道：DL 2000 Marker。

图2.本发明中绵羊ADRA2A基因突变位点测序结果。

图3.本发明中绵羊ADRA2A基因c.217C>A突变位点KASPar SNP分型结果。其中，靠近左侧的红色点表示CC基因型，靠近中间的绿色点表示CA基因型，靠近右侧的蓝点表示AA基因型。

具体实施方式

下面结合实施例详细介绍本发明，本发明的优点将会随着描述而更为清楚。应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方式的限制，本发明提供的具体实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制，本领域技术人员参照说明书的描述对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明所附权利要求书的保护范围之内。

实施例1 ADRA2A基因的扩增

(1)引物设计

以绵羊ADRA2A基因DNA(GenBank收录号：NC_019479.2)为模板，利用Primer 5.0软件设计一对引物M-F和M-R，引物序列如下

ADRA2A：

正向引物M-F：5＇-GGTGGTCATCGGCGTGTT-3＇(SEQ ID NO:2)，

反向引物M-R：5＇-CCCTCCCAGCCAGTTCTTT-3＇(SEQ ID NO:3)。

(2)ADRA2A基因的扩增和测序

PCR反应总体积25μL,其中DNA模板1μL，2×PCR Master Mix 12.5μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，ddH₂O 10μL。PCR扩增程序是：94℃预变性3min，94℃变性30s，63.7℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃延伸10min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到411bp的特异扩增片段，结果如图1所示。将扩增得到的PCR片段进行测序，测序结果发现在该411bp片段中存在一个多态性位点，即ADRA2A基因片段在第217bp位点存在C/A多态性(图2)。

(3)DNA序列同源性检索鉴定：

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local AlignmentSearch Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与绵羊ADRA2A基因DNA(GenBank收录号：NC_019479.2)的部分序列同源性达99％。

实施例2、基因分型检测方法的建立

(1)KASPar引物序列设计

针对实施例1扩增片段的C/A多态性位点设计KASPar引物对，从而用于所述多态性位点的特异性检测，所述KASPar引物对的核苷酸序列为：

用于检测AlleleA的正向引物A1：

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCGGACTCCACACTCACACT(SEQ ID NO:4)；

用于检测AlleleC的正向引物A2:

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCGGACTCCACACTCACACG(SEQ ID NO:5)；

通用反向引物C：CGCGCCTTCAAGAAGATCCTCTG(SEQ ID NO:6)。

以上引物委托北京生工生物工程有限公司合成，将KASPar引物对中各组引物均稀释成10μmol/L，并按照体积比为12:12:30(引物A1：引物A2：引物C)的比例混匀备用。

(2)DNA质控

通过1％琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别对提取得到的基因组DNA的质量进行检测，合格的DNA要求：琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8～2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8～2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)。根据英国LGC公司的KASP检测技术和基因组大小换算出DNA用量为10～20ng/每样品，稀释DNA浓度成为10～20ng/μL备用。

(3)基因分型

首先利用K-pette分液工作站将稀释好的待测DNA模板(10～20ng/μL)1.0μL和空白对照(No template control,NTC)分别加入384孔反应板中，60℃烘干30min(干燥箱，LGC公司)，DNA变成干粉备用。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站分别向每个反应孔中加入1×Master mix(LGC公司，KBS-1016-002)与引物混合液，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜,利用Hydrocycler进行高通量水浴PCR扩增。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序为：

94℃预变性，15分钟；

94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸)，以touch down序扩增10个循环，每循环降低0.6℃；

94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。

扩增结束后，利用BMG PHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况，具体结果如图3所示，图中每个圆点代表一份待测材料，其中靠近左侧的红色圆点表示该位点是纯合基因型“CC”；靠近右侧的蓝色圆点表示该位点是纯合基因型“AA”；靠近中间的绿色圆点表示该位点是杂合基因型“CA”或“AC”；黑色圆点表示NTC(图3中未能显示出来)，即为水对照。

(4)本发明的分子标记在绵羊尾脂重性状关联分析中的应用

试验共检测了161只湖羊的多态性，确定其基因型，并建立如下所述的最小二乘模型，进行基因型与尾脂重的关联分析。

Y_ijl＝μ+Genotype_i+P_j+Combination_l+ε_ijl

其中，Y_ijl是性状观察值，μ为总体均数，Genotype_i为基因型效应，P_j为批次效应，Combination_l为组合的效应，ε_ijl为随机误差，假定ε_ijl相互独立，服从N(0，σ2)分布。

基因型检测结果表明在161个个体中，CC基因型有17个，CA基因型有60个个体，AA基因型有84个个体。基因型与性状关联分析的结果如表1所示，结果显示，c.217C>A突变位点与湖羊尾脂重显著关联。其中AA基因型个体的尾脂重显著高于CC型个体(P<0.05)。CA型个体的尾脂重高于CC型个体，低于AA型个体，CA型个体与CC型和AA型个体间的差异不显著，随着C等位基因数的增加其个体尾脂重减小，由此可知C等位基因为优势等位基因。c.217C>A突变位点与湖羊尾脂重显著相关(P<0.05)。

表1绵羊ADRA2A基因多态性与尾脂重关联分析

注：同列数据间角标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

SEQUENCE LISTING

<110> 甘肃农业大学

<120> 一种与绵羊尾脂重相关的分子标记及其应用

<130> 20181207

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 411

<212> DNA

<213> 绵羊

<223> m is a or c

<400> 1

ggtggtcatc ggcgtgttcg tggtgtgctg gttccccttc ttcttcacct acacgctcac 60

ggccatcggc tgctccgtgc cgcccacgct cttcaagttc ttcttctggt tcggctactg 120

caacagctcg ctgaacccgg tcatatacac catcttcaat cacgacttcc gccgcgcctt 180

caagaagatc ctctgccggg gggacaggaa gcggatmgtg tgagtgtgga gtccgctccc 240

ggagaacaga cttgcgctga ctgcaggcag ctgggatcca gggggcgcgt ctacgtggtc 300

ctgccaaaac ccgggtccag cctgttccta gtttcttggc cccaggatag ctctgccgct 360

tcttgcgggc atctgcgctc tcctacctga gaaaagaact ggctgggagg g 411

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtggtcatc ggcgtgtt 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccctcccagc cagttcttt 19

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc tagcggactc cacactcaca ct 42

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tgcggactcc acactcacac g 41

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgcgccttca agaagatcct ctg 23

Claims

1.一种与绵羊尾脂重相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，其中第217bp处的M是C或A，该突变导致分子标记的C/A多态性。

2.一种检测权利要求1所述的分子标记的PCR引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种检测权利要求1所述的分子标记的KASPar引物对，其特征在于，所述KASPar引物对中：

用于检测AlleleA的正向引物A1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，

用于检测AlleleC的正向引物A2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，

通用反向引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

4.一种检测权利要求1所述的分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2或3所述的引物对。

5.一种检测权利要求1所述的分子标记的方法，其包括如下步骤：

a)使用权利要求2或3所述的引物对，或者使用权利要求4所述的试剂盒，对绵羊基因组DNA或cDNA进行扩增；

b)对步骤a)获得扩增产物的多态性位点进行鉴定。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤b)中的鉴定方法选自测序法、荧光探针法、基因芯片法、高分辨率溶解曲线法。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用权利要求3所述的KASPar引物对或权利要求4所述的试剂盒进行PCR扩增，扩增结束后，再通过检测荧光信号确定分型结果。

8.权利要求1所述的分子标记、或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊尾脂重检测中的应用。

9.权利要求1所述的分子标记、或权利要求2或3所述的引物对，或权利要求4所述的试剂盒，或权利要求5-7任一项所述的方法在绵羊育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述育种为培育低脂型绵羊。