CN110484628A - 一种金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记与应用 - Google Patents

一种金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及家禽育种领域，涉及一种金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记与应用。所述分子标记位于鸡GAS6基因第27463bp处，记为g.C27463T。本发明还公开了上述分子标记在金茅黑鸡选育中的应用，方法简单快捷，且不受外界环境的影响，为鸡腹脂性状的分子育种提供了参考。

Description

一种金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记与应用
技术领域
本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种基于GAS6(即生长停滞特异基因6)基因的与金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记及应用。
背景技术
目前，鸡肉已成为我国仅次于猪肉的第二大肉类消费品。优质肉鸡肉质鲜美，风味独特，逐渐成为城乡人民消费的主流鸡种。肉鸡经过遗传改良后，体增重、饲料转化率、生长速度和胸肌重显著增加,这一选择过程生产出了现代商业鸡品系，即具有高生长速度、胸肉产量高等特点的肉鸡品系。对生长速度的过度追求，导致肉鸡出现了腹脂过度沉积的现象。腹脂过度沉积会造成肉鸡过肥，生产性能下降。因此，有必要对鸡腹脂性状进行遗传改良。
虽然过去几十年来采用传统育种方法对腹脂性状的遗传改良取得了显著的效果，然而腹脂性状为复杂数量性状，受诸多基因的控制，传统育种方法已很难对腹脂性状取得较大的遗传进展。SNPs作为第三代分子标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感分析与药物基因组学等的研究中发挥着越来越重要的作用。
生长停滞特异基因产物6(growth arrest-specific gene 6,GAS6)，最先由Nagata等在无血清培养基培养的NIH3T3细胞中发现并克隆，该基因编码的蛋白是由678个氨基酸构成的构架蛋白，是受体酪氨酸激酶家族中TAM受体的配体，具有广泛的生物学效应。在机体功能调节、机体稳态维持、炎症抑制、免疫水平、生殖调控等生物学活动中起着非常重要的作用。研究表明，GAS6基因在鸡脂肪前体细胞分化过程中差异表达，可能参与调控鸡脂肪沉积。然而目前仍缺少利用GAS6基因的分子标记改良金茅黑鸡腹脂性状的技术。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明要解决的技术问题是提供一种金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记与应用，其利用GAS6基因分子标记改良金茅黑鸡腹脂性状。
为解决上述问题，本发明公开了一种基于GAS6基因的与金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记，所述分子标记位于鸡GAS6基因第27463bp处，记为g.C27463T。鸡GAS6基因第27463bp处的基因型为TT或CC或CT。
本发明还公开了一种用于检测上述与鸡腹脂性状相关的分子标记的引物组，所述引物组包括一组GAS6-P1引物对，
GAS6-P1引物对的核酸序列为：
上游引物F：5’-GACACCTGTGCGGTCAGACT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物R：5’-TCACTGTCTGCCACATGCCA-3’，如SEQ ID NO.2所示。
本发明还公开了一种检测上述与金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记的方法，所述方法包括：以鸡基因组DNA为模板，利用上述的特异性引物组进行PCR扩增，获得PCR产物，PCR产物经SSCP分析后分型。
PCR扩增体系由鸡DNA模板、上游引物F、下游引物R、ddH2O、Taq聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液组成。可选的，PCR扩增体系为：2×Taq Master Mix for Page 10μL，DNA模板1μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，ddH2O 7.4μL；Taq Master Mix for Page包括Taq聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液。
可选的，PCR扩增程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min,4℃保存。
SSCP反应程序为：取PCR产物和上样缓冲液混合，先变性，再迅速冰浴，使DNA处于单链状态；取变性好的PCR产物进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，再银染显色。更具体的，SSCP反应程序为：取2.5μLPCR产物和7.5μL上样缓冲液(98％去离子甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯FF，10mmol/LEDTA(pH8.0)、2％甘油)混合，先98℃变性10min，再迅速冰浴10min，使DNA处于单链状态。取变性好的PCR产物8μL进行非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE30％，Acr∶Bis＝29∶1)电泳，220V电压预电泳10min，120V电压电泳10-12h后，银染显色。
本发明还公开了一种上述的与金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记在鸡育种或鸡腹脂性状改良中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得以下技术效果：
GAS6基因在第27463bp处存在一处突变位点，该处突变位点与鸡腹脂性状显著相关，且容易检测。因此，本发明提供了一种基于GAS6基因与鸡腹脂性状相关的分子标记，并提供了这种分子标记的检测方法及其在鸡腹脂性状改良中的应用，为鸡腹脂性状的分子标记辅助育种提供了一种新的方法。
附图说明
图1是本发明鸡GAS6基因第27463bp处突变聚丙烯酰胺凝胶电泳图，即GAS6基因P1产物(即GAS6-P1引物组扩增得到的PCR产物)的PCR-SSCP电泳图；
图2是本发明鸡GAS6基因第27463bp处突变测序图，即GAS6基因CC、TT和CT的序列比较；
图3是本发明GAS6-P1引物组扩增得到的核苷酸片段，下划线是引物序列，方框处是突变位点。
具体实施方式
以下通过具体实例来详细说明本发明的具体实施方式。
收集江苏三德利牧业发展有限公司同一批次的120只112日龄金茅黑鸡，采集血样，提取基因组DNA，溶于TE，NANODROP1000核酸浓度测定仪测定浓度和纯度后-20℃保存备用。
根据GenBank中已发表的GAS6基因序列(登录号为：NC_006088.5)，采用PrimerPremier 5.0设计1对引物。扩增产物大小为211bp。引物序列如下：
GAS6-P1：上游引物：5’-GACACCTGTGCGGTCAGACT-3’(SEQ ID NO：1)
下游引物：5’-TCACTGTCTGCCACATGCCA-3’(SEQ ID NO：2)
利用上述引物组，以鸡基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：2×MasterMix for Page 10μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，DNA模板μL，ddH2O 7.4μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
取2.5μL PCR产物和7.5μL上样缓冲液(98％去离子甲酰胺、0.025％溴酚蓝、0.025％二甲苯FF，10mmol/LEDTA(pH8.0)、2％甘油)混合，先98℃变性10min，再迅速冰浴10min，使DNA处于单链状态。取变性好的PCR产物8μL进行非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE30％，Acr∶Bis＝29∶1)电泳，220V电压预电泳10min，120V电压电泳10-12h后，银染显色，拍照发现存在三种不同带型，分别命名为CC、TT和CT基因型(图1)。
每种基因型各取3个样本交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果与GAS6基因原序列(GenBankID：NC_006088.5)比对发现，在第27463bp处存在一处C→T突变，记为g.C27463T(图2)。
对GAS6基因3种基因型进行遗传变异分析，分别计算出各等位基因频率和基因型频率，结果显示，C和T基因频率分别为0.39和0.61，CC、CT和TT基因型频率分别为0.26、0.26和0.48，g.C27463T突变位点杂合度为0.543，多态信息含量(Polymorphism InformationContent,PIC)值为0.352，有效等位基因数为1.84。
为建立GAS6基因g.C27463T突变位点与金茅黑鸡腹脂性状的相关性，于江苏三德利牧业发展有限公司收集120只112日龄金茅黑鸡，屠宰测定腹脂重，分析数据，利用SPSS22.0软件中的一般线性模型(general linear model，GLM)将GAS6基因g.C27463T突变位点于腹脂重进行关联分析，结果均以平均值±标准差表示。
由表1可知，TT型个体腹脂重显著低于CT基因型个体(P<0.05)，低于CC基因型个体；CC和CT基因型个体间腹脂重差异不显著(P>0.05)。综上所述，TT基因型个体腹脂重低于CC和CT基因型，为本发明优势基因型，在金茅黑鸡选育过程中，通过选留TT基因型个体，减少腹脂沉积，可改良腹脂性状。
表1 GAS6基因g.C27463T突变与金茅黑鸡腹脂性状的关联分析
注：同行肩标不同小写字母表示显著差异(P<0.05)，不标字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记与应用
<130> xhx2019073101
<141> 2019-07-31
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacacctgtg cggtcagact 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcactgtctg ccacatgcca 20

Claims (8)

1.一种基于鸡GAS6基因的与金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记位于鸡GAS6基因第27463bp处，记为g.C27463T。
2.根据权利要求1所述的一种基于鸡GAS6基因的与金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记，其特征在于，鸡GAS6基因第27463bp处的基因型为TT或CC或CT。
3.用于检测权利要求1或2所述的与金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括一组GAS6-P1引物对，
GAS6-P1引物对的核酸序列为：
上游引物F：5’-GACACCTGTGCGGTCAGACT-3’，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物R：5’-TCACTGTCTGCCACATGCCA-3’，如SEQ ID NO.2所示。
4.含有权利要求3所述引物组的试剂盒。
5.一种检测权利要求1或2所述的与金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括：以鸡基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的引物组进行PCR扩增，获得PCR产物，PCR产物经SSCP分析后分型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系由鸡DNA模板、上游引物F、下游引物R、ddH2O、Taq聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液组成。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72 ℃延伸10 min，4℃保存。
8.权利要求1或2所述的与金茅黑鸡腹脂性状相关的分子标记在鸡选育或鸡腹脂性状改良中的应用。
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