CN108676900B

CN108676900B - 一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合pcr分型试剂盒及其应用

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Publication number: CN108676900B
Application number: CN201810402911.5A
Authority: CN
Inventors: 袁芳艳; 田永祥; 刘泽文; 刘威; 周丹娜; 杨克礼; 段正赢; 郭锐; 高婷
Original assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Science and Veterinary of Hubei Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: CN108676900A

Abstract

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒及其应用。所述复合PCR分型试剂盒包括：PCR试管、PCR混合酶、5对特异性引物、阳性对照、阴性对照和ddH₂O，所述5对特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～10所示。所述复合PCR分型试剂盒用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型具有很高的准确性，特异性好，灵敏度达pg级；进行鉴别的样品来源包括分离的菌种资源或动物组织，可以直接将组织洗涤液或单菌落、菌液经沸水裂解后作为模板，省去了细菌基因组提取的繁琐，大大节约了时间、人力和成本。

Description

一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒及其应用。

背景技术

猪传染性胸膜肺炎是引起猪呼吸系统的一种严重的接触性传染病，以急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素坏死性胸膜肺炎为特性，广泛存在于世界上养猪地区，特别是养猪业发达的国家和地区，给养猪业造成巨大的经济损失。

猪传染性胸膜肺炎可感染各年龄阶段的猪只，以6周-6月龄的猪较为多发；且具有较明显的季节性，多在4月～5月和9月～11月发生。病猪和带菌猪是本病的主要传染源，多呈继发或并发其他疾病，导致临床症状加重、死亡率升高。自1957年首次报道以来，随着国家与国家之间的频繁引种，猪传染性胸膜肺炎逐渐扩散开来，造成世界范围内的广泛流行。我国八十年代开始有该病的报道，九十年代在广东、青岛等地区爆发流行，造成了巨大的经济损失。近年来，随着集约化猪场的快速发展，猪传染性胸膜肺炎感染发病率也日益增高，已经在我国大部分地区流行开来，并有愈发愈烈的趋势。

猪传染性胸膜肺炎的主要病原为胸膜肺炎放线杆菌(APP)。加膜多糖和菌体脂多糖不同，可分为15血清型。根据烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的依赖性可把15血清型分为两个生物型。生长依赖NAD的菌株为生物Ⅰ型，包括血清型1～12型和15型；生长不依赖NAD的菌株为生物Ⅱ型，包括血清型13和14。其中血清型1和5型又可分为a和b两个亚型。此外，还有一些根据现有分型方法不能定型的血清型。

不同血清型间的致病力不完全相同，普遍认为，生物I型APP的致病性要强于生物II型，而且各血清型间交叉保护力比较弱。APP在不同国家的分别存在差异，各国的优势血清型也不相同。随着不同国家及地区之间猪只的流通加剧，APP也变得日益复杂，同一地区，甚至同一猪场存在多个血清型同时存在的状况。在中国，目前已发现并分离到血清型有1、2、3、 4、5、7、8和15等，主要流行血清型有1、3、5和7型。

猪胸膜肺炎放线杆菌的分型方法主要分为血清学方法和基因分型方法。血清学分型方法主要有补体结合、间接血凝、乳胶凝集、琼脂扩散、ELISA。但因为操作繁琐、周期长、或敏感性低、特异性差等不能满足临床的需求。而且目前猪场多为混合感染，因此迫切希望一种高度特异、敏感和简便的方法来高通量、快速分型方法。基因分型方法主要为PCR分型方法，复合PCR技术以其特异、快速、敏感、适于大量样品检测等优点，成为当今细菌病检测和诊断中最具应用价值的方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒及其应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的PCR引物对，包括5对特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～10所示。

一种用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒，包括：PCR试管、PCR混合酶、5对特异性引物、阳性对照、阴性对照和ddH₂O。

上述方案中，PCR混合酶包括Taq酶(5U/μL)、10×ExTaq Buffer(无Mg²⁺)、dNTPMixture(25mM)和MgCl₂(25mM)的混合物。

上述方案中，所述阳性对照为猪胸膜肺炎放线杆菌血清型标准菌株DNA混合物，即标准1型4074株、标准3型S1421株、标准4型M62株、标准5a型MIDG2216株、标准6 型FemΦ株、标准10型D13039株、标准12型1096株和标准14型MIDG2226的DNA混合物。

上述方案中，所述阴性对照为副猪嗜血杆菌的DNA。

上述方案中，所述5对特异性引物的序列分别为：第一对引物P1:aatgatttagtgaaagcggc； P2:agataatgctacgaccgaac；第2对引物P3:tgatcgtttggcgtttatcg；P4:tgcagtcaccgattccacta；第3对引物P5:gaaaattctaggttttactg；P6:cgtaggactggtgttgcccc；第4对引物P7:gcaatcagtccattggcgtt； P8:gacgtttggctatttgaaat；第5对引物P9:aaagaaagaaaggtattcgc；P10:gtttatcgaatgagcaaacg。

利用上述复合PCR分型试剂盒检测区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和 14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的方法，包括如下步骤：

(1)将样品预处理制备得到PCR模板；

(2)依次在PCR反应管中加入PCR混合酶、5对特异性引物、PCR模板、ddH₂O，混匀后得到PCR反应体系；随后进行PCR扩增反应，反应结束后，得到PCR扩增产物；

(3)采用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断样品中猪胸膜肺炎放线杆菌的血清型。

上述方案中，步骤(1)所述样品为临床病变的组织样品或猪胸膜肺炎放线杆菌菌株。

上述方案中，步骤(1)所述样品预处理的工序为：用无菌ddH₂O洗涤，煮沸5～10min，冰浴3min，12000r/min离心1min，上清液即为PCR模板。

上述方案中，步骤(2)所述PCR反应体系的组成：在PCR反应管中加入PCR混合酶12.5μL，第一对特异性引物、第二对特异性引物和第三对特异性引物各0.75μL，第四对特异性引物和第五对特异性引物各1.0μL，PCR模板1.5μL，最后补充ddH₂O到终体积为 25μL。

上述方案中，步骤(2)所述PCR扩增反应的条件参数为：94℃预变性5min；94℃变性10s，56℃退火，72℃延伸90s，30个循环。

本发明的有益效果如下：1)本发明设计了5对PCR引物，采用高保真酶对样本进行特异性复合PCR扩增，所述复合PCR分型试剂盒用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10 型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型具有很高的准确性，假阳性低，特异性好，灵敏度高；2)采用本发明所述试剂盒对样品进行PCR扩增，复合PCR产物可生成2、3或4 条特异性片段，灵敏度达pg级；进行鉴别的样品来源包括分离的菌种资源或动物组织、动物呼吸道分泌物等，可以直接将组织洗涤液或单菌落、菌液经沸水裂解后作为模板，省去了细菌基因组提取的繁琐，大大节约了时间、人力和成本；3)本发明所述检测方法操作简便、反应快速，省时，省钱，可以一次反应就可以区分8种血清型中的任何一种血清型或者多种血清型组合，满足高通量样本分型鉴定的需求，为实现快速、大通量诊断和检测胸膜肺炎放线杆菌临床菌株提供技术支撑。

附图说明

图1为APP标准菌株多重PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，M:DL5000DNA Marker；；1～8:APP血清1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型标准菌株；“﹣”:阴性对照。

图2为APP临床分离菌株的复合PCR产物电泳图，M:DL5000DNA Marker；1～13:APP临床菌株；“﹣”:阴性对照。

图3为APP临床分离菌株的复合PCR产物电泳图，M:DL5000DNAMarker；1～13:APP临床菌株；“﹣”:阴性对照。

图4为APP临床分离菌株的复合PCR产物电泳图，M:DL5000DNA Marker；1～9:APP临床菌株；“﹣”:阴性对照。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

采用复合PCR分型试剂盒检测区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14 型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的方法，包括如下步骤：

(1)复合PCR模板的制备：①对于临床组织样品，无菌条件下将组织样品用酒精擦拭消毒后，用剪刀剔除外面部分，挑取病变严重约1cm左右的组织样品用无菌ddH₂O进行洗涤，煮沸5～10min，冰浴3min，12000r/min离心1min，上清液即为复合PCR反应的模板。 ②对于菌株，可以在无菌操作台上，用灼烧后冷却至室温的接种环从冻干保存或甘油保存APP的安培瓶中刮取适量冻干粉或菌液涂布于TSA培养皿上；次日，用接种环挑取针尖大小，圆型，稍凸，边缘整齐的单菌落，置于已加10uL无菌ddH₂O的EP管内，煮沸5～10min，冰浴3min，12000r/min离心1min，上清液即为复合PCR反应的模板；本实施例选择猪胸膜肺炎放线杆菌的8种血清型阳性标准菌株，经沸水裂解后得到复合PCR模板；

(2)复合PCR反应体系的组成：依次在PCR反应管中加入PCR混合酶12.5μL，引物①②③④⑤⑥各0.75μL，引物⑦⑧⑨⑩各1.0μL，PCR模板1.5μL，最后补充ddH₂O到终体积为25μL，混匀；

(3)复合PCR产物的扩增：94℃预变性5min，94℃变性10s←→56℃退火，72℃延伸90s，30个循环；

(4)复合PCR扩增产物检测：使用1.2％琼脂糖凝胶对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统下观察结果。

(5)复合PCR扩增结果判断：将PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，共出现8条不同大小的带(见图1)，经测序具体扩增大小为348bp、754bp、825bp、968bp、1655bp、1980 bp、2242bp和2631bp等，结果判定情况见表1。

表1多重PCR产物分析结果

从表1的结果可以看出，复合PCR产物生成2、3或4条特异性片段，灵敏度达pg级；具有很高的准确性，假阳性低，特异性好，灵敏度高；所述检测方法操作简便、反应快速，省时，省钱，可以一次反应就可以区分8种血清型中的任何一种血清型或者多种血清型组合，满足高通量样本分型鉴定的需求，为实现快速、大通量诊断和检测胸膜肺炎放线杆菌临床菌株提供技术支撑。

实施例2

一种用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒，采用所述复合PCR分型试剂盒检测实验室送检的猪肺组织，运用建立的复合PCR方法对养殖户送检的共29份肺组织进行了检测(可在2个小时内完成)，包括如下步骤：

(1)复合PCR模板的制备：对于肺组织样品，无菌条件下将组织样品用酒精擦拭消毒后，用剪刀剔除外面部分，挑取病变严重约1cm左右的组织样品用无菌ddH₂O进行洗涤，煮沸5～10min，冰浴3min，12000r/min离心1min，上清液即为复合PCR反应的模板；

(4)复合PCR扩增产物检测：使用1.2％琼脂糖凝胶对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统下观察结果；

(5)复合PCR扩增结果判断：将PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，将结果与图1进行比对。

检测结果：对临床35猪运用APP复合PCR分型方法进行检测，结果显示共有7份样品为核酸阳性样品，其中猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型为3份(图2、图3、图4中泳道1)，血清5型核酸阳性2份(图2、图3中泳道2)，血清7型核酸阳性2份(图3中泳道3、图 4中泳道2)。细菌分离鉴定结果也证实了APP复合PCR分型方法检测结果的正确性。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种用于区分八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒及其应用

<160>10

<210> 1

<211>10 bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

aatgatttag tgaaagcggc 10

<210> 2

<211>10 bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

agataatgct acgaccgaac 10

<210> 3

<211>10 bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

tgatcgtttg gcgtttatcg 10

<210> 4

<211>10 bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

tgcagtcacc gattccacta 10

<210> 5

<211>10 bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

gaaaattcta ggttttactg 10

<210> 6

<211>10 bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

cgtaggactg gtgttgcccc 10

<210> 7

<211>10 bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

gcaatcagtc cattggcgtt 10

<210> 8

<211>10 bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 8

gacgtttggc tatttgaaat 10

<210> 9

<211>10 bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

aaagaaagaa aggtattcgc 10

<210>10

<211>10 bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

gtttatcgaa tgagcaaacg 10

Claims

1.一种用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒，其特征在于，包括：PCR试管、PCR混合酶、5对特异性引物、阳性对照、阴性对照和ddH₂O，所述5对特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1~10所示；所述PCR混合酶包含Taq酶5U/μL、10×ExTaq Buffer、dNTP Mixture 25mM和MgCl₂ 25mM。

2.根据权利要求1所述的用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为猪胸膜肺炎放线杆菌血清型标准菌株DNA混合物。

3.根据权利要求2所述的用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒，其特征在于，所述猪胸膜肺炎放线杆菌血清型标准菌株DNA混合物为标准1型4074株、标准3型S1421株、标准4型M62株、标准5a型MIDG2216、标准6型FemΦ株、标准10型D13039株、标准12型1096株和标准14型MIDG2226的DNA混合物。

4.根据权利要求1所述的用于区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的复合PCR分型试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为副猪嗜血杆菌的DNA。

5.利用权利要求1~4所述复合PCR分型试剂盒检测区分1型、3型、4型、5型、6型、10型、12型和14型八种猪胸膜肺炎放线杆菌血清型的方法，包括如下步骤：

（1）将样品预处理制备得到PCR模板；

（2）依次在PCR反应管中加入PCR混合酶、5对特异性引物、PCR模板、ddH₂O，混匀后得到PCR反应体系；随后进行PCR扩增反应，反应结束后，得到PCR扩增产物；

（3）采用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判断样品中猪胸膜肺炎放线杆菌的血清型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述样品为临床病变的组织样品或猪胸膜肺炎放线杆菌菌株。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述样品预处理的工序为：用无菌ddH₂O洗涤，煮沸 5~10 min，冰浴 3 min，12000 r/min 离心1min，上清液即为PCR模板。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR反应体系的组成：在PCR反应管中加入PCR混合酶12.5μL，第一对特异性引物、第二对特异性引物和第三对特异性引物各0.75μL，第四对特异性引物和第五对特异性引物各1.0μL，PCR模板1.5μL，最后补充ddH₂O到终体积为25μL。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增反应的条件参数为：94℃预变性5min；94℃变性10s，56℃退火，72℃延伸90s，30个循环。