CN113430283B - 鸡bmp15基因在作为鸡睾丸性状分子标记方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸡BMP15基因在作为鸡睾丸性状分子标记方面的应用，属于分子标记领域。本发明公开鸡BMP15基因在作为鸡睾丸性状分子标记方面的应用，所述鸡BMP15基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述应用为鸡BMP15基因外显子2上c.709位点处有一个G>A的碱基突变的SNP位点作为鸡睾丸性状的分子标记方面的应用。本发明通过基于BMP15基因外显子2上c.709G>A位点为候选标记检测该位点在地方鸡种中的多态性并分析了其与睾丸性状的关系，结果发现该位点存在GG、GA、AA三种基因型，并且该位点不同基因型间的睾丸性状存在极显著差异，这为地方鸡种品种选育及标记辅助选择提供依据。

Description

鸡BMP15基因在作为鸡睾丸性状分子标记方面的应用

技术领域

本发明涉及分子标记领域，特别是涉及一种鸡BMP15基因在作为鸡睾丸性状分子标记方面的应用。

背景技术

骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein15，BMP15)为骨形态发生蛋白家族成员，属于转化生长因子β超家族成员之一，作为一种卵母细胞分泌因子，主要在雌性动物卵母细胞中表达并被分泌到胞外，通过结合到卵母细胞周围颗粒细胞/鞘细胞膜上的特异性受体行使生物学功能在动物胚胎生长发育、神经系统、生殖系统以及软骨组织发育中具有重要的作用。BMP15基因目前在鸡上的研究主要集中在该基因多态性及其与母鸡繁殖性能如300日龄产蛋量、开产体质量、开产日龄、开产蛋质量等方面以及卵巢发育。迄今为止，BMP15基因与地方鸡种公禽的繁殖性能还未见有报道。

鸡睾丸是我国优质鸡生产中具有经济价值的副产品，我国广东、福建、台湾等地消费者有着食用鸡鹅等禽类睾丸的习惯，目前市场售价可达100元/kg，一只公鸡的睾丸按20g计算，附加值达2元，如果能提高公鸡睾丸的重量则意味着可以提高公鸡的附加值。根据中医理论，睾丸是一种高档的滋补食材，原始蛋白质含量丰富，具有强身健体、滋阴壮阳的功效。发明人在早期研究中发现地方鸡种睾丸性状在群体中的变异系数高达80％以上。而评价睾丸生长发育的指标如左右两侧的睾丸重、睾丸指数、睾丸总重是屠宰性状，如直接选择这些指标，在现场育种中必须进行大量的屠宰后通过同胞值进行选择，该方法成本高，工作繁琐。随着分子遗传标记辅助选择在育种中的应用，候选基因法是家鸡进行睾丸性状分子选育行之有效、易于操作的方法。

发明内容

本发明的目的是提供鸡BMP15基因在作为鸡睾丸性状分子标记方面的应用，以解决上述现有技术存在的问题，基于BMP15基因外显子2上c.709G>A位点为候选标记检测该位点在地方鸡种中的多态性并分析了其与睾丸性状的关系，进而为地方鸡种品种选育及标记辅助选择提供依据。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供鸡BMP15基因在作为鸡睾丸性状分子标记方面的应用，所述鸡BMP15基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的是，所述应用为鸡BMP15基因上如SEQ ID NO：2所示的基因片段在作为鸡睾丸性状的分子标记方面的应用。

优选的是，所述应用为鸡BMP15基因外显子2上c.709位点处有一个G>A的碱基突变的SNP位点作为鸡睾丸性状的分子标记方面的应用。

优选的是，所述应用为基于鸡BMP15基因外显子2上c.709位点处有一个G>A的碱基突变，利用PCR扩增进行基因分型来判断该位点的多态性，以此判断鸡睾丸性状；所述睾丸性状包括睾丸重和睾丸指数。

本发明还提供一种鸡睾丸性状的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供一种鸡睾丸性状的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供一种鸡睾丸性状的分子标记，其为鸡BMP15基因外显子2上c.709位点处有一个G>A的碱基突变的SNP位点。

本发明还提供所述的分子标记在地方鸡种品种选育及标记辅助选择方面的应用。

优选的是，应用方法为：

(1)以鸡BMP15基因的DNA序列为模板，以如序列SEQ ID NO：3所示上游引物和SEQID NO：4所示下游引物进行扩增，获取扩增产物；

(2)对扩增产物进行测序，根据测序结果分为GG、AG和AA三种基因型；

(3)根据基因型判断与鸡睾丸性状的关系。GG基因型个体的睾丸性状显著高于AG基因型个体，AA基因型个体睾丸性状与AG基因型和GG基因型个体差异不显著。

优选的是，扩增反应体系为：2×PCR mix 25μL，上下游引物各0.4μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 23.2μL；

反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；后延伸72℃10min。

本发明公开了以下技术效果：

本发明以BMP15基因外显子2上c.709G>A位点为候选标记，检测该位点在地方鸡种宁都黄公鸡中的多态性并分析其与睾丸性状的关系，结果发现该位点存在GG、GA、AA三种基因型，并且该位点不同基因型间的睾丸性状存在极显著差异(P<0.01)，GG型个体的睾丸性状(包括左睾丸重、右睾丸重、总睾丸重、左睾丸指数、右睾丸指数、睾丸总重指数)极显著(P<0.01)高于AG型个体，AA型个体与AG型和GG型个体的6个性状差异不显著(P>0.05)。因此，本发明公开的分子标记可以用于区分鸡睾丸性状，为地方鸡种品种选育及标记辅助选择提供依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为BMP15基因PCR产物检测结果；M为DL2000 marker，1为PCR产物；

图2为BMP15基因序列比对的结果；

图3为BMP15基因c.709G>A位点不同基因型测序图；其中图中带阴影的碱基为c.709G>A位点。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例

1、材料与方法

1.1试验材料、指标测定及样品采集

试验鸡群由江西南师科技有限公司提供，饲养时间为2018年4月-2018年8月，鸡苗数为700羽，饲养模式为种公鸡笼养模式，按照肉种鸡常规免疫程序进行统一免疫，其它均按照常规方法进行饲养管理。

在出生第一天戴上翅号，第5周戴上脚号。饲养至16周龄进行屠宰。指标测定有活体质量、左侧睾丸质量、右侧睾丸质量、睾丸总质量与睾丸指数。其中睾丸指数为(睾丸质量/活体质量)×100％。去除死亡、逃逸、以及明显错误与重复数据，最后得到的试验公鸡497只。指标测定参照NY/T 823—2004《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》规定的方法。在翅下静脉采血1～2mL，用2％EDTA抗凝，-20℃保存备用。所采血样用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，并稀释成100ng/μL备用。

1.2引物设计与合成

从NCBI上下载鸡BMP15基因组序列(GenBank登录号：NM_001006589.2)，应用Genetool软件设计上下游引物，引物序列：F(SEQ ID NO:3):5’-ctggcacaggaaatggaact-3’，R(SEQ ID NO:4):5’-ccaccaagcatcaaaacaca-3’，扩增BMP15基因位点c.709G>A上下游957bp片段。引物由湖南擎科生物有限公司合成。

PCR反应体系为(50μL)：2×PCR mix 25μL，上下游引物各0.4μL，DNA模板1.0μL，ddH₂O 23.2μL。

PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；后延伸72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小是否符合预期。检测后的PCR产物送往湖南擎科生物有限公司利用上游引物进行Sanger直接测序，根据每个个体测序结果判定基因型。

1.3统计分析

由于所观察群体拥有相同的遗传背景，均为16w公鸡，且在饲养标准相同条件下饲养，所以标记与睾丸性状间的关联分析采用SAS 9.0GLM程序进行统计分析，构建模型如下：Y_ij＝μ+G_i+e_ij。其中Y_ij为性状表型值，μ为该性状的总体均值，G_i为基因型效应值，e_ij为随机残差效应。

2、结果与分析

2.1PCR产物检测结果

BMP15基因PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测见图1，在957bp处有清晰的单一条带，与预期片段大小一致。

检测后的PCR产物直接测序，测序序列如下所示，除掉5’端与3’端测序结果较差的部分，得到了913bp序列(SEQ ID NO：2)。

ggaactttgcgagggccacgcccatgctgggcacagcggggtgggatgaggccgtgccccaggcctggctgccccaggcgggagctgacggctgctttcctcctgcaggtcgctggtacgtgcagcccctcacctaccgcctggacgcccagtctgaagctgagcaccttctccgtgtcaccgtggcctaccctcagagcctgccgctgccccgtggccgcctcctgtgtgccgtggagctgctgcctgctgccaaagccccggcggtactgctcagccccaccgccccatcccgccacggctgggccgaagcggacatcaccccctatttatccccagcgaacagcagctcaggagggacgctgaccctgcggcacatctgcgtgcgatccggccgagccgccacggccgccccgccgtcccctgcggaccccttcctcctcctcttcctcaatgacacccgcagcgggactctcccggagcctcggcgcagccggcgcgaggcagggacgcttctccacgacctgcccggctacctgcgggatgccggaggggacaaaagcgactgctccctgcgctccttccccgtcagcttcgcccagctgggttgggaccattggatcatcgctccccatcgctacaacccgcgctactgtaagggcgtgtgcccacggctcctccgggacggctaccacgcgcccaaccacgccgtggtgcagaacttggtccaccagctggtggatgccaacgtcccccggccctcctgcgtcccctaccgctacagccccatcagcgtcctgatgatccagcacgacggcagcatcctctacaaggagtatgagaacatgattgcagagtcctgcacctgccgctaacctgtgcctggagctggattctggtgatggggggaccg

将得到的序列经https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行比对，进一步验证得到的序列是否为BMP15基因的序列，比对结果见图2，从图中可看出测序得到的序列为BMP15基因的部分序列。

2.2BMP15基因c.709G>A位点的基因型检测

497只宁都黄公鸡BMP15基因PCR产物直接测序结果发现在CDS区的709位置存在多态性，该位点在CDS中的具体位置如下(SEQ ID NO：1，加粗斜体字母G为c.709G>A位点)：

atggctttgctccggcccttcaccgccctcctcctcctcaccgtgttgctctcctgggctgcgagccagactccccccttgcccctcttgcaagcactgcgggcacaagcaccgggtagccagggctggagagggggtgcagccagtgggcagcccctgcgctacatgctggagctgtaccaacgtgctgccgaccatgagggacggccccggcgtggccgcagtctgagcaccaacaccgtgcggctggtgcaggcagcttcccatgggggacagccctgggcaggtcgctggtacgtgcagcccctcacctaccgcctggacgcccagtctgaagctgagcaccttctccgtgtcaccgtggcctaccctcagagcctgccgctgccccgtggccgcctcctgtgtgccgtggagctgctgcctgctgccaaagccccggcggtactgctcagccccaccgccccatcccgccacggctgggccgaagcggacatcaccccctatttatccccagcaaacagcagctcaggagggacgctgaccctgcggcacatctgcgtgcgatccggccgagccgccacggccgccccgccgtcccctgcggaccccttcctcctcctcttcctcaacgacacccgcagtgggactctcccggagcctcggcgcagccggcgcgaggcagggacgcttctccacgacctgcctggctacctgcgggatgccggaggggacaaaagcgactgctccctgcgctccttccccgtcagcttcgcccagctgggttgggaccattggatcatcgctccccatcgctacaacccgcgctactgtaagggcgtgtgcccacggctcctccgggacggctaccacgcgcccaaccacgccgtggtgcagaacttggtccaccagctggtggatgccaacgtcccccggccctcctgcgtcccctaccgctacagccccatcagcgtcctgatgatccagcacgacggcagcatcctctacaaggagtatgagaacatgattgcagagtcctgcacctgccgctaa

比较测序结果发现该位点为G>A的突变，存在3种基因型(图3)。

2.3BMP15基因c.709G>A位点与宁都黄公鸡睾丸性状的相关性

BMP15基因位点c.709G>A不同基因型与睾丸性状的相关性见表1。从表1可以看出，该位点与所测定的6个性状都存在显著相关(P<0.05)；且该位点不同基因型间的睾丸性状存在极显著差异(P<0.01)，GG型个体的6个性状极显著(P<0.01)高于AG型个体，AA型个体与AG型和GG型个体的6个性状差异不显著(P>0.05)。

表1位点A1861863G基因型与笼养宁都黄公鸡睾丸性状的相关性

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 南昌师范学院

<120> 鸡BMP15基因在作为鸡睾丸性状分子标记方面的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctttgc tccggccctt caccgccctc ctcctcctca ccgtgttgct ctcctgggct 60

gcgagccaga ctcccccctt gcccctcttg caagcactgc gggcacaagc accgggtagc 120

cagggctgga gagggggtgc agccagtggg cagcccctgc gctacatgct ggagctgtac 180

caacgtgctg ccgaccatga gggacggccc cggcgtggcc gcagtctgag caccaacacc 240

gtgcggctgg tgcaggcagc ttcccatggg ggacagccct gggcaggtcg ctggtacgtg 300

cagcccctca cctaccgcct ggacgcccag tctgaagctg agcaccttct ccgtgtcacc 360

gtggcctacc ctcagagcct gccgctgccc cgtggccgcc tcctgtgtgc cgtggagctg 420

ctgcctgctg ccaaagcccc ggcggtactg ctcagcccca ccgccccatc ccgccacggc 480

tgggccgaag cggacatcac cccctattta tccccagcaa acagcagctc aggagggacg 540

ctgaccctgc ggcacatctg cgtgcgatcc ggccgagccg ccacggccgc cccgccgtcc 600

cctgcggacc ccttcctcct cctcttcctc aacgacaccc gcagtgggac tctcccggag 660

cctcggcgca gccggcgcga ggcagggacg cttctccacg acctgcctgg ctacctgcgg 720

gatgccggag gggacaaaag cgactgctcc ctgcgctcct tccccgtcag cttcgcccag 780

ctgggttggg accattggat catcgctccc catcgctaca acccgcgcta ctgtaagggc 840

gtgtgcccac ggctcctccg ggacggctac cacgcgccca accacgccgt ggtgcagaac 900

ttggtccacc agctggtgga tgccaacgtc ccccggccct cctgcgtccc ctaccgctac 960

agccccatca gcgtcctgat gatccagcac gacggcagca tcctctacaa ggagtatgag 1020

aacatgattg cagagtcctg cacctgccgc taa 1053

<210> 2

<211> 913

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaactttgc gagggccacg cccatgctgg gcacagcggg gtgggatgag gccgtgcccc 60

aggcctggct gccccaggcg ggagctgacg gctgctttcc tcctgcaggt cgctggtacg 120

tgcagcccct cacctaccgc ctggacgccc agtctgaagc tgagcacctt ctccgtgtca 180

ccgtggccta ccctcagagc ctgccgctgc cccgtggccg cctcctgtgt gccgtggagc 240

tgctgcctgc tgccaaagcc ccggcggtac tgctcagccc caccgcccca tcccgccacg 300

gctgggccga agcggacatc accccctatt tatccccagc gaacagcagc tcaggaggga 360

cgctgaccct gcggcacatc tgcgtgcgat ccggccgagc cgccacggcc gccccgccgt 420

cccctgcgga ccccttcctc ctcctcttcc tcaatgacac ccgcagcggg actctcccgg 480

agcctcggcg cagccggcgc gaggcaggga cgcttctcca cgacctgccc ggctacctgc 540

gggatgccgg aggggacaaa agcgactgct ccctgcgctc cttccccgtc agcttcgccc 600

agctgggttg ggaccattgg atcatcgctc cccatcgcta caacccgcgc tactgtaagg 660

gcgtgtgccc acggctcctc cgggacggct accacgcgcc caaccacgcc gtggtgcaga 720

acttggtcca ccagctggtg gatgccaacg tcccccggcc ctcctgcgtc ccctaccgct 780

acagccccat cagcgtcctg atgatccagc acgacggcag catcctctac aaggagtatg 840

agaacatgat tgcagagtcc tgcacctgcc gctaacctgt gcctggagct ggattctggt 900

gatgggggga ccg 913

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggcacagg aaatggaact 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaccaagca tcaaaacaca 20

Claims (5)

1. 鸡BMP15基因外显子2上c.709位点处有一个G>A的碱基突变的SNP位点在作为宁都黄公鸡睾丸性状的分子标记方面的应用，其特征在于，所述c.709位点位于SEQ ID NO：1所示序列的第709位；所述睾丸性状为睾丸重和睾丸指数。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为基于鸡BMP15基因外显子2上c.709位点处有一个G>A的碱基突变，利用PCR扩增进行基因分型来判断该位点的多态性，以此判断鸡睾丸性状。

3.鸡BMP15基因外显子2上c.709位点处有一个G>A的碱基突变的SNP位点作为宁都黄公鸡睾丸性状的分子标记在地方鸡种品种选育及标记辅助选择方面的应用，其特征在于，所述c.709位点位于SEQ ID NO：1所示序列的第709位；所述睾丸性状为睾丸重和睾丸指数；所述地方鸡种为宁都黄公鸡。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，应用方法为：

（1）以鸡BMP15基因的DNA序列为模板，以SEQ ID NO：3所示上游引物和SEQ ID NO：4所示下游引物进行扩增，获取扩增产物；

（2）对扩增产物进行测序，根据测序结果分为GG、AG和AA三种基因型；

（3）根据基因型判断鸡睾丸性状。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，扩增反应体系为：2 × PCR mix 25 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA模板1.0 μL，ddH₂O 23.2 μL；

反应程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；后延伸72℃ 10 min。

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