CN114574594A - 加州鲈性别特异snp分子标记引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了加州鲈性别特异SNP分子标记引物及其应用。通过所述SNP分子标记区分样本属于纯合子(XX)或是杂合子(XY)，从而鉴别样本加州鲈的性别，其判断准确率为100％。还包括用于扩增上述SNP分子标记的引物对、试剂盒。另外还提供了供鉴别加州鲈性别的方法，包括步骤：(a)提取待测加州鲈的DNA；(b)以提取的DNA为样本，使用上述引物对或上述试剂盒进行扩增，得到扩增产物；(c)使用高分辨溶解曲线分析(Lightscanner)系统鉴别扩增产物的基因型，若扩增产物为纯合子即待测加州鲈为雌性，若扩增产物为杂合子即待测加州鲈为雄性。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及加州鲈性别特异SNP分子标记引 物及其应用。
背景技术
水产养殖和野外调查发现，许多鱼类的雌雄个体间存在显著差异，如在鲤鱼(Cyprinus carpio)、虹鳟和半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)等鱼类中，卵巢成熟 比精巢晚，性成熟期间大部分营养物质转化为身体的增长，因而雌性个体比雄性 大；相反，尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco) 和斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)等鱼类的精巢成熟比卵巢晚，雄性生长速率比 雌性快，因而雄性个体大。鱼类养殖生产中单性苗养殖具有规格整齐，降低繁殖 耗能等优势，是当前养殖新品种开发的热点。开发和获得性别特异的分子标记是 培育单性苗的必要前提。
随着测序费用的不断降低，通过全基因组测序(WGS)、简化基因组测序 (RAD-seq)等高通量测序技术大大加快了性别连锁标记研究的步伐。已有多种 鱼类的性别特异分子标记被开发出来，如黄颡鱼，鳜鱼，江黄颡鱼，乌鳢等。
加州鲈(Micropterus salmoides)养殖过程中存在大吃小的现象，雌雄个体 存在一定的生长差异，同时雌鱼由于繁殖耗能，生长降低速度降低，淘汰增加， 影响养殖效益。培育单性加州鲈苗种将可以很好的解决这些问题，具有重要的经 济效益。目前，国内外还没有加州鲈性别特异分子标记的报道。因此开发加州鲈 性别特异的分子标记对于培育单性加州鲈苗具有重要的生产应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供加州鲈性别特异SNP分子标记引物及其应用，以解决 现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条 件。
本发明的第一方面在于提供一种用于扩增上述SNP分子标记的引物对。所 述引物对包括：
上游引物：5’-GAGAAGTCAGAGACGATCAG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-TCCTCGAACTCTATGGTGCT-3’(SEQ ID NO.2)。
本发明的第二方面在于提供上述引物对的应用。所述引物对可用于：(1)鉴 定或辅助鉴定大口黑鲈遗传性别/(2)大口黑鲈辅助育种/(3)制备用于鉴定或 辅助鉴定大口黑鲈遗传性别的产品/(4)制备用于大口黑鲈辅助育种的产品。
本发明的第三方面在于提供一种试剂盒，其包含上述引物对。
优选地，所述试剂盒还包括：含有镁离子的10×buffe、LC Green饱和荧 光染料、dNTP、Taq酶。
本发明的第六方面在于提供上述试剂盒的应用。所述试剂盒可用于：(1)鉴 定或辅助鉴定大口黑鲈遗传性别/(2)大口黑鲈辅助育种/(3)制备用于鉴定或 辅助鉴定大口黑鲈遗传性别的产品/(4)制备用于大口黑鲈辅助育种的产品。
本发明的第七方面在于提供鉴别加州鲈性别的方法，包括步骤：
(a)提取待测加州鲈的DNA；
(b)以提取的DNA为样本，使用上述引物对或上述试剂盒进行扩增，得 到扩增产物；
(c)使用高分辨溶解曲线分析(Lightscanner)系统鉴别扩增产物的基因型。
进一步，若扩增产物的序列是如SEQ ID NO.3所示的纯合子，即待测加州 鲈为雌性；若扩增产物的序列是如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的杂合子， 即待测加州鲈为雄性。
所述步骤(a)中的DNA提取方法，可以选择chelex100煮沸法或其他等效 的提取方法。chelex100煮沸法具体包括：
(a-1)配置5％chelex100溶液；
(a-2)取5mg尾鳍组织置于0.2mL PCR管中，震荡chelex100溶液使树脂 颗粒均匀悬浮在溶液中，用扩口吸头吸取150uL至装有尾鳍组织的PCR管中；
(a-3)往PCR管中加入5uL 20mg/mL蛋白酶K溶液，震荡混匀，放置于 PCR仪上，设定条件热盖105℃，模块55℃，40min；98℃，5min；
(a-4)反应结束后立即拿出，涡旋振荡3次，每次5s；
(a-5)将PCR管放入离心机中，4000rpm离心5min；
(a-6)得到的上清即为提取的DNA溶液。
所述步骤(b)的扩增体系包括：
扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s， 40个循环；72℃终延伸5min。12℃条件保存。
所述步骤(c)使用Lightscanner系统进行鉴别，具体步骤包括：将扩增产 物滴入样品孔，悬空滴加液体石蜡，放入HRM仪器板槽中，设置起始扫描温度 68℃，终止扫描温度94℃，开始扫描；扫描结束后，选择Small Amplicon模式 进行分析，点击New subset选择需要分析的样品孔，归为一组；点击Normalize 调整分析分温度区间；点击Grouping-Autogroup进行选定样本的分组，得到分 离曲线。
本发明提供的鉴别加州鲈性别的方法，能够适用常规的DNA提取方法和 PCR扩增技术，并通过Lightscanner系统能够实现高通量检测判断加州鲈样本性 别，具有快速、批量、高效的优点。
附图说明
图1是实施例3中对96个加州鲈样本的标准化溶解曲线图，图中深色曲线 为各个纯合子样本(XX)的集合，图中浅色曲线为各个杂合子样本(XY)的集 合；
图2是实施例3中对96个加州鲈样本的基因型视觉总结图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描 述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获 得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，加州鲈性别特异SNP分子标记的获得
1)在繁殖季节通过解剖观察性腺的方式鉴定出加州鲈雌鱼和雄鱼各24尾， 剪取尾鳍并提取其全基因组DNA。
2)将16尾雌性加州鲈DNA等量混合为雌性混合池，16尾雄性加州鲈DNA等 量混合为雄性混合池。
将雌性混合池、雄性混合池以及剩下的8尾雌性和8尾雄性样品共18个样品， 在Illumina Hiseq X Ten平台进行全基因组测序。将原始数据过滤后的所有clean reads从5’端开始逐一进行AC、AG、AT、GA、GC和GT六种碱基起始的60bp片 段化电子酶切，起始碱基不符合要求则向后位移。8尾雌性和8尾雄性样品的clean reads同样按照这个方法进行60bp片段化的酶切。
3)雌性混合池、雄性混合池间的片段化数据进行比对，获得两混合池特有 的片段以及共有的片段。在两混合池特有片段中，查看是否在8尾雌性和8尾雄性 片段化的数据中出现。结果发现仅来源于8尾雄性的片段远多于8尾雌性的片段， 以此判断加州鲈为XX/XY性别决定类型。
4)接下来从一条测序的雄鱼clean data数据中，调出所有仅来源于8尾雄性片 段的reads序列，采用Velvet软件组装为雄性特异的Contigs。将这些Contigs与雌性 混合池的60bp片段进行比对。挑出含有SNPs的候选Contigs。
5)将这些候选Contigs与8尾雌性和8尾雄性样品的clean reads比对。使用IGV 软件，进行可视化Manual check。判断SNPs位点在8尾雄鱼中是否都是杂合的， 在8尾雌鱼中是否都是纯合的。如果是则在SNPs的左右两侧设计共有引物，进行 有效性验证，最终获得含有效区分雌雄个体的SNP分子标记序列，其核苷酸序列 为：
5’-GAGAAGTCAGAGACGATCAGAGAGACTTCCTGAATAAAAGGATAAGG GGAAGACCAAGAAGCACAAATGTCTTCCACTGTCAATCCCTTGTGCAGCA CCATAGAGTTCGAGGA-3’(SEQ ID NO.3)，以及
5’-GAGAAGTCAGAGACGATCAGAGAGACTTCCTGAATAAAAGGATAAGG GGAAGACCAAGAAGCACAAATGTCTTCCACTCTCAATCCCTTGTGCAGCA CCATAGAGTTCGAGGA-3’(SEQ ID NO.4)。
因此，可针对加州鲈中包含SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示序列的核苷酸序列设计引物进行加州鲈性别鉴定。
实施例2，加州鲈性别特异SNP分子标记在鉴定中的应用过程
1)根据SEQ ID NO.3所示序列设计出上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ IDNO.2。
2)基因组DNA提取(chelex100煮沸法)
配置5％chelex100溶液；取5mg尾鳍组织置于0.2mLPCR管中，震荡chelex100 溶液使树脂颗粒均匀悬浮在溶液中，用扩口吸头吸取150uL至装有尾鳍组织的 PCR管中；往PCR管中加入5uL 20mg/mL蛋白酶K溶液，震荡混匀，放置于PCR 仪上，设定条件热盖105℃，模块55℃，40min；98℃，5min；反应结束后立即 拿出，涡旋振荡3次，每次5s；将PCR管放入离心机中，4000rpm离心5min；得到 的上清即为DNA溶液，可直接用于PCR扩增。
3)PCR扩增
扩增体系包括：
扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸25s， 40个循环；72℃终延伸5min。12℃条件保存。
4)使用Lightscanner系统进行鉴别，具体步骤包括：将扩增产物滴入样品孔， 悬空滴加液体石蜡，放入HRM仪器板槽中，设置起始扫描温度68℃，终止扫描 温度94℃，开始扫描；扫描结束后，选择Small Amplicon模式进行分析，点击New subset选择需要分析的样品孔，归为一组；点击Normalize调整分析分温度区间； 点击Grouping-Auto group进行选定样本的分组，得到分离曲线。
实施例3，加州鲈性别特异SNP分子标记稳定性检测
1)从市场随机收集加州鲈鱼体，给予编号1-96，通过解剖确定鱼体性别，雌 鱼54尾，雄鱼42尾，采集鳍条组织样本保存于96孔板中冷冻保存。
2)按实施例2提供的应用过程进行HRM分型。
HRM分型结果如图1和图2所示。图1中深色的曲线代表检出的SNP位点为杂 合子的样本，因此判断为雄性(XY)；浅色曲线代表检出的SNP位点为纯合子 的样本，因此判断为雌性(XX)。图2针对96孔板的检测结果，图中两个“S” 标记是软件自动选取的标准曲线参照，其中深色块代表检出杂合子的样本，浅色 块代表检出纯合子的样本，白色块为样品明显扩增异常而剔除掉的样品；检出杂 合子的样本40个，纯合子样本54个。利用本发明提供的SNP标记进行鉴定，对于 雌性加州鲈的检测结果与已知结果完全一致，鉴定的准确率达到了100％；对于 雄性加州鲈的检测结果与已知结果高度接近，鉴定准确率为95.24％。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而 且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发 明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性 的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要 求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山市南海百容水产良种有限公司;荆州百容水产良种有限公司;海南百容水产良种有限公司
<120> 加州鲈性别特异SNP分子标记引物及其应用
<130> 2022
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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<210> 3
<211> 113
<212> DNA
<213> Micropterus salmoides
<400> 3
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<210> 4
<211> 113
<212> DNA
<213> Micropterus salmoides
<400> 4
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gcacaaatgt cttccactct caatcccttg tgcagcacca tagagttcga gga 113
Claims (7)
1.引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
2.权利要求1所述引物对在鉴定或辅助鉴定加州鲈遗传性别、加州鲈辅助育种、制备用于鉴定或辅助鉴定加州鲈遗传性别的产品、制备用于加州鲈辅助育种的产品中的应用。
3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，还包括含有镁离子的10×buffe、LC Green饱和荧光染料、dNTP、Taq酶。
5.权利要求3或4所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定加州鲈遗传性别、加州鲈辅助育种、制备用于鉴定或辅助鉴定加州鲈遗传性别的产品、制备用于加州鲈辅助育种的产品中的应用。
6.一种鉴别加州鲈性别的方法，其特征在于，包括步骤：
提取待测加州鲈的DNA；
以提取的DNA为样本，使用如权利要求1所述引物对或权利要求3至4任一项所述试剂盒进行扩增，得到扩增产物；
使用高分辨溶解曲线分析系统鉴别扩增产物的基因型，从而判断加州鲈的性别。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述扩增产物的第79位若为纯合子即待测加州鲈为雌性，若为杂合子即待测加州鲈为雄性。
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