WO2009155772A1 - 一种核酸富集器及其应用 - Google Patents

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WO2009155772A1
WO2009155772A1 PCT/CN2009/000270 CN2009000270W WO2009155772A1 WO 2009155772 A1 WO2009155772 A1 WO 2009155772A1 CN 2009000270 W CN2009000270 W CN 2009000270W WO 2009155772 A1 WO2009155772 A1 WO 2009155772A1
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WO
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nucleic acid
pcr
enricher
dna
specific probe
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Application number
PCT/CN2009/000270
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English (en)
French (fr)
Inventor
朱水芳
黄新
赵文军
陈红运
Original Assignee
中国检验检疫科学研究院
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid enricher and its use.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • the PCR reaction is similar to the natural replication process of DNA. It consists of three basic reaction steps: denaturation-annealing and extension. That is, under the action of Taq DNA polymerase, dNTP is used as the reaction material, the target sequence is template, and base pairing and semi-retention are used.
  • the principle of replication the synthesis of a new semi-reserved replication strand complementary to the template DNA strand.
  • the target gene or a DNA fragment to be studied can be amplified to 100,000 or even a million times in a single tube, which is specific, sensitive, high yield, fast, simple, and reproducible. Easy to automate and other outstanding advantages, PCR has been widely used in biological detection and disease diagnosis and other fields.
  • Real time PCR is a method of adding fluorescent-labeled probes based on conventional PCR to achieve quantitative and qualitative analysis of the starting template by real-time detection of the fluorescent signal of each cycle product in the PCR amplification reaction.
  • the advantages of sex and high sensitivity are widely used in the field of pathogen detection and medical diagnosis.
  • nucleic acid extraction methods mainly include SDS method, CTAB method, etc.
  • the DNA extracted by these methods often contains a large amount of impurities such as proteins, polysaccharides and pigments, which affects the accuracy of the quantitative determination of nucleic acid concentration by the spectrophotometer method, and also interferes with the subsequent The quality and sensitivity of DNA amplification; and these extraction methods are often cumbersome, complicated, and time-consuming, affecting the speed and efficiency of actual detection and diagnosis.
  • the nucleic acid enrichment provided by the present invention is obtained by ligating the internal probe of any one of the following 1) to 4):
  • the specific probe from the 3' end to the 5' end is: a binding region consisting of nucleotides complementary to a conserved region of the DNA of interest to be tested, and a tether;
  • the specific probe from the 3' end to the 5' end is: by the target RNA to be tested a binding region consisting of complementary nucleotides of a conserved region, a connecting arm;
  • the specific probe from the 3 ' end to the 5 ' end is: a binding region, a tether; the binding region is a peptide nucleic acid complementary to a conserved region of the DNA of interest;
  • the specific probe is, in order from the 3' end to the 5' end: a binding region, a tether; the binding region is a peptide nucleic acid complementary to a conserved region of the RNA of interest to be detected.
  • the conserved region refers to a gene fragment which has high homology with the nucleic acid sequence in the species to be tested and which can specifically recognize the species to be tested.
  • the binding region may specifically consist of 25-150 nucleotides, such as 20-31 nucleotides.
  • the binding region may specifically consist of 25-150 structural units corresponding to nucleotides, such as 20-31 structural units.
  • the tether is composed of at least one of the following groups: a deoxynucleotide, an oxygen atom, and a carbon atom.
  • the tether can be any deoxynucleotide such as thymidine, cytosine deoxynucleotide, guanine deoxynucleotide, adenine deoxynucleotide, hypoxanthine deoxynucleotide.
  • the linking arm may also be composed of other linking groups such as oxygen atoms, carbon atoms, and the like. The purpose of the connecting arm is to make the binding zone as a free end for easy capture of the target segment. .
  • the linking arms may specifically consist of 6-30 of said groups, such as 4-15 of said groups.
  • the group at the end of the linker 5' is modified with an amination modification, a carboxylation modification or other activating group.
  • the inner wall of the container may be modified with an amination modification, a carboxylation modification or other activating group.
  • the container can be any conventional container, such as a PCR reaction tube.
  • the nucleic acid enricher can be applied to enrich nucleic acids, such as enriching ribonucleic acid or enriching deoxyribonucleic acid, and the enriched deoxyribonucleic acid can be subjected to a PCR reaction, and the enriched ribonucleic acid can be reversed first. Record and repeat the PCR reaction.
  • the invention also provides a method for PCR, comprising the following steps:
  • hybridization reaction 1) adding a DNA extract of the sample to be tested and a hybridization buffer to the nucleic acid enricher for hybridization reaction; the hybridization reaction is: 94-95 ⁇ denaturation for 3-5 minutes, and then placing on ice for 3-5 minutes, Then hybridized 0. 5-2 hours;
  • the hybridization buffer can be any conventional hybridization buffer, such as a commercially available hybridization solution.
  • the hybridization system composed of the hybridization buffer and the DNA extract is specifically as follows:
  • the washing may specifically be: 2 X SSC washing twice, 0.2 X SSC washing twice, deionized water washing 3 times.
  • the method can be applied to the detection of nucleic acids of interest, including conventional PCR reactions, real-time fluorescent PCR reactions, and other nucleic acid-based detection methods.
  • the nucleic acid of interest can be any sequence.
  • the specific PNA probe in the nucleic acid enricher is as shown in FIG. 4; when the nucleic acid of interest is paulownia arbuscular phytoplasma DNA, the specific DNA The sequence of the probe is shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing (the 5' end of the probe nucleotide sequence is aminated).
  • nucleic acid enricher in the preparation of nucleic acid enriched kits and the use of the nucleic acid enrichers in the preparation of PCR kits are also within the scope of the invention.
  • the invention also contemplates a nucleic acid enriched kit comprising the nucleic acid enricher.
  • Other reagents for nucleic acid extraction and nucleic acid hybridization may also be included in the kit.
  • the invention also contemplates a PCR kit comprising the nucleic acid enricher.
  • Other reagents for nucleic acid extraction, conventional reagents for nucleic acid hybridization, and conventional reagents for PCR may also be included in the kit.
  • Figure 1 shows the XPS results.
  • Figure 2 shows the results of real-time fluorescent PCR detection of Phytolacca sinensis.
  • Figure 3 is a schematic diagram of PCR amplification of paulownia arbuscular phytoplasma.
  • Figure 4 is a specific PNA probe of Example 1.
  • test materials were purchased from the conventional biochemical reagent store.
  • Example 1 One-tube real-time fluorescence POT detection of jujube phytoplasma
  • EDC EDC (Sigma), NHS (Aldrich), Concentrated Hydrochloric Acid (Beijing Chemical Reagent Company), Potassium Permanganate (Beijing Chemical Reagent Company), 10 XPCR buffer (Dalian TaKaRa), dNTP (Dalian TaKaRa), Taq enzyme (Dalian TaKaRa), DL2000 DNA Marker (Dalian TaKaRa), 0.2ml PCR tube (Jiangsu Haimen Sanhe Xinhua Experimental Glass Factory, 3 ⁇ 4: 34700501), 2X Hybrid Buffer (Mai Lai Biotech).
  • Probe 5' - FAM-TAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTC- TAMRA-3' ; Aminoation-specific PNA probe was synthesized by Chengdu Duchuan Anti-Pei Biomedical Technology Co., Ltd., and the sequence is as follows:
  • X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) method was used to characterize the degree of carboxylation on the surface of nucleic acid enriched tubes, as shown in Figure 1.
  • A is the nucleic acid enrichment tube prepared in step 1;
  • B is an untreated PCR tube (control sample).
  • Synthetic jujube phytoplasma DNA (sequence is GenBank Accession Number FJ445390).
  • the synthesized DNA was ligated to pMD18-T simple vector (TAKARA) and transformed into competent Escherichia coli DH5a (Full Golden Biotechnology Co., Ltd.) overnight at 16 °C in a water bath.
  • the solid LB medium was cultured for 12 hours, and the colony was picked up in a 3 ml liquid LB medium with a sterile toothpick and cultured in a shaker at 37 ° C for about 10 hours.
  • the plasmid was extracted and sequenced, and the result showed that the insert in the plasmid was identical to the sequence in GenBank Accession Number FJ445390, and the plasmid was used as a positive plasmid.
  • Treatment 1 Take the phenol/chloroform/isoamyl alcohol extraction 1 time after the infected leaf supernatant 50 in the nucleic acid enrichment tube prepared in step 2, add an equal volume of 2X hybridization buffer, denature at 95 ° C for 3 minutes, immediately The ice was allowed to stand for 3 minutes and then hybridized at 70 ° C for 1 hour. The hybridization solution and the crude extract were discarded, washed twice with 2XSSC, twice with 0.2XSSC, and washed 3 times with deionized water.
  • the PCR reaction reagent is directly added to the nucleic acid enrichment tube, and the PCR system is as follows:
  • ddH 2 0 treatment 2 50 uL of healthy foliage supernatant after phenol/chloroform/isoamyl alcohol extraction for 1 time in the nucleic acid enrichment tube prepared in step 2, adding an equal volume of 2X hybridization buffer, 95 After denaturation at °C for 3 minutes, it was immediately placed on ice for 3 minutes, and then hybridized at 70 ° C for 1 hour. The hybridization solution and the crude extract were discarded, washed twice with 2XSSC; washed twice with 0.2XSSC and washed 3 times with deionized water. The reagent for the PCR reaction is directly added to the _ nucleic acid enrichment tube, and the PCR system is treated as the same.
  • Treatment three (positive control): In the above PCR system, 0.3 ⁇ l of the positive plasmid prepared in the step 2 of 10 ⁇ g/PL was added as a positive control.
  • the PCR amplification products of different treatments were amplified on ABI PRISM 7700 respectively. After the reaction was completed, the sputum analysis software was used. The amplification results are shown in Fig. 2a and Fig. 2b.
  • the instrument automatically gives the Ct value of each sample, which is positive.
  • the Ct value of the healthy sample is 30.0.
  • the Ct value of the healthy sample is 40. 0.
  • the results show that the nucleic acid enrichment tube of the invention can effectively capture target DNA and realize rapid detection of one-tube nucleic acid against Phytophthora sinensis.
  • Example 2 One-tube qualitative PCR detection of paulownia arbuscular phytoplasma
  • EDC EDC (Sigma), NHS (Aldrich), Concentrated Hydrochloric Acid (Beijing Chemical Reagent Company), Potassium Permanganate (Beijing Chemical Reagent Company), 10 X PCR buffer (Dalian TaKaRa), dNTP (Dalian TaKaRa), Taq Enzyme (Dalian TaKaRa), DL2000 DNA Marker (Dalian TaKaRa), 0. 2ml PCR tube (Jiangsu Sanmen Xinhua Experimental Glass Factory, Item No.: 34700 01), 2 X Hybrid Buffer (Mai Laibo Biotechnology Co., Ltd.) ).
  • the primers were automatically synthesized on an ABI 3900 synthesizer with the following sequence:
  • PaWB (As): CGTAACAGCCATTGTATCA.
  • the sequence of the aminated specific DNA probe is as follows:
  • the connecting arms formed by the sequential connection of six carbon atoms and 15 thymine deoxynucleotides; the 3' end of the box is a binding region composed of 31 deoxynucleotides.
  • ⁇ In a different nucleic acid enrichment tube prepared in step two, add an equal volume of 2 ⁇ hybridization buffer, 95 °C The cells were denatured for 5 minutes, immediately placed on ice for 5 minutes, and then hybridized at 68 ° C for 2 hours. The hybridization solution and the crude extract were aspirated, washed twice with 2XSSC, twice with 0.2XSSC, and washed 3 times with deionized water, and used directly for PCR amplification detection.
  • Detection tube The nucleic acid enrichment tube enriched with the DNA extract of infected leaves is used for PCR amplification.
  • Control tube The nucleic acid enrichment tube enriched with healthy leaf DNA extract is used for PCR amplification.
  • the electrophoresis results are shown in Figure 3.
  • M DL2000
  • 1 PCR amplification product of the control tube
  • 2 PCR amplification product of the detection tube.
  • the detection tube can amplify the gene fragment of the paulownia phytoplasma, and the fragment size is 680 bp, but the control tube is not detected.
  • the results show that the nucleic acid enrichment tube of the invention can effectively capture the target DNA and realize rapid detection of the paulownia phytoplasma tube-like nucleic acid.
  • the extracted product usually contains a large amount of impurities such as proteins, polysaccharides, pigments, etc., which seriously affects the accuracy of nucleic acid quantification and the sensitivity of subsequent PCR reactions.
  • the present invention uses sequence-specific probes to recognize target DNA, and removes impurities such as proteins and polysaccharides by hybridization, immobilization, and washing to selectively capture and enrich target nucleic acids.
  • the extracted nucleic acid is often a genomic nucleic acid, most of which is not required, and its presence will interfere with PCR detection, and non-specific amplification products will appear.
  • the present invention employs sequence-specific nucleic acid (peptide nucleic acid) and target DNA recognition, so that non-specific nucleic acid fragments can not be enriched, and the high specificity of nucleic acid detection is improved.
  • nucleic acid detection involves two major steps, DNA extraction and PCR.
  • the extraction, purification, PCR amplification and detection of the nucleic acid of the invention are carried out in a reaction tube, and the operation is simple, the nucleic acid is prevented from being transferred in a plurality of reaction vessels, and the environmental pollution in the detection of PCR, especially real-time fluorescent PCR, is reduced, and the avoidance is avoided. There is a false ft crusting.
  • the invention is taken from a common polypropylene tube, can be used for PCR analysis and detection after being modified and processed by the single tube, and the DNA extraction step is greatly shortened, and only the tissue material liquid nitrogen is ground, and the crude extract of the extraction buffer is taken.
  • Hybridization reactions can be performed without the need for traditional DNA extraction methods
  • the subsequent purification steps such as repeated extraction and washing greatly shorten the extraction time, improve the efficiency, and have more operability.
  • the invention is suitable for rapid detection of specific nucleic acids in microorganisms and plant tissues such as bacteria and viruses as well as human tissues.
  • the present invention adopts sequence-specific probes to selectively capture target DNA and improve the sensitivity of subsequent detection. Therefore, the method is especially suitable for rapid analysis and detection of genes in tissues with extremely low nucleic acid content.

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Description

一种核酸富集器及其应用 技术领域
.本发明涉及一种核酸富集器及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR)是 80 年代中期 发展起来的体外核酸扩增技术。 PCR反应类似于 DNA的天然复制过程， 由 变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成， 即在 TaqDNA聚合酶的作用下， 以 dNTP 为反应原料， 靶序列为模板， 按碱基配对与半保留复制原理， 合 成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。 通过 PCR， 能在一个试管 内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万 倍， 具有特异、 敏感、 产率高、 快速、 简便、 重复性好、 易自动化等突出 优点， PCR已广泛应用于生物检测和疾病诊断等领域。
实时荧光 PCR ( Real time PCR) 是在常规 PCR基础上加入荧光标记探 针， 通过对 PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测实现对起 始模板定量及定性的分析， 具有高特异性和高灵敏度的优点， 广泛应用于 病原体的检测及医疗诊断等领域。
在上述两种 PCR反应中， 模板 DNA的纯度直接影响检测的特异性和灵 敏度。 目前核酸提取方法主要包括 SDS 法、 CTAB 法等， 这些方法提取的 DNA 中往往含有大量的蛋白质、 多糖和色素等杂质， 既影响了分光光度计 法对核酸浓度定量的准确性， 也干扰了后续 DNA扩增的质量和灵敏度； 而 且这些提取方法往往步骤繁琐、 操作复杂、 释时长， 影响了实际检测和诊 断的速度和效率。
发明公开
本发明的目的是提供一种核酸富集器 :其应用。
本发明提供的核酸富集器， 是在容 ^的内璧连接如下 1 ) 至 4 ) 中任 一所述的特异性探针得到的：
1 ) 所述特异性探针自 3 ' 端至 5' 端依次为： 由与待测的目的 DNA的 保守区域互补的核苷酸组成的结合区、 连接臂；
2 ) 所述特异性探针自 3 ' 端至 5' 端依次为： 由与待测的目的 RNA的 保守区域互补的核苷酸组成的结合区、 连接臂；
3 ) 所述特异性探针自 3 ' 端至 5 ' 端依次为： 结合区、 连接臂; 所述 结合区为与待测的目的 DNA的保守区域互补的肽核酸；
4) 所述特异性探针自 3 ' 端至 5 ' 端依次为： 结合区、 连接臂； 所述 结合区为与待测的目的 RNA的保守区域互补的肽核酸。
所述保守区域是指与待测物种内核酸序列同源性较高的， 能特异性识 别该待测物种的基因片段。
1 ) 或 2 ) 所述的特异性探针中， 所述结合区具体可由 25-150个核苷 酸组成， 如 20-31个核苷酸。 3 ) 或 4 ) 所述的特异性探针中， 所述结合区 具体可由 25-150个与核苷酸对应的结构单元组成， 如 20-31个结构单元。
所述连接臂由如下基团的至少一种组成： 脱氧核苷酸、 氧原子和碳原 子。 所述连接臂可为任意脱氧核苷酸， 如胸腺嘧啶脱氧核苷酸、 胞嘧啶脱 氧核苷酸、 鸟嘌呤脱氧核苷酸、腺嘌呤脱氧核苷酸、次黄嘌呤脱氧核苷酸。 所述连接臂也可由氧原子、 碳原子等其它起连接作用的基团组成。 所述连 接臂的作用是使结合区作为自由端便于捕获目标片段。 .
所述连接臂具体可由 6-30个所述基团组成， 如 4-15个所述基团。 为了使连接臂能与容器的内壁连接， 所述连接臂 5 ' 末端的基团进行 了氨基化修饰、 羧基化修饰或其它活化基团的修饰。
为了使连接臂能与容器的内壁连接， 所述容器的内壁可进行氨基化修 饰、 羧基化修饰或其它活化基团的修饰。
所述容器可为任何常规容器， 如 PCR反应管。
所述核酸富集器可应用于富集核酸， 如富集核糖核酸或富集脱氧核糖 核酸， 富集后的脱氧核糖核酸可以真接进行 PCR反应， 富集后的核糖核酸 可先进行反转录再进行 PCR反应。
本发明还提供了一种 PCR的方法， 包括以下步骤：
1 ) 将待测样品的 DNA提取液与杂交缓冲液加入所述核酸富集器中进 行杂交反应； 所述杂交反应为： 94-95Ό变性 3-5分钟， 然后冰上放置 3 - 5 分钟， 然后杂交 0. 5-2小时；
2 ) 弃杂交缓冲液和提取液， 洗涤后在所述核酸富隼器中加入除模板 外的其他 PCR组分， 进行 PCR反应。
所述杂交缓冲液可为任何常规的杂交缓冲液， 如商业购买的杂交液， 所述杂交缓冲液和所述 DNA提取液组成的杂交体系具体如下:
杂交体系 16 μ ΐ
20 X SSC →3 X SSC 2. 4 μ 1
1% SDS — 0. 2% SDS 3. 2 μ 1 甲酰胺 一 25% 4 u 1
50 X Denhardt' s—5 X 1. 6 μ 1
DNA提取液 4. 8 μ 1 所述杂交反应具体可为： 95°C变性 5分钟， 然后冰上放置 5分钟， 然 后在合适的温度下杂交 0. 5-2小时。
所述洗涤具体可为： 2 X SSC 洗涤两次， 0. 2 X SSC 洗涤两次， 去离子 水洗搽 3次。
所述的方法可应用于检测目的核酸， 检测方法包括传统 PCR反应、 实 时荧光 PCR反应及其它基于核酸水平的检测方法。
所述目的核酸可为任意序列。 所述目的核酸为枣疯植原体时， 所述核 酸富集器中的所述特异性 PNA探针如图 4所示； 所述目的核酸为泡桐丛枝 植原体 DNA时， 所述特异性 DNA探针的序列如序列表的序列 1所示 （所述 探针核苷酸序列的 5 '端进行了氨基化修饰） 。
所述核酸富集器在制备富集核酸的试剂盒中的应用和所述核酸富集 器在制备 PCR试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
. 本发明还保护一种富集核酸的试剂盒， 包括所述核酸富集器。 所述试 剂盒中还可包括其它核酸提取和核酸杂交的常规试剂。
本发明还保护一种 PCR试剂盒， 包括所述的核酸富集器。 所述试剂盒 中还可包括其它核酸提取的常规试剂、 核酸杂交的常规试剂和 PCR的常规 试剂。
附图说明
图 1为 XPS结果图。
图 2为枣疯植原体实时荧光 PCR检测结果。
图 3为泡桐丛枝植原体 PCR扩增电泳图。
图 4为实施例 1中的特异性 PNA探针。
实施发明的最佳方式
以下的实施例便于更好地理解本发明， 但 不限定本发明。 下述实施 例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试 验材料， 如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例 1、 枣疯植原体的一管式实时荧光 POT检测
一、 实验材料
EDC (Sigma 公司）， NHS (Aldrich 公司） ， 浓盐酸 （北京化学试剂 公司） ， 高锰酸钾 （北京化学试剂公司） ， 10 XPCR buffer (大连 TaKaRa 公司） ， dNTP (大连 TaKaRa公司） ， Taq酶（大连 TaKaRa公司） ， DL2000 DNA Marker (大连 TaKaRa公司） ， 0.2mlPCR管 （江苏海门市三和新华实 验玻仪厂， 货¾: 34700501) ， 2X杂交缓冲液 （美莱博生物科技公司） 。
引物和探针在 ABI 3900合成仪上自动合成， 序列如下：
P1: 5' -CAGTTCGTGTCGTGAGATGTTAGG-3 ' ；
P2: 5' - TCGCTAAAGTCCCCACCATT -3' ；
探针： 5' - FAM- TAAGTCCTAAAACGAACGCAACCCCTGTC- TAMRA-3' ； 氨基化的特异性 PNA 探针由成都川抗派德生物医药科技有限公司合 成， 序列如下：
5， -匪 2- 10- 0- 0- 0卜 TGGACTGAGA GGTTGAACAG- 3 ' (具体结构见图 4， 方 框内的为连接臂， 方框以外的 3' 端为 20个脱氧核苷酸组成的结合区）。
二、 核酸富集管的制备和表征
1、 核酸富集管的制备
在 0.2mL聚丙烯 PCR管中加入铬酸 50ul， 在 70°C下温育 5min; 去除 铬酸， ddH20 洗净； 加入 10%的硝酸 50 ul， 将 PCR管置于常温 5min; 去 除硝酸， 用 ddH20洗净； 加入 50ul ddH20, 室温放置 3min， 去除 ddH20， 分别加入浓度为 200mM的 EDC和 NHS各 50 L， 室温振荡反应 2小时， 温 度为 28°C， 转速 200rpm。 吸弃反应液， 蒸馏水洗涤 3遍， 加入 2mM氨基 化的特异性 PNA探针 2 L， 硼酸盐缓冲液 100 L， 室温振荡反应 1小时， 温度为 28°C， 转速 200rpm， 吸弃反应液， 蒸馏水洗涤 3遍， 晾干。 得到 核酸富集管。
2、 核酸富集管的表征
采用 X射线光电子能谱 （XPS) 方法表征核酸富集管表面羧基化的程 度， 见图 1。 图 1中， A为步骤 1制备的核酸富集管； B为未处理的 PCR管 (对照样品） 。 由图可见， 对照样品的 C:0=98.35:1.65， 步骤 1制备的核 酸富集管的 C:0= 93.86 ： 6.14， 表面羧基 率为 1.1 X 1015 /cm2。
三、 枣疯植原体的一管式实时荧光 PCR检测
1、 枣疯植原体阳性质粒的制备
合成枣疯植原体 DNA (序列为 GenBank Accession Number FJ445390)。 将合成的 DNA连接于 pMD18-T simple vector (TAKARA公司） ， 16°C水浴 过夜后转化感受态大肠杆菌 DH5a (全式金生物技术有限公司） 。 固体 LB 培养基培养 12h，用无菌牙签挑单菌落于 3ml液体 LB培养基中 37°C摇床中 培养 10h左右。提取质粒进行测序，结果表明，质粒中的插入片段与 GenBank Accession Number FJ445390中的序列一致， 将该质粒作为阳性质粒。
2、 植物材料总 DNA粗体液的提取
分别取 0. lg染枣疯病的枣树枝叶和健康枣树枝叶， 液氮研磨至粉末， 转移至己经预热的 CTAB缓冲液 （600 L) 中混匀， 65°C， 30分钟； 加酚 / 氯仿 /异戊醇 （25: 24： 1) 抽提 1次； 取上清， - 20°C保存。
3、 实时荧光 PCR检测
处理一： 取酚 /氯仿 /异戊醇抽提 1次后的染病枝叶上清液 50 于步 骤二制备的核酸富集管中， 加入等体积 2X杂交缓冲液， 95°C变性 3分钟， 立即放冰上 3分钟， 然后 70°C杂交 1小时。 吸弃杂交液和粗提液， 2XSSC 洗涤两次， 0.2XSSC洗涤两次， 去离子水洗涤 3次。 在核酸富集管中直接 加入 PCR反应的试剂， PCR体系如下：
Taqraan universal PCR Mix
PI
P2
探针
ddH20 处理二 （阴性对照） ： 取酚 /氯仿 /异戊醇抽提 1次后的健康枝叶上清 液 50uL于步骤二制备的核酸富集管中， 加入等体积 2X杂交缓冲液， 95 °C变性 3分钟， 立即放冰上 3分钟， 然后 70°C杂交 1小时。 吸弃杂交液和 粗提液， 2XSSC洗涤两次； 0.2XSSC洗涤两次， 去离子水洗涤 3次。 在_ 核酸富集管中直接加入 PCR反应的试剂， PCR体系同处理一。 处理三（阳性对照）： 在上述 PCR体系中， 加入 0. 3微升浓度为 lOng/ P L的步骤 2制备的阳性质粒， 作为阳性对照。
进行实时荧光 PCR扩增， PCR循环参数：
50°C， 2min; 95 °C , lOmin; 95°C， 15S， 60 °C , lrnin, 40个循环。 每个处理设置三个重复， 检测结果取平均值。
4、 实时荧光 PCR检测
分别将不同处理的 PCR扩增产物在 ABI PRISM 7700上扩增，反应结束 后，打幵分析软件，扩增结果如图 2a和图 2b所示， 仪器自动给出每个样品 的 Ct值， 阳性对照的 Ct 值为 19. 4， 染病样品的 Ct值为 30. 0， 健康样品 的 Ct值为 40. 0。结果表明，本发明的核酸富集管可以有效的捕获目标 DNA, 实现对枣疯植原体的一管式核酸快速检测。 实施例 2、 泡桐丛枝植原体的一管式定性 PCR检测
一、 实验材料
EDC (Sigma 公司）， NHS (Aldrich 公司） ， 浓盐酸 （北京化学试剂 公司） ， 高锰酸钾 （北京化学试剂公司） ， 10 X PCR buffer (大连 TaKaRa 公司） ， dNTP (大连 TaKaRa公司） ， Taq酶（大连 TaKaRa公司） ， DL2000 DNA Marker (大连 TaKaRa公司） ， 0. 2mlPCR管 （江苏海门市三和新华实 验玻仪厂， 货号： 34700 01 ) ， 2 X杂交缓冲液 （美莱博生物科技公司） 。
引物在 ABI 3900合成仪上自动合成， 序列如下：
PaWB (s)： TTATTGGGCGTAAAGGGTG；
PaWB (As)： CGTAACAGCCATTGTATCA。
氨基化的特异性 DNA探针的序列如下：
5 ' -NH2-|C6-T 15|-GGTCTAAGTGCAATGCTCAACATTGTGATGC-3 ' ；
方框内的为六个碳原子和 15 个胸腺嘧啶脱氧核苷酸依次连接形成的 连接臂； 方框以外的 3' 端为 31个脱氧核苷酸组成的结合区。
二、 核酸富集管的制备和表征
同实施例 1的步骤二。
三、 泡桐丛枝植原体的一管式定性 PCR检测
1、 植物材料总 DNA的提取 分别提取染病的泡桐叶片和健康的泡桐叶片的总 DNA。 分别取 0. lg染 病的泡桐叶片和 0.2g健康的泡桐叶片， 液氮研磨至粉末， 转移至已经预热 的 CTAB缓冲液 （600 μθ 中混匀， 65°C， 30min; 加酚 /氯仿 /异戊醇 （25: 24： 1) 抽提 1次； 取上清， - 20°C保存。
2、 泡桐丛枝植原体 DNA的捕获
分别取酚 /氯仿 /异戊醇抽提 1 次后的染病叶片和健康叶片上清液 50. ί 于不同的步骤二制备的核酸富集管中， 加入等体积 2Χ杂交缓冲液， 95°C变性 5分钟， 立即放冰上 5分钟， 然后 68°C杂交 2小时。 吸弃杂交液 和粗提液， 2XSSC洗涤两次， 0.2XSSC洗涤两次， 去离子水洗涤 3次， 直接用于 PCR扩增检测。
3、 PCR扩增
检测管、 对照管的设置：
检测管： 以杂交富集了染病叶片 DNA抽提液的核酸富集管进行 PCR扩 对照管： 以杂交富集了健康叶片 DNA抽提液的核酸富集管进行 PCR扩
PCR扩增体系
10XPCR Buffer 5 uL
dNTP Mix 4uL
PaWB(s) luL
PaWB (As) luL
Taq酶 0.5uL
ddH20 38.5 uL
50uL
PCR循环参数:
变性 95°C， 5min
94。C， lmin
扩增 （35个循环） 60， lmin
72, 1.5min
最终延伸 72 °C, 8min 4、 PCR产物的电泳检测
采用 TBE配制 1. 5 %的琼脂糖凝胶， 胶中的 EB浓度为 0. 5 y g/ w L， PCR 产物上样量为每孔 6 μ ί， 电泳的分子量参照为 DL2000。 电泳条件为 100V, 30分钟， 电泳结果采用凝胶成像系统分析。
电泳结果如图 3所示。 图 3中， M: DL2000; 1： 对照管的 PCR扩增产 物； 2 : 检测管的 PCR扩增产物。 由图可见， 检测管可以扩增出泡桐丛枝 植原体的基因片段， 片段大小为 680bp， 而对照管没有检测到。 结果表明， 本发明的核酸富集管可以有效的捕获目标 DNA， 实现对泡桐丛枝植原体一 管式核酸快速检测。
工业应用
本发明提供的核酸检测方法具有以下优点：
1 ) 高选择性富集核酸
传统的 DNA提取方法中， 提取产物中通常含有大量的蛋白质、 多糖、 色素等杂质， 严重影响了核酸定量的准确和后续 PCR反应的灵敏度。 本发 明采用序列特异性的探针与目标 DNA识别， 通过杂交、 固定， 洗涤除去其 余的蛋白质、 多糖等杂质， 选择性的捕获、 富集目标核酸。
2 ) 高特异性扩增核酸
传统的 DNA提取方法中， 提取的核酸往往是基因组核酸， 其中大部分 是不需要的， 其存在将干扰 PCR检测， 出现非特异性扩增产物。 本发明采 用序列特异性的核酸 （肽核酸） 与目标 DNA识别， 使得非特异性核酸片段 不能富集， 提高了核酸检测的高特异性。
3 ) 一管式快速检测核酸
通常核酸的检测包括两个主要步骤， 即 DNA的提取和 PCR反应。 本发 明核酸的提取纯化和 PCR扩增、 检测在一个反应管中进行， 操作简便， 避 免了核酸在多个反应容器中转移， 减少了 PCR检测尤其是实时荧光 PCR检 测中环境污染的产生， 避免出现假 ft性结喿。
4)成本低廉、 可操作性强
本发明取材于普通的聚丙烯管， 经过筒单的修饰、 处理即可用于 PCR 分析检测， 同时 DNA的提取步骤大大缩短， 只需将组织材料液氮研磨、 '取 提取缓冲液的粗提液即可进行杂交反应， 无需进行传统 DNA提取方法中的 后续反复抽提、 洗涤等纯化步骤， 极大的缩短了提取时间、 提高了效率、 可操作性更强。
5 ) 适用范围广
本发明适用于细菌、 病毒等微生物和植物组织以及人体组织中特定核 酸的 PCR快速检测。
6 ) 适用于核酸含量极低组织中基因的快速分析检测
对于组织中核酸含量极低的情况， 通过常规的提取分离方法很难获得 高纯度的 DNA。 本发明采用序列特异性探针， 选择性的捕获目标 DNA， 提 高了后续检测的灵敏度， 因此该方法尤其适用于核酸含量极低组织中基因 的快速分析检测。

Claims

权利要求
1、 一种核酸富集器， 是在容器的内壁连接如下 1) 至 4) 中任一所述 的特异性探针得到的：
1) 所述特异性探针自 3' 端至 5' 端依次为： 由与待测的目的 DNA的 保守区域互补的核苷酸组成的结合区、 连接臂；
2) 所述特异性探针自 3' 端至 5' 端依次为： 由与待测的目的 RNA的 保守区域互补的核苷酸组成的结合区、 连接臂；
3) 所述特异性探针自 3' 端至 5' 端依次为： 结合区、 连接臂； 所述 结合区为与待测的目的 DNA的保守区域互补的肽核酸；
4) 所述特异性探针自 3' 端至 5' 端依次为： 结合区、 连接臂； 所述 结合区为与待测的目的 RNA的保守区域互补的肽核酸。
2、 如权利要求 1 所述的核酸富集器， 其特征在于： 所述特异性探针 中， 所述结合区由 25- 150个核苷酸组成。
3、 如权利要求 1或 2所述的核酸富集器， 其特征在于： 所述连接臂 由如下基团的至少一种组成： 脱氧核苷酸、 氧原子和碳原子。
4、如权利要求 3所述的核酸富集器，其特征在于：所述连接臂由 6 - 30 个所述基团组成。
5、 如权利要求 1至 4中任一所述的核酸富集器， 其特征在于： 所述 -容器为 PCR反应管。
6、 权利要求 1-5中任一所述核酸富集器在富集核酸中的应用。
7、 如权利要求 6 所述的应用， 其特征在于： 所述核酸为核糖核酸或 脱氧核糖核酸。
8、 一种 PCR的方法， 包括以下步骤：
1) 将待测样品的 DNA提取液与杂交缓冲液加入权利要求 5所述核酸 富集器中进行杂交反应； 所述杂交反应为： 94- 95°C变性 3-5 分钟， 然后 冰上放置 3-5分钟， 然后杂交 0.5-2小时；
2) 弃杂交缓冲液和提取液， 洗涤后在所述核酸富集器中加入除模板 外的其它 PCR组分， 进行 PCR反应。
9、 如权利要求 8 所述的方法， 其特征在于： 所述杂交反应为： 95Ό 变性 5分钟， 然后冰上放置 3分钟， 然后杂交 0. 5-2小时。
10、 如权利要求 8或 9所述的方法， 其特征在于： '所述洗涤为： 2 X SSC洗涤两次， 0. 2 X SSC洗两次， 去离子水洗涤 3次。 '
11、 权利要求 8至 10中任一所述的方法在检测目的核酸中的应用。
12、 如权利要求 11 所述的应用， 其特征在于： 所述目的核酸为枣疯 植原体 DNA时， 所述特异性探针如图 4所示； 所述目的核酸为泡桐丛枝植 原体 DNA时， 所述特异性探针的 DNA序列如序列表的序列 1所示。
13、 权利要求 1-5中任一所述 f亥酸富集器在制备富集核酸的试剂盒中 的应用。
14、 一种富集核酸的试剂盒， 包括权利要求 1-5中任一所述的核酸富 集器。
15、权利要求 1-5中任一所述核酸富集器在制备 PCR试剂盒中的应用。
16、 一种 PCR试剂盒， 包括权利要求 1-5中任一所述的核酸富集器。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3252174B1 (en) * 2012-10-15 2020-07-01 Life Technologies Corporation Compositions, methods, systems and kits for target nucleic acid enrichment
CN103773835A (zh) * 2012-10-23 2014-05-07 启新生物科技有限公司 用于鉴定分枝杆菌的寡核苷酸探针、生物芯片及鉴定方法
CN108823312A (zh) * 2018-07-05 2018-11-16 苏州科诺医学检验所有限公司 快速检测alk融合基因的方法及富集探针和探测引物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1521269A (zh) * 2003-01-28 2004-08-18 国家质量监督检验检疫总局动植物检疫 单管内杂交诱捕为基础的核酸检测方法
CN101020930A (zh) * 2007-03-08 2007-08-22 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 用于禽流感病毒检测和分型的基因芯片

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1521269A (zh) * 2003-01-28 2004-08-18 国家质量监督检验检疫总局动植物检疫 单管内杂交诱捕为基础的核酸检测方法
CN101020930A (zh) * 2007-03-08 2007-08-22 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 用于禽流感病毒检测和分型的基因芯片

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIAO, X.L. ET AL.: "ESTABLISHMENT OF REAL-TIME FLUORESCENT PCR METHOD WITH TaqMan PROBE FOR PHYTOPLASMA DETECTION AND IDENTIFICATION.", ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA, vol. 32, no. 4, November 2002 (2002-11-01), pages 361 - 367 *
ZHAO, W.J. ET AL.: "Tomato ringspot nepovirus detection using hybridization capture real-time PCR.", ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA, vol. 37, no. 6, December 2007 (2007-12-01), pages 666 - 669 *
ZHAO, WJ. ET AL.: "Development of a Hybridization Capture HC-RT-PCR-ELISA Method for Reliable and Sensitive Detection of Tomato Ringspot Virus.", ACTA MICROBIOLOGICA SINICA, vol. 43, no. 2, April 2003 (2003-04-01), pages 174 - 179 *
ZHAO, WJ.: "The Study of Molecular Methods in Tomato Ringspot Virus and Genically Modified Organisms Detection.", CHINESE DOCTORAL DISSERTATIONS & MASTER'S THESES FULL-TEXT DATABASE (MASTER) AGRICULTURE SCIENCE AND TECHNOLOGY., no. 2, 15 December 2002 (2002-12-15), pages D043 - 104 *
ZHU, J.Y ET AL.: "The establishment of detection of real-time fluorescent PCR and capture-PCR-ELISA for detection of fire blight Erwinia amylovora.", PLANT QUARANTINE, vol. 17, no. 1, January 2003 (2003-01-01), pages 7 - 10 *
ZHU, J.Y: "Studies on the Detection of Prunus Necrotic Ringspot Virus with Real-time FluorescenRT-PCR and Hybridization CaptureRT-PCR-ELISA.", CHINESE DOCTORAL DISSERTATIONS & MASTER'S THESES FULL-TEXT DATABASE (MASTER) AGRICULTURE SCIENCE AND TECHNOLOGY., no. 2, 15 December 2002 (2002-12-15), pages D046 - 16 *

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