CN116287174A - 一种日本日月贝遗传性别相关的dna分子标记及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种日本日月贝(Amusium japonicum)遗传性别相关的DNA分子标记及鉴定方法。本发明提供的用于鉴定日本日月贝遗传性别的分子标记为一个雌性特异标记和一个雌雄共有分子标记，雌性特异标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，雌雄共有分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：4。根据其设计PCR引物，采用PCR引物扩增此分子标记，根据电泳结果鉴定日本日月贝的性别，雌雄均扩增出639bp条带，说明PCR成功，出现长度为200bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。该方法鉴定准确率高，稳定性强，简单快速，对贝类主体无损伤，适用于日本日月贝发育不同阶段的性别鉴定，为日本日月贝开展遗传育种工作奠定了基础。

Description

一种日本日月贝遗传性别相关的DNA分子标记及鉴定方法

技术领域

本发明涉及动物性别鉴定技术领域，具体涉及一种日本日月贝遗传性别相关的DNA分子标记及鉴定方法。

背景技术

日本日月贝(Amusium japonicum)隶属于软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、珍珠贝目(Pectinoida)、扇贝科(Pectinidae)、日月贝属(Amusium)。日本日月贝因其经济性状显著，市场售价远高于虾夷扇贝、栉孔扇贝和海湾扇贝等常见养殖种：首先，日本日月贝个体较大，闭壳肌发达，肉质肥美，营养丰富；第二，其鳃丝干制品为久享盛誉的海珍佳品；第三，日本日月贝的贝壳大，壳色鲜艳美丽，可做工艺品贝雕或装饰品等。当前市面上的日本日月贝以捕捞的野生种为主，供不应求。因此，如能开展日本日月贝育种养殖工作，对消除饥饿、提供营养、拉动经济具有重要意义。

日本日月贝为雌雄异体。产自北海湾的日本日月贝的繁殖季节为每年10月至翌年3月，盛期为每年11月至翌年1月。当日本日月贝处于成熟期时，性腺较为丰满，通常可通过性腺颜色对性别进行区分，成熟的雌性生殖腺为桔红色，雄性为乳酪色。然而，由于个体差异较大，尤其是对于尚未完全成熟的日本日月贝，其雌雄性腺均呈透明状，雌性性腺极易与雄性性腺混淆，通过肉眼检查来鉴定性别存在较高假阳性率，而通过性腺采集进行组织学切片鉴定也存在个体无法留种、操作繁琐等不足，尤其是对于性别尚未分化的幼贝，组织学切片也难以准确判定性别。日本日月贝目前尚未形成有规模的人工养殖体系，其中一大制约因素是很难在无损条件下实现性别的快速、精准鉴定，优异亲本种质难以保留，为水产工作者开展贝类近缘、远缘杂交、家系建立，尤其是群体杂交时带来巨大挑战，是目前人工育种环节中的技术瓶颈。

DNA分子标记是性别鉴定的重要工具，不受发育时期和组织部位的限制，并可以做到活体鉴定，具有操作简单、成本低廉、结果准确等优点，已经在大多数水生生物中广泛应用。但由于日本日月贝的性染色体高度不分化，雌雄序列差异较小，筛选到性别特异的分子标记困难较大，迄今为止在日本日月贝中尚未建立遗传性别的分子鉴定方法。为进一步开展日本日月贝的育种工作，提高养殖效益，需要建立一种可靠的基于DNA分子标记的雌雄鉴定方法。

发明内容

本发明是为了解决现有技术无法在主体无损和未性成熟的条件下实现日本日月贝性别鉴定的问题，提供一种日本日月贝活体性别DNA分子标记鉴定方法。

本发明技术方案如下：

本发明首先提供一种日本日月贝(Amusium japonicum)遗传性别相关的DNA分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供一种雌雄日本日月贝共有的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步的，本发明提供所述DNA分子标记和/或所述雌雄日本日月贝共有的分子标记在鉴定日本日月贝性别方面的应用。

进一步的，本发明还提供一种鉴定日本日月贝性别的方法，包括以下步骤：

通过PCR反应检测权利要求1所述DNA分子标记和权利要求2所述雌雄日本日月贝共有的分子标记。

进一步的，所述PCR反应中，用于扩增所述DNA分子标记的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，用于扩增所述雌雄日本日月贝共有的分子标记的上下游引物分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

进一步的，所述的鉴定日本日月贝性别的方法，包括如下的步骤：

1)获得日本日月贝的基因组DNA；

2)以所得的基因组DNA为模板，使用针对SEQ ID NO：1所示序列设计的引物和针对SEQ ID NO：4所示序列设计的引物进行PCR反应；

3)对PCR反应产物进行电泳检测，若同时扩增出639bp和200bp条带，说明为雌性个体，若扩增出639bp，未扩增出200bp条带，则为雄性个体。

与现有技术相比，本发明的有益成果在于：

本发明只需要少量日本日月贝DNA，采取常规PCR手段即可进行性别鉴定，使用特异分子标记对日本日月贝性别鉴定的准确率达100％。

该方法可实现活体检测，通过获取日本日月贝少量鳃丝并提取DNA即可完成检测，不依赖组织和性腺发育程度，简单快速、稳定准确，该方法对于日本日月贝遗传育种工作的发展具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的日本日月贝鳃丝DNA电泳结果的示意图。其中个体编号1-12为雌性个体，个体编号13-24为雄性个体，M表示100bp DNA ladder。

图2为本发明实施例所提供的雌性特异性分子标记在日本日月贝中的遗传性别鉴定结果示意图。其中1-12为雌性个体，13-24为雄性个体，所有个体均能扩增出639bp的对照条带，所有雌性个体均能扩增出200bp的条带。M表示100bp DNA ladder。

图3为性腺尚未完全成熟的日本日月贝的遗传性别鉴定结果示意图。1-13号个体均为肉眼难以分辨性别的日本日月贝个体。其中，2、3、4、10、11、13号个体能扩增出长度为200bp的特异性条带，其它样品未能扩增出雌性特异性条带。

图4为性腺尚未完全成熟的日本日月贝样本的性腺组织学切片结果图。其中1、5、6、7、8、9、12号个体为雄性性腺，2、3、4、10、11、13号个体为雌性性腺；图中SC为精母细胞；SG为精原细胞；ST为精细胞。

具体实施方式

本发明在筛选获得了日本日月贝雌性特异性分子片段的基础上，针对雌性特异性DNA分子标记(SEQ ID NO:1)设计雌性特异性引物，再加上针对对照核苷酸序列(SEQ IDNO:4)设计的引物，联合使用来进行日本日月贝雌雄性别检测。

本发明的实施例中采用传统的酚氯仿抽提方法提取日本日月贝基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪进行检测。

为使本领域技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种日本日月贝性别特异性分子标记筛查方法，具体为：

采用传统酚氯仿法抽提一个雌性日本日月贝基因组DNA；通过纳米孔三代测序系统(ONT)进行测序，深度为100x；利用三代测序组装软件Canu进行基因组拼接，获得雌性日本日月贝的基因组；选取雌雄各20个个体进行重测序，测序深度为20x，使用bwa软件对clean reads同基因组进行mapping，统计各位点的覆盖深度，最终筛选获得雌性特异片段，其片段序列如SEQ ID NO:1。

选择了一段位于28S核糖体RNA基因上的核苷酸序列为雌雄共有分子标记作为对照，其片段序列如SEQ ID NO:4。

SEQ ID NO:1的序列信息如下：

CACTGCGTTTTGTGATTTCTGTGTGATGTGATCACTGTGTTATATGATCACTGTGTTTTGTGATCACTGTGTTATGTGATCAATGTGTTATATGATCATTGTGTTATGTGATCATTGTGTTATATTATCATTGTGCTACGTGATCATTGTGTTATATGATCAGTGTGTTTTGTGACCATTGTGTTTTGTGATCACTGTGT

SEQ ID NO:4的序列信息如下：

TCCTTGGAGTCGGGTTGTTTGGGAATGCAGCCCAAAGTTGGTGGTAAACTCCATCTAAGGCTAAATACTGACACGAGTCCGATAGCGGACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTGAAAAGAACTTTGAAGAGAGAGTTCAAGAGTACGTGAAACCGCTTAGAGGCAAACGGGTGGATCCGTAAAGTCGGCCCGGGGAATTCATCTTGCTGTCGGCGACGGGCACCTCGGTAGAGATCCCTTTCGGGGACTCTGCTGGTGCACGGGTGCTGCCGGCGAGTGCACTTTCCTCGGGCTGAGCGCCACGACCGGTTTCCTGGCGGTCATACGCTCCGCGAAAAGGTAGCTCCTGTCTCTCGAGGGAGGAGTGTTATAGATTGCGGTAGTTGTCTTGCCGGGAGACCGAGGGTCTCCAGCGCCTGCCGGCCCGAACTCGTGTGCGTTCGTTCAACTGGGGTAGACTGCTTGCAGTGTTCTCCGACCGCGAACGTATTTCGGGTACGCAGCCCGGCGGCGCGTTGGGTCAGTGGCGATTCGGTCGGCATTCCACCCGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACATGTGCGCAAGTCATGGGGTCGTACGAAACCTAAAGGCGTAATGAAAGTGAAGGCAGCC

引物合成：根据获得的雌性特异性片段设计雌性特异性引物AJ-1(用于检测序列为SEQ ID NO:1的片段，结合对照核苷酸(SEQ ID NO：4)设计引物Ref。具体序列见下表：

受检样品取材：采集雌性、雄性各12只。取材时性腺处于成熟期，通过肉眼观察性腺颜色可分辨性别。

DNA提取：采用传统酚氯仿法抽提日本日月贝鳃丝的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对抽提的DNA进行质量检测。

PCR扩增：利用上述引物对已知性别的日本日月贝基因组进行扩增。PCR反应体系为模板100ng；2×Taq PCR Master Mix 5μL；AJ-1上游引物(2μM)，1μL，AJ-1下游引物(2μM)，1μL；Ref上游引物(2μM)，0.5μL，Ref下游引物(2μM)，0.5μL；灭菌水补至10μl；所述PCR反应程序为95℃变性3min；95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃延伸10min；4℃保存PCR反应产物；

配制1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测对PCR反应产物进行电泳检测，电泳结果为如图2所示的两种：雌雄均扩增出639bp条带，说明PCR成功，左边扩增出长度为200bp特异性条带的为雌性个体，右边未扩增出长度为200bp特异性条带的为雄性个体，M表示100bp DNAladder。鉴定结果为24只日本日月贝中雄性个体和雌性个体各12只。PCR鉴定的性别与通过肉眼观察性腺颜色分辨的性别一致。

实施例2

为进一步验证本发明所述的雌性特异性分子标记鉴定性别的适用性和有效性，选取了13只性腺尚未完全成熟且肉眼无法鉴定性别的日本日月贝个体进行试验验证。

DNA提取：采用传统酚氯仿法抽提日本日月贝的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对抽提的DNA进行质量检测。

PCR扩增：利用AJ-1和Ref引物对上述13只日本日月贝基因组进行扩增。扩增步骤参照实施例1中记载的方法。

扩增结果检测及性别鉴定：配置1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，电泳结果为如图3所示：所有样品都能扩增出639bp的对照片段条带，说明PCR反应成功，2、3、4、10、11、13号个体能扩增出长度为200bp的特异性条带，判定为雌性个体，其它样品未能扩增出雌性特异性条带，判定为雄性个体。

性腺组织学判定：将上述13只日本日月贝性腺置于4％多聚甲醛中固定过夜，使用梯度甲醇进行脱水，二甲苯、石蜡透明透蜡，将组织进行石蜡包埋，使用切片机进行石蜡切片，用伊红/苏木精染色后，在显微镜下进行观察，判定日本日月贝的性别。根据切片结果显示的生殖细胞类型，1、5、6、7、8、9、12号个体为雄性性腺，如图4所示，2、3、4、10、11、13号个体为雌性性腺，如图4所示。

本实施例的分子鉴定结果和性腺组织学判定结果吻合，证明对于性腺尚未完全成熟的样品，本发明的雌性特异性分子标记可同样保证性别鉴定的有效性。因此，本发明的雌性特异性分子标记检测性别的方法不受性腺形态及发育时期等多种因素的限制，适用范围广，简单快速，稳定准确。

以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种日本日月贝遗传性别相关的DNA分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.一种雌雄日本日月贝共有的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.权利要求1所述DNA分子标记和/或权利要求2所述雌雄日本日月贝共有的分子标记在鉴定日本日月贝性别方面的应用。

4.一种鉴定日本日月贝性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

通过PCR反应检测权利要求1所述DNA分子标记和权利要求2所述雌雄日本日月贝共有的分子标记。

5.根据权利要求4所述的鉴定日本日月贝性别的方法，其特征在于，所述PCR反应中，用于扩增所述DNA分子标记的上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，用于扩增所述雌雄日本日月贝共有的分子标记的上下游引物分别如SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示。

6.根据权利要求3或权利要求4所述的鉴定日本日月贝性别的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)获得日本日月贝的基因组DNA；

2)以所得的基因组DNA为模板，使用针对SEQ ID NO：1所示序列设计的引物和针对SEQID NO：4所示序列设计的引物进行PCR反应；

3)对PCR反应产物进行电泳检测，若同时扩增出639bp和200bp条带，说明为雌性个体，若扩增出639bp，未扩增出200bp条带，则为雄性个体。

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