CN111073983A - 与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的snp标记及其应用 - Google Patents

与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的snp标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的SNP标记及其应用，本发明SNP标记由位于大口黑鲈NCCRP‑1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第202位的SNP位点，以及第76位和第132‑133位碱基处的插入缺失突变位点组成，这三个位点完全连锁。利用本发明的SNP位点，具有目的性强、准确度高的优点，且操作简单、检测快速，便于广泛推广使用，快速对大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种进行鉴定，为原种保留、种质提高提供可靠依据。

Description

与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的SNP标记及 其应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的SNP标记及其应用。
背景技术
大口黑鲈(Micropterus Salmoides L.)，俗名加州鲈，原产于北美洲的淡水湖泊和河流，具有无肌间刺、肉质鲜美、生长迅速、养殖周期短等优点，是重要的淡水养殖鱼类之一。在其原产地，大口黑鲈主要由两个亚种组成，包括分布在美国佛罗里达半岛的大口黑鲈佛罗里达亚种(Micropterus Floridanus)和分布遍及美国中部及东部地区、墨西哥东北部地区以及加拿大东南部地区的大口黑鲈北方亚种(Micropterus Salmoides)。20世纪70年代末，我国第一次引进大口黑鲈，随着时间的发展，现全国大部分地区均有养殖。2010年，中国水产科学研究院珠江水产研究所重新又从美国引进了大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种，两个亚种均具备良好的生产性能。但这两个亚种的外部形态非常相似，很难从外形上进行区分鉴别，加之两个亚种之间存在自然杂交繁殖，产生杂交子代，增加了大口黑鲈种质的区分鉴别难度。如何准确的对大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种进行鉴定，是开展大口黑鲈种质资源研究和保障养殖生产的关键。
现有技术中，难从外部形态学上不能有效准确地区分鉴别不同大口黑鲈群体的分类地位和种质来源，因此目前大口黑鲈两个亚种的鉴定多通过分子生物学的手段进行。早期关于大口黑鲈亚种鉴定的研究多集中在RFLP、RAPD、同工酶特异位点以及微卫星分子标记上，白俊杰等通过微卫星分子标记对我国大口养殖的黑鲈的分类地位进行了鉴定，结果认为我国养殖的大口黑鲈应为北方亚种。
近些年，SNP分子标记日益成为遗传育种研究中首选的遗传标记，将SNP分子标记与大口黑鲈亚种鉴定相结合，可快速准确的对大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种进行鉴定，为大口黑鲈原种保留，种间杂交，种质提纯复壮提供相关的可靠依据。
发明内容
根据现有问题，本发明目的在于提供一种与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的SNP标记及其应用，该分子标记可以作为大口黑鲈亚种鉴定的可靠标记，便于进行大口黑鲈亚种鉴定，为大口黑鲈原种保留，种间杂交，种质提纯复壮提供可靠依据。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供了大口黑鲈NCCRP-1基因组序列如SE1ID NO:1，
第76位突变为A或者碱基缺失，
第132-133位突变为AA或者碱基缺失，
第202位K为碱基G或T。
本发明的第二方面，提供了大口黑鲈物种鉴定相关的SNP位点或插入缺失突变位点，所述SNP位点位于NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1所示的第202位，所述插入缺失突变位点位于SEQ ID NO:1所示的第76位和第132-133位。
本发明的第三方面，提供了上述所述SNP位点或插入缺失突变位点在鉴定大口黑鲈种类中的应用。
根据本发明的实施例，所述大口黑鲈种类为大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种。
本发明的第四方面，提供了一种鉴定大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种的方法，包括以下步骤：
检测大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第76位碱基处的SNP位点为AA或--基因型，其中“-”表示碱基缺失，若是“--”，则为佛罗里达亚种，若是“AA”，则为北方亚种；
或/和，检测大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第132-133位碱基处的SNP位点为AAAA或----基因型，其中“----”表示碱基缺失，若是“AAAA”，则为佛罗里达亚种，若是“----”，则为北方亚种；
或/和，检测大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第202位碱基处的SNP位点为GG或TT基因型，若是GG，则为佛罗里达亚种，如果是TT，则为北方亚种。
根据本发明的实施例，上述方法包括如下步骤：
1)提取大口黑鲈DNA；
2)以提取的DNA为模板，PCR检测大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第76位、第132-133位和第202位的基因型是否分别为AA或--、AAAA或----、GG或TT基因型，其中“-”表示碱基缺失。
根据本发明的实施例，步骤2)中，PCR检测的具体操作为：
用引物P1和P2对大口黑鲈DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，
P1:5'-AAGCACAAAGTGTAGGTATTTTCCA-3'(SEQ ID NO:2)
P2:5'-GGCTGCGGATAAAAGCACTG-3'(SEQ ID NO:3)
随后将所得PCR产物经测序分析，确定大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列的第202位的SNP位点基因型为GG或TT基因型，第76位和第132-133位插入缺失突变位点是否分别为AA或--、AAAA或----基因型。
根据本发明的实施例，所述PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0002375898560000031
根据本发明的实施例，PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
本发明的有益效果是：
(1)本发明大大降低传统形态学对大口黑鲈亚种进行鉴定时的人为统计差异，可以快速对大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种进行鉴定。
(2)本发明大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种的鉴定方法既保证了检测结果的可靠性，无需繁琐操作，提高了处理效率和精确性，建立了快速准确的鉴定大口黑鲈北方亚种、佛罗里达亚种的方法。该方法与传统方法相比，具有目的性强、准确度高的优点，且操作简单、检测快速，便于广泛推广使用。
具体实施方式
大口黑鲈NCCRP-1基因组序列如SEQ ID NO:1，
第76位突变为A或者碱基缺失，
第132-133位突变为AA或者碱基缺失，
第202位K为碱基G或T。
大口黑鲈物种鉴定相关的SNP位点或插入缺失突变位点，所述SNP位点位于NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1所示的第202位，所述插入缺失突变位点位于SEQ ID NO:1所示的第76位和第132-133位。
上述所述SNP位点或插入缺失突变位点在鉴定大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种中的应用。
一种鉴定大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种的方法，包括以下步骤：
检测大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第76位碱基处的SNP位点为AA或--基因型，其中“-”表示碱基缺失，若是“--”，则为佛罗里达亚种，若是“AA”，则为北方亚种；
或/和，检测大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第132-133位碱基处的SNP位点为AAAA或----基因型，其中“----”表示碱基缺失，若是“AAAA”，则为佛罗里达亚种，若是“----”，则为北方亚种；
或/和，检测大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第202位碱基处的SNP位点为GG或TT基因型，若是GG，则为佛罗里达亚种，如果是TT，则为北方亚种。
优选的，上述方法包括如下步骤：
1)提取大口黑鲈DNA；
2)以提取的DNA为模板，PCR检测大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第76位、第132-133位和第202位的基因型是否分别为A-、AA--、GT基因型。其中“-”表示碱基缺失。
优选的，在步骤2)中，当检测大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第76位、第132-133位和第202位的基因型是否分别为AA或--、AAAA或----、GG或TT基因型时，所用到的PCR检测的具体操作为：
用引物P1和P2对大口黑鲈DNA进行初次PCR扩增，得到初次PCR产物，
P1:5'-AAGCACAAAGTGTAGGTATTTTCCA-3'(SEQ ID NO:2)；
P2:5'-GGCTGCGGATAAAAGCACTG-3'(SEQ ID NO:3)；
随后将所得PCR产物经测序分析，确定大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列的第76位、第132-133位和第202位的基因型是否分别为AA或--、AAAA或----、GG或TT基因型。
优选的，所述PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0002375898560000041
PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的SNP标记的获得
本发明发现，大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1所示，其中第76位突变为A或者碱基缺失，存在两种基因型AA和--(其中“--”表示碱基缺失)，第132-133位突变为AA或者碱基缺失，存在两种基因型AAAA和----(其中“----”表示碱基缺失)，第202位K为碱基G或T，存在两种基因型GG和TT。
本实验采用128尾来源于5个群体(亚种分类地位已确定)的大口黑鲈样本进行亚种鉴定。群体1为大口黑鲈北方亚种群体(21尾)和大口黑鲈佛罗里达亚种群体(12尾)(来源：珠江水产研究所)，群体2为佛山三水白金基地内保留的大口黑鲈佛罗里达亚种群体(30尾)，群体3为2017年采集的大口黑鲈北方亚种群体(10尾)和大口黑鲈佛罗里达亚种群体(11尾)，群体4为佛山三水白金基地内2019年繁殖的大口黑鲈北方亚种群体(20尾)，群体5为2018年采集的大口黑鲈样本，其中大口黑鲈北方亚种群体(12尾)和大口黑鲈佛罗里达亚种群体(12尾)。
(1)提取基因组DNA
利用酒精消毒后的剪刀剪取大口黑鲈部分尾鳍约0.5×0.5cm，放入无水乙醇中常温保存。通过海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根)对鳍条基因组DNA进行提取。采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，利用紫外分光光度计(Eppendorf，AG2231型)检测浓度，-20℃保存备用。
(2)PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0002375898560000051
其中P1引物:5'-AAGCACAAAGTGTAGGTATTTTCCA-3'(SEQ ID NO:2)；
P2引物:5'-GGCTGCGGATAAAAGCACTG-3'(SEQ ID NO:3)。
PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
(3)结果
将PCR产物经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，对测序结果的SNP位点及其峰图进行统计。大口黑鲈NCCRP-1基因组序列SEQ ID NO:1第202位碱基处的SNP位点见表1。
表1大口黑鲈NCCRP-1基因第202位SNP不同基因型在5个群体的情况
Figure BDA0002375898560000061
实施例2验证SNP位点的准确性
通过SNaPshot方法对实施例1的SNP位点的准确性进行鉴定，包括如下步骤：
(一)引物序列
根据大口黑鲈NCCRP-1基因的部分基因组序列设计了SNaPshot延伸引物：
P3：5'-AACCAAATTTAAAACCAACCCCAAAAA-3'(SEQ ID NO.4)；
P4：5'-ctgactgactGTAATTATAGGTTTGATTTGAATGGACT-3'(SEQ ID NO.5)；
P5：5'-ctgactgactgactgactgAATGTGTTAAACGGGTTATTTAGAAT-3'(SEQ ID NO.6)；
(二)提取基因组DNA
剪取大口黑鲈部分尾鳍约0.5×0.5cm，放入无水乙醇中常温保存。提取鳍条基因组DNA(海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根)。采用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，利用紫外分光光度计(Eppendorf，AG2231型)检测浓度，-20℃保存备用。
(三)多重PCR扩增
1.将引物用1×TE溶解到10pmol，将一组中的引物加到引起，混匀，离心。初次PCR体系如下：
Figure BDA0002375898560000062
将上述配置的PCR混合物分装到96孔PCR板中，离心，每孔加入2μl DNA样品，离心。
初次PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸3min。
2.PCR产物纯化
取3μlPCR扩增产物用ExoI和FastAP纯化，ExoI主要作用为去除反应产物中的剩余引物，FastAP主要作用为去除反应产物中剩余的dNTP。体系如下：
Figure BDA0002375898560000071
反应条件为：37℃15min，80℃15min，纯化好后进行延伸反应，预先混合延伸引物。
3.延伸反应
体系如下：
Figure BDA0002375898560000072
反应条件为：
Figure BDA0002375898560000073
4.取1μl延伸引物，加入10μl上样Hidi，95℃变性3min，立即冰水浴，上测序仪。
在测序仪上，对延伸产物大小及峰的颜色进行检测，确定待测样本的NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第202位碱基处的SNP位点为GG或者TT，若是GG，则为佛罗里达亚种，若是TT，则为北方亚种。
和/或，待测样本的NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第76位碱基插入突变位点是否为AA或--(其中“--”表示碱基缺失)，若是--，则为佛罗里达亚种，若是AA，则为北方亚种。
和/或，待测样本的NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第132-133位碱基插入突变位点是否为AAAA或----(其中“----”表示碱基缺失)，若是AAAA，则为佛罗里达亚种，若是----，则为北方亚种。
本发明的SNaPshot SNP分型结果与PCR产物的测序结果相一致，本发明SNP位点可为大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种的鉴定提供可靠依据。样本数量较少时可直接通过PCR产物测序对大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种进行鉴定，该方法快捷、准确；样本数量较多时可通过SNaPshot方法对大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种进行鉴定，成本较低，适合推广使用。
综上所述，发明人研究发现，在大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列SEQ ID NO:1的第202位碱基处发现一个SNP位点，在第76位和第132-133位碱基处分别发现一个和两个插入缺失突变位点。并且发现大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列的第76、132-133位的基因型与第202位的SNP完全连锁，即当第202位的SNP位点位GG时，第76位、第132-133位基因型分别为--、AAAA(“--”表示碱基缺失)；当第202位的SNP位点位TT时，第76位、第132-133位基因型分别为AA、----(“----”表示碱基缺失)。
本发明检测的5个群体中，以第202位的SNP位点基因型为例，北方亚种全为TT基因型，佛罗里达亚种全为GG基因型，与之前研究结果相一致，表明该SNP位点可以快速准确的鉴定大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所、广东梁氏水产种业有限公司
<120> 与大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种鉴定相关的SNP标记及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 566
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagcacaaag tgtaggtatt ttccatatcc aaaagcaaat gcaaaattta aaccaaattt 60
aaaaccaacc ccaaaaaatc agcatacaaa agtaaataaa aagactgaat actttataat 120
gctccttttt taagtccatt caaatcaaac ctataattac tggtctaaaa gcaaaaatgt 180
gttaaacggg ttatttagaa tkagtaggtc agcaactatg tctgcattgc agttttcagt 240
aggtttcagc ctagtagctg gttttggttg gtttgacaat cactgaactg ccggtgaaca 300
gggtggggaa gaactcattc aggaatttgt tcttcagtcg gtgcagaaag ctgacatatc 360
tcaccccagg tccatagcca gagaacacat gtgacacctg caggccaaga gagagacata 420
gaatgaaaac ttggaatcct ggcccttctg taaaggggcc tgttacctgt cagtaactca 480
cctccttcca tgtgtgtgag taagtgctga ggtcctcggt ggggttgaca gtgtgctctg 540
agatcacagt gcttttatcc gcagcc 566
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagcacaaag tgtaggtatt ttcca 25
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggctgcggat aaaagcactg 20
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaccaaattt aaaaccaacc ccaaaaa 27
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ctgactgact gtaattatag gtttgatttg aatggact 38
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgactgact gactgactga atgtgttaaa cgggttattt agaat 45

Claims (9)

1.大口黑鲈NCCRP-1基因组序列如SEQ ID NO:1所示，其特征在于，
第76位突变为A或者碱基缺失，
第132-133位突变为AA或者碱基缺失，
第202位K为碱基G或T。
2.大口黑鲈物种鉴定相关的SNP位点或插入缺失突变位点，其特征在于，所述SNP位点位于NCCRP-1基因组序列SEQ ID NO:1所示的第202位，所述插入缺失突变位点位于NCCRP-1基因组序列SEQ ID NO:1所示的第76位和第132-133位。
3.权利要求2所述SNP位点或插入缺失突变位点在鉴定大口黑鲈种类中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述大口黑鲈种类为大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种。
5.一种鉴定大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种的方法，其特征在于，包括以下步骤：
检测大口黑鲈NCCRP-1基因组序列SEQ ID NO:1的第76位碱基处的SNP位点为AA或--基因型，其中“-”表示碱基缺失，若是“--”，则为佛罗里达亚种，若是AA，则为北方亚种；
或/和，检测大口黑鲈NCCRP-1基因组序列SEQ ID NO:1的第132-133位碱基处的SNP位点为AAAA或----基因型，其中“----”表示碱基缺失，若是AAAA，则为佛罗里达亚种；若是“----”，则为北方亚种；
或/和，检测大口黑鲈NCCRP-1基因组序列SEQ ID NO:1的第202位碱基处的SNP位点为GG或TT基因型，若是GG，则为佛罗里达亚种，若是TT，则为北方亚种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)提取大口黑鲈DNA；
2)以提取的DNA为模板，PCR检测大口黑鲈NCCRP-1基因组序列SEQ ID NO:1的第76位、第132-133位和第202位的基因型是否分别为AA或--、AAAA或----、GG或TT基因型，其中“-”表示碱基缺失。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)PCR检测的具体操作为：
用引物P1和P2对大口黑鲈DNA进行PCR扩增，得到PCR产物，
P1:5'-AAGCACAAAGTGTAGGTATTTTCCA-3'；
P2:5'-GGCTGCGGATAAAAGCACTG-3'；
将所得PCR产物测序分析，确定大口黑鲈NCCRP-1基因的基因组序列的第202位的SNP位点基因型为GG或TT基因型，第76位和第132-133位插入缺失突变位点是否分别为AA或--、AAAA或----的基因型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应体系为：
Figure FDA0002375898550000021
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。
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