CN114369669A - 一种与猪肉质性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与猪肉质性状相关的分子标记及其应用，属于分子标记领域。所述分子标记的核苷酸如SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1所示序列的第302bp处存在C/T突变，所述突变包括CC、CT和TT三种突变类型，其中，当猪个体基因型为CC型时，所述猪个体背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹和背最长肌肌内脂肪含量均高于CT型和TT型的猪个体。本发明还提供了用于检测该位点的引物对，并建立了相应的检测方法，为猪肌肉品质的遗传改良提供了新的分子标记。本发明可实现对猪肉质性状进行早期选择，且检测方法高效、准确，从而能加速猪肉质改良的进程，提高猪育种的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记领域，特别是涉及一种与猪肉质性状相关的分子标记及其应用。
背景技术
猪肉品质是猪的重要经济性状，提高猪肉品质是现代种猪选育工作的重要目标之一，同时也是满足消费者对猪肉风味、食品健康和营养需求的重要保障。然而，由于肉质性状的复杂性且遗传力偏低，传统的基于表型选择等遗传改良方法效率低、成本高；分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)的出现大大加速了猪育种的进程，它是利用与特定性状相关联的分子标记作为辅助手段进行选择育种，具有快速、准确、不受环境影响等优点，不仅能大大减少育种的人力物力消耗，而且能缩短育种时限。
用于MAS的分子标记包括蛋白质标记，微卫星标记，单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，简称SNP)标记等。SNP标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、缺失或插入等。挖掘猪肉质性状相关的SNP，能有效加快猪肉质性状的改良进展，为养猪业的可持续发展将带来巨大的经济效益。
胞质5核苷酸酶1A(cytosolic 5'-nucleotidase 1A,NT5C1A)基因，在人的骨骼肌和小鼠的胫骨前肌表达量较高(Hunsucker et al.,2001；Sala-Newby et al.,1999)；抗NT5C1A自身抗体可以作为包涵体肌炎(一种肌肉疾病)的标记物(Amlani et al.,2019)。迄今为止，尚无有关NT5C1A基因作为猪肉质性状分子标记的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种与猪肉质性状相关的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，为猪肉质性状的分子标记辅助育种提供一种新的分子标记。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种与猪肉质性状相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸如SEQ IDNO：1所示，SEQ ID NO：1所示序列的第302bp处存在C/T突变。
优选的是，所述突变包括CC、CT和TT三种突变类型，其中，当猪个体基因型为CC型时，所述猪个体背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹和背最长肌肌内脂肪含量均高于CT型和TT型的猪个体。
本发明还提供一种扩增所述的分子标记的引物对，所述引物对为如SEQ ID NO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物。
本发明还提供一种鉴别猪肉质性状的试剂盒，包括所述的引物对。
本发明还提供一种鉴别猪肉质性状的方法，包括如下步骤：
以待测猪个体的DNA为模板，利用所述的引物对进行扩增，获取扩增产物；对所述扩增产物进行测序，分析基因型以及所述基因型与肉质性状的相关性，进而判断待测猪个体的猪肉品质。
优选的是，扩增体系包括如下组分：DNA 100ng、PCR mix 25μL、上游引物和下游引物各1μL、加ddH2O补至总体积50μL。
优选的是，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火35s，72℃延伸35s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
优选的是，所述猪肉质性状包括：背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹和背最长肌肌内脂肪含量。
本发明还提供所述的分子标记或所述的引物对或所述的试剂盒或所述的方法在辅助猪育种中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明发掘了与猪肉质性状关联的分子标记，位于猪NT5C1A基因第6外显子，该分子标记的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该序列长度为537bp，在该序列中第302bp处存在一处C/T碱基突变；本发明首次发掘了该分子标记，并与猪肉质性状相关联，实现了对猪肉质性状进行早期选择，检测方法高效、准确，从而加速了猪肉质改良的进程，提高了猪育种的经济效益。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明猪NT5C1A基因SEQ ID NO：1序列片段琼脂糖凝胶电泳图，其中M为100bp DNA Ladder(分子量标准，从下至上依次为100bp,200bp,300bp,400bp,500bp,600bp,700bp,800bp,900bp,1000bp和1500bp)，1、2表示扩增的DNA片段；
图2为本发明中筛选的SNP位点的测序图谱，其中箭头表示突变位点。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1猪NT5C1A基因SNP检测片段的获得及检测方法的建立
1、猪基因组DNA的提取
本发明的试验猪品种为硒都黑猪和法系大白猪，样品均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所种猪场提供。猪基因组DNA采用北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(货号：DP348)进行提取，具体步骤参照试剂盒说明书。对提取出的DNA进行浓度和质量检测，置于-20℃下保存备用。
2、猪NT5C1A基因SNP遗传标记检测片段的获得
(1)PCR扩增
根据猪NT5C1A基因(GenBank ID:NC_010448)的基因组序列，设计扩增上述SEQ IDNO：1序列的引物对：
正向引物(SEQ ID NO：2)：5′-TAAAGGGTTTTCTGGAGGC-3′，
反向引物(SEQ ID NO：3)：5’-GGAGGGCTGGTGACAATG-3’。
以硒都黑猪和法系大白猪基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR反应体系50μL，体系中各组分为：基因组DNA 100ng、PCR mix 25μL、上下游引物各1μL、加ddH2O补至总体积50μL。
PCR的运行程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火35s，72℃延伸35s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，扩增产物在537bp处出现一条清晰的亮条带，说明扩增成功。
SEQ ID NO：1
N的为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基)，在该序列的首尾加粗显示为引物序列位置。
(2)PCR产物纯化
用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒(货号：B610353)对上述PCR扩增产物进行纯化，具体步骤见试剂盒说明书。
3、利用PCR产物直接测序法检测分子标记
将上述获得的PCR纯化产物直接送到北京奥科公司进行测序，根据测序结果判定该位点在检测群体中的基因型。利用Chromas软件进行分析。
结果如图2所示，发现在该序列中的第302bp存在一处C/T等位基因突变，引起NT5C1A基因的多态性。
实施例2分子标记在不同猪群中的多态性分布检测
本实施例分别在硒都黑猪和法系大白猪群体中检测猪NT5C1A基因SEQ ID NO：1的302bp处的C/T位点的多态性，检测结果如表1所示。
表1 NT5C1A基因第6外显子c.302C/T多态性在不同猪群中的分布
由表1结果可知，NT5C1A基因第6外显子的c.302C/T位点在不同猪群中均表现为三种基因型，其中CC基因型占优势，C等位基因为优势等位基因，C等位基因在地方猪种硒都黑猪所占比例高于国外猪种法系大白猪。
实施例3分子标记与猪肉质性状的关联分析及应用
为了确定猪NT5C1A基因第6外显子c.302C/T多态性与猪肉质性状是否相关，选择398头法系大白猪×硒都黑猪F2代资源群体为试验材料，采用实施例1建立的方法进行多态性检测，采用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version 9.1)GLM程序进行单标记方差分析，分析猪NT5C1A基因第6外显子的c.302C/T位点三种基因型与猪肉质性状的相关关系，所采用模型为：
Yijkl＝μ+Gi+Sj+Nk(+bijkXijk)+eijkl
Yijkl为性状表型值，μ为平均值，Gi为基因型效应，Sj为性别效应、Nk为年度效应，bijk为屠宰日龄的回归系数，肉质性状以屠宰日龄为协变量，eijkl为残差效应。
关联分析结果如表2所示。
表2猪NT5C1A基因第6外显子c.302C/T多态性与肉质性状的关联分析
注：以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；基因型效应*表示P＜0.05。
由表2可知，NT5C1A基因第6外显子c.302C/T位点的CC基因型个体背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹和背最长肌肌内脂肪含量均显著高于CT型和TT型个体(P<0.05)，并且加性效应达到了显著水平(P<0.05)。有研究结果表明，大理石纹评分与肌内脂肪含量存在相关性，大理石纹评分越高，肌内脂肪含量就越高(刘强等，2011)。肌内脂肪含量与肉的风味、嫩度和多汁性相关，能够影响肉质和胴体组成(Hausman et al.,2009)，由此可见，在猪群体中，继代选育CC基因型个体，可以培育大理石纹和肌内脂肪较高的猪群体，进而达到提高猪肉的风味、嫩度和多汁性的目的，为育种生产活动带来较高的效益。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种与猪肉质性状相关的分子标记及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (302)
<223> n=c或t
<400> 1
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taaagggttt tctggaggc 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagggctgg tgacaatg 18
Claims (9)
1.一种与猪肉质性状相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸如SEQ IDNO：1所示，SEQ ID NO：1所示序列的第302bp处存在C/T突变。
2.如权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述突变包括CC、CT和TT三种突变类型，其中，当猪个体基因型为CC型时，所述猪个体背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹和背最长肌肌内脂肪含量均高于CT型和TT型的猪个体。
3.一种扩增权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对为如SEQ IDNO：2所示的上游引物和如SEQ ID NO：3所示的下游引物。
4.一种鉴别猪肉质性状的试剂盒，其特征在在于，包括权利要求3所述的引物对。
5.一种鉴别猪肉质性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：
以待测猪个体的DNA为模板，利用权利要求3所述的引物对进行扩增，获取扩增产物；对所述扩增产物进行测序，分析基因型以及所述基因型与肉质性状的相关性，进而判断待测猪个体的猪肉品质。
6.如权利要求5所述的鉴别猪肉质性状的方法，其特征在于，扩增体系包括如下组分：DNA 100ng、PCR mix 25μL、上游引物和下游引物各1μL、加ddH2O补至总体积50μL。
7.如权利要求5所述的鉴别猪肉质性状的方法，其特征在于，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火35s，72℃延伸35s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
8.如权利要求5所述的鉴别猪肉质性状的方法，其特征在于，所述猪肉质性状包括：背最长肌大理石纹、股二头肌大理石纹和背最长肌肌内脂肪含量。
9.如权利要求1所述的分子标记或权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述的方法在辅助猪育种中的应用。
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