CN111534633B - 一种新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒及方法 - Google Patents

一种新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒(2019‑nCOV)检测试剂盒及方法。所述试剂盒包括反应液，阳性对照品、内标、阴性对照品。所述的反应液包括新型冠状病毒检测引物、荧光探针、PCR缓冲体系及酶，阳性对照品包括新型冠状病毒假病毒，内标包括不含靶标基因的外源性片段假病毒，阴性对照品包括生理盐水。所述试剂盒及方法能快速、灵敏、特性检测出新型冠状病毒2019‑nCoV，可评估样本取样是否合格并能有效监控假阴性的出现，可辅助临床实现早诊断，早治疗。

Description

一种新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒(2019-nCOV) 检测试剂盒及方法。
背景技术
冠状病毒为不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，根据血清型和基因组特点冠状病毒亚科被分为α、β、γ和δ四个属。已知感染人的冠状病毒有6种，包括α属的229E和NL63，β属的OC43和HKU1、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERSr-CoV)和严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARSr-CoV)。此次从2019年不明原因肺炎患者下呼吸道分离出的冠状病毒为一种属于β属的新型冠状病毒(2019-nCOV)。2019新型冠状病毒是人类分离的第七类冠状病毒，该病毒属于β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别。目前研究显示与蝙蝠 SARS样冠状病毒(Bat-SL-CoV ZC45)同源性达85％以上。
目前还未有相关针对新型冠状病毒的检测方法，本发明针对NCBI于2020 年1月10日公开的基因组序列(MN908947)进行序列比对，选取保守区域进行引物探针设计，开发出针对新型冠状病毒(2019-nCOV)ORF1ab基因、N基因、和E基因同时进行实时荧光检测试剂盒及检测方法，并且设计了内标，可评估样本取样是否合格并能有效监控假阴性的出现，可辅助临床实现早诊断，早治疗。
发明内容
本发明的目的是在于针对新型冠状病毒(2019-nCOV)疫情，开发出一种快速检测的试剂盒并提供一种检测方法。
为解决上述的问题，本发明采用以下技术方案：
一种新型冠状病毒(2019-nCOV)检测试剂盒，试剂盒包括反应液，阳性对照品，内标，阴性对照品；其中，所述的反应液包括新型冠状病毒检测引物、荧光探针、PCR缓冲体系及酶，所述的阳性对照品包括新型冠状病毒假病毒，所述的内标包括不含靶标基因的外源性片段假病毒，所述的阴性对照品包括生理盐水；该试剂盒用于同时检测新型冠状病毒(2019-nCOV)的：如SEQ ID NO:1 所示的ORF1ab基因、如SEQ ID NO:2所示的N基因、和如SEQID NO:3所示的E基因。
所述的新型冠状病毒检测引物及荧光探针为：
ORF1ab F1：GAACCTCATCAGGAGATGC，即SEQ ID NO:5；
ORF1ab R1：ATCATTGAGAAATGTTTACGC，即SEQ ID NO:6；
ORF1ab P：CAAAATTGCCGATAAGTATG，即SEQ ID NO:7，5端标记FAM， 3端标记BHQ1；
N F1：TGCTGAGGCTTCTAAGAAGC，即SEQ ID NO:8；
NR1：GATTAGTTCCTGGTCCCCAA，即SEQ ID NO:9；
N P：CATACAATGTAACACAAGCTTTCG，即SEQ ID NO:10，5端标记 ROX，3端标记BHQ2；
E F1：TTATACTGAAAAATGGGAATC，即SEQ ID NO:11；
E R1：TAACATGTTCAACACCAGTGTC，即SEQ ID NO:12；
E P：TACACAGTTACTTCACTTCAGAC，即SEQ ID NO:13，5端标记HEX， 3端标记BHQ1。
所述的内标采用竞争性内标，内标序列为SEQ ID NO:4，检测引物与新型冠状病毒ORF1ab基因检测引物一致，及荧光探针：
ICP:TTTTGCTAATCATGTTCATACCTC，即SEQ ID NO:14，5端标记CY5， 3端标记BHQ3。
所述的新型冠状病毒假病毒为外壳蛋白包裹由新型冠状病毒(2019-nCOV) 的ORF1ab基因、N基因、和E基因形成的假病毒颗粒；所述的外壳蛋白为噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成；所述的假病毒颗粒中ORF1ab基因、 N基因、和E基因的核苷酸序列即SEQ ID NO:1-3串联。
所述的内标，其不含靶标基因的外源性片段假病毒为外壳蛋白包裹内标IC 基因形成的假病毒颗粒；所述的外壳蛋白为噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成；所述的内标IC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
假病毒的制备方法如下：
1)采用MS2成熟酶编码基因(序列见GENBANK ID:V00642.1(130-1311)) 及噬菌体衣壳蛋白编码基因(序列见GENBANK ID:V00642.1(1335-1772))的扩增引物从MS2噬菌体基因组(来源于大肠杆菌ATCC155967,序列见GENBANK ID:V00642.1)中扩增出相关基因的全长基因；
2)然后将噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因依次克隆进入pET32a表达载体MCS位点，获得含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的重组质粒pET32a-MS2；；
3)将由新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、和E基因即核苷酸序列SEQ ID NO:1-3串联的基因或内标IC基因SEQ ID NO:4克隆进去含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的重组质粒，得到 pET32a-MS2-ORF/E/N或pET32a-MS2-IC，其中，新型冠状病毒ORF1ab基因、 N基因、和E基因或内标IC基因应置于噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的下游；
4)将克隆好的重组质粒转入表达宿主菌，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)；
5)诱导培养所述的重组菌，即可得到新型冠状病毒假病毒颗粒或内标假病毒颗粒。
所述反应液具体包含10*buffer I，5*buffer II，Hotstart Taq酶，UDG酶， dNTP，dUTP，RNA酶抑制剂、反转录酶、及新型冠状病毒检测引物、荧光探针。
具体组分含量为：
10*buffer I 2.5ul，5*buffer II 5ul，20mM dN(U)TP 1.5ul，40U/ul RNA 酶抑制剂0.5ul，200U/ul反转录酶0.25ul，5U/ul Hotstart taq 0.5ul，2U/ul UDG 0.5ul，10μM核苷酸序列如SEQ ID NO:5、6、8、9、11、12所示的引物各0.75μL， 10μM核苷酸序列如SEQ IDNO:7、10、13、14所示的引物各0.4μL，DEPC H2O 补足到21ul。
所述的试剂盒检测方法适用临床样本种类：咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液、呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本、血液样本、血清样本等。
其具体的检测步骤如下：
1)按照21ul反应液加入待检样本DNA 4ul，混匀；
2)置于实时荧光PCR仪中进行PCR扩增检测；
3)实时荧光PCR扩增程序设置如下：
首先阶段1：50℃处理15-30min，
阶段2：95℃处理3min，
阶段3：95℃10s，56℃30-60s进行45个循环，
所述的试剂盒检测方法结果判读方法如下：
阳性对照FAM/HEX/ROX3个通道Ct值均≤33，其CY5通道Ct值≤40；阴性对照CY5通道Ct值≤40，其余通道无Ct值，实验结果方有效；
临床样本判读标准：
阴性：FAM/HEX/ROX3个通道均无Ct值或Ct值≥45(CY5通道Ct值≤40)；
阳性：FAM通道或HEX通道或ROX通道Ct值≤40，可报告为相应通道靶标阳性；
可疑：FAM通道或HEX通道或ROX通道Ct值在40-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为相应靶标阳性，否则为阴性(CY5通道Ct值≤40)。
与现有技术相比，本发明有如下特点：
1)本发明提供有一种新型冠状病毒(2019-nCOV)检测试剂盒及方法，同时检测新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、和E基因，防止病毒传染过程的变异导致假阴性。
2)本发明同时采用竞争性内标从提取到扩增全程监控，防止假阴性。
3)本发明的阳性对照品和内标全部采用假病毒，能增加RNA的稳定性，有效增加产品的效期。
4)检测灵敏度为1000copies/ml。
附图说明
图1为新型冠状病毒ORF1ab基因灵敏度检测结果。
图2为新型冠状病毒E基因灵敏度检测结果。
图3为新型冠状病毒N基因灵敏度检测结果。
图4为内标最低检测限检测结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步说明。
实施案例1：新型冠状病毒(2019-nCOV)检测试剂盒引物及探针的设计
根据新型冠状病毒公开的基因组序列(NCBI：MN908947)ORF1ab基因、 N基因、和E基因三个基因保守区域设计检测探针及引物，并且进行多重PCR 引物组合筛选，三重PCR各靶标检测灵敏度(1000、100、10cps/ul)示意图见图1-3。检测相关序列如下：
ORF1ab F1：GAACCTCATCAGGAGATGC
ORF1ab R1：ATCATTGAGAAATGTTTACGC
ORF1ab P：CAAAATTGCCGATAAGTATG，5端标记FAM，3端标记BHQ1。
N F1：TGCTGAGGCTTCTAAGAAGC
NR1：GATTAGTTCCTGGTCCCCAA
N P：CATACAATGTAACACAAGCTTTCG，5端标记ROX，3端标记BHQ2。
E F1：TTATACTGAAAAATGGGAATC
E R1：TAACATGTTCAACACCAGTGTC
E P：TACACAGTTACTTCACTTCAGAC，5端标记HEX，3端标记BHQ1。
本发明试剂盒提供的内标采用采用竞争性内标，内标序列为SEQ ID NO:4，检测引物与新型冠状病毒ORF1ab基因检测引物一致，及荧光探针：ICP:TTTTGCTAATCATGTTCATACCTC，5端标记CY5，3端标记BHQ3。
实施案例2：阳性对照品及内标假病毒制备
为增加RNA的稳定性，本发明提供一种制备新型冠状病毒的假病毒及内标假病毒的方法，具体操作流程如下：
新型冠状病毒(2019-nCOV)假病毒，其为外壳蛋白包裹新型冠状病毒 ORF1ab基因、N基因、和E基因形成的假病毒颗粒。所述的外壳蛋白为噬菌体 MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成。所述的新型冠状病毒ORF1ab基因、 N基因、和E基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:1-3串联组成。
内标假病毒为外壳蛋白包裹内标IC基因形成的假病毒颗粒。所述的外壳蛋白为噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成。所述的内标IC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
假病毒制备方法的步骤：
1)采用MS2成熟酶编码基因(序列见GENBANK ID:V00642.1(130-1311)) 及噬菌体衣壳蛋白编码基因(序列见GENBANK ID:V00642.1(1335-1772))的扩增引物从MS2噬菌体基因组(来源于大肠杆菌ATCC15597,序列见GENBANK ID:V00642.1)中扩增出相关基因的全长基因；
2)然后将噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因依次克隆进入pET32a表达载体MCS位点，获得含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的重组质粒pET32a-MS2；；
3)将由新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、和E基因即核苷酸序列SEQ ID NO:1-3串联的基因或内标IC基因SEQ ID NO:4克隆进去含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的重组质粒，得到 pET32a-MS2-ORF/E/N或pET32a-MS2-IC，其中，新型冠状病毒ORF1ab基因、 N基因、和E基因或内标IC基因置于噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的下游；
4)将克隆好的重组质粒转入表达宿主菌，宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3) (天根生化购得)；
5)诱导培养所述的重组菌，即可得到新型冠状病毒假病毒颗粒或内标假病毒颗粒。
实施案例3：新型冠状病毒(2019-nCOV)检测试剂盒制备及检测方法的建立
经过原材料的筛选，引物和探针筛选、浓度的优化，反应体系中的组分的浓度优化等实验测试，最终确定RT-PCR反应液的组成为：
10*buffer I 2.5ul，5*buffer II 5ul，20mM dN(U)TP 1.5ul，40U/ul RNA 酶抑制剂0.5ul，200U/ul反转录酶0.25ul，5U/ul Hotstart taq 0.5ul，2U/ul UDG 0.5ul，10μM核苷酸序列如SEQ ID NO:5、6、8、9、11、12所示的引物各0.75μL， 10μM核苷酸序列如SEQ IDNO:7、10、13、14所示的引物各0.4μL，DEPC H2O 补足到21ul。
扩增的反应体系为25ul。
反应程序为：
阶段1：50℃处理15-30min，阶段2：95℃处理3min，阶段3：95℃10s，56℃30-60s进行45个循环。
结果的判读：
临床样本判读标准：
阳性对照FAM/HEX/ROX3个通道Ct值均≤33，其CY5通道Ct值≤40；阴性对照CY5通道Ct值≤40，其余通道无Ct值，实验结果方有效；
临床样本判读标准：
阴性：FAM/HEX/ROX3个通道均无Ct值或Ct值≥45(CY5通道Ct值≤40)；
阳性：FAM通道或HEX通道或ROX通道Ct值≤40，可报告为相应通道靶标阳性；
可疑：FAM通道或HEX通道或ROX通道Ct值在40-45之间，建议重复实验，若Ct值<45，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为相应靶标阳性，否则为阴性(CY5通道Ct值≤40)。
序列表
<110> 杭州千基生物科技有限公司
杭州博芯生物技术有限公司
<120> 一种新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒及方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 921
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(Coronavirus)
<400> 1
tagtaattgg aacaagcaaa ttctatggtg gttggcacaa catgttaaaa actgtttata 60
gtgatgtaga aaaccctcac cttatgggtt gggattatcc taaatgtgat agagccatgc 120
ctaacatgct tagaattatg gcctcacttg ttcttgctcg caaacataca acgtgttgta 180
gcttgtcaca ccgtttctat agattagcta atgagtgtgc tcaagtattg agtgaaatgg 240
tcatgtgtgg cggttcacta tatgttaaac caggtggaac ctcatcagga gatgccacaa 300
ctgcttatgc taatagtgtt tttaacattt gtcaagctgt cacggccaat gttaatgcac 360
ttttatctac tgatggtaac aaaattgccg ataagtatgt ccgcaattta caacacagac 420
tttatgagtg tctctataga aatagagatg ttgacacaga ctttgtgaat gagttttacg 480
catatttgcg taaacatttc tcaatgatga tactctctga cgatgctgtt gtgtgtttca 540
atagcactta tgcatctcaa ggtctagtgg ctagcataaa gaactttaag tcagttcttt 600
attatcaaaa caatgttttt atgtctgaag caaaatgttg gactgagact gaccttacta 660
aaggacctca tgaattttgc tctcaacata caatgctagt taaacagggt gatgattatg 720
tgtaccttcc ttacccagat ccatcaagaa tcctaggggc cggctgtttt gtagatgata 780
tcgtaaaaac agatggtaca cttatgattg aacggttcgt gtctttagct atagatgctt 840
acccacttac taaacatcct aatcaggagt atgctgatgt ctttcatttg tacttacaat 900
acataagaaa gctacatgat g 921
<210> 2
<211> 996
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(Coronavirus)
<400> 2
gcagtagggg aacttctcct gctagaatgg ctggcaatgg cggtgatgct gctcttgctt 60
tgctgctgct tgacagattg aaccagcttg agagcaaaat gtctggtaaa ggccaacaac 120
aacaaggcca aactgtcact aagaaatctg ctgctgaggc ttctaagaag cctcggcaaa 180
aacgtactgc cactaaagca tacaatgtaa cacaagcttt cggcagacgt ggtccagaac 240
aaacccaagg aaattttggg gaccaggaac taatcagaca aggaactgat tacaaacatt 300
ggccgcaaat tgcacaattt gcccccagcg cttcagcgtt cttcggaatg tcgcgcattg 360
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aaacattccc accaacagag cctaaaaagg acaaaaagaa gaaggctgat gaaactcaag 540
ccttaccgca gagacagaag aaacagcaaa ctgtgactct tcttcctgct gcagatttgg 600
atgatttctc caaacaattg caacaatcca tgagcagtgc tgactcaact caggcctaaa 660
ctcatgcaga ccacacaagg cagatgggct atataaacgt tttcgctttt ccgtttacga 720
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ttaactttaa tctcacatag caatctttaa tcagtgtgta acattaggga ggacttgaaa 840
gagccaccac attttcaccg aggccacgcg gagtacgatc gagtgtacag tgaacaatgc 900
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<211> 1000
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(Coronavirus)
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ccaaaaaccc attactttat gatgccaact attttctttg ctggcatact aattgttacg 60
actattgtat accttacaat agtgtaactt cttcaattgt cattacttca ggtgatggca 120
caacaagtcc tatttctgaa catgactacc agattggtgg ttatactgaa aaatgggaat 180
ctggagtaaa agactgtgtt gtattacaca gttacttcac ttcagactat taccagctgt 240
actcaactca attgagtaca gacactggtg ttgaacatgt taccttcttc atctacaata 300
aaattgttga tgagcctgaa gaacatgtcc aaattcacac aatcgacggt tcatccggag 360
ttgttaatcc agtaatggaa ccaatttatg atgaaccgac gacgactact agcgtgcctt 420
tgtaagcaca agctgatgag tacgaactta tgtactcatt cgtttcggaa gagacaggta 480
cgttaatagt taatagcgta cttctttttc ttgctttcgt ggtattcttg ctagttacac 540
tagccatcct tactgcgctt cgattgtgtg cgtactgctg caatattgtt aacgtgagtc 600
ttgtaaaacc ttctttttac gtttactctc gtgttaaaaa tctgaattct tctagagttc 660
ctgatcttct ggtctaaacg aactaaatat tatattagtt tttctgtttg gaactttaat 720
tttagccatg gcagattcca acggtactat taccgttgaa gagcttaaaa agctccttga 780
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tggaattgct atcgcaatgg cttgtcttgt aggcttgatg 1000
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<212> DNA
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ctgtcacggc caatgttaat gcacttttat ctactgatgg taacttttgc taatcatgtt 120
catacctctc cgcaatttac aacacagact ttatgagtgt ctctatagaa atagagatgt 180
tgacacagac tttgtgaatg agttttacgc atatttgcgt aaacatttct caatgat 237
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcattgaga aatgtttacg c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caaaattgcc gataagtatg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgctgaggct tctaagaagc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gattagttcc tggtccccaa 20
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catacaatgt aacacaagct ttcg 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttatactgaa aaatgggaat c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
taacatgttc aacaccagtg tc 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tacacagtta cttcacttca gac 23
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttttgctaat catgttcata cctc 24

Claims (7)

1.一种新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒，其特征在于，包括反应液，阳性对照品，内标，阴性对照品；其中，所述的反应液包括新型冠状病毒检测引物、荧光探针、PCR缓冲体系及酶，所述的阳性对照品包括新型冠状病毒假病毒，所述的内标包括不含靶标基因的外源性片段假病毒，所述的阴性对照品包括生理盐水；该试剂盒用于同时检测新型冠状病毒（2019-nCOV）的：如SEQ ID NO:1所示的ORF1ab基因、如SEQ ID NO:2所示的N基因、和如SEQID NO:3所示的E基因；所述的检测引物及荧光探针为：
ORF1ab F1：GAACCTCATCAGGAGATGC，即SEQ ID NO:5；
ORF1ab R1：ATCATTGAGAAATGTTTACGC，即SEQ ID NO:6；
ORF1ab P：CAAAATTGCCGATAAGTATG，即SEQ ID NO:7，5端标记FAM，3端标记BHQ1；
N F1：TGCTGAGGCTTCTAAGAAGC，即SEQ ID NO:8；
NR1：GATTAGTTCCTGGTCCCCAA，即SEQ ID NO:9；
N P：CATACAATGTAACACAAGCTTTCG，即SEQ ID NO:10，5端标记ROX，3端标记BHQ2；
E F1：TTATACTGAAAAATGGGAATC，即SEQ ID NO:11；
E R1：TAACATGTTCAACACCAGTGTC，即SEQ ID NO:12；
E P：TACACAGTTACTTCACTTCAGAC，即SEQ ID NO:13，5端标记HEX，3端标记BHQ1。
2.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒，其特征在于，所述的内标采用竞争性内标，内标序列为SEQ ID NO:4，检测引物与新型冠状病毒ORF1ab 基因检测引物一致，及荧光探针：
ICP: TTTTGCTAATCATGTTCATACCTC，即SEQ ID NO:14，5端标记CY5，3端标记BHQ3。
3.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒，其特征在于，所述的新型冠状病毒假病毒为外壳蛋白包裹由新型冠状病毒（2019-nCOV）的ORF1ab基因、N基因、和E基因形成的假病毒颗粒；
所述的外壳蛋白为噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成；
所述的假病毒颗粒中ORF1ab基因、N基因、和E基因的核苷酸序列即SEQ ID NO:1-3串联。
4.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒，其特征在于，所述的内标，其不含靶标基因的外源性片段假病毒为外壳蛋白包裹内标IC基因形成的假病毒颗粒；
所述的外壳蛋白为噬菌体MS2成熟酶和噬菌体MS2衣壳蛋白组成；
所述的内标IC基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
5.如权利要求3或权利要求4所述的新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒，其特征在于，假病毒的制备方法如下：
1）采用序列见GENBANK ID:V00642.1(130-1311)的MS2成熟酶编码基因及序列见GENBANK ID:V00642.1(1335-1772)的噬菌体衣壳蛋白编码基因的扩增引物从序列见GENBANK ID:V00642.1的MS2噬菌体基因组中扩增出相关基因的全长基因；
2）然后将噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因依次克隆进入pET32a表达载体MCS位点，获得含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的重组质粒pET32a-MS2；
3）将由新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、和E基因即核苷酸序列SEQ ID NO:1-3串联的基因或内标IC基因SEQ ID NO:4克隆进去含有噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的重组质粒，得到pET32a-MS2-ORF/E/N或pET32a-MS2-IC，其中，新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因、和E基因或内标IC基因置于噬菌体MS2成熟酶编码基因和噬菌体衣壳蛋白编码基因的下游；
4）将克隆好的重组质粒转入表达宿主菌，宿主菌为大肠杆菌BL21（DE3）；
5)诱导培养所述的重组菌，即可得到新型冠状病毒假病毒颗粒或内标假病毒颗粒。
6.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒，其特征在于，所述反应液具体包含10* buffer I，5* buffer II，Hotstart Taq酶，UDG酶，dNTP，dUTP，RNA酶抑制剂、反转录酶、及所述的检测引物及荧光探针。
7.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒（2019-nCOV）检测试剂盒，其特征在于，所述的反应液的具体组分含量为：
10*buffer I 2.5ul，5*buffer II 5ul，20mM dN（U）TP 1.5ul，40U/ul RNA酶抑制剂0.5ul，200U/ul反转录酶 0.25ul，5U/ul Hotstart taq 0.5ul，2U/ul UDG 0.5ul，10μM核苷酸序列如SEQ ID NO:5、6、8、9、11、12所示的引物各0.75μL，10μM核苷酸序列如SEQ IDNO:7、10、13、14所示的探针各0.4μL，DEPC H2O 补足到21ul。
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