CN111088370A - 一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物、鉴别方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。还公开了利用上述引物进行卵形鲳鲹雌雄鉴别的方法以及上述引物或方法在制备用于鉴别卵形鲳鲹雌雄的试剂盒或生物制剂中的应用。该引物特异性好，该鉴别方法，操作方便，简单易行，鉴定成功率高，且实现对卵形鲳鲹活体没有伤害，可一次性快速批量准确鉴定卵形鲳鲹的性别，具有重要的科研价值和实际应用价值。

Description

一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物、鉴别方法及其应用

技术领域

本发明属于海洋经济鱼类遗传育种技术领域，具体涉及一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物、鉴别方法及其应用。

背景技术

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)，属鲈形目，鲹科，鲳鲹属，俗称金鲳、黄腊鲳、黄腊鲹，是国内近十几年来开发的一种优质养殖对象，是深远海养殖的最佳品种，目前国内的养殖产量已经超过10万吨。卵形鲳鲹雌雄个体在早期胚胎发育和幼鱼阶段并没有表现出形态学上的差异，从体型大小和生殖器的特征无法对其雌雄进行性别鉴定，性别只能通过解剖后分辨雌雄生殖器官进行鉴定。性别鉴定是遗传选育最关键的环节，无法活体鉴定卵形鲳鲹性别严重阻碍了遗传选育等育种工作的开展。

现有技术存在的问题是：

(1)通常在生产实践中，无法通过表型鉴定卵形鲳鲹性别。

(2)在科研工作中，可以通过外形观察和组织切片等方式对卵形鲳鲹的生理性别进行鉴定，但是需要解剖采集性腺组织，造成卵形鲳鲹的死亡。

(3)目前，没有通过生物技术手段进行活体性别鉴定的技术。

可以通过开发准确高效的性别特异性分子标记准确地鉴定卵形鲳鲹的性别，目前虽然性别特异性标记开发的技术方法很多，一些技术方法也均可以实现，不存在显著的技术障碍，但是不同物种性别决定区间和区间内雌雄差异各不相同，且鱼类生理性别通常受外界环境如温度、激素等影响。性别特异性行分子标的开发与所采用的卵形鲳鲹群体、测序技术、标记类型、参数设置等都有密切的关系。

因此，本发明拟对卵形鲳鲹雌雄性别特异性分子标记以及卵形鲳鲹雌雄鉴定方面进行深入研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物。

本发明的目的还在于提供一种卵形鲳鲹雌雄鉴别的方法。

本发明的最后一个目的在于提供上述引物或方法在在制备用于鉴别卵形鲳鲹雌雄的试剂盒或生物制剂中的应用。

本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的碱基序列如SEQ IDNO：1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

具体的：

正向引物为5’-ctccaacagctgcccaaac-3’。

反向引物为5’-ccacgatccgcacttacaac-3’。

本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种卵形鲳鲹雌雄鉴别的方法，包括以下步骤：提取待测卵形鲳鲹的基因组DNA，采用上述的引物进行PCR扩增，将扩增产物进行毛细管电泳检测扩增序列，其中雌性为10bp插入纯合，雄性为10bp缺失纯合或杂合。

本发明方法运用PCR技术扩增雌雄个体中性别特异的DNA片段，通过毛细管电泳鉴定扩增片段，从而达到区分雌雄性别的目的。

在上述卵形鲳鲹雌雄鉴别的方法中：

优选的，PCR扩增时采用的PCR反应体系为：20ng/μL DNA模板1.0μL，10×Taqbuffer(Mg²⁺free)2.5μL，浓度2.5mM dNTPs 2.0μL，浓度25mM MgCl₂ 1.5μL，10mM正向引物和反向引物各0.5μL，5U/μL Taq 0.1μL，ddH₂O补齐25.0μL。

优选的，PCR扩增时采用的PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸45sec，循环35次，72℃延伸10min。

优选的，毛细管电泳检测采用自动测序仪ABI 3730XL进行，此处仅为优选，其他型号的类似产品也可以适用，也可以是采用片段分型的办法，只要能检测到扩增序列即可。

本发明的上述第三个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的引物或方法在制备用于鉴别卵形鲳鲹雌雄的试剂盒或生物制剂中的应用。

因此，本发明卵形鲳鲹性别特异性标记的成功开发，突破了卵形鲳鲹活体鉴定性别的技术瓶颈，为卵形鲳鲹活体性别控制提供了工具。该技术的应用能够实现孵化早期对卵形鲳鲹苗种进行性别鉴定，提高培育效率、降低成本；能够实现对选育群体性别比例的控制，避免近交衰退；能够促进卵形鲳鲹性别决定、性别控制等研究工作的开展。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明提供的卵形鲳鲹性别鉴定分子标记和鉴定方法，操作方便，简单易行，鉴定成功率高。

(2)本发明提供的鉴定方法实现了对于活体卵形鲳鲹物无实质性伤害，可用于活体鉴别卵形鲳鲹性别，应用于活体性别的鉴定，突破了活体无法鉴定性别的技术瓶颈。

(3)本发明可一次性快速批量准确鉴定卵形鲳鲹的性别。

(4)本发明对于卵形鲳鲹性别决定、性别控制具有重要的科研价值和实际应用价值。

附图说明

图1为实施例1-2中卵形鲳鲹雌性个体毛细管电泳峰型。上：10bp缺失纯合峰型；中：10bp插入纯合峰型；下：杂合峰型。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

本实施例提供的卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物，该引物包括正向引物和反向引物，其中正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

具体的：

正向引物为5’-ctccaacagctgcccaaac-3’。

反向引物为5’-ccacgatccgcacttacaac-3’。

该引物的设计是基于以下的原理：

采集卵形鲳鲹1个全同胞家系，包含2个亲本和100个子代个体，解剖后鉴定生理学性别。利用高通量测序以卵形鲳鲹基因组序列为参考序列对亲本和子代进行标记开发，利用连锁分析定位性别数量性状位点，定位到单个区间。将区间内显著与性别连锁的插入缺失开发为性别特异性标记。

以下为卵形鲳鲹的基因组序列，其中下划线部分为本发明中所检测到的变异位点：

其中大写表示更可靠，小写表示是重复序列区域，N表示碱基未知。

为了验证该引物的准确性，本实施例通过以下的验证试验来进行进一步的说明，具体如下：

本实施例的实施对象是卵形鲳鲹，取48个雌性和48个雄性，通过解剖方法鉴别了雌雄性别，然后用本实施例中的引物来验证该引物的可行性。

(1)DNA的提取

从卵形鲳鲹活体上剪取约1平方厘米鳍条(该过程对于卵形鲳鲹活体无实质性伤害，采样后卵形鲳鲹个体重新放回后经观察可健康生长，下同)，保存于95％酒精，采样后卵形鲳鲹个体重新放回。利用DNA提取试剂盒或者酚仿法等提取组织DNA。

(2)卵形鲳鲹别特异性标记的扩增

以正向引物为5’-ctccaacagctgcccaaac-3’(SEQ ID NO：1所示)和反向引物为5’-ccacgatccgcacttacaac-3’(SEQ ID NO：2所示)为扩增引物，以提取的卵形鲳鲹DNA为模板，用普通的Taq酶进行扩增，得PCR扩增产物。

其中：

PCR的反应体系为：20ng/μL DNA模板1.0μL，10×Taq buffer(Mg²⁺free)2.5μL，浓度2.5mM dNTPs 2.0μL，浓度25mM MgCl2 1.5μL，10mM正向引物和反向引物各0.5μL，5U/μLTaq 0.1μL，ddH2O补齐25.0μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸45sec，循环35次，72℃延伸10min；

(3)性别特异性片段检测

将步骤(2)中的扩增产物利用正向引物在自动测序仪ABI 3730XL上进行碱基检测。

(4)性别判定

雌性个体的峰型为纯合10bp插入，雄性个体为杂合峰型或者纯合10bp缺失，如图1中所示。

48个雌性个体中检测到48个插入纯合峰型、0个杂合峰型、0个缺失纯合峰型，48个雄性个体中检测到4个纯合缺失峰型、1个纯合插入峰型、43个杂合峰型。雌雄鉴别的准确率为97.91％。

实施例2

本实施例提供的卵形鲳鲹雌雄鉴别的方法，包括以下步骤：提取待测卵形鲳鲹的基因组DNA，采用实施例1中的引物进行PCR扩增，将扩增产物进行毛细管电泳检测扩增序列，其中雌性为10bp插入纯合，雄性为10bp缺失纯合或杂合。

具体包括以下步骤：

(1)DNA的提取

选取112尾待测卵形鲳鲹(未知雌雄)，从活体上剪取约1平方厘米鳍条，保存于95％酒精，采样后卵形鲳鲹重新放回。利用DNA提取试剂盒或者酚仿法等提取组织DNA。

(2)卵形鲳鲹别特异性标记的扩增

以实施例1中的正向引物为5’-ctccaacagctgcccaaac-3’(SEQ ID NO：1所示)和实施例1中的反向引物为5’-ccacgatccgcacttacaac-3’(SEQ ID NO：2所示)为扩增引物，以提取的卵形鲳鲹DNA为模板，用普通的Taq酶进行扩增，得PCR扩增产物。

其中：

PCR的反应体系为：20ng/μL DNA模板1.0μL，10×Taq buffer(Mg²⁺free)2.5μL，浓度2.5mM dNTPs 2.0μL，浓度25mM MgCl2 1.5μL，10mM正向引物和反向引物各0.5μL，5U/μLTaq 0.1μL，ddH2O补齐25.0μL。

PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸45sec，循环35次，72℃延伸10min。

(3)性别特异性片段检测

将步骤(2)中的扩增产物利用正向引物在自动测序仪ABI 3730XL上进行碱基检测。

(4)性别判定

雌性个体的峰型为纯合10bp插入，雄性个体为杂合峰型或者纯合10bp缺失，如图1中所示。鉴定到55个纯合插入峰型、1个纯合缺失峰型、56个杂合峰型。

解剖检测生理性别为56个雌性、56个雄性。

通过对上述56个雌性样品和上述56个雄性样品的峰型进行分析发现，56个雌性中鉴定到3个杂合峰型，53个纯合插入峰型，56个雄性中鉴定到1纯合缺失峰型，2个纯合插入峰型，53个杂合峰标记，因此，56个雌性样品中有3个样品鉴定错误(3个杂合峰型)，56个雄性样品中有2个样品鉴定错误(其中的2个纯合插入峰型)，所以总计鉴定错误的样品有5个，鉴定准确性为95.54％。

因此，进一步的，可以将上述引物、方法制备试剂盒或生物制剂，用于鉴别卵形鲳鲹雌雄的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物、鉴别方法及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctccaacagc tgcccaaac 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccacgatccg cacttacaac 20

<210> 1

<211> 4024

<212> DNA

<213> 卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)

<400> 1

ggtcttaagt tgtgtgagca gatgttgact aagtagtaat tgaaagagga gaaattgttt 60

tcacctagtt ataataaatt gaaatgacat ttagtttttc ttggtcatca gttaccagtt 120

gttgcatgtt gagccaaccc tactgaactc agtgctgttt caatcatatt aatcagagaa 180

gaggaagtgc tgattaattg gcccgtagcc caactattcg tccatggaaa cttcccaaat 240

tgtgcaaaaa tgatcacaca agaataatgg tttggtataa acttatgaat ggctgtgaaa 300

aaactgacga ctgtgaagct cataatgctt ctttgtctct agagctgctc tctctcccct 360

gtggtggtgt tacatcattg attagagtct tggttctatt gattttgtgc tcataaatat 420

tcataaatat gaattaactt gtcctgaacc ataaaaaata atcgccttct tcttttaatc 480

tgagtgatat attttccttt gaggagcagt ctgtcttaat ctgtcctgtg gtcagccttg 540

ttcagtttat cagattagtt cttaatgggc ggaaccactt tattgactgt tgttactgac 600

agtgttttac caaacaacca aaggcagcaa actgcctttt ggctactgtt tttgtcatca 660

taaatccacc caggtgttct gaagttattg attattgatt ccctgatgct ttcatgtaat 720

caatctgctt ccacaaatcc tatttcctct tgatctgtgt cactggttta tgctgggtga 780

atagttcacg ccgagctgat aattaggacc acagctgagc taaaccaata tcatcaactg 840

aaccgctctt atccagtgca gttngttatg ctnctcccct cagaatatat agatctagca 900

gatactgttt ggttttacnt ggtatcngtg nngggggtgg ggtggagggt tgaagatcta 960

caatcagctc ctttccacca atgcaaacct cagtgctgct tctaggctgg tgctagtgca 1020

ggtttggagt tggtttaacg tgnaaccccc tcagatctgg attgcttttc cacgaaattg 1080

acagccacca cggaaccacg tcattacagc actgtacatg tttgtctctg gtttcccagc 1140

aacacaaggg ccaggcacaa caacaataca ctttacaagt gttgctcctg gctttgngag 1200

cctacattga catctaagta ttgaactgat tctgaacact tcaattttnn aaaaaaaatg 1260

ttggtcacaa agttttgtgt gtcctgttgg tgatgataat cctgccctca ttgttcctng 1320

ttgagagcca nttctttggc tggtttgaga nnaggcacca gctccaaacc ggttgttgaa 1380

ctgccttggt ggaaaagggg taaatgattc ccagggaaag cccttcaggg ctacgttcca 1440

tcatttaccc agagagcttc atttcatcca gagcttgaca agccacaatt tcaggcagca 1500

ggttagacct ccctgggtgt atgngtgtgt cttttgggct ttgtaatgct gaaatactcc 1560

atttagtagg actctatcca actcctacca gggatgacca cagcaaccca caggtctggt 1620

ggagtctccc tcgcttaaga cgtccaaaac ctccaccaca atctccagag ttgttttaca 1680

aaatgctgcc agaggatgcc atgatgtgta gcatccacag caccaaagcc ataggcaaca 1740

cactgtttct tgccaggact gttctcactg aggttggaat catgantcag tgctgacgct 1800

tgtgtaggct tggcccttaa gagcacaggg ccatgtcgga accctttccc tgtatgttta 1860

cagtcttcat tcaatgaaac tgctctccaa cagctgccca aacagtcaca ctgagctgaa 1920

tgcctccagt gttgggacag caaggcacta attttaggac aggacatccg tcattctctc 1980

ttctctccat gtttccactg aaactttatt caactttaaa ctttaacttt attcaacttt 2040

tatgtaatgt gaggtcacgt ttaccaataa actcccacca tggagtgttt ttgccctgcg 2100

cagttgtaag tgcggatcgt ggcaccgcag tgcatcctgt tactcctaac aaacaggtac 2160

agtcctgcta tgctgagagc gggtcccgtt aactgtcact gctgccctct gtcttcagag 2220

gtgtcacggt acgctggttt atatttggtt tccgttgcgt ctctgcctca ccacctccag 2280

gccacacatc tggtcttcag gccgacactg gctgagncca agcatttcct cctggttact 2340

cagcctccca ggagagctgn agngagagag agagaganag agagaangng ngngngngng 2400

nngnnngnng agagaganag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagta 2460

gacagaggga aagcgagagc ggaagtcagc cacggaacga acacatcacg gcatctttcc 2520

ctctttccct ccatgctctc tagtctggag tgattcatcc cttgcccgtc caaggggaga 2580

gcctttgcca gggctttgca tcgcacgcta tccttgttcc ttatcccacc gcccattaac 2640

tccattggaa agctattttt ctgtaaattg tcacgttttg tggaggatta ccccaaaata 2700

ttctaacttg atcaacctga cccattagtt tattgattct ccaataagtt tatatcatgg 2760

atttacagct ttgcagtcgt tgatgtgatt agtattgatt tgtcgttttc agtcatggct 2820

gtctgtctga attttcttct ctgggtctgt tggcttggct gaatcattta tagtttacag 2880

gcaggggtag ggaattaccg tacacacact tccattcaca agtcgctttc tgctgctgtt 2940

gagttattct tccccgtctg gtttgacatt tacagcacct ctccctgagt taaacattaa 3000

tcatatctca ttatccaaac cctcatcttt tcctcatatg cttcagagtc catctgcctt 3060

gtaaatataa caaagattcc ataccagcct ataaatttgt agttcatgtt ttctttgtta 3120

gttttgagcc atccaaaaag aagcagtaga ctgtttttac agagcgtggg ctatacatag 3180

gctagtttgc ccagtagtaa agtgtggtgt gtgaactntg aggggcccag agctgacctg 3240

gatagtgttt caggtaggcc aacacccccg agctgggccg ggacagccac aggagctggc 3300

tcaaggctgt ggctcacaga gacaacaagt caggccacag gggacacagt gatgcctcgt 3360

acaccaggga gtcaggccag cttgcacaca ggcaagctct gatgtctgat ggggttttcc 3420

aaagtctggt tgggaatcta aaggctggat ctctgtgaaa ggaaacatct tttcccatca 3480

tctgcttaac agggagtcct ggaatgaaaa gttcattgtt ccagccatga aatttgattt 3540

tatgtgtctg ccagtggcag ccccagttgt agtcagtcaa ggcacttact ccaatgtcta 3600

tacaaaacca agagggaatg cgatttgata tgactatctg gctancagtc aggataagta 3660

acttttatta tggctgtggt caccagataa tcttcctcag tacacctaca gtaacagcaa 3720

tttaccatca attgtgtttc tataaacatg tggatagaaa aactgtttcg agtgcaatca 3780

aaaagaccag gtttattttt aggttaacaa gcttcgcaga gaaatgactg atctgaataa 3840

aagcattttc ggggttttgt acgcaactac agcacaaaag aatcctctgt tccctactcc 3900

tatattaaat gagcctgttt tgcatgccat atttctcccc accagctcac ccctcgcaag 3960

tgagagccaa gcattacagg aacagagcag ctatgtgctg agactgccag gaacggctac 4020

atgc 4024

Claims (5)

1.一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物，其特征是所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种卵形鲳鲹雌雄鉴别的方法，其特征是包括以下步骤：提取待测卵形鲳鲹的基因组DNA，采用权利要求1中的引物进行PCR扩增，将扩增产物进行毛细管电泳检测扩增序列，其中雌性为10bp插入纯合，雄性为10bp缺失纯合或杂合。

3.根据权利要求2所述的卵形鲳鲹雌雄鉴别的方法，其特征是：PCR扩增时采用的PCR反应体系为：20ng/μL DNA模板1.0μL，10×Taq buffer(Mg²⁺free)2.5μL，浓度2.5mM dNTPs2.0μL，浓度25mM MgCl₂ 1.5μL，10mM正向引物和反向引物各0.5μL，5U/μL Taq 0.1μL，ddH₂O补齐25.0μL。

4.根据权利要求2所述的卵形鲳鲹雌雄鉴别的方法，其特征是：PCR扩增时采用的PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性10sec，55℃退火40sec，72℃延伸45sec，循环35次，72℃延伸10min。

5.权利要求1所述的引物或权利要求2-4任一项所述的方法在制备用于鉴别卵形鲳鲹雌雄的试剂盒或生物制剂中的应用。

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