CN108866075A

CN108866075A - 影响番茄果色形成调控基因yft2的可变剪切子及应用

Info

Publication number: CN108866075A
Application number: CN201810610111.2A
Authority: CN
Inventors: 赵凌侠; 陈露露; 李文贞; 赵伟华; 温腾健; 杜可玉; 李勇鹏; 冯学超
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2018-11-23

Abstract

本发明公开了一种影响番茄果色形成调控基因YFT2的可变剪切子及应用；具体涉及调控番茄果实颜色蛋白质的基因核苷酸序列、启动子序列和该蛋白的氨基酸序列，以及基因可变剪切的2种方式。本发明利用自然黄果番茄突变体黄樱桃22号，通过构建黄樱桃22号×LA1585F₂突变群体，成功地定位出影响黄樱桃22号果实颜色的YFT2基因。构建过表达载体，在黄樱桃22号中对YFT2进行转基因互补实验，可以恢复番茄果色为红色。通过RACE得到了该基因的转录本全长，发现在黄樱桃22号中存在一个可变剪切，导致YFT2蛋白不能正常合成，进而影响果色。本发明为通过可变剪切影响番茄果色提供基础。

Description

影响番茄果色形成调控基因YFT2的可变剪切子及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和遗传学领域，特别涉及一种影响番茄果色形成调控基因YFT2的可变剪切子及应用。

背景技术

番茄(Solanum lycopersicum；2n＝24)属于茄科(Solanaceae)番茄属(Lycopersicon)植物，是世界上极其重要蔬菜作物之一。番茄果实属于浆果，是番茄经济性状最重要的部分，可以生吃，烹饪或加工。

番茄果实颜色是番茄果实成熟变化的外在体现，是由植物色素分子叶绿素、黄酮类化合物和类胡萝卜素的共同决定的。这些色素分子对番茄自身繁衍后代和对人类抵抗癌症和心血管疾病都有积极作用。随着人们生活水平的提高，番茄果实营养价值已提到重要位置，而作为外部品质性状果色更是吸引消费者购买的直接因素。因此果实颜色是一个十分重要的番茄育种性状，关系到其营养价值和市场需求。研究番茄果色性状会提高番茄品质育种进程，产生一定的经济价值。

目前研究表明番茄果色的形成和调控是一个复杂的代谢网络，番茄果色形成受到植物众多生物合成代谢途径(类胡萝卜素合成、黄酮类化合物合成、叶绿素合成与降解)及相关调控基因调控；也受到植物质体发育的影响；同时还和乙烯、ABA、光信号转导通路的相关。番茄成熟果实中主要色素分子是番茄红素，早些时候的研究主要关注于类胡萝卜素代谢途径，目前该途径上的结构基因已经清楚。现在人们开始注意到番茄色素化合物的积累还和质体发育，植物激素，光信号转导相关，但是现有的研究结果很难全面阐明番茄果实颜色形成和调控机制。因此筛选新的番茄果色突变体以及通过图位克隆鉴定参与番茄果实颜色形成和调控的基因尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种影响番茄果色形成调控基因YFT2的可变剪切子及应用；具体是提供一个控制番茄黄果色性状的基因和导致黄果性状产生的原因，可用于今后筛选黄果番茄品种，进行品质改良。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种黄果番茄果色调控基因YFT2，其DNA序列如SED ID NO:1所示。

优选的，所述基因YFT2编码的蛋白的氨基酸序列如SED ID NO:2所示。

优选的，所述调控基因YFT2的前体mRNA具有两种可变的如SED ID NO:4和SED IDNO:5所示的剪切形式。

本发明还涉及一种所述的黄果番茄果色调控基因YFT2在调控番茄黄果色中的应用。

本发明还涉及一种所述的黄果番茄果色调控基因YFT2在番茄育种中的应用。

本发明还涉及一种黄果番茄果色调控蛋白，其氨基酸序列如SED ID NO:2所示。

本发明还涉及一种所述的黄果番茄果色调控蛋白在调控番茄黄果色中的应用。

本发明还涉及一种所述的黄果番茄果色调控蛋白在番茄育种中的应用。

本发明还涉及一种黄果番茄果色调控基因YFT2的启动子，编码所述启动子的碱基序列如SED ID NO:3所示。

本发明还涉及一种所述的启动子在调控番茄黄果色中的应用。

本发明还涉及一种所述的启动子在番茄育种中的应用。

本发明还涉及一种黄果番茄果色调控基因YFT2的可变剪切子，其可变的mRNA序列如SED ID NO:4所示。

本发明还涉及一种所述的如SED ID NO:4所示的可变剪切子在调控番茄黄果色中的应用。

本发明还涉及一种所述的如SED ID NO:4所示的可变剪切子在番茄育种中的应用。

本发明还涉及一种黄果番茄果色调控基因YFT2的可变剪切子，其可变的mRNA序列如SED ID NO:5所示。

本发明还涉及一种上述的如SED ID NO:5所示的可变剪切子在调控番茄黄果色中的应用。

本发明还涉及一种上述的如SED ID NO:5所示的可变剪切子在番茄育种中的应用。

本发明以黄果番茄突变体黄樱桃22号(Solanum lycopersicum var.cerasiformeNO.22)为母本，红果野生番茄醋栗番茄LA1585(S.pimpinellifolium)为父本杂交获得F₁，F₁再自交获得F₂群体，再利用F₂群体的380株个体，其中黄果85株、红果295株，结合公布的42个番茄CAPS和dCAPS标记对黄果番茄突变体果色调控基因进行初步定位。之后再利用F₂群体的1800株个体结合公布的番茄基因组序列开发10对CAPS和dCAPS标记，使用染色体步移技术将黄果色调控基因定位于429W和438W之间的候选区域含有95.7Kb的核苷酸序列内，该含有95.7Kb的核苷酸序列包含11个基因，其中YFT2基因参与类葫芦萝卜素通路合成。构建过表达载体，在黄樱桃22号中对YFT2进行转基因互补实验，可以恢复番茄果色为红色，证明正是YFT2基因的低表达导致了黄色果的产生。通过Rapid amplification of cDNA ends(RACE)得到了该基因的转录本全长，发现在黄樱桃22号中存在一个可变剪切，除了产生正常的YFT2转录本之外，主要产生一个异常的转录本，导致YFT2蛋白不能正常合成，进而影响果色。最后得出YFT2基因的可变剪切就是控制黄果番茄突变体黄樱桃22号黄果色性状的原因。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、根据本发明中提供的控制番茄黄果色性状的基因序列，通过可变剪切，形成一个异常的转录本，进而产生黄果表型。

2、研究该剪切机制可以为一步番茄果色的形态建成机理打下坚实的基础。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1杂交群体构建和各亲本及后代果实颜色表型；

图2突变基因定位图；

图3YFT2 5’端和3’端的qRT-PCR结果；

图4黄樱桃22号和pHB-YFT2过表达植株的果实示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

一、番茄黄果色突变体黄樱桃22号的遗传分析

为了确定突变体黄樱桃22号的黄果色的表型是否由单基因控制，本发明对黄樱桃22号(CN102676546A)进行了相应的遗传分析。分别利用黄果番茄突变体黄樱桃22号为母本和红果野生番茄醋栗番茄LA1585(Gao,L.,Zhao,W.,Qu,H.,Wang,Q.and Zhao,L.(2016)Theyellow-fruited tomato 1(yft1)mutant has altered fruit carotenoid accumulationand reduced ethylene production as a result of a genetic lesion in ETHYLENEINSENSITIVE2.Theoretical and Applied Genetics,129,717-728.)为父本构建杂交群体并对后代果色进行分析，具体步骤如下：

1.遗传分析群体的构建

分别以黄果番茄突变体黄樱桃22号为母本和红果野生番茄醋栗番茄LA1585为父本进行杂交获得F₁代，F₁代自交得到F₂代，如图1所示。记录每一个F₁代和F₂代植株成熟果实颜色，在黄樱桃22号×LA1585杂交得到的F₁代单株中果实颜色都为红色。F₂代单株中，分别获得了正常表型的红果植株和突变表型的黄果植株。通过卡方分析法进行验证，F₂代中红果植株和黄果植株的分离比符合3:1的分离比(见表1)。遗传分析结果表明黄樱桃22号突变体的表型是由单隐性核基因突变引起的。

表1杂交群体中红果植株和黄果植株的分离情况

二、YFT2图位克隆

遗传分析表明，突变体黄樱桃22号的黄果色表型是由一个隐性核基因控制。利用黄果番茄突变体黄樱桃22号和红果野生番茄醋栗番茄LA1585杂交衍生的F₂群体的390株，其中85株黄果、295株红果，进行初定位，将突变基因定位在位于3号染色体上CAPS分析标记03-52和30M2之间的27.35Mb区域内。进一步增加1800株F₂群体进行细定位，最终将突变基因定位在3号染色体CAPS分析标记429W和438W之间的95.7Kb区域内。利用番茄基因组注释信息，发现共有11个基因位于95.7Kb的定位区间。其中Solyc03g031860编码的YFT2是内胡萝卜素合成途径上的关键酶之一，和果实发育相关。测序结果发现在黄果突变体黄樱桃22号中YFT2翻译起始密码子上游-2005bp存在T变成了C(SEQ ID NO.3所示的DNA序列)，基因第四个内含子A变成了G(SEQ ID NO.1所示的DNA序列)。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示黄樱桃22号突变体YFT2的表达量在5’端和3’端存在明显差异，如图3所示。具体步骤如下：

1.基因定位

从黄樱桃22号×LA1585杂交群体F₂代中选取1800株个体作为定位群体。每株取1克左右的嫩叶，用来提取总DNA进行基因定位。突变基因定位图如图2所示。

1.1番茄基因组DNA的提取

用CTAB法提取亲本及F₂分离群体的叶片总DNA。

1)取一小片新鲜叶片，放入1.5ml EP管中，加入500μL micro prep buffer；

2)研磨后，65℃水浴30min，期间每10min颠倒混匀一次。

3)冷却至室温后，加入等体积(500μL)的氯仿：异戊醇(V:V＝24:1)，轻轻混匀30sec，10000rpm离心10min。

4)吸取上清350μL到新的EP管中，加入等体积异丙醇(-20℃预冷)，轻轻混匀，于-20℃冰箱中沉淀30min。

5)10000rpm离心10min，弃异丙醇。DNA白色沉淀用70％乙醇吹洗两遍。

6)将乙醇残留尽量吸取干净后置于60℃恒温箱中干燥至刚出现半透明，加入35μLddH₂O溶解后置于-20℃冰箱保存。

1.2突变基因的初步定位和精细定位

在突变基因的初步定位中，用85株具有突变表型黄果和295株具有正常表型红果F2个体进行CAPS分析。首先根据公布的番茄分子遗传图谱，选取近似均匀分布于12条染色体上的42个分子标记主要是CAPS标记进行初定位。之后选取1800株F₂个体，根据发布的番茄基因组序列，增加10对CAPS标记进行精细定位。具体实验条件如下：

表2 PCR反应体系：

试剂	体积/μL
		DNA模板	4.0
10×rTaq Buffer	2.5
		dNTP Mix(2mM)	2.0
Forward Primer(10μM)	1.0
		Reverse Primer(10μM)	1.0
ddH₂O	14.25
		rTaq(5U/μL)	0.25

PCR反应条件为：95℃变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min(根据实际CAPS标记扩增产物长度调整)，35个循环；最后72℃延伸10min。

表3酶切反应体系：

PCR产物加入量根据CAPS分子标记实际扩增情况确定后加ddH₂O补足总反应体系15μL。

酶切反应2h，产物用2.0％-3.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并在UVP凝胶成像系统(Transilluminator White/UV，UVP，inc.，USA)紫外光下拍照，统计带型。

2.基因预测和序列分析

利用已经公布的番茄基因组注释信息，发现精细定位的95.7Kb区域内包括11个基因。其中Solyc03g031860编码的YFT2是类胡萝卜素通路的关键酶基因PSY1，和果实颜色形成相关。根据已知YFT2序列，设计引物对YFT2基因全长和启动子进行扩增，回收目的条带，连接克隆载体pMD19-T-Simple Vector(Takara)，转化大肠杆菌DH5α，送生物公司进行测序。扩增YFT2基因全长引物序列5’-TGGCCATTGTTGAAAGAGAG-3’(forward，SED ID NO:6)和5’-TCATGCTTTATCTTTGAAGAGAGG-3’(reverse，SED ID NO:7)，扩增YFT2启动子引物序列5’-AAAGAGGAACAAAAGAGGCAAGAAC-3’(forward，SED ID NO:8)和5’-TTACACAAATTCCACCCTCTCTTTC-3’(reverse，SED ID NO:9)。

3.基因表达分析

采用qRT-PCR对基因转录水平进行分析。花后不同阶段(days post anthesis，dpa)的果实样品(25dpa，35dpa和45dpa)总RNA提取使用天根公司植物总RNA提取试剂盒(RNAprep pure Plant Kit)。样本cDNA单链合成使用Takara公司反转录试剂盒(PrimeScript^TM RT Master Mix kit)，并按如下反应体系和反应条件进行。

表4反转录反应体系：

试剂	使用量
		5×PrimeScript Buffer(for Real Time)	2μL
Total RNA	500ng
		RNase-free ddH₂O	up to 10μL

反转录反应条件：37℃20min，85℃5s，4℃10min。产物-70℃超低温冰箱保存。

本实验根据数据库已知的YFT2mRNA序列设计荧光定量引物，分别在YFT2的5’端和3’端设计定量引物，检测的YFT2的表达水平，发现YFT2的定量结果在5’端和3’端存显著性差异，如图3所示。用于鉴定YFT2 5’端表达量的定量PCR引物序列为5’-TGAAAGAGAGGGTGGAATTTGTAAG-3’(forward，SED ID NO:10)和5’-GACCACAGACAGGCAAACCAAC-3’(reverse，SED ID NO:11)。鉴定YFT2 3’端表达量的定量PCR引物序列为5’-GGAAGGGTGACCGATAAATGGAG-3’(forward，SED ID NO:12)和5’-GAGAGGCAGTTTTTGTAGGAGGC-3’(reverse，SED ID NO:13)。用于内参ACTIN引物为5’-TTGCTGACCGTATGAGCAAG-3’(forward，SED ID NO:14)和5’-GGACAATGGATGGACCAGAC-3’(reverse，SED ID NO:15)。荧光定量PCR采用takara公司的SYBR Premix Ex Taq II试剂盒，具体反应体系和反应条件如下：

表5荧光定量PCR反应体系

试剂	使用量
		SYBR Premix Ex Taq II(2×)	10.0μL
PCR Forward Primer(10μM)	0.8μL
		PCR Reverse Primer(10μM)	0.8μL
cDNA模板	2.0μL
		ddH₂O	6.4μL
Total	20.0μL

反应条件：94℃120s；94℃20s，55℃20s，72℃20s，40个循环。

反应结束后将Ct值导出在excel表格中进行数据处理，本实验利用2^-ΔCt计算目的基因相对于内参基因的相对表达量。计算方法为：ΔCt＝Ct_t-Ct_r；相对表达量＝2^-ΔCt；其中Ct_t表示目的基因的Ct值；Ct_r表示同一样品内参基因的Ct值。

三、在黄樱桃22号中过表达YFT2

设计引物，将YFT2在黄樱桃22号中过表达，果实可以恢复红色表型，如图4所示。验证了YFT2的可变剪切导致了黄果表型的出现。具体步骤如下：

1.在黄樱桃22号中过表达YFT2

1.1YFT2蛋白编码区的克隆

根据所述黄樱桃22号中正常的YFT2基因的编码序列(SEQ ID NO.4所示的mRNA序列)，设计扩增出完整编码框的上游引物PSY1-CDS-5'-Hind III(TTCTTGAAGCTTATGTCTGTTGCCTTGTTATGGGTT，SED ID NO:16)和下游引物PSY1-CDS-3'-XbaI(CTTCATTTTCTAGATTATCTTTGAAGAGAGGCAGT，SED ID NO:17)，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(下划线部分)通过高保真酶KOD，以红樱桃cDNA文库为模板，扩增正常的YFT2基因蛋白编码区并测序。DNA序列测定由上海铂尚生物技术有限公司测序完成。测序结果表明，所克隆的序列与NCBI中所报道的番茄PSY1基因的氨基酸编码序列(GenbankID：M84744)一致。

1.2含有YFT2基因的植物双元表达载体的构建

以pHB(pHB表达载体为在pCAMBIA3301表达载体上改造获得并保存，Mao,J.,Zhang,Y.-C.,Sang,Y.,Li,Q.-H.and Yang,H.-Q.(2005)A role for Arabidopsiscryptochromes and COP1in the regulation of stomatal opening.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America,102,12270-12275.)为表达载体，将上述YFT2基因编码区连入其对应的酶切位点位置。具体地，HindIII和Xba I双酶切表达载体pHB和扩增的YFT2基因片段，回收YFT2基因片段和pHB载体大片段，连接转化，挑取单克隆，提取质粒。由上海铂尚生物技术服务有限公司测序确认基因的正确性。

1.3含YFT2基因双元植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得

将上述含YFT2基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证。

1.4根癌农杆菌介导的PSY1基因转化黄樱桃22号

1.4.1外植体的预培养

将用75％的酒精和10％的次氯酸纳灭菌后的黄樱桃番茄22号(Solanumlycopersicum var.cerasiforme yellow cherry No.22)种子播于MS发苗培养基(MS粉0.22％，蔗糖3％，植物凝胶0.26％，余量为ddH₂O，pH＝5.8)上无菌培养光照和暗培养交替进行，取生长10天的小苗，以下胚轴和子叶作外植体进行转化，其中75％的酒精杀菌50s，10％的次氯酸纳消毒10min。

1.4.2农杆菌和外植体的共培养

将含有过表达YFT2质粒的EHA105工程菌在含三种抗生素(50mg/L Rif，100mg/LStr，100mg/L Kan)的LB液体中于28℃摇菌培养至OD₆₀₀为0.5～0.8时，室温4,000rpm离心10min；弃上清，菌体用灭菌的MS液体培养基(MS粉0.44％，蔗糖3％，余量为ddH₂O，pH＝5.8)重悬，然后加入无菌外植体浸泡8min，期间轻轻摇动几次。取出转化后的外植体，用灭菌纸吸去残余菌液，置于共培养基上(MS粉0.44％，蔗糖3％，植物凝胶0.26％，6-苄氨基嘌呤0.0002％，3-吲哚乙酸0.00002％，余量为ddH₂O，pH＝5.8)在25℃共培养36小时。

1.4.3抗性再生植株的筛选培养

共培养结束后将外植体转移到愈伤组织诱导培养基(MS粉0.44％，蔗糖3％，植物凝胶0.26％，6-苄氨基嘌呤0.0002％，3-吲哚乙酸0.00002％，潮霉素0.001％，羧苄青霉素0.025％，余量为ddH₂O，pH＝5.8)上，在25～28℃光照下培养，光周期为16h/8h(光照/黑暗)培养12～15天可见切口片愈伤组织的形成，待愈伤组织成簇，转移到分化培养基30～35天后可见有小芽从外植体边缘长出。

1.4.4抗性植株的生根和移栽入土

待再生芽长至3～4cm时，将其移植到生根培养基(MS粉0.44％，蔗糖3％，植物凝胶0.26％，6-苄氨基嘌呤0.0002％，3-吲哚乙酸0.00002％，潮霉素0.0005％，羧苄青霉素0.025％，余量为ddH₂O，pH＝5.8)上生根培养，7～10天可见有白色再生根长出；形成完整根系后，将再生植株取出并用水小心洗去附着在根系上的固体培养基，移植到珍珠岩中驯化，开始驯化阶段用保鲜膜保护幼苗，3周后移入土中用于后续分析。

1.4.5抗性植株的检测和果实表型观察

根据包含目的基因YFT2所在的T-box区域的筛选标记潮霉素基因序列分别设计正向引物Hygromycin-F(GGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGC，SED ID NO:18)和反向引物Hygromycin-R(GGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGC，SED ID NO:19)对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出523bp的特异DNA片段。而以EHA105空菌侵染的番茄苗为模板时，没有扩增出任何片段。阳性植株种植后，果实表型恢复为红色，如图4所示。

四、YFT2 cDNA全长的获得和比对

根据NCBI数据库中的YFT2cDNA(Genbank ID：M84744)的保守序列设计引物，通过Rapid amplification of cDNA ends(RACE)获得黄樱桃22号中的cDNA全长，发现与数据库中以及另一个红果材料红樱桃中的cDNA全长存在差异。黄樱桃22号中除了含有类似于红樱桃等红果番茄中的正常的YFT2cDNA(SEQ ID NO.4所示的DNA序列)之外，还具有一种异常的长转录本，命名为YFT2-long(SEQ ID NO.5所示的DNA序列)。具体步骤如下：

1.黄樱桃22号中YFT2基因全长的获得

提取黄樱桃22号和红樱桃35dpa的果实的RNA，将RNA分别在-80摄氏度和37℃中放置2h后，比较二者的浓度差异并通过琼脂糖凝胶电泳查看RNA的纯度和完整性。二者没有明显差别的RNA才用作后续cDNA文库构建。

根据数据库已有的YFT2mRNA序列，设计巢式引物，采用Rapid amplification ofcDNA endsRACE方法进行cDNA全长的克隆(Clontech，USA)：

1.1cDNA第一条链的合成

配备用于5’RACE所用的cDNA文库的反应液：10μl RNA，1μl 5’-CDS Primer A，1μlSMARTer II A Oligonucleotide(在配备3’RACE的cDNA文库时，将1μl SMARTer II AOligonucleotide替换成无菌水)，将RACE反应液混匀，72℃孵育3min后，42℃放置2min，依次加入4.0μl 5×First-Strand Buffer，0.5μl DTT(100mM)，1.0μl dNTPs(20mM)，0.5μlRNase Inhibitor(40U/μl)和2.0μl SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)，轻柔混匀后，依次42℃放置90min，70℃放置10min，加入90μl Tricine-EDTA稀释成工作浓度，-20℃储存。

1.2 5’RACE

用Clontech提供的5’通用引物(UPM和UPM-short)和设计的特异性引物GSP-5'RACE(GATTACGCCAAGCTTGCCCTTCTTCTCTCGGGAGTCATTAGC，SED ID NO:20)以及巢式引物GSP-5'RACE-nest(GATTACGCCAAGCTTGATGGAGTAGCCAAAATAGCAGACC，SED ID NO:21)，以5’RACE-Ready cDNA为模板进行，反应条件按照Clontech说明书设置。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pLB载体上(TIANGEN，China)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态后，进行测序。

1.3 3’RACE

用Clontech提供的3’通用引物(UPM和UPM-short)和设计的特异性引物GSP-3'RACE(GATTACGCCAAGCTTTGCTGGAAGGGTGACCGATAAATGGAG，SED ID NO:22)以及巢式引物GSP-3'RACE-nest(GATTACGCCAAGCTTGCAGAGAAAGGCGTGACAGAATTGAGC，SED ID NO:23)，以3’RACE-Ready cDNA为模板进行，反应条件按照Clontech说明书设置。用琼脂糖凝胶电泳进行检测并对产物进行胶回收，将胶回收的目的片段连接到pLB载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态后，进行测序。

1.4黄樱桃22号中存在2种YFT2的cDNA形式

根据数据库中的YFT2的CDS序列以及得到的5’RACE和3’RACE结果，进行拼接后，分别在黄樱桃22号和红樱桃中得到了不同的YFT2全长片段序列信息。黄樱桃22号中得到的YFT2全长具有一个和红樱桃中的YFT2不同的3’末端，命名为YFT2-long(SEQ ID NO.5所示的DNA序列)。在得到的基因全长的基础上，在黄樱桃22号中以总cDNA为模板扩增两种YFT2的转录本，PSY1-cDNA-F(AAACCAACAAATTGCATTCTCC，SED ID NO:24)为正向引物，PSY1-cDNA-R(GGTATATCAATTATCATGCCCACAG，SED ID NO:25)为反向引物，扩增YFT2。PSY1-cDNA-F为正向引物，PSY1-long-cDNA-R(TATGCCATGTAAATTACGACATGAC，，SED ID NO:26)为反向引物，扩增YFT2-long。具体实验条件如下：

表6 PCR反应体系：

试剂	体积/μL
		50×cDNA模板	4.0
10×KOD Buffer	2.5
		dNTP Mix(2mM)	2.5
Mg²⁺(25mM)	1
		Forward Primer(10μM)	0.75
Reverse Primer(10μM)	0.75
		ddH₂O	13.0
KOD(5U/μL)	0.5

PCR反应条件为：95℃变性3min；98℃变性10sec，55℃退火30sec，68℃延伸3min，40个循环；最后72℃延伸10min。如期得到一条1987bp的YFT2目标特异条带和一条2060bp的YFT2-long的目标特异条带。然后按常规方法对PCR扩增产物进行连接pLB测序，分别获得SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列。

综上所述，本发明公开了一种调控番茄果实颜色蛋白质的基因核苷酸序列、启动子序列和该蛋白的氨基酸序列，以及基因可变剪切的2种方式。本发明利用自然黄果番茄突变体黄樱桃22号(Solanum lycopersicum var.cerasiforme)，通过构建黄樱桃22号×LA1585突变群体，F₁代果实均为红色，而F₂代果色出现红黄色分离，经卡方检测，符合孟德尔单基因隐形遗传3:1比例，推测黄樱桃22号黄果表型为单基因隐形控制。在突变群体黄樱桃22号×LA1585的F₂代中，用以CAPS分子标记为主的图位克隆技术，成功地将影响黄樱桃22号黄果色的基因定于番茄3号染色体上429W和438W间的95.7Kb区间内的YFT2基因。构建过表达载体，在黄樱桃22号中对YFT2进行转基因互补实验，可以恢复番茄果色为红色。通过Rapid amplification of cDNA ends(RACE)得到了该基因的转录本全长，发现在黄樱桃22号中存在一个可变剪切，导致YFT2蛋白不能正常合成，进而影响果色。本发明为通过可变剪切影响番茄果色提供基础。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 影响番茄果色形成调控基因YFT2的可变剪切子及应用

<130> DAG36337

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3302

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 1

atgtctgttg ccttgttatg ggttgtttct ccttgtgacg tctcaaatgg gacaagtttc 60

atggaatcag tccgggaggg aaaccgtttt tttgattcat cgaggcatag gaatttggtg 120

tccaatgaga gaatcaatag aggtggtgga aagcaaacta ataatggacg gaaattttct 180

gtacggtctg ctattttggc tactccatct ggagaacgga cgatgacatc ggaacagatg 240

gtctatgatg tggttttgag gcaggcagcc ttggtgaaga ggcaactgag atctaccaat 300

gagttagaag tgaagccgga tatacctatt ccggggaatt tgggcttgtt gagtgaagca 360

tatgataggt gtggtgaagt atgtgcagag tatgcaaaga cgtttaactt aggttagctt 420

cttcaatcta ttcattcgtt taccaaatat tatttggtaa gcactaatta tgaatatata 480

tatgttcatg ttattgatga agacaaaatt tgatctttgt ttgtttattc aggaactatg 540

ctaatgactc ccgagagaag aagggctatc tgggcaatat atggtgaggt ttctagccat 600

ttaataacag ttacgcgcac aaacacatat gattaatcgg ggacgagaaa aaaagaaatg 660

aagtttgagt tttgagggtc atatgtaata ggtaaatccg agcttgacta gcttgagatg 720

tttattgtca tatcatgctc aatactaacc aaaacactga aaaagaactt gattatattt 780

acatactaat attttcattt gcgttgctgt tcacattttt acctatggaa ctggtttttg 840

tgatttgtta tacttcatat tcgatgttaa taaaatatat cattcctccc tttttctcca 900

cttcaagctt tactgtagtg ttgaaagggg aaactccttt taatgattgc atatataaac 960

gaacttcttg agttgaatag tttctcatta tgatctgttt aaacagtatg gtgcagaaga 1020

acagatgaac ttgttgatgg cccaaacgca tcatatatta ccccggcagc cttagatagg 1080

tgggaaaata ggctagaaga tgttttcaat gggcggccat ttgacatgct cgatggtgct 1140

ttgtccgata cagtttctaa ctttccagtt gatattcagg ttagtctacc aattctatgg 1200

tctttatatt tgttcaattt gcgtttgatg tcacttttgc tgagggcttt tctaatagct 1260

tacttcagcc tagcggaaat gtttgtagtt gaatctctag ttctgtctcc tatatctgtt 1320

tctctcgtcc tagatactac acatacttca tttctgtttt aacattttat tcgtcttttg 1380

gtgttgtttt gtatgtgaat catatatttg gaacagaatc attattagtt cacatgattt 1440

catttgcttt cttcaatagc gtaattgtct aaccttccaa tatatgttgc agccattcag 1500

agatatgatt gaaggaatgc gtatggactt gagaaaatcg agatacaaaa acttcgacga 1560

actatacctt tattgttatt atgttgctgg tacggttggg ttgatgagtg ttccaattat 1620

gggtatcgcc cctgaatcaa aggcaacaac agagagcgta tataatgctg ctttggctct 1680

ggggatcgca aatcaattaa ctaacatact cagagatgtt ggagaagagt aagtacaaag 1740

ctgtgtttta cgcacataat tttttttgct aatatttaca tatcaaaata taggaaaatg 1800

agctcttcgg ttatccggtt tatatttttt ttatgtcaac ataatagtat aaagtaatta 1860

gtatcagtcg ttctgggaat aaaattgcag aactcaattt agccgtgttg tgaaatcctg 1920

cttgttttga gagcttaaag ctcattagtt agtcgttaga gacgaagaaa ttcttcgttg 1980

tccatcttta ttccaccttg aagttgtgat attttcatta ttggtacatt tggcaaaaac 2040

acctgaacaa atttatgacg gatgcctttt gaaagtcact atacctgtct agtcggcgtt 2100

tatcacattt ctttgacata ttgaactttg aaacatgata tcagctctag acagtgacga 2160

gccatgatca atttctttcc tttattcttt ctttggaagt gccgtattta ggcttccgtt 2220

gttcttatat attgctttcc ctgcagtgcc agaagaggaa gagtctactt gcctcaagat 2280

gaattagcac aggcaggtct atccgatgaa gatatatttg ctggaagggt gaccgataaa 2340

tggagaatct ttatgaagaa acaaatacat agggcaagaa agttctttga tgaggcagag 2400

aaaggcgtga cagaattgag ctcagctagt agattccctg taagcattcg taaactcttt 2460

agttttatga aatgattctt ttttcgcgtt attagatgaa tatggttgct tgtgttgagt 2520

atttctaggt cgatgaagtt gagacaaggg tttttaagtt ttaacgactt ttacggggtg 2580

ccatgttatc tgctacctaa tcttaggtag ttgaccggaa gggctagaat tttaacctca 2640

tgttcaccct accaaccaag aaatgaacct cgcatagagc tcgtagttat gaatatttgc 2700

tttggcatga cattgtgcgg atcatgaaat gtcttagatt atatggaaaa atcattctat 2760

tacatcgaat agatacatta gatctaagaa gcacgccgtg ttgtaaatga gaaattctat 2820

agctcagatc tttagttttc tctgaacgac ctacaaacca acggataacc ttgtattgag 2880

cttgtcgttc tcagtatttg cactaacatt acgtcgtgtg gatcctgaaa tggcttggat 2940

tgctattatt ctggatatgg caaaaccatt ttattagtac tagatatcga ataactacat 3000

ttgaccctac aagtaccctg ggttggagtt acaatatccc atacctcgta tctttagtgt 3060

tctcttattt atcacctttg tctactattc tggcaaaata acctcactcg ttactcggtg 3120

ttttccaggt atgggcatct ttggtcttgt accgcaaaat actagatgag attgaagcca 3180

atgactacaa caacttcaca aagagagcat atgtgagcaa atcaaagaag ttgattgcat 3240

tacctattgc atatgcaaaa tctcttgtgc ctcctacaaa aactgcctct cttcaaagat 3300

aa 3302

<210> 2

<211> 412

<212> PRT

<213> Solanum lycopersicum

<400> 2

Met Ser Val Ala Leu Leu Trp Val Val Ser Pro Cys Asp Val Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ser Phe Met Glu Ser Val Arg Glu Gly Asn Arg Phe Phe Asp

20 25 30

Ser Ser Arg His Arg Asn Leu Val Ser Asn Glu Arg Ile Asn Arg Gly

35 40 45

Gly Gly Lys Gln Thr Asn Asn Gly Arg Lys Phe Ser Val Arg Ser Ala

50 55 60

Ile Leu Ala Thr Pro Ser Gly Glu Arg Thr Met Thr Ser Glu Gln Met

65 70 75 80

Val Tyr Asp Val Val Leu Arg Gln Ala Ala Leu Val Lys Arg Gln Leu

85 90 95

Arg Ser Thr Asn Glu Leu Glu Val Lys Pro Asp Ile Pro Ile Pro Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Leu Leu Ser Glu Ala Tyr Asp Arg Cys Gly Glu Val Cys

115 120 125

Ala Glu Tyr Ala Lys Thr Phe Asn Leu Gly Thr Met Leu Met Thr Pro

130 135 140

Glu Arg Arg Arg Ala Ile Trp Ala Ile Tyr Val Trp Cys Arg Arg Thr

145 150 155 160

Asp Glu Leu Val Asp Gly Pro Asn Ala Ser Tyr Ile Thr Pro Ala Ala

165 170 175

Leu Asp Arg Trp Glu Asn Arg Leu Glu Asp Val Phe Asn Gly Arg Pro

180 185 190

Phe Asp Met Leu Asp Gly Ala Leu Ser Asp Thr Val Ser Asn Phe Pro

195 200 205

Val Asp Ile Gln Pro Phe Arg Asp Met Ile Glu Gly Met Arg Met Asp

210 215 220

Leu Arg Lys Ser Arg Tyr Lys Asn Phe Asp Glu Leu Tyr Leu Tyr Cys

225 230 235 240

Tyr Tyr Val Ala Gly Thr Val Gly Leu Met Ser Val Pro Ile Met Gly

245 250 255

Ile Ala Pro Glu Ser Lys Ala Thr Thr Glu Ser Val Tyr Asn Ala Ala

260 265 270

Leu Ala Leu Gly Ile Ala Asn Gln Leu Thr Asn Ile Leu Arg Asp Val

275 280 285

Gly Glu Asp Ala Arg Arg Gly Arg Val Tyr Leu Pro Gln Asp Glu Leu

290 295 300

Ala Gln Ala Gly Leu Ser Asp Glu Asp Ile Phe Ala Gly Arg Val Thr

305 310 315 320

Asp Lys Trp Arg Ile Phe Met Lys Lys Gln Ile His Arg Ala Arg Lys

325 330 335

Phe Phe Asp Glu Ala Glu Lys Gly Val Thr Glu Leu Ser Ser Ala Ser

340 345 350

Arg Phe Pro Val Trp Ala Ser Leu Val Leu Tyr Arg Lys Ile Leu Asp

355 360 365

Glu Ile Glu Ala Asn Asp Tyr Asn Asn Phe Thr Lys Arg Ala Tyr Val

370 375 380

Ser Lys Ser Lys Lys Leu Ile Ala Leu Pro Ile Ala Tyr Ala Lys Ser

385 390 395 400

Leu Val Pro Pro Thr Lys Thr Ala Ser Leu Gln Arg

405 410

<210> 3

<211> 3000

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 3

caattcttaa gaatcttaga acaaactaaa ccaaataaaa ttaaacgatt taatcaactt 60

aatttaattt ttcaatgtgg gtcaattttt atccaaatac ttttacaccc acttttcacc 120

atcacaaggg gtaagaacta gcaaattatt ttgccttaac aaaaacttac tattggtgta 180

gagaaaattg gttgattttc ttatcaatat atataattta gtacccaatt ttcccaaaac 240

taaataaaat atagaatatc cactaaggtg gttacacgtg tacactcaac caatgacggc 300

acttcaaatt cttgataacg gtatcttccc accttcatat atttcaacat tttattgtta 360

aaataaaatc gcacgctcta ttttatctaa attttattta tagaattata ttaagtatgt 420

tattattgat ttttacgtat aaatatattt catattaaaa tcatataagt tgacatcact 480

aagttcgttg gatttgcatg tagacccaat tattcagata ctcaacatga ctcatttaat 540

attggattat tgaaatattt gtaatacatt aagaatataa ttgttaacta ttttaatttt 600

taattatacg taaatatcaa acaaaaatat taatatgatc gctatattag atgataacta 660

taaggagcct acacaattaa cactatttaa ctctattctt tgcatttata aaaagttact 720

ttagtcttag gttcacaatg tcaaaatcta aacaactaaa aacgacgagg agtaaggttt 780

gcaacgacga taacaaggat taggcaacaa ttagagttgt gaattgtgag tattaactat 840

acttttacta tattaggcag aatttttgca ctcaatgagt aacttgattt atttattttt 900

tatttcgccc taaattattg gacaagtcat atatttgttt tgaaaacatt cttttattgg 960

ctaaatcgaa aattgaatcg ttaaagatca aaaatcaata acaaatatct tattggttta 1020

acatatttaa aaataaaaaa ccaataaatc taactaataa tatttaatac gaaaacgaaa 1080

tggactgaca cacattccta aatttttggt caaaattttt tcataatttc cctaaaatct 1140

aaaatattaa atatttgacg gaaacaaaaa attcactttt aataaattat ttgaaggact 1200

aaaacagtgg aagaatatat ttaagaagct aatttgaacc tagtgccaaa tataaaggga 1260

ccatttttgt catttttcaa cttgaaaatc tacgtgtctt aatataacac caaagaatta 1320

atatttactg aaaaaatgta aaaatgagga tatggattct gaatcactca attccaatca 1380

gcaaaaataa aataaaataa aataaaataa aatttaaaaa ataataataa atgctataaa 1440

atgaccaaaa tgtgtggagc aaaaagtgca gaaaaaacca acaaattgca ttctccattc 1500

ttggaagtgg ccattcttga tttcttgaaa caaaggtttg tttcccttca cttcttgata 1560

tgtaaagttg caatctttat aactttctat tgctttgcta gtgtttttgt tatatacagg 1620

gggtggagtt agagggtaag ttacgcattt agtcgtaact ttagtcaaac ttcgtaataa 1680

tttagtaagt taaaatatat tagaaatttt cagaattcat aaactttaaa ttttaaattt 1740

tgacttcgct ttgtgtgact atacaattac agaaattcag agtggccatt gttgaaagag 1800

agggtggaat ttgtgtaagt tttgtttcct ttcagttctt gatatataaa gttgcaatct 1860

ttaacattct ttgttcactt tctataggtt tgctaggttc ggttaaattc agtagcttta 1920

gtttaaaccc tatgcggaat agagaatgtg taaactttaa acttcaaatt ttggctccgc 1980

atacgactag cgactatata ataataggaa ttgagcactt ggcttttgta tatagcttct 2040

atgtgtacca aaattagaaa atcaggcgat tattataatc ttgttgacta aatatagaat 2100

gcatccatta cccccaaaaa gtgtgattcc actgtcatag gaggtttttt ttatttcatt 2160

ttatttgtgc tttcaataat gtagagtagt tttacaaaga tcctttcttt gtgacacatg 2220

gtaggtaata ttgctgattt tgttgtagtt ttggggttat aaagtttcaa attatttata 2280

ctggagggta ggggtggggg ttgtctataa tgcaggttat ggttttacgt gaactcaata 2340

attattgtag atactaagaa atccactcag tgttcttgcg gtgtcttgct tttgatttca 2400

gcatcacttg tagttgattg tgtttagatt atcacattat tctgtggctg taactgtatc 2460

cttgttagtt gctttgtttc tacactgttg ttttccctct tttataccta ttttgatatg 2520

ttgtactcga acgagggtca tcggggaaca acctctttac ctccgtgagg tagagctatg 2580

gtctgtgtcc actctaccct ccccagatcc ctcttgtagg atttcactat attgtaatat 2640

taacttgagg tcactatagg agctcaaaaa cttctaattt tgaatcaatg tctggttata 2700

ctttttttgt cataactgta tctcaaatgt ggtgtttggt ttatctcatt ttgcagaagt 2760

caagaaacag gttactcctg tttgagtgag gaaaagttgg tttgcctgtc tgtggtcttt 2820

ttataatctt tttctacaga agagaaagtg ggtaattttg tttgagagtg gaaatattct 2880

ctagtgggaa tctactagga gtaatttatt ttctataaac taagtaaagt ttggaaggtg 2940

acaaaaagaa agacaaaaat cttggaattg ttttagacaa ccaaggtttt cttgctcaga 3000

<210> 4

<211> 2014

<212> RNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 4

cagaaaaaac caacaaattg cattctccat tcttggaagt ggccattctt gatttcttga 60

aacaaaggtt tgtttccctt cacttcttga tatgtaaagt tgcaatcttt ataactttct 120

attgctttgc tagtgttttt gttatataca gggggtggag ttagagggta agttacgcat 180

ttagtcgtaa ctttagtcaa acttcgtaat aatttaaaat tcagagtggc cattgttgaa 240

agagagggtg gaatttgtaa gtcaagaaac aggttactcc tgtttgagtg aggaaaagtt 300

ggtttgcctg tctgtggtct ttttataatc tttttctaca gaagagaaag tgggtaattt 360

tgtttgagag tggaaatatt ctctagtggg aatctactag gagtaattta ttttctataa 420

actaagtaaa gtttggaagg tgacaaaaag aaagacaaaa atcttggaat tgttttagac 480

aaccaaggtt ttcttgctca gaatgtctgt tgccttgtta tgggttgttt ctccttgtga 540

cgtctcaaat gggacaagtt tcatggaatc agtccgggag ggaaaccgtt tttttgattc 600

atcgaggcat aggaatttgg tgtccaatga gagaatcaat agaggtggtg gaaagcaaac 660

taataatgga cggaaatttt ctgtacggtc tgctattttg gctactccat ctggagaacg 720

gacgatgaca tcggaacaga tggtctatga tgtggttttg aggcaggcag ccttggtgaa 780

gaggcaactg agatctacca atgagttaga agtgaagccg gatataccta ttccggggaa 840

tttgggcttg ttgagtgaag catatgatag gtgtggtgaa gtatgtgcag agtatgcaaa 900

gacgtttaac ttaggaacta tgctaatgac tcccgagaga agaagggcta tctgggcaat 960

atatgtatgg tgcagaagaa cagatgaact tgttgatggc ccaaacgcat catatattac 1020

cccggcagcc ttagataggt gggaaaatag gctagaagat gttttcaatg ggcggccatt 1080

tgacatgctc gatggtgctt tgtccgatac agtttctaac tttccagttg atattcagcc 1140

attcagagat atgattgaag gaatgcgtat ggacttgaga aaatcgagat acaaaaactt 1200

cgacgaacta tacctttatt gttattatgt tgctggtacg gttgggttga tgagtgttcc 1260

aattatgggt atcgcccctg aatcaaaggc aacaacagag agcgtatata atgctgcttt 1320

ggctctgggg atcgcaaatc aattaactaa catactcaga gatgttggag aagatgccag 1380

aagaggaaga gtctacttgc ctcaagatga attagcacag gcaggtctat ccgatgaaga 1440

tatatttgct ggaagggtga ccgataaatg gagaatcttt atgaagaaac aaatacatag 1500

ggcaagaaag ttctttgatg aggcagagaa aggcgtgaca gaattgagct cagctagtag 1560

attccctgta tgggcatctt tggtcttgta ccgcaaaata ctagatgaga ttgaagccaa 1620

tgactacaac aacttcacaa agagagcata tgtgagcaaa tcaaagaagt tgattgcatt 1680

acctattgca tatgcaaaat ctcttgtgcc tcctacaaaa actgcctctc ttcaaagata 1740

aagcatgaaa tgaagatata tatatatata tatatagcaa tatacattag aagaaaaaaa 1800

ggaagaagaa atgttgttgt attgatataa atgtatatca taaatattag gttgtagtaa 1860

cattcaatat aattatctct tgtagttgtt gtatcttcac tttatctcaa ctcctttgag 1920

agaactttcc gtagttatct gctttgcact tggttactca gaattttact gtgggcatga 1980

taattgatat accaaattca gttttgattc tatc 2014

<210> 5

<211> 2102

<212> RNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 5

cagaaaaaac caacaaattg cattctccat tcttggaagt ggccattctt gatttcttga 60

aacaaagtgt ttttgttata tacagggggt ggagttagag ggtaagttac gcatttagtc 120

gtaactttag tcaaacttcg taataattta aaattcagag tggccattgt tgaaagagag 180

ggtggaattt gtaagtcaag aaacaggtta ctcctgtttg agtgaggaaa agttggtttg 240

cctgtctgtg gtctttttat aatctttttc tacagaagag aaagtgggta attttgtttg 300

agagtggaaa tattctctag tgggaatcta ctaggagtaa tttattttct ataaactaag 360

taaagtttgg aaggtgacaa aaagaaagac aaaaatcttg gaattgtttt agacaaccaa 420

ggttttcttg ctcagaatgt ctgttgcctt gttatgggtt gtttctcctt gtgacgtctc 480

aaatgggaca agtttcatgg aatcagtccg ggagggaaac cgtttttttg attcatcgag 540

gcataggaat ttggtgtcca atgagagaat caatagaggt ggtggaaagc aaactaataa 600

tggacggaaa ttttctgtac ggtctgctat tttggctact ccatctggag aacggacgat 660

gacatcggaa cagatggtct atgatgtggt tttgaggcag gcagccttgg tgaagaggca 720

actgagatct accaatgagt tagaagtgaa gccggatata cctattccgg ggaatttggg 780

cttgttgagt gaagcatatg ataggtgtgg tgaagtatgt gcagagtatg caaagacgtt 840

taacttagga actatgctaa tgactcccga gagaagaagg gctatctggg caatatatgt 900

atggtgcaga agaacagatg aacttgttga tggcccaaac gcatcatata ttaccccggc 960

agccttagat aggtgggaaa ataggctaga agatgttttc aatgggcggc catttgacat 1020

gctcgatggt gctttgtccg atacagtttc taactttcca gttgatattc agccattcag 1080

agatatgatt gaaggaatgc gtatggactt gagaaaatcg agatacaaaa acttcgacga 1140

actatacctt tattgttatt atgttgctgg tacggttggg ttgatgagtg ttccaattat 1200

gggtatcgcc cctgaatcaa aggcaacaac agagagcgta tataatgctg ctttggctct 1260

ggggatcgca aatcaattaa ctaacatact cagagatgtt ggagaagatg ccagaagagg 1320

aagagtctac ttgcctcaag atgaattagc acaggcaggt ctatccgatg aagatatatt 1380

tgctggaagg gtgaccgata aatggagaat ctttatgaag aaacaaatac atagggcaag 1440

aaagttcttt gatgaggcag agaaaggcgt gacagaattg agctcagcta gtagattccc 1500

tgtatgggca tctttggtct tgtaccgcaa aatactagat gagattgaag ccaatgacta 1560

caacaacttc acaaagagag catatgtgag caaatcaaat atgctcaagg gactttttag 1620

caatttcaag ggatcgaaga gaggaagcaa cgcgacaaca acgctcgtag gtttggctcc 1680

atgtgaaacg tacattgcca tagatgatag aggtcctatt ggcataacat tttgaggctc 1740

ttgttaagaa ggtaagagga gttaaagaca cataatttgc tccacatttt ggtaaattat 1800

ccataggatt attaaagtaa aaagttgtgt ttttttttaa aaagaagtat aaggtattaa 1860

aatttgttgg agaggaaaat atagtgaggt aacttagaat ttgtatgcaa aagatgcaaa 1920

ctaagatgga aaatttatag tgaaaaaact aagtgtggag tcaagactaa tgtggcccat 1980

tatgggtccc taaatggttg tttaggtgga aatcatagtg aagttgcaat gactatgtat 2040

agtcatgtcg taatttacat ggcataatta aattttgaga tataaatttt taaattttga 2100

tg 2102

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增YFT2基因全长正向引物

<400> 6

tggccattgt tgaaagagag 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增YFT2基因全长反向引物

<400> 7

tcatgcttta tctttgaaga gagg 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增YFT2启动子正向引物

<400> 8

aaagaggaac aaaagaggca agaac 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 扩增YFT2启动子反向引物

<400> 9

ttacacaaat tccaccctct ctttc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 鉴定YFT2 5’端表达量的PCR正向引物

<400> 10

tgaaagagag ggtggaattt gtaag 25

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 鉴定YFT2 5’端表达量的PCR反向引物

<400> 11

gaccacagac aggcaaacca ac 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 鉴定YFT2 3’端表达量的PCR正向引物

<400> 12

ggaagggtga ccgataaatg gag 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 鉴定YFT2 3’端表达量的PCR反向引物

<400> 13

gagaggcagt ttttgtagga ggc 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 内参ACTIN 正向引物

<400> 14

ttgctgaccg tatgagcaag 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 内参ACTIN 反向引物

<400> 15

ggacaatgga tggaccagac 20

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PSY1-CDS-5'-Hind III

<400> 16

ttcttgaagc ttatgtctgt tgccttgtta tgggtt 36

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PSY1-CDS-3'-Xba I

<400> 17

cttcattttc tagattatct ttgaagagag gcagt 35

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hygromycin-F

<400> 18

ggacattgtt ggagccgaaa tccgc 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Hygromycin-R

<400> 19

gggcgaagaa tctcgtgctt tcagc 25

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GSP-5'RACE

<400> 20

gattacgcca agcttgccct tcttctctcg ggagtcatta gc 42

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GSP-5'RACE-nest

<400> 21

gattacgcca agcttgatgg agtagccaaa atagcagacc 40

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GSP-3'RACE

<400> 22

gattacgcca agctttgctg gaagggtgac cgataaatgg ag 42

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GSP-3'RACE-nest

<400> 23

gattacgcca agcttgcaga gaaaggcgtg acagaattga gc 42

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PSY1-cDNA-F

<400> 24

aaaccaacaa attgcattct cc 22

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PSY1-cDNA-R

<400> 25

ggtatatcaa ttatcatgcc cacag 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PSY1-long-cDNA-R

<400> 26

tatgccatgt aaattacgac atgac 25

Claims

1.一种黄果番茄果色调控基因YFT2，其DNA序列如SED ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的黄果番茄果色调控基因YFT2，其特征在于，其编码的蛋白的氨基酸序列如SED ID NO:2所示。

3.如权利要求1所述的黄果番茄果色调控基因YFT2，其特征在于，所述调控基因YFT2的前体mRNA具有两种可变的如SED ID NO:4和SED ID NO:5所示的剪切形式。

4.一种黄果番茄果色调控蛋白，其氨基酸序列如SED ID NO:2所示。

5.一种黄果番茄果色调控基因YFT2的启动子，其特征在于，编码所述启动子的碱基序列如SED ID NO:3所示。

6.一种黄果番茄果色调控基因YFT2的可变剪切子，其可变的mRNA序列如SED ID NO:4所示。

7.一种黄果番茄果色调控基因YFT2的可变剪切子，其可变的mRNA序列如SED ID NO:5所示。

8.一种如权利要求1-3中任一项所述的黄果番茄果色调控基因YFT2、权利要求4所述的黄果番茄果色调控蛋白、权利要求5所述的启动子、权利要求6所述的可变剪切子、或权利要求7所述的可变剪切子在调控番茄黄果色中的应用。

9.一种如权利要求1-3中任一项所述的黄果番茄果色调控基因YFT2、权利要求4所述的黄果番茄果色调控蛋白、权利要求5所述的启动子、权利要求6所述的可变剪切子、或权利要求7所述的可变剪切子在番茄育种中的应用。