CN116246694B - 一种实时数字pcr定量确定方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种实时数字PCR定量确定方法、装置，该方法包括：确定当前扩增实验中每一微单元的目标扩增曲线，并计算每一所述目标扩增曲线对应的Cq值；从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线；根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率；将每一所述阳性扩增曲线对应的所述Cq值和所述扩增效率代入预测拷贝数模型，输出每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数；基于每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数，确定实时数字PCR定量结果。采用本发明提供的一种实时数字PCR定量确定方法，不仅能够提高实时数字PCR定量结果的准确性，还可以提升定量结果的动态范围。
Description
技术领域
本发明涉及数字PCR技术领域，具体涉及一种实时数字PCR定量确定方法及装置。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)技术经历了普通PCR、实时荧光PCR(简称qPCR)、数字PCR(dPCR)等三代技术迭代。dPCR在qPCR的基础上，将样品分割成大量微单元，通过检测每个微单元扩增终点的荧光信号，结合泊松分布，可以实现目标物质的绝对定量，将PCR的定量检测能力推上了新的高度。
然而，利用终点荧光值进行阴阳性的判断，缺失了整个反应过程的实时监测，会导致阴阳性分类不准确，进而产生假阳性/假阴性，影响定量结果；同时，阴阳性的统计将每个微单元定量结果限制为“0”或“1”，会导致dPCR的定量结果的动态范围受限于微单元数量。
发明内容
因此，本发明要解决现有技术中存在定量结果不准确的技术问题，从而提供一种实时数字PCR定量确定方法及装置。
根据第一方面，本发明实施例提供了一种实时数字PCR定量确定方法，包括如下步骤：
确定当前扩增实验中每一微单元的目标扩增曲线，并计算每一所述目标扩增曲线对应的Cq值；
从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线；
根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率；
将每一所述阳性扩增曲线对应的所述Cq值和所述扩增效率代入预测拷贝数模型，输出每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数；
基于每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数，确定实时数字PCR定量结果。
可选地，所述目标扩增曲线为荧光信号值与扩增次数的关系曲线，所述从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线，包括：
获取预设终点荧光值；
判断所述目标扩增曲线的终点荧光值是否大于所述预设终点荧光值；
若所述目标扩增曲线的终点荧光值大于所述预设终点荧光值，则对大于所述预设终点荧光值的所述目标扩增曲线进行拟合(sigmoid拟合)；
确定出满足拟合条件的所述目标扩增曲线；
判断满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的所述Cq值是否处于预设Cq阈值范围；
若满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的所述Cq值处于预设Cq阈值范围，则确定处于所述预设Cq阈值范围的所述目标扩增曲线为所述阳性扩增曲线。
可选地，所述预设Cq阈值范围通过以下步骤确定：
获取满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的第一Cq值；
确定所述第一Cq值的分布区间；
基于所述分布区间，确定所述预设Cq阈值范围。
可选地，所述预测拷贝数模型通过以下步骤确定：
获取待训练模型；
获取标准扩增实验中，每一所述微单元对应的初始拷贝数，以及每一所述目标扩增曲线对应的所述Cq值、所述扩增效率与拟合参数；其中，所述拟合参数为对所述目标扩增曲线进行拟合后确定的参数；
将标准扩增实验中，每一所述微单元对应的所述Cq值、所述扩增效率、所述拟合参数、所述扩增曲线对应的曲线参数作为所述待训练模型的输入特征，所述初始拷贝数作为所述待训练模型的输出特征，训练所述待训练模型；
将训练完成后的所述待训练模型，作为所述预测拷贝数模型。
可选地，所述目标扩增曲线通过以下步骤确定，包括：
获取初始荧光扩增曲线；
基于参比染料通道荧光信号、初始荧光信号、所述参比染料通道荧光信号的中值，确定校正后的第一荧光扩增曲线；
将所述第一荧光扩增曲线进行滤波平滑处理，获得第二荧光扩增曲线；
确定所述第二荧光扩增曲线中的平台期，根据一次函数模板，对所述平台期对应的扩增曲线进行拟合，获得拟合后的荧光平台期曲线；
基于所述初始荧光扩增曲线、所述荧光平台期曲线，确定第三荧光扩增曲线，并将所述第三荧光扩增曲线作为所述目标扩增曲线。
可选地，所述根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率，包括：
根据第一函数模板对所述阳性扩增曲线进行拟合，所述第一函数模板为其中，x为扩增次数，y为荧光信号值，a2、b2、c2、d2为常数；将拟合确定后的常数a2作为所述扩增效率。
可选地，所述从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线之后，还包括：
判断所述阳性扩增曲线对应的Cq值是否超出预设阈值范围；
若所述阳性扩增曲线对应的Cq值超出所述预设阈值范围，则判断超出所述预设阈值范围的所述阳性扩增曲线是否存在异常阳性扩增曲线；
若存在，则确定所述异常阳性扩增曲线对应的所述微单元无效。
根据第二方面，本发明实施例提供了一种实时数字PCR定量确定装置，包括：
计算模块，用于确定当前扩增实验中每一微单元的目标扩增曲线，并计算每一所述目标扩增曲线对应的Cq值；
筛选模块，用于从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线；
确定模块，用于根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率；
预测模块，用于将每一所述阳性扩增曲线对应的所述Cq值和所述扩增效率代入预测拷贝数模型，输出每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数；
结果模块，用于基于每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数，确定实时数字PCR定量结果。
根据第三方面，本发明实施例提供了一种计算机设备，包括：存储器和处理器，所述存储器和所述处理器之间互相通信连接，所述存储器中存储有计算机指令，所述处理器通过执行所述计算机指令，从而执行上述的实时数字PCR定量确定方法。
根据第四方面，本发明实施例提供了一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储有计算机指令，所述计算机指令用于使所述计算机执行上述的实时数字PCR定量确定方法。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明实施例，首先，确定当前扩增实验中每一微单元的目标扩增曲线，并计算每一目标扩增曲线对应的Cq值；再从所有的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线；并确定与阳性扩增曲线一一对应的扩增效率；其次，将每一阳性扩增曲线对应的Cq值和扩增效率代入预测拷贝数模型，输出每一阳性微单元中的拷贝数；最终，基于每一阳性微单元中的拷贝数，确定总的定量结果。本实施例中，在不增加微单元数量的前提下，通过阳性扩增曲线对应的Cq值和扩增效率E，基于预测拷贝模型，将每一阳性微单元中的定量值从“1”扩展至“n”，不仅提高了实时数字PCR定量结果的准确性，还提升了定量结果的动态范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1中一种实时数字PCR定量确定方法的一个具体示例的流程图；
图2为本申请实施例1中目标扩增曲线的一个具体示例的曲线图；
图3为本申请实施例1中利用sigmoid函数进行拟合后的一个具体示例的曲线图；
图4为本申请实施例1中第一Cq值分布区间的一个具体示例的分布图；
图5为本申请实施例1中待训练模型的一个具体示例的训练流程图；
图6为本申请实施例1中传统方法采用终点法的一个具体示例的定量结果示意图；
图7为本申请实施例1中传统方法采用Cq法的一个具体示例的定量结果示意图；
图8为本申请实施例1中采用本发明方法的一个具体示例的定量结果示意图；
图9为本申请实施例2中一种实时数字PCR定量确定装置的一个具体示例的原理框图；
图10为本申请实施例3中一种计算机设备的一个具体示例的结构示意图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，还可以是两个元件内部的连通，可以是无线连接，也可以是有线连接。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实施例1
本实施例提供一种实时数字PCR定量确定方法，该确定方法可以由服务器、终端等设备来执行，通过服务器、终端等设备的计算、预测及数据输出，从而实现实时数字PCR定量的确定，如图1所示，包括如下步骤：
步骤S101，确定当前扩增实验中每一微单元的目标扩增曲线，并计算每一所述目标扩增曲线对应的Cq值。
在利用数字PCR进行靶标分子的绝对定量时，通常将稀释后的样品分割成大量微单元，每一微单元作为一个独立反应体系。在对每一微单元进行扩增实验时，获取每一微单元在每一次扩增后对应的荧光信号，并生成扩增曲线，将每一扩增曲线经过处理后，获得每一微单元对应的目标扩增曲线。本实施例中，可以通过阈值线法、二次求导法、一阶导数交点法、拟合法等，计算出每一目标扩增曲线对应的Cq值。其中，本实施例中，Cq值可以为量化周期(quantificatiaon cycle)，可以是指目标扩增曲线与阈值线相交处对应的PCR循环数。
步骤S102，从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线。
如上所述，在扩增实验中包括多个微单元，可以根据微单元对应的目标扩增曲线确定出该微单元为阳性微单元或是阴性微单元。其中，存在靶标分子的微单元为阳性微单元，未存在靶标分子的微单元为阴性微单元。根据每一微单元对应的目标扩增曲线，筛选出阳性微单元对应的目标扩增曲线，将阳性微单元对应的目标扩增曲线作为阳性扩增曲线。具体地筛选方法将在下文介绍。
步骤S103，根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率。
本实施例中，可以利用拟合法、Cq值定位法等，通过阳性扩增曲线计算出该阳性扩增曲线对应的扩增效率。其中，Cq值定位法为：取Cq值±1区间的荧光曲线，通过求导得到扩增效率。
步骤S104，将每一所述阳性扩增曲线对应的所述Cq值和所述扩增效率代入预测拷贝数模型，输出每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数。
本实施例中，预测拷贝数模型为预先训练好的深度学习模型，将每一阳性扩增曲线对应的Cq值和扩增效率作为预测拷贝模型的输入特征，通过预测拷贝模型输出每一阳性扩增曲线对应的阳性微单元中的拷贝数。
步骤S105，基于每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数，确定实时数字PCR定量结果。也即是，将每一阳性微单元中的拷贝数进行加和，从而确定出利用实时数字PCR获得的样品的定量结果。
本实施例中提供的实时数字PCR定量确定方法，区别于传统的数字PCR定量方法。传统的数字PCR定量方法，在获取每一微单元的扩增曲线后，根据预先设定的荧光信号阈值或Cq值，确定出该微单元为阳性微单元或是阴性微单元后，根据总的阳性微单元数量以及泊松分布，直接估算出当前样品中的总的拷贝值，也即是总的定量结果的概率值，其定量结果不准确。且在阳性微单元或是阴性微单元的判断过程中，直接利用终点法进行阴阳性的判断，会导致阴阳性分类不准确，进而产生假阳性/假阴性。并且，由于传统的数字PCR定量方法中，在阳性微单元或是阴性微单元的统计中，将每一微单元定量结果限制为了“0”或“1”，无法进一步准确的确定出每一阳性微单元对应的拷贝数，导致数字PCR的定量结果的动态范围受限于微单元数量，定量动态范围受限。
本实施例中，首先，确定当前扩增实验中每一微单元的目标扩增曲线，并计算每一目标扩增曲线对应的Cq值；再从所有的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线；并确定与阳性扩增曲线一一对应的扩增效率；其次，将每一阳性扩增曲线对应的Cq值和扩增效率代入预测拷贝数模型，输出每一阳性微单元中的拷贝数；最终，基于每一阳性微单元中的拷贝数，确定总的定量结果。本实施例中，在不增加微单元数量的前提下，通过阳性扩增曲线对应的Cq值和扩增效率E，基于预测拷贝模型，将每一阳性微单元中的定量值从“1”扩展至“n”，不仅提高了实时数字PCR定量结果的准确性，还提升了定量结果的动态范围。
作为一种可选实施方式，本发明实施例中，目标扩增曲线可以如图2所示，所述目标扩增曲线为荧光信号值与扩增次数的关系曲线，所述从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线，包括：
获取预设终点荧光值；判断所述目标扩增曲线的终点荧光值是否大于所述预设终点荧光值。
本实施例中可以先采用传统方法中，利用终点法，也即是根据扩增曲线中的终点荧光值与预设荧光值进行比较，将小于预设终点荧光值的目标扩增曲线判定为阴性线，将大于预设终点荧光值的目标扩增曲线，初步判定为阳性线。
若所述目标扩增曲线的终点荧光值大于所述预设终点荧光值，则对大于所述预设终点荧光值的所述目标扩增曲线进行拟合。
也即是，对初步确定出的阳性线进行拟合。具体地，可以将初步确定出的阳性线拟合为Sigmoid增长曲线，优选四参数拟合，拟合函数模板可以为：其中，a1、b1、c1、d1为拟合参数，e为自然对数的底数，x可以为扩增次数，y可以为荧光信号值。拟合的最大容忍误差可以设定为10000，当拟合误差超过10000时，判定为无法拟合，无法拟合的目标扩增曲线可以判定为阴性线。拟合后的曲线可以如图3所示。
确定出满足拟合条件的所述目标扩增曲线；
判断满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的所述Cq值是否处于预设Cq阈值范围。其中，预设Cq阈值范围可以根据所有满足拟合条件的目标扩增曲线对应的第一Cq值的分布区间进行确定。
若满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的所述Cq值处于预设Cq阈值范围，则确定处于所述预设Cq阈值范围的所述目标扩增曲线为所述阳性扩增曲线。
若满足拟合条件的目标扩增曲线对应的所述Cq值超出预设Cq阈值范围，则确定超出预设Cq阈值范围的目标扩增曲线为阴性线。
本实施例中，通过对每一微单元的实时目标扩增曲线进行筛选，从而去除阴性线，确定出阳性扩增曲线。进一步地，基于筛选后的阳性扩增曲线进行分析，可以有效提高定量结果的准确性，从而提高定量结果的动态范围。
作为一种可选实施方式，本发明实施例中，所述预设Cq阈值范围通过以下步骤确定：
获取满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的第一Cq值；
确定所述第一Cq值的分布区间；
基于所述分布区间，确定所述预设Cq阈值范围。
具体地，获取所有满足拟合条件的目标扩增曲线对应的第一Cq值，将所有第一Cq值生成分布区间，汇总每一分布区间内阳性微单元的总数，如图4所示，纵轴可以为阳性微单元数量，横轴可以为所有满足拟合条件的目标扩增曲线对应的第一Cq值的分布区间。根据分布区间对应的阳性微单元数量峰值，确定出预设Cq阈值范围。以图4为例，图4中分布区间：(26.76,27,22]对应的阳性微单元数量为峰值，可以将(26.76,27,22]扩大至(21.76,32,22]，从而将(21.76,32,22]作为预设Cq阈值范围。
本实施例中，对满足拟合条件的目标扩增曲线，根据每一第一Cq值的分布情况以及对应的阳性微单元数量，对阳性微单元以及阴性微单元进行进一步筛选，从而了提高阳性微单元与阴性微单元判断的准确性。
作为一种可选实施方式，本发明实施例中，所述预测拷贝数模型通过以下步骤确定：
获取待训练模型。
本实施例中，待训练模型可以选取但不限于SVM、GBDT、LightGBM、CNN。
获取标准扩增实验中，每一所述微单元对应的初始拷贝数，以及每一所述目标扩增曲线对应的所述Cq值、所述扩增效率与拟合参数；其中，所述拟合参数为对所述目标扩增曲线进行拟合后确定的参数。
本实施例中，在训练待训练模型之前，需要获取标准扩增实验中每一微单元对应的数据。
具体地，选取由低到高的已知浓度的样本，并做多次扩增实验，记录下每次实验中，每个微单元对应的目标扩增曲线，并计算每一目标扩增曲线对应的Cq值以及扩增效率，并对每一目标扩增曲线进行拟合。同样可以采用拟合函数模板为：进行拟合，将a1、b1、c1、d1作为拟合参数。在每一次的扩增实验中，样本中包含的定量结果，也即是总拷贝数，以及每一微单元中的拷贝数均为已知值，也即可以准确的获知每一微单元对应的初始拷贝数。
将标准扩增实验中，每一所述微单元对应的所述Cq值、所述扩增效率、所述拟合参数、所述扩增曲线对应的曲线参数作为所述待训练模型的输入特征，所述初始拷贝数作为所述待训练模型的输出特征，训练所述待训练模型。
将训练完成后的所述待训练模型，作为所述预测拷贝数模型。
本实施例中，将标准扩增实验中获得的每一微单元对应的Cq值、扩增效率、拟合参数、扩增曲线对应的曲线参数作为待训练模型的输入特征，以及将已知的初始拷贝数作为待训练模型的输出特征，来训练待训练模型，提高了预测拷贝数模型输出的拷贝数的准确性，从而提高了定量结果的准确定，且提升了定量结果的动态范围。
作为一种可选实施方式，本实施例中，还可以将泊松分布的参数作为待训练模型的输入特征，所述泊松分布公式为其中k为样本的总拷贝数，λ为阳性微单元的总数。待训练模型的训练流程图可以如图5所示。
作为一种可选实施方式，本发明实施例中，所述目标扩增曲线通过以下步骤确定，包括：
步骤S201，获取初始荧光扩增曲线；可以是根据每一次扩增后对应的荧光信号值生成的初始荧光扩增曲线，其中可能包含了异常荧光信号值等。
具体地，每一微单元对应的荧光信号值通过以下步骤确定：
步骤a，获取每一次扩增后对应的初始图像，所述初始图像为包括微单元的整个芯片区域；
步骤b，锐化所述初始图像，用于将所述微单元的孔位边缘清晰化；
步骤c，对锐化后的所述初始图像进行滤波，用于滤除白噪声；滤波包括但不限于：高斯滤波、Kalman滤波、Butterworth滤波，三次样条滤波，Whittaker滤波。
步骤d，对滤波后的所述初始图像进行二值化，增强所述初始图像的对比度；
步骤e，通过开运算滤除非ROI区域噪音，并填充连通域，将所述芯片区域填充；
步骤f，利用与位运算剔除所述芯片区域外的信号，获得高信噪比图像；
步骤g，对所述高信噪比图像进行边缘检测，提取出每一所述微单元的位置信息；
步骤h，将芯片旋转至边缘与坐标轴平行，使其与预设的芯片孔位模板匹配；
步骤i，提取每一所述微单元内荧光信息；
步骤j，计算每一微单元内荧光信息的统计学特征，最终得到每一微单元的荧光信号值。
步骤S202，基于参比染料通道荧光信号FR、初始荧光信号Fx、所述参比染料通道荧光信号的中值Fmid，确定校正后的第一荧光扩增曲线。
以单次循环下对应的荧光信号值为例，可以采用公式：Fxn＝Fx/FR*Fmid计算校正后的荧光值Fxn。其中，Fxn为校正后的荧光值，Fx为初始荧光信号，FR为参比染料通道荧光信号，Fmid为参比染料通道荧光信号的中值。对每一次扩增后的荧光信号值进行校正，从而获得校正后的第一荧光扩增曲线。
步骤S203，将所述第一荧光扩增曲线进行滤波平滑处理，获得第二荧光扩增曲线。
本实施例中，可以采用傅里叶变换将第一荧光扩增曲线转化为频域，将高频部分滤波去除，公式可以为：再通过傅里叶逆变换还原为原始滤除噪声后的平滑信号，从而获得第二荧光扩增曲线。
步骤S204，确定所述第二荧光扩增曲线中的平台期，根据一次函数模板，对所述平台期对应的扩增曲线进行拟合，获得拟合后的荧光平台期曲线。
本实施例中，可以对滤除噪声后的平滑信号进行基线矫正。具体地，初始荧光扩增曲线在初始n个循环为平台期，理论上平台期的荧光信号应为恒定值。对平滑后信号求导，当导数出现快速增大时，即为平台期结束。确定平台期结束对应的循环次数为循环n，将循环[0,n]的信号使用一次函数进行拟合，获得拟合后的荧光平台期曲线。
步骤S205，基于所述初始荧光扩增曲线、所述荧光平台期曲线，确定第三荧光扩增曲线，并将所述第三荧光扩增曲线作为所述目标扩增曲线。
将初始荧光扩增曲线减去荧光平台期曲线，可以获得基线矫正后的信号，也即是第三荧光扩增曲线。并将第三荧光扩增曲线作为所述目标扩增曲线。
进一步地，可以使用高斯聚类对所有微单元校正后的荧光信号进行聚类分析，类别为2类，可以讲过聚类中心值较低的类，判定为阴性微单元，不参与接下来分析，从而提高确定定量结果的效率。
作为一种可选实施方式，本发明实施例中，所述根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率，包括：
根据第一函数模板对所述阳性扩增曲线进行拟合，所述第一函数模板为其中，x为扩增次数，y为荧光信号值，a2、b2、c2、d2为常数；将拟合确定后的常数a2作为所述扩增效率。
作为一种可选实施方式，本发明实施例中，所述从所有所述微单元的扩增曲线中目标筛选出阳性扩增曲线之后，还包括：
判断所述阳性扩增曲线对应的Cq值是否超出预设阈值范围；
若所述阳性扩增曲线对应的Cq值超出所述预设阈值范围，则判断超出所述预设阈值范围的所述阳性扩增曲线是否存在异常阳性扩增曲线；
若存在，则确定所述异常阳性扩增曲线对应的所述微单元无效。
预设阈值范围的设定可以根据每一微单元对应的Cq值进行设定，例如可以是[15,30]，然后，对超出预设阈值范围的阳性扩增曲线进行进一步判断。可以对超出预设阈值范围的阳性扩增曲线进行一阶求导，判断超出预设阈值范围的阳性扩增曲线的一阶导数。如果一阶导数存在阶跃信号，则判定该阳性扩增曲线为异常阳性扩增曲线，则判定异常阳性扩增曲线对应微单元为无效微单元，反之则为有效单元。
本实施例中，异常阳性扩增曲线对应的无效微单元，可能是存在杂质或其他因素的影响。本实施例充分考虑了杂质等外在因素的影响，去除无效微单元，从而提高定量结果的准确性，提升定量结果的动态范围。
如图6-8所示，图6为传统方法中采用终点法获得定量结果的示意图，图7为传统方法中采用Cq法获得定量结果的示意图，图8为采用本方法获得定量结果的示意图。表1为终点法、Cq法与本方法的定量结果比对。可以看出，采用本方法获得的定量结果动态范围更大。
| 理论拷贝数 | 终点法 | Cq法 | 本方法 |
| 103 | 2165 | 1846 | 1325 |
| 104 | 15231 | 10806 | 9789 |
| 105 | nan | nan | 108553 |
实施例2
本实施例提供一种实时数字PCR定量确定装置，该装置可以用于执行上述实施例1中的实时数字PCR定量确定方法，该装置可以设置在服务器或其它设备内部，模块间相互配合，从而实现实时数字PCR定量的确定，如图9所示，该装置包括：
计算模块201，用于确定当前扩增实验中每一微单元的目标扩增曲线，并计算每一所述目标扩增曲线对应的Cq值；
筛选模块202，用于从所有所述微单元的扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线；
确定模块203，用于根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率；
预测模块204，用于将每一所述阳性扩增曲线对应的所述Cq值和所述扩增效率代入预测拷贝数模型，输出每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数；
结果模块205，用于基于每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数，确定实时数字PCR定量结果。
本实施例中，首先，确定当前扩增实验中每一微单元的目标扩增曲线，并计算每一目标扩增曲线对应的Cq值；再从所有的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线；并确定与阳性扩增曲线一一对应的扩增效率；其次，将每一阳性扩增曲线对应的Cq值和扩增效率代入预测拷贝数模型，输出每一阳性微单元中的拷贝数；最终，基于每一阳性微单元中的拷贝数，确定总的定量结果。本实施例中，在不增加微单元数量的前提下，通过阳性扩增曲线对应的Cq值和扩增效率E，基于预测拷贝模型，将每一阳性微单元中的定量值从“1”扩展至“n”，不仅提高了实时数字PCR定量结果的准确性，还提升了定量结果的动态范围。
关于上述装置部分的具体描述，可以参见上述方法实施例，这里不再赘述。
实施例3
本实施例提供一种计算机设备，如图10所示，该计算机设备包括处理器301和存储器302，其中处理器301和存储器302可以通过总线或者其他方式连接，图10中以通过总线连接为例。
处理器301可以为中央处理器(Central Processing Unit，CPU)。处理器301还可以为其他通用处理器、数字信号处理器(Digital Signal Processor，DSP)、图形处理器(Graphics Processing Unit，GPU)、嵌入式神经网络处理器(Neural-network ProcessingUnit，NPU)或者其他专用的深度学习协处理器、专用集成电路(Application SpecificIntegrated Circuit，ASIC)、现场可编程门阵列(Field-Programmable Gate Array，FPGA)或者其他可编程逻辑器件、分立门或者晶体管逻辑器件、分立硬件组件等芯片，或者上述各类芯片的组合。
存储器302作为一种非暂态计算机可读存储介质，可用于存储非暂态软件程序、非暂态计算机可执行程序以及模块，如本发明实施例中实时数字PCR定量确定方法对应的程序指令/模块。处理器301通过运行存储在存储器302中的非暂态软件程序、指令以及模块，从而执行处理器的各种功能应用以及数据处理，即实现上述方法实施例中实时数字PCR定量确定方法。
存储器302还可以包括存储程序区和存储数据区，其中，存储程序区可存储操作系统、至少一个功能所需要的应用程序；存储数据区可存储处理器301所创建的数据等。此外，存储器302可以包括高速随机存取存储器，还可以包括非暂态存储器，例如至少一个磁盘存储器件、闪存器件、或者其他非暂态固态存储器件。在一些实施例中，存储器302可选包括相对于处理器301远程设置的存储器，这些远程存储器可以通过网络连接至处理器301。上述网络的实施例包括但不限于互联网、企业内部网、局域网、移动通信网及其组合。
所述存储器302中存储一个或者多个模块，当被所述处理器301执行时，执行如图1所示实施例中的实时数字PCR定量确定方法。
上述计算机设备具体细节可以对应参阅图1所示的实施例中对应的相关描述和效果进行理解，此处不再赘述。
本发明实施例还提供一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储有计算机可执行指令，该计算机可执行指令可执行上述任意实施例中的实时数字PCR定量确定方法。其中，所述存储介质可为磁碟、光盘、只读存储记忆体(Read-Only Memory，ROM)、随机存储记忆体(Random Access Memory，RAM)、快闪存储器(Flash Memory)、硬盘(HardDisk Drive，缩写：HDD)或固态硬盘(Solid-State Drive，SSD)等；所述存储介质还可以包括上述种类的存储器的组合。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种实时数字PCR定量确定方法，其特征在于，包括如下步骤：
确定当前扩增实验中每一微单元的目标扩增曲线，并计算每一所述目标扩增曲线对应的Cq值；
从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线；
根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率；
将每一所述阳性扩增曲线对应的所述Cq值和所述扩增效率代入预测拷贝数模型，输出每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数；
基于每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数，确定实时数字PCR定量结果；
所述目标扩增曲线为荧光信号值与扩增次数的关系曲线，所述从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线，包括：
获取预设终点荧光值；
判断所述目标扩增曲线的终点荧光值是否大于所述预设终点荧光值；
若所述目标扩增曲线的终点荧光值大于所述预设终点荧光值，则对大于所述预设终点荧光值的所述目标扩增曲线进行拟合；
确定出满足拟合条件的所述目标扩增曲线；
判断满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的所述Cq值是否处于预设Cq阈值范围；
若满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的所述Cq值处于预设Cq阈值范围，则确定处于所述预设Cq阈值范围的所述目标扩增曲线为所述阳性扩增曲线；
所述根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率，包括：
根据第一函数模板对所述阳性扩增曲线进行拟合，所述第一函数模板为；其中，x为扩增次数，y为荧光信号值，a2、b2、c2、d2为常数；将拟合确定后的常数a2作为所述扩增效率。
2.根据权利要求1所述的实时数字PCR定量确定方法，其特征在于，所述预设Cq阈值范围通过以下步骤确定：
获取满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的第一Cq值；
确定所述第一Cq值的分布区间；
基于所述分布区间，确定所述预设Cq阈值范围。
3.根据权利要求1所述的实时数字PCR定量确定方法，其特征在于，所述预测拷贝数模型通过以下步骤确定：
获取待训练模型；
获取标准扩增实验中，每一所述微单元对应的初始拷贝数，以及每一所述目标扩增曲线对应的所述Cq值、所述扩增效率与拟合参数；其中，所述拟合参数为对所述目标扩增曲线进行拟合后确定的参数；
将标准扩增实验中，每一所述微单元对应的所述Cq值、所述扩增效率、所述拟合参数、所述扩增曲线对应的曲线参数作为所述待训练模型的输入特征，所述初始拷贝数作为所述待训练模型的输出特征，训练所述待训练模型；
将训练完成后的所述待训练模型，作为所述预测拷贝数模型。
4.根据权利要求1或3所述的实时数字PCR定量确定方法，其特征在于，所述目标扩增曲线通过以下步骤确定，包括：
获取初始荧光扩增曲线；
基于参比染料通道荧光信号、初始荧光信号、所述参比染料通道荧光信号的中值，确定校正后的第一荧光扩增曲线；
将所述第一荧光扩增曲线进行滤波平滑处理，获得第二荧光扩增曲线；
确定所述第二荧光扩增曲线中的平台期，根据一次函数模板，对所述平台期对应的扩增曲线进行拟合，获得拟合后的荧光平台期曲线；
基于所述初始荧光扩增曲线、所述荧光平台期曲线，确定第三荧光扩增曲线，并将所述第三荧光扩增曲线作为所述目标扩增曲线。
5.根据权利要求1所述的实时数字PCR定量确定方法，其特征在于，所述从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线之后，还包括：
判断所述阳性扩增曲线对应的Cq值是否超出预设阈值范围；
若所述阳性扩增曲线对应的Cq值超出所述预设阈值范围，则判断超出所述预设阈值范围的所述阳性扩增曲线是否存在异常阳性扩增曲线；
若存在，则确定所述异常阳性扩增曲线对应的所述微单元无效。
6.一种实时数字PCR定量确定装置，其特征在于，包括：
计算模块，用于确定当前扩增实验中每一微单元的目标扩增曲线，并计算每一所述目标扩增曲线对应的Cq值；
筛选模块，用于从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线；
确定模块，用于根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率；
预测模块，用于将每一所述阳性扩增曲线对应的所述Cq值和所述扩增效率代入预测拷贝数模型，输出每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数；
结果模块，用于基于每一阳性扩增曲线对应的所述微单元中的拷贝数，确定实时数字PCR定量结果；
所述目标扩增曲线为荧光信号值与扩增次数的关系曲线，所述从所有所述微单元的目标扩增曲线中筛选出阳性扩增曲线，包括：
获取预设终点荧光值；
判断所述目标扩增曲线的终点荧光值是否大于所述预设终点荧光值；
若所述目标扩增曲线的终点荧光值大于所述预设终点荧光值，则对大于所述预设终点荧光值的所述目标扩增曲线进行拟合；
确定出满足拟合条件的所述目标扩增曲线；
判断满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的所述Cq值是否处于预设Cq阈值范围；
若满足拟合条件的所述目标扩增曲线对应的所述Cq值处于预设Cq阈值范围，则确定处于所述预设Cq阈值范围的所述目标扩增曲线为所述阳性扩增曲线；
所述根据所述阳性扩增曲线，确定与所述阳性扩增曲线一一对应的扩增效率，包括：
根据第一函数模板对所述阳性扩增曲线进行拟合，所述第一函数模板为；其中，x为扩增次数，y为荧光信号值，a2、b2、c2、d2为常数；将拟合确定后的常数a2作为所述扩增效率。
7.一种计算机设备，其特征在于，包括：
存储器和处理器，所述存储器和所述处理器之间互相通信连接，所述存储器中存储有计算机指令，所述处理器通过执行所述计算机指令，从而执行权利要求1-5任一项所述的实时数字PCR定量确定方法。
8.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述计算机可读存储介质存储有计算机指令，所述计算机指令用于使所述计算机执行权利要求1-5任一项所述的实时数字PCR定量确定方法。
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