CN113151510B - 一种与鸡睾丸性状相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与鸡睾丸性状相关的分子标记及其应用，属于生物基因领域。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；SEQ ID NO：1所示序列的SNP位点g.1798处有一个C/T的碱基突变，导致不同的基因型出现。本发明通过所述分子标记可判定不同基因型和鸡睾丸性状的相关性，进而筛选出优良睾丸性状的个体，所述分子标记为地方鸡种公鸡标记辅助选择提供依据，并且利用所述分子标记检测鸡睾丸相关性状的方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。

Description

一种与鸡睾丸性状相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物基因领域，特别是涉及一种与鸡睾丸性状相关的分子标记及其应用。

背景技术

宁都黄鸡是江西省珍贵的优良地方小型肉用黄鸡品种，是宝贵的家禽品种资源，外表清秀靓丽，尤其以肉质细嫩、味道鲜美、营养价值高而深受广大消费者的青睐。肉用种公鸡获得较高的种用价值除遗传因素外，合格的体重、充分发育的性腺与适时的性成熟也是非常重要的因素。如果能够从宁都黄公鸡性腺的生长发育规律及其相关基因入手，筛选性腺生长相关的遗传标记，可为宁都黄鸡的分子辅助选育积累理论基础，为宁都黄种公鸡的饲养管理提供数据，对种公鸡科学培育是非常必要的。

睾丸，公鸡最重要的生殖器官。睾丸发育受下丘脑-垂体-睾丸轴的内分泌调节。睾丸重量和体积的改变会对公鸡的交配能力产生一定影响，从而导致群体繁殖性能下降。睾丸的大小、总重量和双侧对称性与精子穿透力、种蛋受精率显著相关。根据中医理论，睾丸是一种高档的滋补食材，原始蛋白质含量丰富，具有强身健体、滋阴壮阳的功效。如果能在保持公鸡出栏体重的同时增加睾丸重，可增加附加产品的经济价值。由此，运用分子遗传标记选择方法，对宁都黄公鸡睾丸重量进行选育，有重要的生产价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种与鸡睾丸性状相关的分子标记及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过该分子标记可以对宁都黄公鸡进行分型，再经过分析其与睾丸性状的关系，可以筛选出具有优良睾丸性状的个体。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种与鸡睾丸性状相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的是，SEQ ID NO：1所示序列的SNP位点g.1798处有一个C/T的碱基突变，导致不同的基因型出现。

本发明还提供一种扩增所述的分子标记的引物对，所述引物对序列如下所示：

上游引物：5’-CGAGCACCCCCATCCATTT-3’；

下游引物：5’-TTTCCTCACTCTTTCCCGGC-3’。

本发明还提供一种利用所述的分子标记检测鸡睾丸相关性状的方法，包括以下步骤：

步骤1：获取待检测鸡的基因组DNA；

步骤2：利用权利要求3所述的引物对扩增包含GH基因位点g.1798的上下游基因序列；

步骤3：将步骤2所得的扩增产物进行电泳分型；

步骤4：根据分型结果，统计分析GH基因位点g.1798不同基因型与睾丸性状的相关性。

优选的是，扩增体系15μL，包括以下组分：DNA模板1-2μL、2×PCR mix 7.5μL、引物对2μL，用水补充至15μL。

本发明还提供根据所述的分子标记、所述的引物对或所述的方法在检测鸡睾丸相关性状中的应用。

本发明还提供根据所述的分子标记、所述的引物对或所述的方法在地方鸡种公鸡选育和标记辅助育种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开一种与鸡睾丸性状相关的分子标记，该分子标记是以GH基因g.1798位点为分子标记检测位点，以用于检测该位点在宁都黄公鸡中的多态性，并分析其与睾丸性状的关系，从而为地方鸡种公鸡标记辅助选择提供依据。本发明采用的是分子标记技术在基因水平上进行鸡种选育，相比现有技术中根据表型数据选育，不仅成本低，操作简便，并且结果更准确。该检测方法还具有简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行的优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2目的位点的分型结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例所用引物对由生物公司合成。

实施例1利用与鸡睾丸性状相关的分子标记筛选优良睾丸性状的种公鸡

采用PCR方法对相应的变异位点进行分型，根据被检鸡血液目的位点的基因型来选择优良睾丸性状的种公鸡。具体步骤如下：

具体步骤包括

步骤1：样本DNA准备。

(1)采集387只16周龄公鸡血液，采用苯酚-氯仿抽提法提取血液DNA。

(2)DNA质量检测与稀释：取质量合格的DNA样品，稀释至100ng/μL，-20℃保存备用。

步骤2：PCR扩增

将合成好的上下游引物分别用1×TE溶解到浓度为10pmol，将一组中的引物加到一起，混匀，离心。

PCR反应体系如表1。

表1 PCR反应体系

将配制的PCR总管分装到200μL PCR中，离心，每孔加入2μL DNA样品，离心，上PCR仪。

扩增条件如表2所示。

表2扩增条件

上述引物对为：

上游引物F(SEQ ID NO：2):CGAGCACCCCCATCCATTT；

下游引物R(SEQ ID NO：3):TTTCCTCACTCTTTCCCGGC。

扩增所得到的目的基因的基因序列(SEQ ID NO：1)如下：

CACGAGCACCCCCATCCATTTTAAACAGACCCCCAGCTATATAAGGGGTGTCTCACCTGTTATCATCACCTGGATGAAAGGAGGAAACGTTCAAGCAACACCTGAGCAACTCTCCCGGCAGGAATGGCTCCAGGTACTTTGCTTTATCTCAGTTCTAATGGGTGTTCCAATGCTGCTGCATGCTTTGGGTGATGGGATACGATGGTGGGGTGTGCTGTGGTGGGCTGACACACGCAGAGCCGGCTCTGAACTAAAATGTGGCAACTTACAGATCAGTGACAAAGGATCTCCTTCCCTACAGTGCAACTTCAAACCATGAGCTGACTCAGGTAACCCTGAGCCTAACCTTGACAGGGGGCAGGAATGAGCTGCAGAATACGAAGAACAAGGCAAACCAGAGTTGTAATGGTGATTGCTATCATACGTGTTGCCAGGGATATTAAAACTCAGTTCCAAGGCTTTAAAACGGAGATCAGGATGATGTCTAATCAGACTCATAGAATGGCCCGGGTTGAAAAGCACTTCAAAGATCACCTAATTTCAACCCCTTGCACTTGTCCAAGTCCTGCAGGCTCCAGGGCATTCCTCCACTGAAGTTAAACCCTACTGAGATTAACTTTTGTAAGCGGACACTCATGTGAGCTGGATGTCGAGGGTTAATAACCTTCAGGCTTGACAGTGACCTCCAGATCCTACAGGTGTGTCCCAGAGAGCCACAGCGCAGGTAATGCAGCCACTTCTCACCCCAGTGAAGGCAGACAGTGCCATGGCAGCAGCACGGTGCAAATAGGCTCAGCTGAGCTGTTCCCAGTCCTCACCCACTGCTCTCCACCCTGTTGGCTCACGCGCCAAAGAGTGTACCGTGCTCTGCTCAGGAAGGTGAAACCTACCAAAAAACATCAAAAAACATGAGCACGTTAGGGGAAAATAAAGGGACGGACCCACATGGAGCAACATGTGGGCTTGTGTGGAGGGCTGCACTCACAGGTGGACACAACCCTGAGCCCCAGGTGCCACCAAAGGACGGGTAACCCCTCTCCTCTCCGCTCTGCTGTAGGCTCGTGGTTTTCTCCTCTCCTCATCGCTGTGGTCACGCTGGGACTGCCGCAGGAAGCTGCTGCCACCTTCCCTGCCATGCCCCTCTCCAACCTGTTTGCCAACGCTGTGCTGAGGGCTCAGCACCTCCACCTCCTGGCTGCCGAGACATATAAAGAGTTCGTAAGTGTTGGCCATCTCCTCATTAGCTTGATGCCTCCAGGACCGTGCCACGGCTTCCCACCCTGCATAAATTCCTGCAAGCAGAGACTTTTCAGCTATCGGTGCCTCCTGAGGAGGAGAAAGGGTCTTAATAGGGTAGGAGAGGTGATGACCGACCAGCCTGTCCTCC【C/T】CACAGCTCTCTGCCTCCTCCTGCAAGGAGTCACCTCCTCCTGTCCATGTGTTCTGTGCTCACCTCAACCCTTCAGTGAGAGCAATCTCTAAGACCAGTAGGTGTTGTGCCAACACGTGGGCTCTGCTTTCCCACCTGCCAGTCCTGCACAGGGATGCACATCATGTCCCACGTTTCCTTCTTGCAAAGAGCAACCTGCCGGGAAAGAGTGAGGAAAGAGTCCGTGCTCTTCTCTTATCACAC

注：“【】”内为目的位点。

(3)测序分型

将扩增得到的PCR产物送生物公司测序。用DNAStar软件的SeqMan模块读取实验结果，查看目的位点基因型。

步骤3：性状关联分析

采用SAS 9.0GLM程序进行统计分析GH基因位点g.1798不同基因型与睾丸性状，包括16w左睾丸重、16w右睾丸重、总睾丸重、左右睾丸重差、左睾丸指数、右睾丸指数和睾丸总重指数的相关性。结果显示为CC基因型的睾丸性状极显著高于TT型个体，具体结果如下表3所示：

表3不同基因型和睾丸性状之间相关性的鉴定结果

实施例2利用与鸡睾丸性状相关的分子标记进行分型

为了进一步验证上述结果的可行性，对已知留种公鸡进行鉴定。

通过GH基因位点g.1798基因型选择留种公鸡。

1、样本采集与准备

(1)孵化200只宁都黄种鸡蛋，出生当天鉴别雌雄；

(2)采集雄性个体血液。

2、DNA提取

基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法(奥斯泊F等，1998)，具体步骤如下：

(1)取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL 20％SDS和6μL 10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；

(2)取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；

(3)取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；

(4)取上清，加入500μL氯仿-异戊醇(23：1)轻摇20min，10,000rpm离心10min；

(5)取上清，加入1mL冰无水乙醇(-20℃)，来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；

(6)用1mL 75％乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；

(7)待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；

(8)存放于-20℃冰箱中保存备用。

3、目的位点分型

利用实例1的方法进行PCR扩增，获取PCR产物。

4、测序分型

将扩增得到的PCR产物送生物公司测序，采用下游引物R进行序列测序。用DNAStar软件的SeqMan模块读取实验结果，查看目的位点基因型。

采用chromas软件查看峰图，分型结果有如图1所示的3种结果。

5、结果判定

根据分型结果，将基因型分别为CC、CT和TT个体进行标号，饲养至16周龄，屠宰实验数据表明，CC基因型个体的睾丸性状与TT基因型个体差异极显著，且CC基因型优于TT基因型，CT基因型居中。与预测结果相一致。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 南昌师范学院

<120> 一种与鸡睾丸性状相关的分子标记及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1630

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1388)

<223> n=c或t

<400> 1

cacgagcacc cccatccatt ttaaacagac ccccagctat ataaggggtg tctcacctgt 60

tatcatcacc tggatgaaag gaggaaacgt tcaagcaaca cctgagcaac tctcccggca 120

ggaatggctc caggtacttt gctttatctc agttctaatg ggtgttccaa tgctgctgca 180

tgctttgggt gatgggatac gatggtgggg tgtgctgtgg tgggctgaca cacgcagagc 240

cggctctgaa ctaaaatgtg gcaacttaca gatcagtgac aaaggatctc cttccctaca 300

gtgcaacttc aaaccatgag ctgactcagg taaccctgag cctaaccttg acagggggca 360

ggaatgagct gcagaatacg aagaacaagg caaaccagag ttgtaatggt gattgctatc 420

atacgtgttg ccagggatat taaaactcag ttccaaggct ttaaaacgga gatcaggatg 480

atgtctaatc agactcatag aatggcccgg gttgaaaagc acttcaaaga tcacctaatt 540

tcaacccctt gcacttgtcc aagtcctgca ggctccaggg cattcctcca ctgaagttaa 600

accctactga gattaacttt tgtaagcgga cactcatgtg agctggatgt cgagggttaa 660

taaccttcag gcttgacagt gacctccaga tcctacaggt gtgtcccaga gagccacagc 720

gcaggtaatg cagccacttc tcaccccagt gaaggcagac agtgccatgg cagcagcacg 780

gtgcaaatag gctcagctga gctgttccca gtcctcaccc actgctctcc accctgttgg 840

ctcacgcgcc aaagagtgta ccgtgctctg ctcaggaagg tgaaacctac caaaaaacat 900

caaaaaacat gagcacgtta ggggaaaata aagggacgga cccacatgga gcaacatgtg 960

ggcttgtgtg gagggctgca ctcacaggtg gacacaaccc tgagccccag gtgccaccaa 1020

aggacgggta acccctctcc tctccgctct gctgtaggct cgtggttttc tcctctcctc 1080

atcgctgtgg tcacgctggg actgccgcag gaagctgctg ccaccttccc tgccatgccc 1140

ctctccaacc tgtttgccaa cgctgtgctg agggctcagc acctccacct cctggctgcc 1200

gagacatata aagagttcgt aagtgttggc catctcctca ttagcttgat gcctccagga 1260

ccgtgccacg gcttcccacc ctgcataaat tcctgcaagc agagactttt cagctatcgg 1320

tgcctcctga ggaggagaaa gggtcttaat agggtaggag aggtgatgac cgaccagcct 1380

gtcctccnca cagctctctg cctcctcctg caaggagtca cctcctcctg tccatgtgtt 1440

ctgtgctcac ctcaaccctt cagtgagagc aatctctaag accagtaggt gttgtgccaa 1500

cacgtgggct ctgctttccc acctgccagt cctgcacagg gatgcacatc atgtcccacg 1560

tttccttctt gcaaagagca acctgccggg aaagagtgag gaaagagtcc gtgctcttct 1620

cttatcacac 1630

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgagcacccc catccattt 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttcctcact ctttcccggc 20

Claims (6)

1.一种与鸡睾丸性状相关的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的与鸡睾丸性状相关的分子标记，其特征在于，SEQ ID NO：1所示序列的1388bp处有一个C/T的碱基突变，导致不同的基因型出现。

3.一种利用权利要求1或2所述的分子标记检测宁都黄公鸡睾丸相关性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：获取待检测宁都黄公鸡的基因组DNA；

步骤2：利用引物对扩增包含SEQ ID NO：1所示序列的1388bp碱基的上下游基因序列；

步骤3：将步骤2所得的扩增产物进行测序；

步骤4：根据分型结果，统计分析不同基因型与睾丸性状的相关性；

所述睾丸性状为16w左睾丸重、16w右睾丸重、总睾丸重、左右睾丸重差、左睾丸指数、右睾丸指数和睾丸总重指数；

所述引物对为：上游引物：5’-CGAGCACCCCCATCCATTT-3’；下游引物：5’-TTTCCTCACTCTTTCCCGGC-3’。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，扩增体系15μL，包括以下组分：DNA模板1-2μL、2×PCR mix 7.5μL、引物对2μL，用水补充至15μL。

5.根据权利要求1或2所述的分子标记、权利要求3或4所述的方法在检测宁都黄公鸡睾丸相关性状中的应用，其特征在于，所述睾丸性状为16w左睾丸重、16w右睾丸重、总睾丸重、左右睾丸重差、左睾丸指数、右睾丸指数和睾丸总重指数。

6.根据权利要求1或2所述的分子标记、权利要求3或4所述的方法在宁都黄公鸡种公鸡选育和标记辅助育种中的应用，其特征在于，育种性状为睾丸性状，所述睾丸性状为16w左睾丸重、16w右睾丸重、总睾丸重、左右睾丸重差、左睾丸指数、右睾丸指数和睾丸总重指数。

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