CN116656735A - 一种鸡cyp19a1基因可诱导敲除系统及其构建方法和应用 - Google Patents
一种鸡cyp19a1基因可诱导敲除系统及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统及其构建方法和应用，属于基因编辑技术领域。本发明的鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统，包括TRE‑CAS9‑rtTA‑Puro载体和sgRNA‑sy004载体。本发明将由TRE‑CAS9‑rtTA‑Puro载体和sgRNA‑sy004载体组成的鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统转染入待敲除细胞中，能够在Dox的作用下，诱导CAS9表达，以此控制鸡CYP19A1基因敲除程度，避免基因过度敲除，无法控制激素水平，影响鸡体存活。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统及其构建方法和应用。
背景技术
CYP19A1基因编码的芳香化酶能够将雄激素转换为雌激素，是维持内分泌和正常生命活动的重要因子。在鸡体方面，干扰CYP19A1基因表达能够导致性别表型出现逆转，在鸡性别分化和激素调控中十分重要。目前，CAS9基因编辑被广泛应用于相关研究，但是使用CAS9来进行基因编辑会存在以下问题：CAS9长时间表达会增加脱靶的几率，脱靶效应会影响研究的准确性，同时在体内持续的表达会导致CYP19A1基因的功能区域被敲除而失去活性，敲除后CYP19A1编码的芳香化酶无法表达，导致其下游产物雌激素分泌被阻断，进而影响细胞或者个体的正常代谢和存活。
而Tet-On系统通过TRE启动子调节CAS9或sgRNA的表达以产生可诱导的CRISPR/CAS9系统。Federico等将CAS9蛋白连入Tet-On系统TRE启动子之后，在hPSC中开发了iCRISPR系统，能够快速高效地生成用于功能丧失研究的双等位基因敲除hPSC，以及用于精确建模疾病状况的具有特定核苷酸改变的纯合敲入hPSC。Lukas将Tet-On系统与CRISPR/CAS9系统结合在小鼠上建立诱导型CRISPR(iCRISPR)，该系统可以有效地用于在多个目标基因座中产生双等位基因突变。Tet-On诱导的CRISPR/CAS9系统，构建简单，经过对Tet-On优化后，背景值低，并且是可逆的，是诱导CAS9表达的最佳系统。因此，为了进一步研究鸡CYP19A1的功能和应用前景，我们通过Tet-On系统来结合CAS9系统建立了一种能够通过调控CAS9蛋白的表达水平，进而达到调控鸡CYP19A1基因敲除水平的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统及其构建方法和应用。本发明将由TRE-CAS9-rtTA-Puro载体和sgRNA-sy004载体组成的鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统转染入待敲除细胞中，能够在Dox的作用下，诱导CAS9表达，以此控制鸡CYP19A1基因敲除程度，避免基因过度敲除，无法控制激素水平，影响鸡体存活。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统，所述系统包括TRE-CAS9-rtTA-Puro载体和sgRNA-sy004载体。
本发明还提供了一种上述系统的构建方法，包括如下步骤：
(1)设计并扩增Puro-rtTA元件和CAS9元件，将所述Puro-rtTA元件、所述CAS9元件与TRE-tight载体连接，得到TRE-CAS9-rtTA-Puro载体；
(2)设计得到鸡CYP19A1的sgRNA，将所述sgRNA与sy004载体连接，得到sgRNA-sy004载体。
优选的，所述Puro-rtTA元件的扩增方法为：以VK001-08载体为模板，扩增得到Puro元件，将Puro元件与pTet-on-Advanced载体连接，得到pTet-on-Advanced-Puro载体；以pTet-on-Advanced-Puro载体为模板，扩增得到Puro-rtTA元件。
优选的，所述Puro元件的扩增引物包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
优选的，所述Puro-rtTA元件的扩增引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
优选的，所述CAS9元件的扩增方法为：以VK001-08载体为模板，扩增得到所述CAS9元件。
优选的，所述CAS9元件的扩增引物包括SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
优选的，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明还提供了一种上述系统在制备敲除鸡CYP19A1基因的试剂中的应用，将所述试剂转染入待敲除细胞中，通过添加Dox诱导鸡CYP19A1基因敲除。
本发明提供了一种鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统及其构建方法和应用。本发明将VK001-8载体中的Puro元件添加入pTet-on-Advanced载体中，得到pTet-on-Advanced-Puro载体；从VK001-8载体中扩增的CAS9元件和从pTet-on-Advanced-Puro载体中扩增出的Puro-rtTA元件共同连接至TRE-tight载体中，构建成可诱导的敲除载体TRE-CAS9-rtTA-Puro；并将单个的sgRNA连入sy004载体，构建成sgRNA-sy004载体。将由TRE-CAS9-rtTA-Puro载体和sgRNA-sy004载体组成的鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统转染入待敲除细胞中，能够在Dox的作用下，诱导CAS9表达，逐渐敲除鸡CYP19A1基因，以达到对鸡CYP19A1基因敲除程度的精准控制，排除sgRNA的干扰。
附图说明
图1为实施例1构建成功的质粒图谱及测序峰图
图2为实施例2转染后的DF-1细胞在不同浓度Dox溶液诱导后的明场暗场荧光图。
图3为实施例2转染后的DF-1细胞在不同浓度Dox溶液诱导后的CAS9蛋白的表达情况图。
图4为实施例2转染后的DF-1细胞在不同浓度Dox溶液诱导后的T7E1检测结果图。
图5为实施例2转染后的DF-1细胞在20ug/mL浓度Dox溶液诱导后的测序结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统，具体构建过程如下：
1、TRE-CAS9-rtTA-Puro载体的构建
(1)在pTet-on-Advanced中加入Puro元件
根据VK001-08载体(购自北京唯尚立德生物科技有限公司)中Puro元件的序列，设计引物Puro-F和Puro-R(序列参见表1)，并引入酶切位点EcoRI以及XbaI，按照表2所示的扩增体系和表3所示的扩增程序，以VK001-08载体为模板扩增出含有酶切位点的Puro元件。
表1 Puro-F和Puro-R引物序列
注：GAATTC为EcoRI，TCTAGA为XbaI
表2 Puro元件扩增体系
| 成分 | 用量 |
| 2×Primer Star Max | 10μL |
| 上游引物 | 1μL(10μM) |
| 下游引物 | 1μL(10μM) |
| 基因组模板 | 1μL(150ng/μL) |
| ddH2O | 7μL |
表3 Puro元件扩增程序
将扩增后的PCR产物，经过琼脂糖凝胶电泳后，使用天根纯化回收试剂盒进行胶回收。将回收后的产物连接在擎科T载体上，经测序验证扩增成功。将验证成功的Puro元件，和pTet-on-Advanced(购自重庆优宝生物技术股份有限公司)进行双酶切，酶切体系如表4所示，于37℃酶切1h，然后用T4连接酶在16℃下，过夜连接16h，得到pTet-on-Advanced-Puro载体。
表4载体/片段酶切体系
连接后将连接产物转化至感受态DH5α细胞中(购自北京擎科生物科技有限公司)，5min冰上冷激，42℃水浴45s热激，2min冰上冷激后，加入200μl无抗性的LB培养基，吹打混匀取100μl，涂抹于含有氨苄抗性的固体培养基平板上37℃过夜后，挑菌测序，将测序正确的细胞使用天根无内毒素质粒大提试剂盒提取载体，将载体于-20℃保存。
(2)将CAS9元件及Puro-rtTA元件共同连入TRE-tight载体
根据步骤(1)连接的pTet-on-Advanced-Puro载体中Puro-rtTA元件的序列设计引物Puro+rtTA-F和Puro+rtTA-R，根据VK001-08载体中CAS9元件设计引物CAS9-F和CAS9-R，并引入酶切位点KpnI、NotI及PciI。序列参见表5。
表5引物序列
注：GGTACC为KpnI，GCGGCCGC为NotI，ACATGT为PciI
按照步骤(1)中表2所示的扩增体系和表3所示的扩增程序，以pTet-on-Advanced-Puro载体为模板扩增出含酶切位点的Puro-rtTA元件；以VK001-08质粒为模板扩增出含有酶切位点的CAS9元件。按照表6所示的酶切体系对Puro-rtTA元件、CAS9元件和TRE-tight载体(购自广州优宝生物科技有限公司)进行酶切，于37℃酶切1h，然后用T4连接酶在16℃下，过夜连接16h，得到TRE-CAS9-rtTA-Puro载体。
表6酶切体系
| 成分 | 用量 |
| 酶A | 1μL |
| 酶B | 1μL |
| 10X buffer | 2μL |
| 质粒 | 100ng |
| ddH2O | Up to 20μL |
2、sgRNA-sy004载体的构建
(1)鸡CYP19A1的sgRNA的合成
设计鸡CYP19A1基因的sgRNA，并由北京擎科生物科技有限公司合成，该sgRNA序列如SEQ ID NO.7所示。根据该sgRNA，设计并合成左右含有EcoRI酶切位点的Oligo引物，Oligo-F序列如SEQ ID NO.8所示，Oligo-R序列如SEQ ID NO.9所示。将Oligo-F和Oligo-R分别稀释成浓度为10μM，按照表7所示的退火体系和表8所示的退火程序进行退火，形成双链。
表7 sgRNA引物退火体系
| 成分 | 用量 |
| Oligo-F | 1μL(10μM) |
| Oligo-R | 1μL(10μM) |
| T4 buffer | 1μL |
| ddH2O | 7μL |
表8 sgRNA引物退火程序
(2)载体构建
将步骤(1)退火形成的双链sgRNA根据表9所示的连接体系连接到sy004载体(购自苏州泓迅生物科技股份有限公司)中，于16℃连接16h，得到sgRNA-sy004载体。
表9载体连接体系
| 成分 | 用量 |
| T4连接酶 | 1μL |
| 载体 | 1μL |
| sgRNA双链 | 1μL |
| T4 10X buffer | 1μL |
| ddH2O | 6μL |
将10μL连接产物加入到超级感受态DH5α细胞(购自北京擎科生物科技有限公司)中，5min冰上冷激，42℃水浴45s热激，2min冰上冷激后，加入200μl无抗性的LB培养基，吹打混匀取100μl，均匀的涂在含有氨苄的固体培养基平板上，37℃培养过夜。挑取单个菌落，进行扩摇并送测序，测序结果如图1所示。测序成功的菌液使用天根无内毒素质粒大提试剂盒提取sgRNA-sy004载体，将载体于-20℃保存。
实施例2
本实施例验证了实施例1构建的鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统对鸡CYP19A1基因诱导敲除的效果，具体过程如下：
1、细胞转染
将DF-1细胞以每孔1×105个的密度均匀的铺至24孔板内。第二天当细胞汇合度达到80％进行转染。利用转染试剂lipo8000，按照每25μL opti加入1μg TRE-CAS9-rtTA-Puro载体、1μg sgRNA-sy004载体和1.5μL转染试剂的剂量，将实施例1构建的TRE-CAS9-rtTA-Puro载体和sgRNA-sy004载体共同转入DF-1细胞中，为实验组。用能够稳定敲除鸡CYP19A1基因的VK001-8-sg载体代替TRE-CAS9-rtTA-Puro载体和sgRNA-sy004载体，转染细胞，为阳性对照PCA组。不做任何处理的细胞，为空白对照CK组。
其中，能够稳定敲除鸡CYP19A1基因的VK001-8-sg载体的构建过程为：将实施例1中的退火得到的双链sgRNA连接至VK001-8载体上，得到VK001-8-sg载体。
将转染48h后的实验组细胞进行荧光观察，检测结果如图2所示。通过观察荧光可以看出，TRE-CAS9-rtTA-Puro载体和sgRNA-sy004载体已成功转入细胞中，并能够表达红色荧光蛋白。
2、载体验证
将转染后的实验组细胞和阳性对照组细胞添加入不同浓度(0、1、5、10、15、20μg/mL)的Dox溶液中来诱导CAS9的表达，检测不同浓度Dox溶液诱导下CAS9蛋白的表达量，检测结果如图3所示，可以看出，CAS9蛋白的表达随着浓度的升高而升高。
分别收集将实验组细胞、阳性对照PCA组细胞、空白对照CK组细胞基因组进行T7E1检测，检测结果如图4所示，可以看出，随着Dox溶液浓度升高，500bp处基因产物条带变浅。进一步，计算不同浓度Dox溶液诱导下的敲除效率，计算结果如表10所示，可以看出，敲除效率随Dox溶液浓度升高出现上升，表明Dox可以调控鸡CYP19A1基因的敲除率。
表10Dox溶液浓度与敲除效率的关系表
经T7E1检测后，将添加了20μg/mL Dox后的细胞基因组DNA扩增产物连接至擎科T载体上进行测序，测序结果如图5所示。可以看出，鸡CYP19A1基因已被成功敲除，显示敲除系统构建成功。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种鸡CYP19A1基因可诱导敲除系统，其特征在于，所述系统包括TRE-CAS9-rtTA-Puro载体和sgRNA-sy004载体。
2.一种权利要求1所述系统的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)设计并扩增Puro-rtTA元件和CAS9元件，将所述Puro-rtTA元件、所述CAS9元件与TRE-tight载体连接，得到TRE-CAS9-rtTA-Puro载体；
(2)设计得到鸡CYP19A1的sgRNA，将所述sgRNA与sy004载体连接，得到sgRNA-sy004载体。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述Puro-rtTA元件的扩增方法为：以VK001-08载体为模板，扩增得到Puro元件，将Puro元件与pTet-on-Advanced载体连接，得到pTet-on-Advanced-Puro载体；以pTet-on-Advanced-Puro载体为模板，扩增得到Puro-rtTA元件。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述Puro元件的扩增引物包括SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述Puro-rtTA元件的扩增引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述CAS9元件的扩增方法为：以VK001-08载体为模板，扩增得到所述CAS9元件。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述CAS9元件的扩增引物包括SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.7所示。
9.一种权利要求1所述系统或权利要求2～8任一项所述构建方法得到的系统在制备敲除鸡CYP19A1基因的试剂中的应用，其特征在于，将所述试剂转染入待敲除细胞中，通过添加Dox诱导鸡CYP19A1基因敲除。
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