CN109929948A - 一种用于检测d型流感病毒d/660分支的荧光定量pcr检测材料及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR检测材料及试剂盒，材料中包括包括qPCR前引物、qPCR后引物和特异性荧光定量探针，其中，qPCR前引物序列为：GCAAAGAAGTTTCGGTCATTGTC；qPCR后引物序列为：CCAGTTTACCCCTTCATAAAATA；特异性荧光定量探针序列为：荧光基团‑AAAAGCCGACAACATCAACGAAGC‑淬灭基团。经验证表明使用本发明中的引物和特异性荧光探针结合本发明中提供的方法，可以实现对D型流感病毒的D/660分支的高特异性的定量检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR检测材料及试剂盒。
背景技术
流感病毒是一种严重威胁人、畜健康的传染病。IDV是一种单股负链RNA病毒，具有7个基因组片段，编码9种蛋白质：糖蛋白血凝素-酯酶融合蛋白(HE)；聚合酶PB2，PB1和P3；核蛋白；基质蛋白(M1和CM2)，和非结构蛋白(NS1和NEP)。IDV与ICV有低于50％的蛋白质序列同一性。IDV与人ICV产生的血清之间没有交叉反应。在2014年国际病毒分类委员会执委会批准命名了一种新病毒—D型流感病毒，提议为正粘病毒科的新成员。
2011年IDV首次从患有呼吸道疾病的猪中分离出，随后在美国、法国、日本、中国、爱尔兰等多个地区都有所报道。D型流感病毒分为两个分支D/OK和D/660，若能确定是属于D型流感病毒的哪个分支，能够及时的预防治疗，减少经济损失。血清学研究表明至少从2004年以来IDV存在于肉牛中。犊牛的母体抗体水平在6个月后降低，刚断奶的犊牛似乎最容易感染。牛被认为是IDV的天然宿主。研究表明鸡和火鸡没有感染IDV，但是来自人血清样本的血清学证据发现，人的血清能检测到阳性，所以IDV可能具有潜在的公共健康风险。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种迅速准确，能极大缩短检测周期的用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR材料。
本发明另一要解决的技术问题是提供一种用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明还一要解决的技术问题是提供上述荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
提供一种用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR材料，包括qPCR前引物、qPCR后引物和特异性荧光定量探针，
qPCR前引物序列为：
GCAAAGAAGTTTCGGTCATTGTC(SEQ ID NO.1)
qPCR后引物序列为：
CCAGTTTACCCCTTCATAAAATA(SEQ ID NO.2)
特异性荧光定量探针序列为：
荧光基团-AAAAGCCGACAACATCAACGAAGC-淬灭基团(SEQ ID NO.3)
优选地，所述特异性荧光定量探针的荧光基团为FAM荧光基团；所述猝灭基团为BHQ1淬灭基团。
提供一种用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR检测试剂盒，包括反转录酶与抑制剂、荧光定量PCR酶混合液，阳性对照样品、阴性对照样品和ddH2O，其中荧光定量PCR酶混合液中包括上述的荧光定量PCR检测材料。
优选地，所述qPCR前引物、qPCR后引物的浓度为10μmol/L，所述特异性荧光定量探针的浓度为10μmol/L。
进一步地，所述阳性对照为含有所述qPCR前引物与所述qPCR后引物扩增片段的18-T载体质粒溶液。
优选地，所述含有所述qPCR前引物与所述qPCR后引物扩增片段的18-T载体质粒溶液的浓度为1×105copies/μL。
优选地，所述阴性对照为18-T载体质粒溶液。
提供一种上述用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1.利用TRIZOL方法提取待测样品的RNA；
S2.将待测样品中的RNA反转录合成cDNA；
S3.于待测样品的cDNA中加入荧光定量PCR酶混合液，进行荧光定量PCR检测。
优选地，所述荧光定量PCR的反应体系为20μL，其中，荧光定量PCR酶混合液LunauniversaprobeQpcr Mix 10μL，待测样品的cDNA 2μL，加Nuclease-free H2O补充至20μL；所述荧光定量PCR酶混合液中含有浓度为10μM的qPCR前引物0.8μL，浓度为10μM的qPCR后引物0.8μL，浓度为10μM的探针0.4μL。
优选地，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性60秒，95℃15秒，60℃30s，共40～45个循环。
本发明的有益效果是：
1.本发明通过荧光定量PCR可以确定D型流感病毒的不同分支，而本发明的引物和探针能检测D型流感病毒的D/660分支，从而能够及时的预防治疗，减少经济损失。
2.本发明提供的检测材料敏感性高：通过倍比稀释标准阳性质粒进行灵敏度检测得出检测的最低浓度为10.09copies/μL。
3.本发明提供的检测材料特异性强：除了D型流感病毒的HEF基因能检测到阳性的荧光信号外，而其他亚型流感病毒均是阴性。
4.本发明提供的试剂盒能快速的检测到D型流感病毒，能为养殖公司及时发现该病毒的流行情况提供了重要依据，同时也减少了养殖业的损失。
5.本发明提供的用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR的检测方法，该检测方法迅速准确，能极大缩短检测周期，能及时的发现疫病的流行情况，从而为疫病防控提供时间和技术上的保障。
附图说明
图1 D型流感病毒荧光定量PCR阳性样品扩增曲线。图中4条曲线，从左至右前三个为同一个样品三个重复，第四个为阴性对照。
图2 D型流感病毒荧光定量PCR标准曲线。
图3荧光定量PCR引物对敏感性实验扩增。图中6组曲线，从左至右依次为：10-7-10-2copies/μL 6个浓度梯度
图4荧光定量PCR引物对特异性实验扩增结果。图中9条曲线，从左至右依次为：阳性对照、猪塞内加谷病毒(SVV)；猪圆环病毒(pcv3)；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)；猪丁型冠状病毒(PDCoV)；H1亚型禽流感病毒；H3亚型禽流感病毒；H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例与附图进一步说明本发明的技术方案。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料。除非特别说明，下述实施例中使用的系统为本领域常规使用的设备。
HEF基因表达的蛋白是D型流感病毒上的一种表面蛋白，因此选择利用HEF基因来检测到D型流感病毒。此外选择HEF基因不仅能检测到D型流感病毒更能确定是属于D型流感病毒的哪个分支，从而能够及时的预防治疗，减少经济损失。因此，参照NCBI中的D型和C型流感病毒HEF基因序列，利用生物技术软件Megalian找到同源性最高序列片段，针对D型流感病毒设计特异性引物序列，并确保所设计的引物自身不会错配或形成发卡结构。
实施例1表1荧光定量PCR引物及探针序列
已知的羊的D型流感病毒为检测材料，阴性对照为纯水。
所述特异性荧光探针的荧光基团为FAM荧光基团；所述猝灭基团为BHQ1淬灭基团。1、羊的D型流感病毒RNA抽提
利用TRIZOL方法提取RNA。细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；12000rpm离心5min弃沉淀，Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min；4℃12000rpm离心15min，吸取上层液体至另一离心管中；加入异丙醇(沉淀RNA)混匀，室温放置5-10min；4℃12000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底，Trizol加入75％乙醇(沉淀RNA)，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃8000rpm离心5min，弃上清。室温晾干5-10min；吸取50μL DEPC处理的水溶解RNA，保存在-80℃也可以直接用于反转录。
2、反转录合成cDNA
反转录合成cDNA:DNTP Mixture(10Mmeach)1μL,Oligo Dt Primer(2.5uM)1μL，TotalRNA 5μL，65℃5分钟，然后迅速冷却。加5×PrimeScript TM Rtase Buffer 4μl,Rnase Inhibitor(40U/μl)0.5μL,PrimeScript TM Rtase 0.5μL,Rnase Free DH2O定容至20μL。42℃反应30分钟，95℃，5分钟使酶失活。
3、荧光定量PCR检测
反应体系为20μL，包括荧光定量PCR酶混合液Luna universaprobeQpcr Mix10μL，模版cDNA2μL，H2O(Nuclease-free)补充至20μL；其中荧光定量PCR酶混合液LunauniversaprobeQpcr Mix10μL包含qPCR前引物(10μM)0.8μL，qPCR后引物(10μM)0.8μL，探针(10μM)0.4μL。反应程序为：95℃预变性60秒，然后95℃15秒，60℃30s然后40～45个循环。
如附图1所示检测的标准阳性样品的Ct值为10，而阴性对照则Ct值大于35，说明本方法能有效地检测D型流感病毒D/660分支。
实施例2荧光定量PCR标准曲线绘制
反应体系为20μL，包括荧光定量PCR酶混合液Luna universaprobeQpcr Mix10μL，模版cDNA2μL，H2O(Nuclease-free)补充至20μL，其中荧光定量PCR酶混合液LunauniversaprobeQpcr Mix10μL包含qPCR前引物(10μM)0.8μL，qPCR后引物(10μM)0.8μL，探针(10μM)0.4μL。
反应程序为：95℃预变性60秒，然后95℃15秒，60℃30s然后40-45个循环。
将上述阳性标准样品，通过测阳性质粒的浓度计算成拷贝数，然后用ddH2O倍比稀释为6个浓度梯度10-7-10-2copies/μL，分别以这6个浓度梯度配制20μL体系，Bio-rad荧光定量PCR仪进行扩增，建立的标准曲线为图2，标准曲线斜率为-3.4746，y轴截距为44.16。结果如附图2所示，标准曲线与Cq值的相关性为r2(相关系数)为0.9959。说明：不同浓度标准品之间具有良好的相关性。
实施例3荧光定量PCR探针法的灵敏性实验
将实施例2中所述阳性标准样品，通过测阳性质粒的浓度进而计算成拷贝数，然后用ddH2O倍比稀释为6个浓度梯度10-7-10-2copies/μL，分别以这6个浓度梯度配制20μL体系，Bio-rad荧光定量PCR仪进行扩增，反应条件如实施例2，结果见附图3所示。提取的阳性质粒用超纯水进行10倍稀释，在260nm与280nm波长下测定质粒的含量，由公式得质粒DNA的拷贝数根据公式算可得：实时荧光定量PCR的检出最低浓度为10.09copies/μL。
实施例4荧光定量PCR探针法的特异性实验
分别提取了猪塞内加谷病毒(SVV)；猪圆环病毒(pcv3)；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)；猪丁型冠状病毒(PDCoV)；H1亚型禽流感病毒；H3亚型禽流感病毒；H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒来进行检测。具体操作如下：
1、利用TRIZOL方法提取RNA。细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解；12000rpm离心5min弃沉淀，Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min；4℃12000rpm离心15min，吸取上层液体至另一离心管中；加入异丙醇(沉淀RNA)混匀，室温放置5-10min；4℃12000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底，Trizol加入75％乙醇(沉淀RNA)，温和振荡离心管，悬浮沉淀；4℃8000rpm离心5min，弃上清。室温晾干5-10min；吸取50μL DEPC处理的水溶解RNA，保存在-80℃也可以直接用于反转录。
2、反转录合成cDNA
反转录合成cDNA:DNTP Mixture(10Mm each)1μL,Oligo Dt Primer(2.5uM)1μL，Total RNA 5μL，65℃5分钟，然后迅速冷却。加5×PrimeScript TM Rtase Buffer 4μL,Rnase Inhibitor(40U/μL)0.5μL,PrimeScript TM Rtase 0.5μl,Rnase Free ddH2O定容至20μL。42℃反应30分钟，95℃，5分钟使酶失活。
3、荧光定量PCR检测
反应体系为20μL，包括荧光定量PCR酶混合液Luna universaprobeQpcr Mix10μL，模版cDNA2μL，H2O(Nuclease-free)补充至20μL，其中荧光定量PCR酶混合液LunauniversaprobeQpcr Mix10μL包含qPCR前引物(10μM)0.8μL，qPCR后引物(10μM)0.8μL，探针(10μM)0.4μL。反应程序为：95℃预变性60秒，然后95℃15秒，60℃30s然后40-45个循环。
检测结果如附图4所示，从结果中可以看出，只有D型流感病毒出现扩增曲线，Ct值为21.0，小于30；而其他样品的Ct值都大于32.0，说明本实施例采用的检测材料及方法具有良好的特异性，只能够检测出D型流感病毒的D/660分支。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一种用于检测D型流感病毒D660分支的荧光定量PCR材料及试剂盒
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcaaagaagt ttcggtcatt gtc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccagtttacc ccttcataaa ata 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaaagccgac aacatcaacg aagc 24
Claims (10)
1.一种用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR材料，包括qPCR前引物、qPCR后引物和特异性荧光定量探针，
qPCR前引物序列为：
GCAAAGAAGTTTCGGTCATTGTC(SEQ ID NO.1)
qPCR后引物序列为：
CCAGTTTACCCCTTCATAAAATA(SEQ ID NO.2)
特异性荧光定量探针序列为：
荧光基团-AAAAGCCGACAACATCAACGAAGC-淬灭基团(SEQ ID NO.3)。
2.根据权利要求1所述的检测材料，其特征在于，所述特异性荧光定量探针的荧光基团为FAM荧光基团；所述猝灭基团为BHQ1淬灭基团。
3.一种用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR检测试剂盒，包括反转录酶与抑制剂、荧光定量PCR酶混合液，阳性对照样品、阴性对照样品和ddH2O，其中荧光定量PCR酶混合液中包括权利要求1或2任一所述的荧光定量PCR检测材料。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述qPCR前引物、qPCR后引物的浓度为10μmol/L，所述特异性荧光定量探针的浓度为10μmol/L。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有所述qPCR前引物与所述qPCR后引物扩增片段的18-T载体质粒溶液。
6.根据权利要5所述的试剂盒，其特征在于，所述含有所述qPCR前引物与所述qPCR后引物扩增片段的18-T载体质粒溶液的浓度为1×105copies/μL。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为18-T载体质粒溶液。
8.一种权利要求4至7任一所述用于检测D型流感病毒D/660分支的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1.利用TRIZOL方法提取待测样品的RNA；
S2.将待测样品中的RNA反转录合成cDNA；
S3.于待测样品的cDNA中加入荧光定量PCR酶混合液，进行荧光定量PCR检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为20μL，其中，荧光定量PCR酶混合液Luna universaprobeQpcr Mix 10μL，待测样品的cDNA 2μL，加Nuclease-free H2O补充至20μL；所述荧光定量PCR酶混合液中含有浓度为10μM的qPCR前引物0.8μL，浓度为10μM的qPCR后引物0.8μL，浓度为10μM的探针0.4μL。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性60秒，95℃15秒，60℃30s，共40～45个循环。
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| CN201910184009.5A CN109929948A (zh) | 2019-03-12 | 2019-03-12 | 一种用于检测d型流感病毒d/660分支的荧光定量pcr检测材料及试剂盒 |
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| CN109929948A true CN109929948A (zh) | 2019-06-25 |
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|---|---|
| CN (1) | CN109929948A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111334616A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-06-26 | 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心） | D型流感病毒荧光定量pcr与lamp荧光定量pcr引物对及其应用 |
-
2019
- 2019-03-12 CN CN201910184009.5A patent/CN109929948A/zh active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZIQING YAN等: "Evolutionary changes of the novel Influenza D virus hemagglutinin-esterase fusion gene revealed by the codon usage pattern", 《VIRULENCE》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111334616A (zh) * | 2020-04-30 | 2020-06-26 | 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心） | D型流感病毒荧光定量pcr与lamp荧光定量pcr引物对及其应用 |
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