CN116904474A - 一种斑鳜雄性性别特异性分子标记和遗传性别鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种斑鳜雄性性别特异性分子标记和遗传性别鉴定方法，属于动物分子遗传学领域。本发明公开了一段雄性斑鳜序列，利用该序列可以进行斑鳜的雌雄鉴定。利用本序列对应的引物对待测斑鳜进行PCR扩增，当扩增结果片段为606bp或者扩增结果的序列为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列时，则待测斑鳜为雄性，否则为雌性。进一步，本发明提供了一段斑鳜内参序列进行配合斑鳜特异的DNA片段。本发明提供的斑鳜序列片段可以快速有效鉴定斑鳜雌雄。利用本方法可以有效提高斑鳜养殖效率，进一步提高斑鳜养殖合理性，人为调节养殖斑鳜雌雄比例，更为合理的利用养殖斑鳜的人力、物力和财力。
Description
技术领域
本发明涉及一种斑鳜雄性性别特异性分子标记和遗传性别鉴定方法，属于动物分子遗传学领域。
背景技术
斑鳜属鲈形目，班鳜种。俗称肉鳜、褐鳜、玉鳜、岩鳜等，其体圆桶形，修长，头部具暗黑色不规则的小圆斑，体侧有较多不规则的环形斑，体黄褐色及至灰褐色，腹部黄白，与全国广泛养殖的翘嘴鳜、大眼鳜虽同属鳜，但有明显的区别。
斑鳜的肉质同广泛养殖的鳜一样，肉质细腻、嫩滑、结实，规格在250克/尾左右的商品鱼出口价格在300元/千克左右，国内市场价格180元/千克左右，属高档经济鱼类之一，市场上供不应求，而广泛养殖的翘嘴鳜市场价格在24-50元/千克左右，且随市场供求价格波动较大，故斑鳜作为养殖鳜类的替代品，前景广阔。由于斑鳜人工繁育时孵化率较低，未形成较大规模的苗种生产能力。现在所养殖的一小部分来源于人工繁育的苗种，绝大部分来源于野生苗种。所以斑鳜的繁殖生物学研究亟待进行。
通过斑鳜的外观不能进行斑鳜的性别鉴定，这对斑鳜的养殖和繁殖增加了较大的困难。性别特异分子标记的开发应用和性别决定基因的鉴定一方面可以提高与性别相关的经济性状，为实现性控育种提供必要的工具；另一方面也为阐明鱼类性别决定的分子机理奠定基础。性别分子标记是开发性别控制技术的重要工具。
发明内容
本发明的目的是提供一种斑鳜雄性性别特异性分子标记和遗传性别鉴定方法。
一种斑鳜雄性性别特异性的DNA片段，雄性斑鳜特异的片段为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列。SEQ ID NO:1具体片段为：AGGAAGTTTCACCCTTAGTTAGCACTTCTTTACTGGATATTTCTATCTAAGATCCTTGAGAAAGCAGTTGCCAATCGGTTATGTGACTTTCTACGTAACAATAGTTTATTTGAGGATTCAGGATTTAGCGTACATCATAGCACGGAGACAGCACTGGTGAAAATTACAAATGACCTTTTAATTGCATCAGACAATGGACTTGTCTCTGTACTTGTCTTGTTAGATCTTAGTGCTGCATTCGACAGCATTGACCATCACATCCTATTACAGAGACTGGAACATTCAATTAGCATTATAGGAACTGCACTAAGCTGGTTTGAATCCTATCCATCAGATAGATCTCACTTTGTACATGTAAATTTCCCCCACATGCCGCTGCTGGGCAGCTGGGGAGCAGAAGGCATGTTAGGTGTCTAGTACCACCCAATGGTCACAGCCTAGATGACACACAGGCAATAATTTCAAAAGAAAACAACAGTCTCTTGACATCTTGTCATGTCTGTAAGCCAAAATGAACCCCTTTATCCATAGCCCCTCAGCCTTGCTAGATGGGCCTTTTTGTCATTTGTTTGTGGGGACATATACCCATACTCGTGCGTCAACCTA。
一种雌雄斑鳜鉴定的DNA片段组合，其特征在于，所述DNA片段组合为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和 SEQ ID NO:2为所示核苷酸序列。SEQ ID NO:2具体片段为GGACCCGTAACCCAATCCCTGACCAGCTTCCTAGTCCATTTCCGAGAGGTGTTCGGGAGGCCAGCAGGTGATACATCCGCCGGCGAGCAGCTCTATCAGCTCAAACAAGGTCAGCGCTCCGTCCAGGACTACGCCTTGGAGTTCCGAACCATCGCCACAGCTAGCGGCTGGAACGAGCAATCTCTCATCACCACCTTCTGTCAGGGATTGGAGCCCAGGGTAAGACTGCATCTCGCCGCATACGATG。
所述SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或所述片段组合应用于鉴定斑鳜的性别。
一种鉴定斑鳜性别的引物组合，包括用于斑鳜雌雄鉴定的两对引物：
QZG5F：为SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；TAGGTTGACGCACGAGTA
QZG5R：为SEQ ID NO:4所示核苷酸序列；AGGAAGTTTCACCCTTAGTT
QZG31F：为SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；CATCGTATGCGGCGAGA
QZG31R ：为SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；GGACCCGTAACCCAATC;
QZG5F、 QZG5R序列为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列引物，利用该引物在雄性斑鳜可扩出阳性片段，但在雌性斑鳜上扩不出阳性片段；
QZG31F、QZG31R序列为SEQ ID NO:2所示核苷酸序列引物，利用该引物在雌性和雄性斑鳜上均可扩出阳性片段。
权利要求4所述的引物组合在斑鳜性别鉴定中应用。
一种斑鳜雄性性别的鉴定方法，对待测斑鳜的基因组DNA进行PCR扩增，当扩增结果为606bp和247bp，或者扩增结果的序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，则所测斑鳜性别为雄性；当扩增结果仅为247bp，或者扩增结果的序列仅为SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，则所测斑鳜性别为雌性。
优选地，所述鉴定斑鳜雌雄的具体方法为：提取待鉴定斑鳜DNA；利用权利要求4所示的引物组合对待测样品进行PCR扩增；把PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳30分钟进行分离，电压为120V；根据分离结果统计PCR扩增产物的条带大小。
进一步优选地，PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，MgCl23ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水10.5ul。
进一步优选地，PCR扩增程序为： 94℃预变性3min; 94℃变性10s，退火温度复性10s，72℃延伸30s，35个循环； 72℃延伸10min； 4℃保存。
使用本发明提供的序列可以准确鉴定斑鳜雌雄，实施例进行了验证，与实际结果完全一致，准确度100%。
与现有技术相比，本发明具有以下的优点：
利用本发明可以快速准确的鉴定斑鳜性别。利用本发明可以实现斑鳜全雌化养殖，节省了养殖空间，合理利用斑鳜养殖的人力、物力和财力。本方法可以无损伤鉴定斑鳜的性别，传统鉴定斑鳜性别的方法为等斑鳜性成熟后才能鉴定，本技术的突破无疑是斑鳜人工繁殖的巨大创新。本方法避免了科研人员在实验操作过程出现的各种失误对实验结果造成误读的现象，比如提取DNA失败、加错样品或者药剂都不会对本方法的实验结果造成偏差。
附图说明
图1为斑鳜性别鉴定图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和有点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
提取待鉴定斑鳜DNA
取已知性别的12尾雄性斑鳜和12尾雌性斑鳜。对这24尾斑鳜进行提取DNA，具体提取法方法为：
(1)取出保存的鳍条样本，剪取0.5 g左右，放入2mL的灭菌离心管中，加入1×TE无菌缓冲液，4℃浸泡12 h；
(2)取出鳍条组织，放入含有350ul的无菌抽提缓冲液中，轻轻混匀，加入40ul 20%SDS和10ul 20 mg/mL蛋白酶K (终浓度为400ug／mL)，混匀；
(3)56℃孵育4 h，每隔半小时轻轻摇晃离心管以利消化。若组织不易消化，可延长孵育时间至8 h，或37℃消化过夜：
(4)待组织消化完全，取出离心管，加入300ul 6 M NaCI溶液，立刻剧烈震动30 S；
(5)12000 rpm离心10 min;
(6)弃沉淀，将上清液倒入新的离心管中，再以同等条件离心一次，取上清液，加入等体积的预冷异丙醇，．20℃放置1 h以上；
(7)4℃，12000 rpm离心15 min；
(8)弃上清液，沉淀用70％乙醇溶液洗涤一次，37℃烘干或自然晾干；
(9)加入50ul灭菌双蒸水溶解DNA，待完全溶解后稀释成100 ng/uL，置于4℃冰箱保存备用。
(10)用1%琼脂糖凝胶鉴定提取的DNA完整度，所用Marker为DL1000。
实施例2鉴定斑鳜的性别
利用本发明提供的引物组对这实施例1的24尾斑鳜DNA进行PCR反应。PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，MgCl23ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水10.5ul。PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min; 94℃变性10s，退火温度复性10s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。然后在1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，电压为100V。在照胶仪上观察结果，具体结果如图1所示，由图1可知，12尾雄性斑鳜均有两个条带，12尾雌性斑鳜均有一个条带。经过本方法鉴定24尾斑鳜有12尾为雄性，12尾为雌性。其结果和采样记录的结果一致。所以本发明能够准确进行斑鳜的性别鉴定。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种斑鳜雄性性别特异性的DNA片段，其特征在于，雄性斑鳜特异的片段为SEQ IDNO:1所示核苷酸序列。
2.一种雌雄斑鳜鉴定的DNA片段组合，其特征在于，所述DNA片段组合为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和 SEQ ID NO:2为所示核苷酸序列。
3.权利要求1中所述SEQ ID NO:1所示核苷酸序列或权利要求2中所述片段组合应用于鉴定斑鳜的性别。
4.一种鉴定斑鳜性别的引物组合，其特征在于，包括用于斑鳜雌雄鉴定的两对引物：
QZG5F：为SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；
QZG5R：为SEQ ID NO:4所示核苷酸序列；
QZG31F：为SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；
QZG31R ：为SEQ ID NO:6所示核苷酸序列；
QZG5F、 QZG5R序列为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列引物，利用该引物在雄性斑鳜可扩出阳性片段，但在雌性斑鳜上扩不出阳性片段；
QZG31F、QZG31R序列为SEQ ID NO:2所示核苷酸序列引物，利用该引物在雌性和雄性斑鳜上均可扩出阳性片段。
5.权利要求4所述的引物组合在斑鳜性别鉴定中应用。
6.一种斑鳜雄性性别的鉴定方法，其特征在于，对待测斑鳜的基因组DNA进行PCR扩增，当扩增结果为606bp和247bp，或者扩增结果的序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，则所测斑鳜性别为雄性；当扩增结果仅为247bp，或者扩增结果的序列仅为SEQ IDNO:2所示核苷酸序列，则所测斑鳜性别为雌性。
7.根据权利要求6所述斑鳜雄性性别的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定斑鳜雌雄的具体方法为：提取待鉴定斑鳜DNA；利用权利要求4所示的引物组合对待测样品进行PCR扩增；把PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上进行电泳30分钟进行分离，电压为120V；根据分离结果统计PCR扩增产物的条带大小。
8.根据权利要求7的斑鳜雄性性别的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增体系是25ul：10×PCR Buffer 3ul，2.5mmol/L dNTP 2ul，MgCl2 3ul，上下游引物各1ul，Taq酶0.5ul，DNA模板2ul，超纯水10.5ul。
9.根据权利要求7的斑鳜雄性性别的鉴定方法，其特征在于，PCR扩增程序为： 94℃预变性3min; 94℃变性10s，退火温度复性10s，72℃延伸30s，35个循环； 72℃延伸10min； 4℃保存。
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| WO2016180009A1 (zh) * | 2015-05-14 | 2016-11-17 | 中国科学院海洋研究所 | 一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的dna探针序列及获取方法 |
| CN110777210A (zh) * | 2019-11-12 | 2020-02-11 | 中山大学 | 翘嘴鳜雄性分子标记引物及其应用 |
| CN112359104A (zh) * | 2020-12-10 | 2021-02-12 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种鳜性别特异标记的开发方法与应用 |
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| CN115896298A (zh) * | 2022-08-02 | 2023-04-04 | 中山大学 | 翘嘴鳜x染色体分子标记引物及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHONG HAN ET AL.: ""Screening and characterization of sex-specific markers developed by a simple NGS method in mandarin fish (Siniperca chuatsi)"", 《AQUACULTURE》, vol. 527, pages 1 - 7 * |
| 周云红等: ""鳜雌雄表型差异及性别相关标记筛选"", 《安徽农业大学学报》, vol. 47, no. 1, pages 30 - 35 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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