JP2019107015A - リガーゼ支援核酸環状化及び増幅 - Google Patents

Abstract

【課題】標的ＤＮＡが断片化されていて、配列の長さが約１０００ヌクレオチド未満である場合、従来法では、増幅速度の低下、特に標的ＤＮＡの末端の近くの重要な配列の脱落、及び非常に配列に偏った増幅をもたらす。そのため、短い断片化されたＤＮＡを非特異的に増幅するための効果的な方法を提供する。【解決手段】精製工程が介在しない、単一の反応器での線状ＤＮＡ由来の一本鎖ＤＮＡ環の生成及び増幅のための方法が開示される。一本鎖ＤＮＡ環は、鋳型非依存性一本鎖ＤＮＡライゲーションによって生成される。また、血液から抽出した循環する核酸の全ゲノム増幅が開示され、実施するためのキットも開示される。【選択図】図１

Description

本発明は、一般に、鋳型非依存性一本鎖ＤＮＡライゲーションによって一本鎖もしくは二本鎖線状ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環を生成することを伴う核酸アッセイに関する。それはさらに、ローリングサークル増幅による一本鎖ＤＮＡ環の増幅及び／又は検出に関する。一本鎖ＤＮＡ環の生成及びその後のＤＮＡ増幅は、単離及び／又は精製工程を介さずに単一の反応器で実施される。これらの方法を実施するためのキットも提供される。

ＤＮＡ増幅は、標的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を複製してその複数のコピーを生成するプロセスである。ｄｓＤＮＡの個々の鎖は、逆平行で相補的であるので、各々の鎖は、その相補鎖を生成するための鋳型鎖として用いることができる。鋳型鎖は全体として、又は末端切断部分として保存され、相補鎖はＤＮＡポリメラーゼによってデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）から構築される。相補鎖合成は、鋳型鎖とハイブリダイズするプライマー配列の３’末端から出発して５’→３’方向に進む。

全ゲノム増幅（ＷＧＡ）は、標的ＤＮＡの非特異的増幅を伴う。ＷＧＡは、多くの場合、鎖置換活性を有する高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼ）とともに標的ＤＮＡの複数の位置でＤＮＡ合成を開始させるためのランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いる多置換増幅（ＭＤＡ）技法によって達成される。たとえＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、米国）及びＲｅｐｌｉＧ（Ｑｉａｇｅｎ）キットなどの現在利用できる市販のＷＧＡ系が、高分子量の標的ＤＮＡで最適な結果を提供するとしても、標的ＤＮＡが短く、かつ／又は高度に断片化されている場合には、これらの系の成績は悪い。標的ＤＮＡが断片化されていて、配列の長さが約１０００ヌクレオチド未満である場合、従来法を用いる標的ＤＮＡの増幅は、結果として増幅速度の低下、特に標的ＤＮＡの末端の近くの重要な配列の脱落、及び非常に配列に偏った増幅をもたらす。鋳型ＤＮＡの長さが短くなるほど、ＭＤＡ反応において複数回プライミングされた鎖の尤度は低下する。このことは、より短い断片の増幅可能性を低下させる。そのため、短い断片化されたＤＮＡを非特異的に増幅するための効果的な方法が非常に望ましい。

ライゲーション媒介ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、断片化されたｄｓＤＮＡを増幅するために使用されている。しかし、断片化されたＤＮＡのごく一部だけしかこれらの反応において増幅されず、不適切なゲノムカバー度を導く。断片化された標的ｄｓＤＮＡを効率的に増幅するためには、それらを最初に修復し、その後に平滑末端ライゲーションによって鎖状体化して、１０００塩基対（ｂｐ）よりも長い配列を生成すればよい。しかし、標的ＤＮＡの濃度が比較的高いと、しばしば鎖状体化及びその後の増幅を促進することが必要とされる。二本鎖標的ＤＮＡの環状化は、ＭＤＡ、ＷＧＡ、高分岐ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）及び大規模並列ＤＮＡシークエンシングを含む、様々な核酸に基づくアッセイでも用いられている。断片化されたｄｓＤＮＡを効率的に環状化し増幅するためには、断片化されたＤＮＡの二本鎖末端を最初に修復し、その後に平滑末端ライゲーションして二本鎖ＤＮＡ環を形成する。しかし、長さが５００ｂｐ未満の二本鎖ＤＮＡ断片を環状化することは困難である。

二本鎖ＤＮＡは、変性させて一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を生成することができ、一本鎖ＤＮＡはリガーゼを用いる鋳型依存性分子内ライゲーション反応においてさらに環状化させることができる。しかし、標的ＤＮＡの事前の配列情報が、鋳型依存性環状化を実施するために必要とされる。ｓｓＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションも文書化されている。例えば、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＰｈａｇｅ（商標）ＲＮＡリガーゼＩＩ又はＴｈｅｒｍｏＰｈａｇｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｋａｒｉａ、Ｍａｔｉｓ、アイスランド）或いはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州、米国）という商標名で市販されている）は、デジタルＤＮＡボールを作成するために、並びに／又はＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡなどの遺伝子座特異的切断及び増幅を行うために使用されている。ｍＲＮＡの５’末端断片から調製した線状一本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子も、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼを用いる環状化の後、ローリングサークル複製によって増幅された。センスＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列をｃＤＮＡに適切に組み込むことにより、環状化されたｃＤＮＡ鋳型は、転写基材として働き、従って生体試料中のｍＲＮＡ分子の増幅に影響を及ぼすことが示されている。さらに、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼは、ｃＤＮＡ末端のランダム増幅（ＲＡＣＥ）のためにｃＤＮＡ末端を増幅するために使用されている。限られた量の断片化されたＤＮＡから、ローリングサークル増幅のためのＤＮＡ鋳型も、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼを用いることによって生成されている。この方法は、線状の断片化されたｄｓＤＮＡを変性させて線状ｓｓＤＮＡ断片を得、線状ｓｓＤＮＡとＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを連結して一本鎖ＤＮＡ環を得、その後ＲＣＡによってランダムプライマー及びＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖ＤＮＡ環を増幅することを伴った。しかし、反応条件を最適化させた後でさえ、生成された一本鎖環状ＤＮＡの量は非常に変動し、配列依存性であった。例えば、５’Ｇ及び３’Ｔヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、同一のライゲーション条件下で５’Ａ及び３’Ｃを含むその相補オリゴヌクレオチドよりも著しく良好に連結された。さらに、分子内ライゲーション効率は、同一か又は非常に似たサイズを有するがヌクレオチド配列がわずかに異なる線状ｓｓＤＮＡ配列の間で変動した。この効率は異なるサイズ（例えば、サイズが１００塩基から数キロベースに及ぶ配列長）の線状ｓｓＤＮＡ配列間でも変動した。さらに、ライゲーション−増幅反応の全ての試みは中間の単離、精製及び／又はクリーニング工程を必然的に含み、従ってライゲーション−増幅ワークフローを扱いにくいものにした。例えば、環状化とそれに続くローリングサークル増幅による、断片化されたＤＮＡからなる法医学試料の分析は、５’ＤＮＡリン酸化、アダプターライゲーション、ＤＮＡ環状化、及び全ゲノム増幅を含む多数の工程で実行された。各々の工程反応は、次の工程を実施する前に反応クリーンアップに付した。ライゲーション及び増幅を単一の反応器で実施した場合に、増幅の利点は認められなかった。しかし、多段階プロセスは多くの場合、鋳型ＤＮＡを失い、分析の失敗という結果をもたらした。そのため、配列の偏りも、介在するクリーニング工程もない、短いＤＮＡ配列を単一の反応器で非特異的に増幅するための効率的な方法が非常に望ましい。

国際公開第２０１０／０９４０４０号

一部の実施形態では、線状ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環を生成するための方法が提供される。この方法は、線状ＤＮＡを準備する工程、リン酸供与体の存在下でポリヌクレオチドキナーゼとともに線状ＤＮＡをインキュベートすることによってそれを末端修復して、５’末端にリン酸基を有し、３’末端にヒドロキシル基を有するライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成する工程、及び、一本鎖ＤＮＡ環を生成するための、修復したライゲーション可能なＤＮＡ配列のリガーゼによる分子内ライゲーションを実施する工程を含む。この方法の全ての工程は、単離もしくは精製工程を介さずに単一の反応器で実施される。リン酸供与体は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）又はその組合せであってよい。線状ＤＮＡは、二本鎖か又は一本鎖ＤＮＡのいずれかであってよい。ＤＮＡは、循環ＤＮＡなどの断片化されたＤＮＡであってよい。ライゲーション可能なＤＮＡは、二本鎖形態である場合、分子内ライゲーション反応の前に変性させる必要がある。一本鎖ＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションの能力のあるプレ−アデニル化リガーゼを、ライゲーション反応に用いることができる。

一部の実施形態では、線状ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環を生成するための方法が提供され、該方法は分子内ライゲーション工程の前にＤＮＡプレ−アデニル化工程を用いる。線状ＤＮＡは、所望により、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の存在下でポリヌクレオチドキナーゼとともにインキュベートされて、５’末端にリン酸基を有し、３’末端にヒドロキシル基を含むライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成することができる。線状ＤＮＡが非常に断片化された形態である場合、ライゲーション可能なＤＮＡ配列を線状ＤＮＡから生成することが好ましいことがある。その後、線状ＤＮＡ又はライゲーション可能なＤＮＡ配列をＡＴＰの存在下でアデニル化酵素とともにインキュベートして、５’アデニル化ＤＮＡ配列を生成する。その後、５’アデニル化ＤＮＡ配列を、５’アデニル化ＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションの能力のある非アデニル化リガーゼとともにインキュベートして、一本鎖ＤＮＡ環を生成する。この方法の全ての工程は、単離もしくは精製工程を介さずに単一の反応器で実施される。非アデニル化リガーゼがＡＴＰ依存性リガーゼである場合、ＡＴＰは、分子内ライゲーション反応の前に反応混合物から（例えば、反応混合物をホスファターゼで処理することにより）除去されているべきでありうる。５’アデニル化ＤＮＡが二本鎖形態である場合、それは分子内ライゲーション反応の前に変性させる必要がある。

本発明のこれら及びその他の特徴、態様及び利点は、添付の図を参照して以下の詳細な説明を読むとより良く理解されるであろう。

断片化されたｄｓＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅の一実施形態の模式図を示す図である。 健康な個体の血漿から単離した循環ＤＮＡのサイズプロフィールを示す図である。 異なるリガーゼを用いて血液から抽出された循環ＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅を示す図である。 ４つの異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座の感受性がありバランスのとれたＤＮＡ増幅のためのリガーゼ支援全ゲノム増幅の有効性を示す図である。 １２の異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座の感受性がありバランスのとれたＤＮＡ増幅のためのリガーゼ支援全ゲノム増幅の有効性を示す図である。 異なる反応及び緩衝条件でのリガーゼ支援全ゲノム増幅の効率を示す図である。 リガーゼ支援全ゲノム増幅における高分子量ゲノムＤＮＡの増幅の抑制を示す図である。 ポリヌクレオチドキナーゼを用いる断片化されたＤＮＡのプロセシング（例えば、末端修復）とその後のプロセシングされた断片化されたＤＮＡのリガーゼ支援増幅を含むリガーゼ支援全ゲノム増幅の模式図を示す図である。 ＧＴＰの存在下、ＰＮＫ及びＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）を用いる、断片化されたＤＮＡのリガーゼ支援増幅の単一管反応の模式図を示す図である。 ＤＹＳ１４雄特異的マーカーがインプットＤＮＡから作成したライブラリーを用いて検出される、雄−雌血漿／血液を用いる単一管リガーゼ支援増幅反応を示す図である。 断片化されたＤＮＡのリン酸化及びプレ−アデニル化とその後の実質的非アデニル化リガーゼを用いるライゲーションの模式図を示す図である。 実質的非アデニル化リガーゼを用いるプレ−アデニル化ＤＮＡ配列の環状化の効率の向上を示す図である。 標的ＤＮＡ配列がプレ−アデニル化された場合及びライゲーションが非アデニル化リガーゼを用いて実施された場合のリガーゼ支援全ゲノム増幅の効率の向上を示す図である。

以下の詳細な説明は例示的なものであり、本発明又は本発明の使用を制限することを目的としない。明細書全体を通して、特定の用語の例示は、限定されない例と考慮されるべきである。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに指示されている場合を除いて複数形への言及が含まれる。本明細書において明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用される近似を表す語は、その関連する基本機能を変えることなく許容範囲内で変化しうる任意の量的表現を修飾するために適用されてよい。従って、「約」などの用語によって修飾された値は、特定される正確な値に限定されない。別に指定されない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される構成成分の量、分子量などの性質、反応条件などを表す全ての数は、全ての例において「約」という用語で修飾されていると理解される。従って、他にそうでないことが示されていない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲で示される数値パラメータは本発明によって得ようとする望ましい性質によって変化する可能性のある近似値である。少なくとも、特許請求の範囲と同等物の学説の適用を制限する試みではなく、各々の数値パラメータは、少なくとも報告される有効数字の数を考慮し、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。必要な場合には、範囲が提供されており、それらの範囲はその間のあらゆる下位範囲を含む。特許請求される本発明の主題をより明白かつ簡潔に記載し示すために、以下の説明及び添付される特許請求の範囲で使用される特定の用語に対して以下の定義が与えられる。

本明細書において、用語「ヌクレオシド」とは、核酸塩基（ヌクレオベース）が糖部分に結合しているグリコシルアミン化合物をさす。「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドリン酸をさす。ヌクレオチドは、表１に記載されるようにそのヌクレオシドに対応するアルファベット文字（文字呼称）を用いて表すことができる。例えば、Ａはアデノシン（ヌクレオベースを含有するヌクレオシド、アデニン）を意味し、Ｃはシチジンを意味し、Ｇはグアノシンを意味し、Ｕはウリジンを意味し、Ｔはチミジン（５−メチルウリジン）を意味する。ＷはＡか又はＴ／Ｕのいずれかを意味し、ＳはＧか又はＣのいずれかを意味する。Ｎはランダムヌクレオシドを表し、ｄＮＴＰは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸をさす。Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ／Ｕのいずれであってもよい。

本明細書において、用語「ヌクレオチド類似体」とは、天然に存在するヌクレオチドに構造的に類似する化合物をさす。ヌクレオチド類似体は、変更されたリン酸主鎖、糖部分、ヌクレオベース、又はその組合せを有してよい。ヌクレオチド類似体は、天然ヌクレオチド、合成ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、又は代替置換部分（例えば、イノシン）であってよい。一般に、変更されたヌクレオベースをもつヌクレオチド類似体は、とりわけ、異なる塩基対形成及び塩基スタッキング特性を付与する。本明細書において、用語「ＬＮＡ（ロックド核酸）ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの糖部分がリボ核酸（ＲＮＡ）を模倣する糖コンホメーションにロックされた二環式フラノース単位を含有するヌクレオチド類似体をさす。デオキシリボヌクレオチド（又はリボヌクレオチド）からＬＮＡヌクレオチドへの構造変化は、化学的見地から限られている、つまり、２’位と４’位の炭素原子間のさらなる結合の導入である（例えば、２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合、例えば、Ｓｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，４，４５５−４５６，１９９８、又はＫｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５４，３６０７−３６３０，１９９８参照）。ＬＮＡヌクレオチドにおいてフラノース単位の２’位及び４’位は、Ｏ−メチレン（例えば、オキシ−ＬＮＡ：２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチド）、Ｓ−メチレン（チオ−ＬＮＡ）、又はＮＨ−メチレン部分（アミノ−ＬＮＡ）、及び同類のものによって結合されてよい。そのような結合は、フラノース環のコンホメーションの自由度を制限する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、相補的一本鎖ＲＮＡ、及び相補的一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性の向上を示す。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、Ａ型（ＲＮＡ様）の二重鎖コンホメーションを誘導することができる。改変されたリン酸塩−糖骨格（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ）を有するヌクレオチド類似体は、多くの場合、とりわけ、二次構造形成などの鎖の性質を修飾する。文字呼称の前の星（＊）記号は、その文字で指定されるヌクレオチドがホスホロチオエート修飾ヌクレオチドであることを示す。例えば、＊Ｎは、ホスホロチオエート修飾ランダムヌクレオチドを表す。文字呼称の前のプラス（＋）記号は、その文字で指定されるヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドであることを示す。例えば、＋Ａは、アデノシンＬＮＡヌクレオチドを表し、＋Ｎは、ロックドランダムヌクレオチド（すなわちランダムＬＮＡヌクレオチド）を表す。

本明細書において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのオリゴマーをさす。本明細書において用いられる用語「核酸」とは、ヌクレオチドのポリマーをさす。本明細書において用いられる用語「配列」とは、オリゴヌクレオチド又は核酸のヌクレオチド配列をさす。本明細書全体を通して、オリゴヌクレオチド又は核酸が一連の文字で表される場合はいつでも、ヌクレオチドは、左から右へ５’→３’の順序である。例えば、文字配列（Ｗ）_x（Ｎ）_y（Ｓ）_z（式中、ｘ＝２、ｙ＝３及びｚ＝１）で表されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド配列ＷＷＮＮＮＳを表し、この際、Ｗは５’末端ヌクレオチドであり、Ｓは３’末端ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの類似体（例えば、ホスホロチオエート類似体）であってよい。オリゴヌクレオチド又は核酸には、修飾された塩基及び／又は骨格（例えば、修飾されたリン酸結合又は修飾された糖部分）を含むこともできる。安定性及び／又はその他の利点を核酸に与える合成骨格の限定されない例としては、ホスホロチオエート結合、ペプチド核酸、ロックド核酸、キシロース核酸、又はそれらの類似体を挙げることができる。

本明細書において、用語「プライマー」とは、標的核酸配列（例えば、増幅させるＤＮＡ鋳型）とハイブリダイズして核酸合成反応を開始させる短い線状のオリゴヌクレオチドをさす。プライマーは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はキメラ配列であってよい。プライマーは、天然、合成、又は修飾ヌクレオチドを含んでよい。プライマーの長さの上限と下限は経験的に求められる。プライマー長の下限は、核酸増幅反応条件下での標的核酸とのハイブリダイゼーションによって安定した二重鎖を形成するために必要とされる最小の長さである。非常に短いプライマー（通常３ヌクレオチド長未満）は、そのようなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸と熱力学的に安定した二重鎖を形成しない。上限は、多くの場合、標的核酸の予め決められた核酸配列以外の領域で二本鎖形成ができる可能性によって決まる。一般に、適したプライマー長は、約３ヌクレオチド長から約４０ヌクレオチド長の範囲内である。

本明細書において、用語「ランダムプライマー」とは、オリゴヌクレオチド配列の任意の所与位置で、該所与位置が可能性のあるヌクレオチド又はそれらの類似体のいずれからも構成されうるような方法（完全ランダム化）でヌクレオチドをランダム化することによって生成されたプライマー配列の混合物をさす。従ってランダムプライマーは、配列内のヌクレオチドのあらゆる可能性のある組合せからなる、オリゴヌクレオチド配列のランダムな混合物である。例えば、六量体のランダムプライマーは、配列ＮＮＮＮＮＮ又は（Ｎ）₆で表すことができる。六量体ランダムＤＮＡプライマーは、４つのＤＮＡヌクレオチド、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴのあらゆる可能性のある六量体の組合せからなり、結果として４⁶（４，０９６）の特有の六量体ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を含むランダム混合物となる。ランダムプライマーは、標的核酸の配列が不明である場合か、又は全ゲノム増幅反応のために、核酸合成反応を開始させるために効果的に使用することができる。

本明細書に記載されるように、用語「部分拘束プライマー」とは、オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチドの一部を完全にランダム化すること（すなわち、ヌクレオチドは、Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ、又はそれらの類似体のいずれかであってよい）一方で、一部のその他のヌクレオチドの完全なランダム化を制限する（すなわち、特定の位置でのヌクレオチドのランダム化は、可能性のある組合せＡ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ、又はそれらの類似体よりも程度が低い）ことによって生成されたプライマー配列の混合物をさす。例えば、ＷＮＮＮＮＮで表される部分拘束ＤＮＡ六量体プライマーは、混合物中の全ての配列の５’末端ヌクレオチドがＡ又はＴであるプライマー配列の混合物を表す。ここで、５’末端ヌクレオチドは、完全ランダムＤＮＡプライマー（ＮＮＮＮＮＮ）の最大４の可能性のある組合せ（Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）とは対照的に、２つの可能性のある組合せ（Ａ又はＴ）に拘束される。部分拘束プライマーの適したプライマー長は、約３ヌクレオチド長から約１５ヌクレオチド長の範囲内であってよい。

本明細書に記載されるように、用語「末端ミスマッチプライマー−二量体構造を有する部分拘束プライマー」とは、部分拘束プライマー中の２つの個別のプライマー配列が、３以上のヌクレオチドの内部相同性で互いに分子間でハイブリダイズして、陥凹末端を持たないプライマー−二量体構造、又は単一ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−二量体構造、又は２つのヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−二量体構造を形成する場合、プライマー−二量体構造の両方の３’末端ヌクレオチドにヌクレオチドミスマッチ（すなわちヌクレオチドが塩基対形成しない）が存在する、部分拘束プライマー配列をさす。例えば、ＷＮＮＮＳで表される部分拘束五量体プライマーは、分子間でハイブリダイズして陥凹末端を持たないプライマー−二量体構造を形成する場合に、両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。プライマー−二量体構造には、３ヌクレオチドの内部相同性が存在する（すなわち、分子間ハイブリダイゼーションによって陥凹末端を持たないプライマー−二量体構造が形成される場合に、ＷＮＮＮＳの３つのランダムヌクレオチドは、互いに塩基対形成することがある）。しかし、このプライマー例は、分子間でハイブリダイズして単一ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を含むプライマー−二量体構造を形成する場合に末端ミスマッチをもたらさない。同様に、ＷＷＮＮＮＳで表される部分拘束六量体プライマーは、分子間でハイブリダイズして陥凹末端を持たないプライマー−二量体構造を形成する場合に、両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。さらに、このプライマー例は、分子間でハイブリダイズして単一ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−二量体構造を形成する場合でさえ、両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。ＷＷＷＮＮＮＳで表される部分拘束七量体プライマーは、分子間でハイブリダイズして陥凹末端を持たないプライマー−二量体構造を形成する場合に、両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。さらに、このプライマー例は、分子間でハイブリダイズして、単一ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−二量体構造を形成するか、又は２−ヌクレオチド塩基３’陥凹末端を有するプライマー−二量体構造を形成する場合に、両方の３’末端ヌクレオチドに末端ミスマッチをもたらす。

本明細書において、用語「ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）」とは、ローリングサークル機構によって、環状の核酸鋳型（例えば、一本鎖ＤＮＡ環）を増幅する核酸増幅反応をさす。ローリングサークル増幅反応は、プライマーと、環状の、多くの場合一本鎖の、核酸鋳型とのハイブリダイゼーションによって開始される。次に、核酸ポリメラーゼが、環状の核酸鋳型の周囲を連続的に前進して、核酸鋳型の配列を何度も繰り返して複製すること（ローリングサークル機構）によって、環状の核酸鋳型にハイブリダイズしたプライマーを伸長させる。ローリングサークル増幅は、一般に、環状の核酸鋳型配列のタンデム反復単位を含むコンカテマーを生成する。ローリングサークル増幅は、線状の増幅速度を示す線状ＲＣＡ（ＬＲＣＡ）（例えば、単一の特異的プライマーを用いるＲＣＡ）であってもよいし、指数関数的な増幅速度を示す指数関数的ＲＣＡ（ＥＲＣＡ）であってもよい。ローリングサークル増幅はまた、複数のプライマーを用いて実施して（多重プライミング（ｍｕｌｔｉｐｌｙ ｐｒｉｍｅｄ）ローリングサークル増幅又はＭＰＲＣＡ）超分岐コンカテマーを導くこともできる。例えば、二重プライミングＲＣＡにおいて、一方のプライマーは、線状ＲＣＡでのように、環状の核酸鋳型に対して相補的であってよいが、もう一方はＲＣＡ産物のタンデム反復単位核酸配列と相補的であってよい。その結果として、二重プライミングＲＣＡは、両方のプライマーの関与する多重ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、及び鎖置換事象の分枝カスケードを特徴とする指数関数的（幾何学的）増幅速度をもつ連鎖反応として進行することができる。これは、多くの場合、別のコンカテマー二本鎖核酸増幅産物のセットを生成する。ローリングサークル増幅は、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどの適した核酸ポリメラーゼを用いて等温条件下、インビトロで実施されてよい。

本明細書において、多置換増幅（ＭＤＡ）とは、増幅がプライマーを変性核酸にアニーリングした後に鎖置換核酸合成する工程を含む核酸増幅法をさす。核酸が鎖置換によって合成されるにつれて、プライミング事象の数は次第に増加して、超分岐核酸構造のネットワークが形成される。ＭＤＡは、配列の偏りが制限された高分子量ＤＮＡを少量のゲノムＤＮＡ試料から生成するための全ゲノム増幅に非常に有用である。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ又はＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大きい断片などの、その核酸合成活性の他に鎖置換活性を有する鎖置換核酸ポリメラーゼは、ＭＤＡで使用することができる。ＭＤＡは、配列の偏りが制限された増幅を実現するために、ランダムプライマーを用いて、等温反応条件下で実施される場合が多い。

本明細書において、用語「プレ−アデニル化リガーゼ」とは、そのアデニル化形態のリガーゼをさす。リガーゼのアデニル化形態は、ＡＴＰ又はｄＡＴＰの不在下で５’ホスホリル基及び３’ヒドロキシル基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションをする能力がある。プレ−アデニル化リガーゼを用いるライゲーションとは、反応で使用されるリガーゼ分子が高い割合でアデニル化形態であるライゲーション反応をさす。概して、リガーゼ分子の６０％超がそのアデニル化形態であってよい。一部の実施形態では、プレ−アデニル化リガーゼを用いてライゲーション反応を実施する場合、反応に用いるリガーゼ分子の７０％超がそのアデニル化形態であってよい。一部のその他の実施形態では、プレ−アデニル化リガーゼを用いてライゲーション反応を実施する場合、反応に用いるリガーゼ分子の８０％、９０％、又は９５％超がそのアデニル化形態であってよい。

本明細書において、用語「アデニル化酵素」とは、核酸配列をアデニル化して５’アデニル化核酸を生成する能力のある酵素をさす。本明細書において用いられる５’アデニル化核酸とは、ヒドロキシル基をその３’末端に有し、アデニル化末端ヌクレオチドをその５’末端に有する核酸配列をさす。例えば、５’アデニル化ＤＮＡ（ＡｐｐＤＮＡ）とは、その５’末端がアデニル化され、その３’末端にヒドロキシル基を有するＤＮＡ配列をさす。

本明細書において、用語「非アデニル化リガーゼ」とは、その非アデニル化形態のリガーゼをさす。リガーゼの非アデニル化形態は、ＡＴＰ又はｄＡＴＰの不在下で３’ヒドロキシル基を有する線状５’−アデニル化ｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションをする能力がある。非アデニル化リガーゼを用いるライゲーションとは、反応で使用されるリガーゼ分子が高い割合で非アデニル化形態であるライゲーション反応をさす。概して、リガーゼ分子の６０％超がその非アデニル化形態であってよい。一部の実施形態では、非アデニル化リガーゼを用いてライゲーション反応を実施する場合、反応に用いるリガーゼ分子の７０％超がその非アデニル化形態であってよい。一部のその他の実施形態では、非アデニル化リガーゼを用いてライゲーション反応を実施する場合、反応に用いるリガーゼ分子の８０％、９０％又は９５％超がその非アデニル化形態であってよい。

一部の実施形態では、線状ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環を生成するための方法が提供される。線状ＤＮＡは、断片化された線状ＤＮＡであってよい。断片化されたＤＮＡは、循環ＤＮＡ、非常に古いＤＮＡ又は環境曝露によって劣化したＤＮＡ、或いはホルマリンに固定されたＤＮＡであってよい。断片化された線状ＤＮＡの長さは、１５ヌクレオチドから２１０００ヌクレオチドに及んでよい。断片化された線状ＤＮＡは、ライゲーションできない末端を有する配列を含むことがある。例えば、線状ＤＮＡは、５’ヒドロキシル基か又は３’ホスホリル基のいずれか、或いは両方を有することができる。一部の実施形態では、この方法は、線状ＤＮＡを準備する工程、リン酸供与体の存在下でポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）とともに線状ＤＮＡをインキュベートすることによってそれを末端修復して、５’末端にリン酸基を有し、３’末端にヒドロキシル基を有するライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成する工程、及び、ライゲーション可能なＤＮＡ配列のリガーゼによる分子内ライゲーションを実施して、一本鎖ＤＮＡ環を生成する工程を含む。末端修復には、ライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成するための、５’末端ヌクレオチドのリン酸化、３’末端ヌクレオチドの脱リン酸化又は両方が含まれうる。末端修復したライゲーション可能なＤＮＡは、二本鎖形態である場合、分子内ライゲーション反応の前に変性させる必要がある。一部の実施形態では、ＤＮＡをＰＮＫ反応の前に変性させる。一本鎖ＤＮＡのリン酸化又は脱リン酸化は、通常、二本鎖平滑末端又は５’陥凹末端のリン酸化又は脱リン酸化よりも効率的である。リン酸供与体及び反応混合物中のその濃度は、それがその後の分子内ライゲーション反応を阻害しないように選択される。例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）又はデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）以外のいずれの適したリン酸供与体も、ＰＮＫを用いる末端修復反応に使用されてよい。適したリン酸供与体としては、限定されるものではないが、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）又はデオキシチミン三リン酸（ｄＴＴＰ）が挙げられる。一部の実施形態では、プレ−アデニル化リガーゼは、ライゲーション反応に使用される。鋳型非依存性一本鎖ＤＮＡ配列の可能ないずれのプレ−アデニル化リガーゼも用いることができる。一部の実施形態では、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼの実質的にアデニル化された形態が鋳型非依存性分子内ライゲーション反応に使用される。キナーゼ反応及びライゲーション反応は、ＡＴＰ及び／又はｄＡＴＰの不在下で実施される。この方法の全ての工程は、単離もしくは精製工程を介さずに単一の反応器で実施される。この方法の個々の工程は、中間の精製もしくは単離工程を含まずに同時に又は順次に実施することができる。例えば、ＰＮＫは、線状標的ＤＮＡの末端修復を促進するために、ＧＴＰとともに、線状標的ＤＮＡを含む核酸溶液を含有する反応器（例えば、エッペンドルフチューブ）に添加されてよい。５’リン酸化及び３’ホスファターゼ活性を有するいずれのＰＮＫ（例えば、Ｔ４ ＰＮＫ）も、末端修復反応に使用することができる。その各々が５’リン酸化又は３’ホスファターゼを有するＰＮＫの組合せを末端修復反応に使用してもよい。ひとたびキナーゼ反応が完了すれば、プレ−アデニル化リガーゼを同じ反応器に添加して、分子内ライゲーション反応を促進することができる。

線状ＤＮＡは、天然もしくは合成起源の二本鎖又は一本鎖ＤＮＡであってよい。ＤＮＡは、生体試料から得てもよいし（例えば、生物学的被験体から得た試料）、或いは、インビボ又はインビトロで未知の物体から見出してもよい（例えば、法医学調査中に得たＤＮＡ） 例えば、それは、限定されるものではないが、生物学的被験体の体液（例えば、血液、血漿、血清、尿、乳、脳脊髄液、胸腔内液、リンパ液、涙、痰、唾液、便、肺吸引液、咽頭もしくは生殖器スワブ）、器官、組織、細胞培養、細胞分画、切片（例えば、器官又は組織の断面部分）或いは生物学的被験体から、又は特定領域（例えば、疾患細胞、又は血中循環腫瘍細胞を含有する領域）から単離した細胞から得ることができる。標的線状ＤＮＡ（すなわち目的の線状ＤＮＡ）を含有するか含有すると思われる生体試料は、真核生物起源、原核生物起源、ウイルス起源又はバクテリオファージ起源の試料であってよい。例えば、標的線状ＤＮＡは、昆虫、原虫、鳥類、魚類、爬虫類、哺乳類（例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモット、又はウサギ）、又は霊長類（例えば、チンパンジー又はヒト）から得ることができる。線状ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）であってよい。ｃＤＮＡは、逆転写酵素を用いてＲＮＡ鋳型（例えば、ｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ）から生成することができる。線状ＤＮＡは、断片化されたＤＮＡであってよく、ライゲーションできない末端ヌクレオチドを有してよい。例えば、線状ＤＮＡは、ＤＮＡリガーゼが分子内ライゲーション反応を実施することができないように、５’ヒドロキシル基及び／又は３’リン酸基を含むことがある。線状ＤＮＡは、溶液中に分散させてもよいし、固相支持体、例えばブロット、アッセイ、アレイ、スライドガラス、マイクロタイタープレート又はＥＬＩＳＡプレートの上に固定化されていてもよい。例えば、線状ＤＮＡは、プライマーを通じて基板の上に固定化されていてよく、その後環状化され増幅されてよい。

線状ＤＮＡが二本鎖形態である場合、それは分子内ライゲーション反応の前に一本鎖形態に変性させる必要がある。これは、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡ配列に変換するための当該技術分野で承認されている方法のいずれかを使用することによって実現することができる。例えば、ｄｓＤＮＡは、加熱変性させてもよいし、化学変性させてもよいし、熱化学変性させてもよい。ｄｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡの融解温度を低下させる変性剤（例えば、グリセロール、エチレングリコール、ホルムアミド、尿素又はその組合せ）を用いて化学変性させることができる。変性剤は、反応混合物に加えられる変性剤１０％（体積／体積）ごとに融解温度を５℃〜６℃低下させることができる。変性剤又は変性剤の組合せ（例えば、１０％グリセロール及び６〜７％エチレングリコール）は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、又は２５％の反応混合物（体積／体積）を含んでよい。ハイブリダイゼーション・ストリンジェンシーを低下させる塩を、低い濃度で反応緩衝液に含めて、ｄｓＤＮＡを低温で化学変性させてもよい。ｄｓＤＮＡは、例えば、９５℃でｄｓＤＮＡを加熱することによって、熱変性させることができる。

変性工程の後、生成したｓｓＤＮＡは、鋳型の不在下でｓｓＤＮＡ基質の分子内ライゲーションをする能力のあるＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼで処理されて一本鎖ＤＮＡ環を形成することができる。ライゲーション反応に使用してよい適したリガーゼとしては、限定されるものではないが、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ又は大腸菌ＤＮＡリガーゼが挙げられる。線状一本鎖ＤＮＡ分子の一本鎖ＤＮＡ環への変換は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼなどのライゲーション酵素を用いて鋳型依存性分子内ライゲーション反応によって慣習的に実施される。しかし、特にｓｓＤＮＡ分子の環状化が未知の配列及び／又はサイズのｓｓＤＮＡ分子の集団で実施される場合に、一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡの鋳型依存性分子内ライゲーションは、制限された成功しかしなかった。たとえバクテリオファージＴ４ ＲＮＡリガーゼＩが鋳型非依存性分子内ライゲーション活性を示すとしても、この活性は非常に低く、線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成する際に実際に使用するには非効率的である。

一部の実施形態では、ｓｓＤＮＡの一本鎖ＤＮＡ環への変換は、５’ホスホリル及び３’ヒドロキシル基を有する線状ｓｓＤＮＡ及び／又はｓｓＲＮＡ基質に対して良好な鋳型非依存性分子内ライゲーション活性を有する熱安定性ＲＮＡリガーゼで実施される。リガーゼは、実質的にプレ−アデニル化形態であってよい。例えば、好熱性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓに感染させるサーマスバクテリオファージＴＳ２１２６に由来するＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼを、断片化された線状ｓｓＤＮＡの環状ｓｓＤＮＡへの鋳型非依存性環状化に用いることができる。ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼなどの中温性のＲＮＡリガーゼの多くよりも熱安定性が高い（約７５℃まで安定）。ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ活性の温度範囲は、約４０℃よりも高く、例えば、約５０℃〜約７５℃でありうる。このため、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼは、より高い温度で使用されてよく、それはｓｓＤＮＡの望ましくない二次構造をさらに減らす。線状ｓｓＤＮＡの環状化は、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ以外のリガーゼによって、又はトポイソメラーゼなどのＤＮＡ結合活性を有する任意のその他の酵素を用いることによっても実現されることができる。一部の実施形態では、断片化された一本鎖ＤＮＡ分子の環状化は、線状の断片化されたｓｓＤＮＡ分子を環状化する際に高い鋳型非依存性リガーゼ活性を有する好熱性古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ ＲＮＡリガーゼ）に由来するＲＮＡリガーゼ１によって実現される。

一部の実施形態では、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼによるｓｓＤＮＡの環状化の効率を向上させる方法が提供される。ｐＨ８．０のＨＥＰＥＳ緩衝液のライゲーション反応への使用は、ライゲーション効率を向上させた。鋳型非依存性ｓｓＤＮＡライゲーションは、反応をＴＲＩＳ緩衝液（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩについて、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒにより提案される１０ｘ反応緩衝液は、０．３３Ｍ ＴＲＩＳ酢酸（ｐＨ７．５）、０．６６Ｍ酢酸カリウム、及び５ｍＭ ＤＴＴを含む）で実施した場合に非効率的であった。さらに、ライゲーション反応の必須補因子であるマンガンは、アルカリ条件下で急速に酸化され、ＴＲＩＳの存在下で沈殿を生じる。Ｍｎ²⁺のＭｎ³⁺への空気酸化は、Ｍｎ³⁺イオンを強く錯化することのできる陰イオンによって促進することができる。例えば、ＨＣｌでｐＨを適切に調節した等量の０．２モル／リットルＴｒｉｓ及び２ミリモル／リットルのＭｎＣｌ₂を混合した場合、色の変化は、ｐＨ９．３（ＴＲＩＳ塩基だけのｐＨ）では即座であり、ｐＨ８．５では約３分の初期のタイムラグがあり、８．３よりも低いｐＨ値では１時間以内に検出できなかった。低いｐＨでは反応が起こらなかったが、高いｐＨで観察された変化は、酸を添加することによって逆転しなかった。ＴＲＩＳ緩衝液中のマンガンの急速な酸化のために、分子内ライゲーションをＴＲＩＳ緩衝液中で実施する場合には、より高い濃度のマンガンがライゲーション反応に必須である（例えば、２．５ｍＭの終濃度へのＭｎＣｌ₂の添加）。さらに、マンガン濃度は時間とともに低下し続けるので、反応物中のマンガンの働く濃度を正確に予測することは困難となる。ライゲーション及び増幅が単一の反応器で実施される場合に、マンガンの濃度が高いほど、増幅中のポリメラーゼのエラーレートは高くなりうる。ライゲーション反応でＴＲＩＳ緩衝液をＨＥＰＥＳ緩衝液で置き換えることにより、効果的な分子内ライゲーションを、０．５ｍＭ未満のマンガンイオン濃度によって実現することができる。ＨＥＰＥＳの他には、その他のＧｏｏｄの緩衝液のいずれか（例えば、Ｇｏｏｄ，Ｎｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５（２）：４６７−４７７，１９６６、及びＧｏｏｄ，Ｎｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４：５３−６８，１９７２参照）を分子内ライゲーション反応に用いることができる。

ライゲーション反応混合物中のｓｓＤＮＡ環は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）方法によって等温条件下で増幅させることができる。ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー及びｄＮＴＰを含む増幅試薬を同じ反応器に添加して増幅反応混合物を生成し、ＲＣＡ反応を開始させてよい。増幅反応混合物には、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質などの試薬及び／又は適した増幅反応緩衝液がさらに含まれてよい。ｓｓＤＮＡ環の増幅は、ライゲーションが実施されている同じ反応器で実施される。ｓｓＤＮＡ環の単離又は精製及び／又はリガーゼの除去は、増幅反応の前に必要ではない。増幅されたＤＮＡは、ＤＮＡ検出のための現在公知の方法のいずれかによって検出されてよい。

ＲＣＡは、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼなどの当技術分野で公知のＤＮＡポリメラーゼのいずれかを使用することによって実施されてよい。それは、ランダムプライマー混合物を用いて、又は特異的プライマーを用いることにより実施されてよい。一部の実施形態では、ランダムプライマーがＲＣＡ反応に使用される。１又は複数のヌクレオチド類似体（例えば、ＬＮＡヌクレオチド、２−アミノ−Ａ、又は２−チオＴ修飾）を含むプライマー配列を使用してもよい。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性プライマー（例えば、適切な位置にホスホロチオエート基を含むプライマー配列）を増幅反応に用いる（例えば、ＮＮＮＮ＊Ｎ＊Ｎ）。一部の実施形態では、ＲＣＡは、ｓｓＤＮＡ環をランダムプライマー混合物を含むプライマー溶液と接触させて、核酸鋳型−プライマー複合体を形成すること、核酸鋳型−プライマー複合体をＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸と接触させること、並びに、核酸鋳型を増幅することにより実施されてよい。一部の実施形態では、プライマー溶液は、ＷＷＮＮＳなどの部分拘束プライマーを含む。部分拘束プライマーは、末端にミスマッチのあるプライマー−二量体構造を有しうる。一部の実施形態では、ｘ、ｙ及びｚが互いに独立した整数値であり、ｘの値が２又は３であり、ｙの値が２、３又は４であり、ｚの値が１又は２である、ヌクレオチド配列（Ｗ）_x（Ｎ）_y（Ｓ）_zからなる部分拘束プライマーが、ＲＣＡ反応に使用される。部分拘束プライマーは、１又は複数のヌクレオチド類似体を含んでよい。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドを含み、末端ミスマッチプライマーダイマー構造を有する、ヌクレアーゼ耐性、部分拘束プライマーがＲＣＡ反応に用いられる。適したプライマー配列としては、限定されるものではないが、＋Ｗ＋ＷＮＮＳ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮＳ、＋Ｗ＋ＷＮＮＮＳ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮＮＳ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮ＊Ｓ、＋Ｗ＋ＷＮＮ＊Ｓ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮＮ＊Ｓ、＋Ｗ＋ＷＮＮＮ＊Ｓ、Ｗ＋Ｗ＋Ｎ＊Ｎ＊Ｓ、＋Ｗ＋ＷＮ＊Ｎ＊Ｓ、Ｗ＋Ｗ＋ＮＮ＊Ｎ＊Ｓ、又は＋Ｗ＋ＷＮＮ＊Ｎ＊Ｓが挙げられる。一部の実施形態では、ＲＣＡ反応は、ｓｓＤＮＡ環を末端ミスマッチプライマーダイマー構造を含む部分拘束プライマー混合物から本質的になるプライマー溶液と接触させ、ｓｓＤＮＡ環を増幅することによって実施される。一部のその他の実施形態では、ＲＣＡ反応は、ｓｓＤＮＡ環を、ヌクレオチド類似体を含む部分拘束プライマー混合物から本質的になるプライマー溶液と接触させ、ｓｓＤＮＡ環を増幅することによって実施される。ｓｓＤＮＡ環のＲＣＡは、配列の脱落が減少し、増幅の偏りが減少した大量のＤＮＡを生成する。ｓｓＤＮＡライゲーション及び増幅の全プロセスは、中間の精製もしくは単離工程を含まずに、単一の管で実施されてよい。

一部の実施形態では、多置換増幅（ＭＤＡ）による制限量の線状の断片化されたＤＮＡの増幅のための方法が提供される。ＭＤＡの従来法は、線状の断片化されたＤＮＡで試みた場合、増幅速度の低下及び非常に配列に偏った増幅をもたらした。さらに、重要な配列の脱落が特に断片化されたＤＮＡの末端の近くで多くの場合観察された。これらの制限を克服するために、断片化されたｄｓＤＮＡは最初にｓｓＤＮＡに変換される。次に、ｓｓＤＮＡは、鋳型非依存性分子内ライゲーション反応によって一本鎖環状ＤＮＡ（すなわちＤＮＡ環）に変換され、それにより問題の多いＤＮＡ末端を除去する。５００ｂｐよりも短いｓｓＤＮＡ配列でさえも、ｓｓＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションを用いて環状化することができる。さらに、ｓｓＤＮＡのライゲーションが鋳型に依存しない方法で実施される場合には、標的配列の事前の知識はＤＮＡ環を作成するために必要でない。環状化の前に、断片化されたＤＮＡをＰＮＫで処理してライゲーションできない末端を修復することができる。断片化されたｓｓＤＮＡを環状化した後、環状化されたＤＮＡでＭＤＡが実施される。増幅反応は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）方法を用いることによって等温条件下で実施することができる。ＲＣＡは、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）ＲＣＡキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）などの市販のＲＣＡ増幅キットを用いて実施することができる。ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ（商標）ローリングサークル増幅は、ロックド核酸を含有するランダムプライマーを用い、それはより高い感受性及び増幅バランスを提供する。一部の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性プライマーがＲＣＡ反応に使用される。本明細書に開示される方法は、増幅感受性を向上させ、配列の脱落を減らし、よりバランスのとれた増幅を可能にする。一本鎖の断片化されたＤＮＡの鋳型非依存性環状化は、低い濃度でさえ、より短い配列で達成されうるので、リガーゼ支援全ゲノム増幅を高度に断片化されたＤＮＡ（例えば、血漿中の循環ＤＮＡ）の増幅に用いる場合、速度が速く配列包括度の向上した、よりバランスのとれたＤＮＡ増幅を達成することができる。例えば、ｓｓＤＮＡの持続長は、ｓｓＤＮＡの鋳型非依存性環状化に関して１５ヌクレオチドと低いことがある。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）をライゲーション反応に用いる場合、標準条件下で、線状のコンカテマー又は環状のコンカテマーはほとんど生成されない。さらに、環状化及び増幅反応は、ともに中間の精製もしくは単離工程を含まずに単一の反応器で実施することができ、それにより汚染の機会を減らし、増幅ワークフローを単純化することができる。リガーゼ支援全ゲノム増幅法は、限定されるものではないが、循環血漿ＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から単離された断片化されたＤＮＡ、環境条件にさらされた法医学ＤＮＡ試料又は非常に古いＤＮＡ試料を分析するために用いることができる。増幅されたライブラリーは、ｑＰＣＲ又は塩基配列決定法によって、増幅された配列の標的検出にさらに使用することができる。

ｓｓＤＮＡ断片のＤＮＡ環への事前のライゲーションとそれに続くローリングサークル増幅を含む、本明細書に記載される様々なライゲーション支援全ゲノム増幅法は、高分子量ゲノムＤＮＡよりも断片化されたＤＮＡの優先増幅をもたらす。例えば、循環ＤＮＡを含む血漿調製物は、精製プロセス中に血液細胞から放出されるゲノムＤＮＡでしばしば汚染されることがある。ＭＤＡによる全ゲノム増幅の従来法は、循環ＤＮＡとゲノムＤＮＡの両方を増幅する。対照的に、断片化された循環ＤＮＡ分子が最初にＴＳ２１２６ ＲＮＡによって環状化され、その後にＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＲＣＡによって環状化されたＤＮＡ分子が増幅される場合、循環ＤＮＡは高分子量ゲノムＤＮＡよりも優先的に増幅された。そのような、断片化されたＤＮＡのゲノムＤＮＡへの優先増幅は、診断上関連するＤＮＡを下流の分析のために優先的に増幅することができるので、診断用途に特に適している（実施例４参照）。さらに、リガーゼ支援全ゲノム増幅は、従来のＭＤＡに基づく全ゲノム増幅と比較した場合に、断片化されたＤＮＡのより強い増幅を許容する。

図１は、断片化されたｄｓＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅の一実施形態の模式図を示す。二本鎖ＤＮＡの持続長は非常に高く（約１５０ｂｐ）、その生得的な剛性は５００ｂｐ未満の断片の環状化を非常に非効率的にする。さらに、約２５０ｂｐの範囲の小型の二本鎖の断片化されたＤＮＡ分子で、末端が適切なアラインメントでない限り、環状化は非効率的である（約１０．５ｂｐ／回転）。対照的に、一本鎖の断片化されたＤＮＡの環状化の持続長は、二本鎖の断片化されたＤＮＡと比較すると非常に小さく約１５ヌクレオチドである。図１に示されるように、リガーゼ支援全ゲノム増幅において、断片化されたｄｓＤＮＡは、最初に一本鎖ＤＮＡ環に変換される。これは、断片化された二本鎖ＤＮＡを９５℃で十分な時間インキュベートしてｄｓＤＮＡを一本鎖に変性させることによって実現することができる。次に、断片化されたｓｓＤＮＡを、一本鎖ＤＮＡ基質の鋳型非依存性分子内ライゲーションの能力のあるＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼで処理して、一本鎖ＤＮＡ環を生成する。分子内ライゲーションに使用されうるリガーゼの限定されない例としては、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ、Ｍｔｈ ＲＮＡリガーゼ（ＭｔｈＲｎｌ１）、又は大腸菌リガーゼが挙げられる。次に、ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムプライマー、及びｄＮＴＰを含む増幅試薬を添加して一本鎖ＤＮＡ環のＲＣＡ反応を開始させる。ＲＣＡを用いるこのリガーゼ支援全ゲノム増幅は、従来の全ゲノム増幅法とは対照的に配列の脱落及び増幅の偏りの低下した大量のＤＮＡを生成する。そのため、それは非常に断片化されたＤＮＡでさえも増幅及び検出するために使用されうる。一本鎖ＤＮＡ環の生成及びＲＣＡによるそのその後の増幅の全プロセスは、精製工程を介さずに単一の管で行われる。

一部の実施形態では、ライゲーションできないＤＮＡ末端を修復するための断片化されたＤＮＡのプロセシングを含む、断片化されたＤＮＡのリガーゼ支援全ゲノム増幅に対して、単一管ワークフローが提供される。例えば、断片化された一本鎖ＤＮＡが５’ホスホリル基及び３’ヒドロキシル基を含まない場合、それは分子内ライゲーション反応においてライゲーションされないことがある。そのようなライゲーションできないＤＮＡ配列の存在は、リガーゼ支援全ゲノム増幅において増幅の偏りを引き起こすことがある。例えば、図８に概略的に表されるように、細胞死の間のＤＮアーゼＩＩ消化により生成されるＤＮＡ断片は、５’ヒドロキシル基、３’ホスホリル基を含むことがある。そのような５’ヒドロキシル基、３’ホスホリル基を含む二本鎖ＤＮＡ断片から生じる一本鎖ＤＮＡ断片は、分子内ライゲーション反応において環状化されない。従ってＤＮアーゼＩＩ型の切れ目は、全ゲノム増幅において標本として不十分である。一部の実施形態では、断片化されたＤＮＡは、キナーゼ（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ＴＰＫ）で処理されて断片化されたＤＮＡの５’ヒドロキシル基をリン酸化し、かつ／又は３’ホスホリル基を脱リン酸化する。キナーゼを反応に含めることにより、５’リン酸を含まないプールの断片の効率的な環状化が許容される。断片化されたＤＮＡの５’末端をキナーゼでリン酸化し、その後断片化されたＤＮＡを増幅することにより、より代表的なライブラリーが作成される。

一部の実施形態では、断片化されたｄｓＤＮＡのリン酸化修復は、Ｔ４ ＰＮＫキナーゼを用いて実施することができる。リン酸化修復は、断片化されたｄｓＤＮＡか又は変性し断片化されたｓｓＤＮＡのいずれかで実施されてよい。リン酸化修復がｄｓＤＮＡで実施される場合、修復されたｄｓＤＮＡをその後変性させて線状ｓｓＤＮＡとしてよく、それはその後にＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）（ＣＬＩＩと略される）を用いて環状化させることができる。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）は、実質的にアデニル化形態のＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼを含む。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）によるｓｓＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションは、より高い濃度のＡＴＰ又はｄＡＴＰによって阻害される。しかし、キナーゼによるリン酸化修復は、多くの場合ＡＴＰの存在を必要とする。さらに、ＤＮＡに損傷を与えずに反応混合物からＡＴＰを除去することは容易でないことがある。例えば、ＡＴＰを除去するための反応混合物のホスファターゼ処理も、結果として（ＤＮＡが、例えば、プレ−アデニル化によって保護されていない限り）ＤＮＡの脱リン酸化をもたらし、従ってＤＮＡ鎖をライゲーション不可能にする。結果として、精製もしくは単離工程を介さずに、単一管において、断片化されたＤＮＡのリン酸化修復及びｓｓＤＮＡ環の生成を実施することは、困難な場合が多い。本明細書において提供される方法は、キナーゼ反応中にＡＴＰの代わりにＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ又はｄＴＴＰを用いる。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）はＧＴＰ又は代替リン酸供与体（例えば、ＣＴＰ又はＵＴＰ）に対する寛容性が高いので、キナーゼ修復工程及びライゲーション工程は、精製及び／又は単離工程を介さずに単一の反応器で実行することができる。キナーゼ反応混合物は、マンガン塩及びベタイン（両性イオントリメチルグリシン）などの追加の試薬をさらに含んでよい。ライゲーションされると、ｓｓＤＮＡ環を増幅させることができる。ライゲーション及び増幅反応を比較的低濃度のＧＴＰで実行することにより、本明細書に記載される単一管ワークフローは、酵素処理間の間欠性のクリーンアップ工程を回避し、ＤＮＡ鋳型の喪失を最小限に抑える（キナーゼ修復、ライゲーション及び増幅を伴う単一管ワークフローの模式図について図９を参照）。

一部の実施形態では、線状ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環を生成するための代替法が提供される。該方法は分子内ライゲーション工程の前にＤＮＡプレ−アデニル化工程を用いる。最初に、線状ＤＮＡは、ＡＴＰの存在下でポリヌクレオチドキナーゼとともにインキュベートされて、５’末端にリン酸基を有し、３’末端にヒドロキシル基を含むライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成することができる。その後、ライゲーション可能なＤＮＡ配列をアデノシン三リン酸の存在下でアデニル化酵素とともにインキュベートして、５’アデニル化ＤＮＡ配列を生成する。５’アデニル化ＤＮＡ配列は、遊離３’ヒドロキシル基を有する。ライゲーション反応でのＡＴＰの濃度は、ライゲーション可能なＤＮＡ配列の３’末端でアデニル化が起こらないように選択される。その後、５’アデニル化ＤＮＡ配列を、５’アデニル化ＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションの能力のある非アデニル化リガーゼとともにインキュベートして、一本鎖ＤＮＡ環を生成する。ＡＴＰ依存性非アデニル化リガーゼを分子内ライゲーション反応に用いる場合、ＡＴＰは、分子内ライゲーション反応の前に反応混合物をホスファターゼで処理することにより反応混合物から除去されているべきでありうる。ＤＮＡの末端ヌクレオチドの５’リン酸塩（通常、ホスファターゼによって除去される）は、プレ−アデニル化のためにホスファターゼ処理から保護される。ＤＮＡが二本鎖形態である場合、それは分子内ライゲーション反応の前に変性させる必要がある。この方法の全ての工程は、単離もしくは精製工程を介さずに単一の反応器で実施される。

一部の実施形態では、好熱性古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ ＲＮＡリガーゼ１）に由来するＲＮＡリガーゼＩなどのＲＮＡリガーゼをＡＴＰの存在下で使用して線状ＤＮＡのアデニル化形態を生成する。一本鎖ＤＮＡ環を生成するために、自己アデニル化、脱アデニル化及び／又はアデニル酸転移のできない変異体又は適切に操作されたＡＴＰ非依存性リガーゼを、アデニル化線状ＤＮＡの分子内ライゲーション反応に使用してよい。例えば、Ｍｔｈ ＲＮＡリガーゼのモチーフＶリジン変異体（Ｋ２４６Ａ）を用いることができる。この変異体はプレ−アデニル化基質で完全なライゲーション活性を有する。モチーフＩ（Ｋ９７Ａ）において触媒リジンに対するアラニン置換を有するＭｔｈ ＲＮＡリガーゼ変異体を用いてもよい。Ｋ９７Ａ変異体の活性は、供与体基質としてプレ−アデニル化ＲＮＡか又は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のいずれかと類似しているが、同一配列をもつｓｓＤＮＡと比較して受容体基質としてＲＮＡに対して２倍優先される。ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼなどのＡＴＰ依存性リガーゼが５’アデニル化ＤＮＡ配列の分子内ライゲーション反応に用いられる場合、反応中のＡＴＰは、ライゲーション反応の前に除去されているべきでありうる。

一部の実施形態では、代替ワークフローを用いるリガーゼ支援全ゲノム増幅が提供される。このワークフローの模式図は図１１に提供される。この方法は、ライゲーション及び増幅の前に、断片化されたＤＮＡをキナーゼで修復すること及び断片化されたＤＮＡの５’末端をＡＴＰの存在下でＲＮＡリガーゼ又はＤＮＡリガーゼでプレ−アデニル化することを含む。ライゲーションできない末端を有する配列（例えば、５’ヒドロキシル及び／又は３’ホスホリル基を含む配列）を含む断片化されたＤＮＡは、キナーゼで処理することによって５’末端でリン酸化され、３’末端で脱リン酸化されて、ライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成する。次に、ライゲーション可能なＤＮＡ配列をＡＴＰの存在下でＭｔｈ ＲＮＡリガーゼ（ＭｔｈＲｎｌ １）などのＲＮＡリガーゼを用いてアデニル化して、断片化されたＤＮＡのアデニル化形態を生成することができる。ＡＴＰはその後に反応混合物をホスファターゼ（例えば、シュリンプアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ））で処理することによって反応混合物から除去される。ＤＮＡの５’アデニル化のための、当技術分野で利用可能ないずれの方法を用いてもよい（例えば、ＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ又は合成法）。次に、プレ−アデニル化一本鎖線状ＤＮＡを、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ Ｉ（商標）などの低い程度のアデニル化を有するＲＮＡリガーゼで処理して、分子内ライゲーションによってＤＮＡ環を生成する。次に、ＲＣＡを使用してＤＮＡ環を増幅する。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ Ｉ（商標）が分子内ライゲーションによってＤＮＡ環を生成する実施形態では、分子内ＤＮＡライゲーション及びその後の増幅反応はＡＴＰの不在下で実施される。キナーゼ処理及びプレ−アデニル化反応の後のＡＴＰの反応混合物からの除去は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ Ｉによるプレ−アデニル化ｓｓＤＮＡの環状化がＡＴＰによって阻害されるので必須である。一部の実施形態では、ＡＴＰは、ホスファターゼによる処理によってアデノシン及びリン酸に変換される。たとえアデノシンが環状化反応に対して抑制性でないとしても、結果として得られるリン酸塩が分子内ライゲーション反応を阻害することがある。生成されたリン酸塩は、反応混合物をリン酸塩封鎖酵素で、又はリン酸塩を沈殿又は除去する試薬（例えば、ＬａｙｎｅＲＴ樹脂などのリン酸塩結合樹脂）で処理することによって、溶液からさらに除去することができる。リン酸塩の除去は、マルトースのグルコース及びグルコース−１−リン酸塩への変換を触媒するマルトースホスホリラーゼなどの酵素で反応混合物を処理し、それによりリン酸塩を溶液から除去することによっても実現することができる。キナーゼを反応に含めることにより、５’リン酸塩及び／又は３’ヒドロキシル基を含まないプールのＤＮＡ断片の環状化及び増幅が許容され、それによって、リガーゼ支援増幅による、より代表的なライブラリーが作成される。標的ＤＮＡのプレ−アデニル化は、分子内ライゲーション反応に、低い程度のアデニル化を有するリガーゼ（例えば、約３０％アデニル化されているＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ Ｉ（商標））を使用することを容易にする。高い程度のアデニル化を有するリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標））は、非アデニル化ＤＮＡを１回だけしかライゲーションしないので、これは興味深いものでありうる。従って、化学量論量のリガーゼがしばしば分子内ライゲーション反応を完了させるために必要とされる。対照的に、低い程度のアデニル化を有するリガーゼ（例えばＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ Ｉ（商標）など）は、高い回転率を有し、可逆的かつ触媒的に又は繰り返し複数のプレ−アデニル化されたＤＮＡ分子に作用することができる。これは、ライゲーション速度を高め、必要なリガーゼの量を減らし、潜在的により困難又は複雑なＤＮＡ鋳型の環状化の増加を可能にする。

一部の実施形態では、リガーゼ支援全ゲノム増幅のための方法は、全血又は尿などの生体試料中の循環核酸（例えば、生体試料の非細胞画分由来の循環ＤＮＡ）の増幅及びその後の検出に使用される。循環核酸は、アポトーシス細胞又は壊死細胞に起源をもつものであってもよいし、細胞から活発に放出されたものであってもよい。細胞ヌクレアーゼは高分子量ゲノムＤＮＡを小型のヌクレオソームの大きさの断片に分解するので、循環核酸は天然に高度に断片化されている。高度に断片化された循環核酸は多くの場合、従来の核酸増幅法に従わない。さらに、循環核酸は血流中に非常に少量で存在する。二本鎖循環線状核酸の標準的なローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、非効率的であり、非常に偏っている。ローリングサークル増幅の前に循環核酸を一本鎖に分離し、リガーゼによって環状化することは、効率を高め、偏りを少なくする。そのような希薄なＤＮＡ鋳型で良好なＲＣＡ速度及び高い感受性を可能にするために、ＬＮＡを含むプライマーを用いるＲＣＡ法が用いられる。この改良されたＲＣＡは、微量ＤＮＡ及び単一細胞増幅のために最適化された。

一部の実施形態では、全血由来の循環ＤＮＡを増幅する方法が提供される。循環ＤＮＡは、全血の非細胞画分（例えば、血漿又は血清）から増幅される。この方法は、全血の非細胞画分を収集する工程、非細胞画分から循環ＤＮＡ（主にその天然の二本鎖形態に存在）を収集する工程、二本鎖ＤＮＡを変性させて線状一本鎖ＤＮＡを生成する工程、循環一本鎖ＤＮＡ分子を環状化して一本鎖ＤＮＡ環を生成する工程、及びローリングサークル増幅によって一本鎖ＤＮＡ環を増幅する工程を含む。持続長のために、１５０ｂｐよりも小さい配列長を有するｄｓＤＮＡを環状化することは通常可能ではなく、ＤＮＡが２００ｂｐよりも長くなるまでｄｓＤＮＡを環状化することは非常に困難である。対照的に、１５ヌクレオチド（ｎｔ）以上の配列長を有する線状ｓｓＤＮＡ分子は、５’末端がリン酸化され、３’末端がヒドロキシル化されている限り、適したリガーゼによって非常に効率的に環状化される。一本鎖ＤＮＡ環を生成するための一本鎖ＤＮＡの環状化は、一本鎖ＤＮＡの鋳型非依存性分子内ライゲーションの能力のあるリガーゼを用いることによって実現される。一部の実施形態では、一本鎖ＤＮＡ分子の環状化は、一本鎖線状ＤＮＡを、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）などのＲＮＡリガーゼで処理することによって実施される。

一部の実施形態では、循環ＤＮＡ検出の感受性は、ｓｓＤＮＡライゲーション工程及びＲＣＡの前にポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）で循環核酸をリン酸化することによってさらに高まる。ＰＮＫ工程をワークフローに組み込むと、本明細書に提示されるリガーゼ支援全ゲノム増幅法は、１％のレベルでスパイクした場合に（三重反復）、雌全血中の雄循環ＤＮＡを検出することができた。鋳型非依存性分子内ライゲーションは、ｓｓＤＮＡ鋳型が５’リン酸基及び３’ヒドロキシル基を有さない限り、達成されることができない。多様な条件がＤＮＡにおいて５’ヒドロキシルを生じる（ＤＮアーゼＩＩ酵素切断、及び血液中のホスファターゼ活性など）。ＰＮＫ処理はこの問題を除去し、ローリングサークル増幅ＣＮＡライブラリーの多様性を向上させる。

一部の実施形態では、線状ＤＮＡからの一本鎖ＤＮＡ環の生成のためのキットが提供される。一実施形態では、このキットは、一緒にパッケージングされた、ポリヌクレオチドキナーゼ、リン酸供与体、及びｓｓＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションの能力のあるプレ−アデニル化リガーゼを含む。ポリヌクレオチドキナーゼは、Ｔ４ ＰＮＫであってよい。リン酸供与体は、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ又はｄＴＴＰから選択されてよい。一実施形態では、キットには、ＴＳ２１２６リガーゼが含まれてよい。ＴＳ２１２６リガーゼの６０％超がプレ−アデニル化されていてよい。キットは、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ＤＮＡ増幅試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ）、及び、提供される方法による一本鎖ＤＮＡ環の生成に用いられるその他の試薬（例えば、ＭｎＣｌ₂、ベタイン）をさらに含んでよい。一部の実施形態では、キットには、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ及びランダム／部分拘束プライマーが含まれてよい。もう一つの実施形態では、キットは、一緒にパッケージングされた、アデニル化酵素、ホスファターゼ及び非アデニル化リガーゼを含む。キットは、ポリヌクレオチドキナーゼ及び／又はリン酸供与体をさらに含んでよい。アデニル化酵素は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍに由来するＲＮＡリガーゼＩ（Ｍｔｈ ＲＮＡリガーゼ）であってよい。非アデニル化リガーゼは、リガーゼの６０％超がその非アデニル化形態である、ＴＳ２１２６リガーゼの組成物であってよい。キットには、線状ＤＮＡからの一本鎖ＤＮＡ環の生成の説明書がさらに含まれてよい。

発明の実践は、説明のためだけに本明細書に提示され、添付される特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない、以下の実施例からさらにより十分に理解されるであろう。実施例の項で使用されるいくつかの略語は、略さずに書くと以下の通りである：「ｍｇ」：ミリグラム、「ｎｇ」：ナノグラム、「ｐｇ」：ピコグラム、「ｆｇ」：フェムトグラム、「ｍＬ」：ミリリットル、「ｍｇ／ｍＬ」：ミリリットル毎ミリグラム、「ｍＭ」：ミリモル、「ｍｍｏｌ」：ミリモル、「ｐＭ」：ピコモル濃度、「ｐｍｏｌ」：ピコモル、「μＬ」：マイクロリットル、「ｍｉｎ．」：分及び「ｈ．」：時間。

実施例１：血漿由来の循環核酸の全ゲノム増幅：
Ｗａｋｏ ＤＮＡ抽出器ＳＰキット（和光純薬株式会社）を用いて、明らかに健康な個体の、クエン酸塩−リン酸塩−デキストロース（ＣＰＤ）で安定化させた血漿から循環ＤＮＡを単離した。約１．３ｎｇを、ＴＢＥ緩衝液を用いる２％アガロースゲルによる電気泳動により分析し、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄで染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎイメージャで可視化した。図２に示されるように、循環ＤＮＡの大部分は約１８０ｂｐの長さであった。さらなるそれよりも少ない量の配列は約３７０ｂｐの長さであり、さらにそれよりもかなり少ない量のそれよりも高分子量の配列があった。

３５０ｐｇの血漿由来の循環ＤＮＡを９５℃で加熱して鋳型を変性させた。次に、変性した一本鎖ＤＮＡ鋳型をＲＮＡ又はＤＮＡリガーゼで処理して一本鎖ＤＮＡ環を生成した。ＡＴＰ依存性Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、細胞にコードされたＮＡＤ依存性大腸菌ＤＮＡリガーゼ又は熱安定性ＲＮＡリガーゼ（ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ）をライゲーション反応に使用した。次に、１００ｐｇのＤＮＡを連結した一本鎖ＤＮＡ環を、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いるＧｅｎｏｍｉＰｈｉキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いる全ゲノム増幅に供した。「ａｔ Ｎ」が、２−アミノ ｄＡ、２−チオ−ｄＴ、正常なＧ及び正常なＣを含有するランダム混合物を表す、プライマー混合物＋Ｎ＋Ｎ（ａｔ Ｎ）（ａｔ Ｎ）（ａｔ Ｎ）＊Ｎを用いて増幅を実施した。リアルタイム増幅は、少量のＳＹＢＲグリーンＩを増幅混合物に添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ ＳＮｉＰｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で経時的に蛍光シグナル増加をモニターすることによって実施した。比較のために、当量濃度の未処理ゲノムＤＮＡ、未処理血漿ＤＮＡ、及びＤＮＡ鋳型を含まない（鋳型増幅のない）試料を含めた。

図３に示されるように、同等量の高分子量ゲノムＤＮＡと比較した場合に、未処理の断片化された血漿ＤＮＡの増幅速度は、はるかに低く、増幅の欠陥を示した。しかし、断片化された血漿ＤＮＡが前処理され、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）を用いて一本鎖ＤＮＡ環に変換された場合、急速な増幅速度が実現された（図３Ａ）。ＡＴＰ依存性Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（図３Ｂ）及び細胞にコードされたＮＡＤ依存性大腸菌ＤＮＡリガーゼ（図３Ｃ）を含むリガーゼも効果的であったが、断片化された血漿ＤＮＡの増幅速度を回復させるには効率が低かった。これらの実施例では、増幅速度の相対的な増加は、一本鎖ＤＮＡ鋳型の分子内ライゲーションを促進する際のリガーゼの各々の有効性を示す。

実施例２：リガーゼ支援全ゲノム増幅により増幅させた血漿由来の循環核酸の分析。

実施例１で生成した増幅させたＤＮＡを、４つの異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座（ｖＷＡ、ＴＰＯＸ、Ｄ８Ｓ１１２９、及びＤ１３Ｓ３１７）を標的とするプライマーを用いる定量的ＰＣＲによってさらに分析して、感受性がありバランスのとれたＤＮＡ増幅を促進するためのリガーゼ支援全ゲノム増幅法の有効性を試した。これらのＤＮＡレベルを増幅させていないＤＮＡから得た値と比較して、増幅後の相対的な発現レベルを決定した。図４に示されるように、両方の例において、未処理血漿ＤＮＡの増幅は、配列の脱落を導くか、又は試験した遺伝子座で標本として非常に不十分であるＤＮＡを生成した。対照的に、この方法にＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）か又はＴ４ ＤＮＡリガーゼのいずれかを含めると、４つの遺伝子座の配列の脱落を防ぎ、増幅させた高分子量ゲノムＤＮＡに表示の点でより類似するＤＮＡを生成した。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）を一本鎖ＤＮＡリガーゼとして使用する実施例では、１２の異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座を標的とするプライマーを用いる定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって試験した１２の異なるＣＯＤＩＳ遺伝子座のうち、１１を増幅後に回収したが、増幅させた未処理血漿ＤＮＡでは４しか存在しなかった（図５）。図５において、報告されるＣｔ値は、２つの複製の平均である。Ｃｔ値が未決定であったＰＣＲ反応は「Ｘ」で印がつけられている。

実施例３：リガーゼ支援全ゲノム増幅の反応条件の最適化。

リガーゼ支援ＤＮＡ増幅反応を、ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼによる一本鎖ＤＮＡ分子のライゲーション反応の効率を最適化することによってさらに最適化した。標準的な製造業者の推奨する緩衝液からマンガンを除去することによって増幅率がバックグラウンドレベルまで低下したので、金属イオンの存在はライゲーション反応に必要不可欠であった。未処理ゲノムＤＮＡ及び未処理血漿ＤＮＡを、変更した緩衝条件を用いてＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）で処理した血漿ＤＮＡ試料と比較した（図６）。全ての緩衝条件は、３３ｍＭ ＫＯＡｃ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、及び１Ｍベタインを含んだ。指示される場合、緩衝液は３３ｍＭ ＴＲＩＳ−酢酸塩（ｐＨ７．５）又は３３ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ８．０）を含み、さらに２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂か又は２．５ｍＭ ＭｎＣｌ₂を含んだ。少量のＳＹＢＲグリーンＩを増幅混合物に添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで経時的に蛍光の増加をモニターすることによってリアルタイム増幅を実施した。増幅閾値は、蛍光がバックグラウンドレベル（２０００ＲＦＵ）より高くなる時点である。

リガーゼ支援全ゲノム増幅反応（試料１００ｐｇ）の増幅速度の比較を図６に示す。マグネシウムとマンガンの両方が、標準的なＴＲＩＳ緩衝液の存在下で同様の効果を促進したが、ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ８．０の存在下でマンガンとマグネシウムの組合せが、高い増幅率を促進するのに最も効果的であったことが観察された。ＨＥＰＥＳ緩衝液は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中のマンガン陽イオンの酸化の減少に起因しうるこの反応条件において、血漿ＤＮＡの環状化効率を増加させた。

実施例４：リガーゼ支援全ゲノム増幅における高分子量ゲノムＤＮＡの増幅の抑制。

未処理のゲノムＤＮＡの全ゲノム増幅反応の増幅速度を、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ Ｉ（商標）及びＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）で処理したゲノムＤＮＡ試料（試料１００ｐｇ）と比較した。結果を図７に示す。図７に示されるように、ゲノムＤＮＡのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ処理は、高分子量ゲノムＤＮＡの増幅率に抑制効果（血漿ＤＮＡへのプラスの効果とは異なる）を生じた。抑制は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ Ｉ及びＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）の両方について明白であった。

Ｐｈｉ２９に基づく増幅がリガーゼによって抑制されたかを調査するために、未処理のゲノムＤＮＡを活性のあるリガーゼの存在下で増幅させた。少量のＳＹＢＲグリーンＩを増幅混合物に添加し、Ｔｅｃａｎプレートリーダーで経時的に蛍光の増加をモニターすることによってリアルタイム増幅を実施した。増幅閾値は、蛍光がバックグラウンドレベル（２０００ＲＦＵ）より高くなる時点である。ゲノムＤＮＡ増幅の抑制は、増幅中に存在する、活性のあるリガーゼの効果ではないことが観察された。

血液細胞由来のゲノムＤＮＡはしばしば循環核酸の調製物を汚染し、診断価値が少ないので、高分子量ゲノムＤＮＡよりも循環の増幅を優先することは、特定の用途に有利でありうる。

実施例５：リガーゼ支援全ゲノム増幅を用いる断片化されたＤＮＡの単一管増幅−分子内ライゲーションの前の循環ＤＮＡ断片のキナーゼによるリン酸化の効果。

循環ＤＮＡ断片のキナーゼによるリン酸化は、血漿中の循環ＤＮＡのより感受性の高い検出を許容した。雄−雌血漿／血液混合実験を実施して、キナーゼで処理したインプットＤＮＡから作成したライブラリーがより代表的であったことを確立し、ＤＹＳ１４雄特異的マーカーのより感受性の高い検出を可能にした（図１０、３／３複製物、それに反してリン酸化が行われなかった場合は１／３しか検出されなかった）。１００μＬの血液／血漿混合物を以下の通り調製した：１００Ａ：１００％雄血漿、５Ａ〜Ｃ：雌全血に５％ｖ／ｖでスパイクした雄血漿、１Ａ〜Ｃ：雌全血に１％ｖ／ｖでスパイクした雄血漿、及び０Ａ：１００％雌血液。ＭＦ１膜（Ｗｈａｔｍａｎ）を通した横の流れによって血漿を血液細胞から分離し、それに続いて乾燥させ一晩貯蔵したセルロースパッドの上に収集した。次に、循環ＤＮＡを、標準的なヨウ化ナトリウム／洗浄剤に基づく方法であるＷａｋｏ抽出器ＳＰキット（和光純薬株式会社）の変更によって、セルロースパッドから単離した。次に、約１．８ｎｇのＤＮＡを、ＧＴＰ、マンガン、及びベタインの存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて又は用いずに処理し、次にＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）で処理して一本鎖ＤＮＡ断片を環状化した。次に、ＤＮＡをＧｅｎｏｍｉＰｈｉ全ゲノム増幅（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に供し、生成物を定量的ＰＣＲで分析して、２つのマーカー：Ｄｙｓ１４（Ｙ−染色体に位置するマルチコピー遺伝子であり、雄画分だけから検出可能であるべきである）、及びＤ１６Ｓ５３９（染色体１６に位置するＳＴＲ遺伝子座であり、雄と雌の両方の画分から検出可能であるべきである）の検出を評価した。反応は、ワークフロー中に中間の精製もしくは単離工程を含まずに、単一の反応器で実施された。これは、比較的低い濃度のＧＴＰでリン酸化反応を実施することによって実現された。

図１０は、キナーゼを反応に含めることにより、５’リン酸塩を含まないプールのＤＮＡ断片の環状化及び増幅が許容され、それによって、より代表的なライブラリーが作成されることを示す。これには、細胞死の間にＤＮアーゼＩＩ消化によって特異的に生成される５’ヒドロキシルを含有するＤＮＡ断片が含まれる。雄−雌血漿／血液混合実験を用いて、キナーゼで処理したインプットＤＮＡから作成したライブラリーがより代表的であったことが証明され、ＤＹＳ１４雄特異的マーカーのより感受性の高い検出（３／３複製物、それに反してリン酸化が行われなかった場合は１／３しか検出されなかった）を可能にした。

実施例６：環状化反応の前の断片化されたＤＮＡのプレ−アデニル化の効果。

４０分でリン酸化されたか又はプレ−アデニル化された小型のＤＮＡ断片の環状化の効率は、異なる量のＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ酵素で評価される。５’位にリン酸基か又はアデニル化を含む、２．５ｐｍｏｌの６４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを、漸増量のＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ Ｉ（商標）又はＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ ＩＩ（商標）で４０分間６０℃で処理した。環状化率を、線状及び環状の位置のバンドの強度を走査することによって求めた。図１２に示されるように、断片化されたＤＮＡのプレ−アデニル化は、ライゲーション及び増幅速度を向上させた。図１２では、Ｐ−６４ｍｅｒは、５’−リン酸化された６４−ｎｔオリゴヌクレオチドを表し、ａｄ−６４は、プレ−アデニル化された６４−ｎｔオリゴヌクレオチドを表す。プレ−アデニル化ＤＮＡは、標準的なリン酸化されたＤＮＡよりも急速に環状化された。さらに、アデニル化の程度の低いライゲーション酵素は、モル過剰の基質のライゲーションを触媒し、リガーゼがプレ−アデニル化されたＤＮＡ分子と連結する複数の機会を有することを示した。そのことは、ライゲーション速度を増加させ、より困難な鋳型の環状化の増加を可能にする可能性がある。

実施例７：プレ−アデニル化ワークフローを用いる５’−リン酸塩及び５’−ヒドロキシル含有オリゴヌクレオチドの環状化。

５ｐｍｏｌの６４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドを含有する、５’位にリン酸基か又はヒドロキシル基のいずれかとの反応物を、１．２５ＵのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで指示される場所で３７℃で処理した。２５ｐｍｏｌ Ｍｔｈ ＲＮＡリガーゼとの６５℃でのインキュベーションの後、反応物を０．２５単位のシュリンプアルカリホスファターゼで処理した。Ｍｔｈ ＲＮＡリガーゼはＡＴＰ濃度に対して非常に感受性が高いので、標準的な１００μＭのＡＴＰ濃度で、Ｍｔｈ ＲＮＡリガーゼは、ＤＮＡ末端をほとんどアデニル化する。このＡＴＰ濃度ではＭｔｈ ＲＮＡリガーゼによる分子内ライゲーションは起こらない。酵素は各々のインキュベーションの後に熱失活させた。最後に、反応物を、指示される場所で５０単位のＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ Ｉで処理し、６０℃で６０分間インキュベートした。環状化率を、線状及び環状の位置のバンドの強度を走査することによって求めた（図１３）。Ｐ−６４ｍｅｒは、５’−リン酸化された６４−ｎｔオリゴヌクレオチドを表し、ａｄ−６４ｍｅｒは、プレ−アデニル化された６４−ｎｔオリゴヌクレオチドを表す。

図１１は、５’−リン酸塩又は５’−ヒドロキシル基を含有する線状オリゴヌクレオチドが環状形態に変換される、「単一管」プレ−アデニル化ワークフローを示す。この「単一管」プロセスにおいて、基質は、中間の精製工程を含まずに、ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｍｔｈ ＲＮＡリガーゼ、シュリンプアルカリホスファターゼ、及びＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ Ｉ（商標）で連続的に処理される。

特許請求される本発明は、その精神又は本質的な特徴から逸脱することなくその他の具体的な形態で具体化されてよい。前述の実施形態は、多様な全ての可能性のある実施形態又は実施例から選択された実施形態又は実施例である。そのため、前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を制限するというよりもむしろあらゆる点で実例となると考えられるべきである。特許請求される本発明の特定の特徴だけが本明細書において例示され説明されたが、当業者が、本開示の利益を得て、これら及びその他の種類の用途に適した本発明の原理に従って本方法を用いるための適した条件／パラメータを特定し、選択し、最適化するか又は変更することができることは理解されるべきである。試薬の正確な使用、選択、変数、例えば濃度、体積、インキュベーション時間、インキュベーション温度、及び同類のものなどの選択は、主にそれが意図される特定の用途に依存しうる。そのため、添付される特許請求の範囲は、本発明の真の精神の中に入る全ての変更及び改変を網羅することを目的とすることが理解される。さらに、特許請求の範囲の等価物の意味及び範囲内にある全ての改変は、その中に包含されることを意図する。

Claims (34)

1. 線状ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環を生成するための方法であって、
   （ａ）線状ＤＮＡを準備する工程と、
   （ｂ）線状ＤＮＡをリン酸供与体の存在下でポリヌクレオチドキナーゼとともにインキュベートして、５’末端にリン酸基を有し、３’末端にヒドロキシル基を有するライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成する工程と、
   （ｃ）ライゲーション可能なＤＮＡ配列を、一本鎖ＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションが可能なリガーゼとともにインキュベートして、一本鎖ＤＮＡ環を生成する工程と
   を含んでおり、当該方法の工程の全てが、単離もしくは精製工程を介さずに単一の反応器で実施される、方法。
2. 工程（ｂ）が、アデノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸以外のリン酸供与体を用いて実施される、請求項１に記載の方法。
3. リン酸供与体が、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、ウリジン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
4. リン酸供与体がグアノシン三リン酸である、請求項３に記載の方法。
5. 線状ＤＮＡが、ポリヌクレオチドキナーゼとともに２００μＭ未満のグアノシン三リン酸の存在下でインキュベートされる、請求項４に記載の方法。
6. 線状ＤＮＡが、ポリヌクレオチドキナーゼとともに３０μＭまでのグアノシン三リン酸及び２．５ｍＭまでのマンガンイオンの存在下でインキュベートされる、請求項５に記載の方法。
7. ライゲーション可能なＤＮＡ配列が二本鎖形態である場合に、工程（ｃ）の前にライゲーション可能なＤＮＡ配列を変性させる工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
8. リガーゼが、プレ−アデニル化リガーゼである、請求項７に記載の方法。
9. プレ−アデニル化リガーゼが、プレ−アデニル化ＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼである、請求項８に記載の方法。
10. 工程（ａ）〜（ｃ）が、単一の反応器において順次実施される、請求項９に記載の方法。
11. 方法の工程の全てが、アデノシン三リン酸又はデオキシアデノシン三リン酸の不在下で実施される、請求項１０に記載の方法。
12. 方法の工程の全てが、ＨＥＰＥＳ緩衝液で実施される、請求項１１に記載の方法。
13. 線状ＤＮＡが、循環ＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋試料から単離したＤＮＡ、環境条件にさらされた法医学ＤＮＡ試料、又は非常に古いＤＮＡ試料である、請求項１に記載の方法。
14. 等温条件下で一本鎖ＤＮＡ環を増幅する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
15. 一本鎖ＤＮＡ環が、ローリングサークル増幅を介して増幅される、請求項１４に記載の方法。
16. ローリングサークル増幅が、ヌクレアーゼ耐性プライマーを用いて実施される、請求項１５に記載の方法。
17. ヌクレアーゼ耐性プライマーが、１以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 一本鎖ＤＮＡ環が、ランダムプライマー混合物を用いて増幅される、請求項１５に記載の方法。
19. 一本鎖ＤＮＡ環が、末端ミスマッチプライマーダイマー構造を含む部分拘束プライマー混合物から本質的になるプライマー溶液を用いて増幅される、請求項１５に記載の方法。
20. 線状ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡ環を生成するための方法であって、
    （ａ）線状ＤＮＡを準備する工程と、
    （ｂ）所望により線状ＤＮＡをアデノシン三リン酸の存在下でポリヌクレオチドキナーゼとともにインキュベートして、５’末端にリン酸基を有し、３’末端にヒドロキシル基を有するライゲーション可能なＤＮＡ配列を生成する工程と、
    （ｃ）線状ＤＮＡ配列又はライゲーション可能なＤＮＡ配列を、アデノシン三リン酸の存在下でアデニル化酵素とともにインキュベートして、５’アデニル化ＤＮＡ配列を生成する工程と、
    （ｄ）５’アデニル化ＤＮＡ配列を、５’アデニル化一本鎖ＤＮＡ配列の鋳型非依存性分子内ライゲーションが可能な非アデニル化リガーゼとともにインキュベートして、一本鎖ＤＮＡ環を生成する工程と
    を含んでおり、当該方法の工程の全てが、単離もしくは精製工程を介さずに単一の反応器で実施される、方法。
21. ５’アデニル化ＤＮＡ配列が二本鎖形態である場合に、工程（ｄ）の前に５’アデニル化ＤＮＡ配列を変性させる工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. アデニル化酵素が、好熱性古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍに由来するＲＮＡリガーゼ１である、請求項２１に記載の方法。
23. 非アデニル化リガーゼが、アデノシン三リン酸非依存性であり、自己アデニル化、脱アデニル化及びアデニル酸転移の欠けた変異体又は操作されたリガーゼである、請求項２２に記載の方法。
24. 変異体リガーゼが、好熱性古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍに由来するＲＮＡリガーゼ１の変異体である、請求項２３に記載の方法。
25. ５’アデニル化ＤＮＡ配列を含む工程（ｃ）の反応混合物をホスファターゼとともにインキュベートして、アデノシン三リン酸を反応混合物から除去する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
26. 非アデニル化リガーゼが、サーマスバクテリオファージＴＳ２１２６に由来するＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼである、請求項２５に記載の方法。
27. 工程（ａ）〜（ｄ）が、単一の反応器において順次実施される、請求項２６に記載の方法。
28. 線状ＤＮＡが、循環ＤＮＡ、ホルマリン固定パラフィン包埋試料から単離したＤＮＡ、環境条件にさらされた法医学ＤＮＡ試料、又は非常に古いＤＮＡ試料である、請求項２０に記載の方法。
29. 等温条件下で一本鎖ＤＮＡ環を増幅する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
30. 一本鎖ＤＮＡ環が、ローリングサークル増幅を介して増幅される、請求項２９に記載の方法。
31. 一本鎖ＤＮＡ環が、ヌクレアーゼ耐性プライマーを用いて増幅される、請求項３０に記載の方法。
32. ヌクレアーゼ耐性プライマーが、１以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項３１に記載の方法。
33. 一本鎖ＤＮＡ環が、ランダムプライマー混合物を用いて増幅される、請求項３０に記載の方法。
34. 一本鎖ＤＮＡ環が、末端ミスマッチプライマーダイマー構造を含む部分拘束プライマー混合物から本質的になるプライマー溶液を用いて増幅される、請求項３０に記載の方法。

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