CN114058684A - 核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用 - Google Patents

核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114058684A
CN114058684A CN202010764532.8A CN202010764532A CN114058684A CN 114058684 A CN114058684 A CN 114058684A CN 202010764532 A CN202010764532 A CN 202010764532A CN 114058684 A CN114058684 A CN 114058684A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
acid amplification
reagent
freeze
tween
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010764532.8A
Other languages
English (en)
Inventor
林钰琼
章瑞程
范国来
叶甜甜
黄红丹
萧瀚铭
张俊杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Fapon Biotech Co Ltd filed Critical Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Priority to CN202010764532.8A priority Critical patent/CN114058684A/zh
Priority to PCT/CN2021/094418 priority patent/WO2022022015A1/zh
Publication of CN114058684A publication Critical patent/CN114058684A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用。该冻干保护组方包括甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温。该冻干保护组方延长了核酸扩增用试剂的保质期，解决了核酸扩增用试剂长途运输和长期保存困难的问题，能够实现常温运输。

Description

核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用。
背景技术
核酸扩增是通过酶的作用将待检测核酸序列进行扩增，然后检出的方法，其是一类技术方法的总称，包括常规PCR、实时荧光PCR、等温核酸扩增技术等等。
实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)于1996年由美国Applied Biosystems公司提出，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的过程，而且与常规PCR相比，它具有特异性强、有效解决PCR防污染的问题、自动化程度高等特点，目前已广泛应用。
目前的PCR扩增试剂基本呈液体状态，在常温下保存并不稳定，室温1个月即失效，在2～8℃保存，有效期也只有3个月左右。而且液体试剂每次使用都需要反复冻融，对试剂的活性有很大的影响，这很大程度上限制了核酸扩增用试剂的长期使用和长途运输，增加了运输的成本及复杂性，并且容易因保存温度不当而引起其敏感性降低甚至完全失效。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种核酸扩增用试剂的冻干保护组方。
本发明的第二目的在于提供一种冻干核酸扩增用试剂的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种冻干核酸扩增用试剂。
本发明的第四目的在于提供冻干核酸扩增用试剂的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种核酸扩增用试剂的冻干保护组方，所述冻干保护组方包括甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温。
进一步地，甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温的含量分别独立地为：2-15w/v％、0.5-5w/v％、0.1-2w/v％和0.01-0.5v/v％。
进一步地，甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温的含量分别独立地为：7-15w/v％、2-5w/v％、0.1-1w/v％和0.1-0.5v/v％。
进一步地，甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温的含量分别独立地为：8-13w/v％、2.5-4w/v％、0.1-0.5w/v％和0.1-0.3v/v％。
进一步地，所述冻干保护组方还包括海藻糖，含量优选为3-20w/v％，进一步优选为5-20w/v％。
进一步地，所述冻干保护组方还包括BSA，含量优选为0.05-1w/v％，进一步优选为0.1-1w/v％。
进一步地，吐温包括吐温80或吐温20。
进一步地，核酸扩增包括新型冠状病毒核酸检测或艾滋病毒核酸检测。
一种冻干核酸扩增用试剂的制备方法，将核酸扩增用试剂和上述冻干保护组方的混匀液冷冻干燥，得到冻干核酸扩增用试剂。
进一步地，核酸扩增用试剂包括酶。
进一步地，核酸扩增用试剂包括逆转录酶或DNA聚合酶。
进一步地，核酸扩增用试剂还包括RNA酶抑制剂、dNTPS、引物、探针或盐离子。
进一步地，逆转录酶的浓度为2-30U/μL。
进一步地，DNA聚合酶的浓度为0.1-1U/μL。
进一步地，RNA酶抑制剂的浓度为1-6U/μL。
进一步地，dNTPS的浓度为1-10mM。
上述制备方法制备得到的冻干核酸扩增用试剂。
上述冻干核酸扩增用试剂在核酸扩增反应或制备核酸扩增产品中的应用。
进一步地，核酸扩增包括新型冠状病毒核酸检测或艾滋病毒核酸检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种核酸扩增用试剂的冻干保护组方，该冻干保护组方包括甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温，能够延长核酸扩增用试剂的保质期，可以使核酸扩增用试剂能够在2～8℃或室温下长期保存，而不影响其反应效率，解决了核酸扩增用试剂长途运输和长期保存困难的问题，能够实现常温运输。该冻干保护组方能够最大限度地减少核酸扩增用试剂在制备、分装和冷冻干燥等生产过程中对活性物质的损伤，提高活性物质的稳定性，在37℃加速一个月后，利用该冻干保护组方制备的冻干核酸扩增用试剂的活性仍然保持稳定。此外，该冻干保护组方可以在一定程度上提高核酸扩增反应体系的检测灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例3中0天实验组16检测ORF1ab基因样本103、104、105、106copy/ml扩增曲线；
图2为实施例3中0天实验组16检测N基因样本103、104、105、106copy/ml扩增曲线；
图3为实施例3中37℃1个月后实验组16检测ORF1ab基因样本103、104、105、106copy/ml扩增曲线；
图4为实施例3中37℃1个月后实验组16检测N基因样本103、104、105、106copy/ml扩增曲线；
图5为本发明提供的冻干核酸扩增用试剂部分样品的成品图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明提供一种核酸扩增用试剂的冻干保护组方，该冻干保护组方包括甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温。
该冻干保护组方经过合理组方，试剂间合理配伍，大大延长了核酸扩增用试剂的保质期，可以使核酸扩增用试剂能够在2～8℃或室温下长期保存，而不影响其反应效率，解决了核酸扩增用试剂长途运输和长期保存困难的问题，能够实现常温运输。该冻干保护组方能够最大限度地减少核酸扩增用试剂在制备、分装和冷冻干燥等生产过程中对活性物质的损伤，提高活性物质的稳定性，在37℃加速一个月后，利用该冻干保护组方制备的冻干核酸扩增用试剂的活性仍然保持稳定。此外，该冻干保护组方可以在一定程度上提高核酸扩增反应体系的检测灵敏度。
需要说明的是，本发明中核酸扩增用试剂是指进行核酸扩增反应的体系中具有功能性作用的各种活性物质，例如酶(逆转录酶、DNA聚合酶等)、dNTPS、引物、探针、RNA酶抑制剂或盐离子等等。
在优选地实施方式中，甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温的含量分别独立地为：2-15w/v％、0.5-5w/v％、0.1-2w/v％和0.01-0.5v/v％。甘露醇的含量可以但不限于为2w/v％、4w/v％、6w/v％、8w/v％、10w/v％、12w/v％、14w/v％或15w/v％；葡聚糖的含量可以但不限于为0.5w/v％、1w/v％、1.5w/v％、2w/v％、2.5w/v％、3w/v％、3.5w/v％、4w/v％、4.5w/v％或5w/v％；PVP的含量可以但不限于为0.1w/v％、0.5w/v％、1w/v％、1.5w/v％或2w/v％；吐温的含量可以但不限于为0.01v/v％、0.05v/v％、0.1v/v％、0.15v/v％、0.2v/v％、0.25v/v％、0.3v/v％、0.35v/v％、0.4v/v％、0.45v/v％或0.5v/v％。
在更优选的实施方式中，甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温的含量均独立地为：7-15w/v％、2-5w/v％、0.1-1w/v％和0.1-0.5v/v％。更进一步优选为：8-13w/v％、2.5-4w/v％、0.1-0.5w/v％和0.1-0.3v/v％。
在一些实施方式中，冻干保护组方中还包括海藻糖，含量优选为3-20w/v％，进一步优选为5-20w/v％。海藻糖的含量可以但不限于为3w/v％、5w/v％、7w/v％、9w/v％、11w/v％、13w/v％、15w/v％、17w/v％、19w/v％或20w/v％。
在一些实施方式中，冻干保护组方中还可以包括BSA，含量优选为0.05-1w/v％，进一步优选为0.1-1w/v％。BSA的含量可以但不限于为0.05w/v％、0.2w/v％、0.4w/v％、0.6w/v％、0.8w/v％或1w/v％。
需要说明的是，上述海藻糖、甘露醇、葡聚糖、PVP、吐温和BSA的含量均独立地为最终使用浓度，具体为预冷冻干燥的核酸扩增用试剂中各物质的含量。此外，“w/v％”表示质量体积比，每100mL溶液中含有的某物质克数；“v/v％”表示体积百分比，每100mL溶液中含有的某物质mL数。
在上述冻干保护组方中，葡聚糖可以为不同分子量葡聚糖的混合物，也可以为分子量在1000-80000范围内任意点值分子量的葡聚糖，例如为分子量1000、3000、40000、50000或80000的葡聚糖。吐温优选为吐温80或吐温20。
本发明提供的上述冻干保护组方制备得到的冻干制品，可适用于核酸样品检测，例如病毒的核酸检测，例如近期流行的新型冠状病毒的核酸检测、HIV的核酸检测、HCV的核酸检测等；其中，在新型冠状病毒检测上，检测灵敏度高，且在疫情高发期，陆运不通、航班取消、空运难情况下，实现常温运输，与寄送常规液态试剂需放入几十公斤的干冰相比，冻干核酸扩增用试剂能有效降低寄运试剂总重量，实现更大寄运量。
本发明又提供一种冻干核酸扩增用试剂的制备方法，将核酸扩增用试剂和上述冻干保护组方的混匀液冷冻干燥，得到冻干核酸扩增用试剂。
在一些实施方式中，冷冻干燥采用真空冷冻干燥的形式，将溶液冻结成固态，然后在真空的条件下使水蒸气升华分离，干燥后的溶质保留在容器中，其成份和活性不变。例如可以为：超低温预冻1-8h，一次干燥8-20h，二次干燥2-10h。
在优选地实施方式中，核酸扩增用试剂包括酶，优选为逆转录酶或DNA聚合酶；还可以包括RNA酶抑制剂、dNTPS、引物、探针或盐离子。其中，逆转录酶的浓度优选为2-30U/μL，例如可以但不限于为2U/μL、6U/μL、10U/μL、14U/μL、18U/μL、22U/μL、26U/μL或30U/μL；DNA聚合酶的浓度优选为0.1-1U/μL，例如可以但不限于为0.1U/μL、0.2U/μL、0.3U/μL、0.4U/μL、0.5U/μL、0.6U/μL、0.7U/μL、0.8U/μL、0.9U/μL或1U/μL；RNA酶抑制剂的浓度优选为1-6U/μL，例如可以但不限于为1U/μL、2U/μL、3U/μL、4U/μL、5U/μL或6U/μL；dNTPS的浓度优选为1-10mM，例如可以但不限于1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。
需要说明的是，上述逆转录酶、DNA聚合酶、RNA酶抑制剂和dNTPS的含量均独立地为最终使用浓度，具体为预冷冻干燥的核酸扩增用试剂中各物质的含量。
本发明还提供上述制备方法制备得到的冻干核酸扩增用试剂，部分样品的成品图如图5所示，该冻干核酸扩增用试剂可以应用于核酸扩增反应或制备核酸扩增产品中。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
下述实施例中用到的引物和探针序列信息如下：
ORF1ab-F：5’-CCCTGTGGGTTTTACACTTAA-3’(SEQ ID NO.1)；
ORF1ab-R：5’-ACGATTGTGCATCAGCTGA-3’(SEQ ID NO.2)；
ORF1ab-P：5’-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-3’(SEQ ID NO.3)；
N-F：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’(SEQ ID NO.4)；
N-R：5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’(SEQ ID NO.5)；
N-P：5’-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-3’(SEQ ID NO.6)；
HIV-F：5’-ATGGCAGTATTCATYCACAATT-3’(SEQ ID NO.7)；
HIV-R：5’-ATTATGTCTAYTATTCTTTCYCCTG-3’(SEQ ID NO.8)；
HIV-P：5’-ACTGTAYCCCCCAATCCCCCCTT-3’(SEQ ID NO.9)。
实施例1
1)制备扩增酶预混液，包含终浓度为20U/μl的逆转录酶，终浓度为0.5U/μl的DNA聚合酶，终浓度为3.75U/μl的RNA酶抑制剂及终浓度为5mM的dNTP，将各物质混匀制备成酶混合液；
2)按照如下各组冻干保护组方的组分及其终浓度分别配置添加至1)中的酶混合液中混匀(如下物质浓度中，吐温为体积百分比，其余物质为质量体积百分比)；
组1：海藻糖3mmol/L，蔗糖0.5mmol/L；
组2：甘露醇8％，PEG 1％，苏氨酸1％；
组3：海藻糖1％，PVP 3％，BSA 2％；
组4：海藻糖20％，甘露醇5％，BSA 7％，吐温80 0.3％，Tris-HCl 60mM；
组5：甘露醇10％、吐温80 0.2％、PVP 0.3％、葡聚糖3％；
组6：甘露醇10％、吐温80 0.2％、PVP 0.3％；
组7：甘露醇10％、吐温80 0.2％、葡聚糖3％；
组8：甘露醇10％、PVP 0.3％、葡聚糖3％；
组9：吐温80 0.2％、PVP 0.3％、葡聚糖3％；
组10：甘露醇2％、吐温20 0.2％、PVP 2％、葡聚糖T80 2％；
组11：甘露醇15％、吐温20 0.01％、PVP 1％、葡聚糖T1 5％；
组12：甘露醇7％、吐温80 0.5％、PVP 0.1％、葡聚糖T40 0.5％；
组13：甘露醇8％、吐温80 0.2％、PVP 0.1％、葡聚糖2.5％、海藻糖5％；
组14：甘露醇13％、吐温20 0.3％、PVP 0.3％、葡聚糖3％、海藻糖3％；
组15：甘露醇9％、吐温20 0.2％、PVP 0.5％、葡聚糖4％、海藻糖20％、BSA 1％；
组16：甘露醇11％、吐温80 0.1％、PVP 0.3％、葡聚糖T50 2.5％、海藻糖7％、BSA0.1％；
3)将上述混合物分装进西林瓶，进行真空冷冻干燥，即得到核酸扩增冻干制品(即冻干核酸扩增用试剂)。
实施例2
将实施例1中的核酸扩增冻干制品分别用于新型冠状病毒的检测，引物和探针分别采用上述的ORF1ab和N基因的引物和探针。按照下表1和2配制核酸扩增反应体系，振荡混匀，分装进8联PCR管：
表1
组份 浓度
核酸扩增冻干制品 /
5×buffer 1×
ORF1ab-F 0.2μM
ORF1ab-R 0.2μM
ORF1ab-P 0.125μM
表2
组份 浓度
核酸扩增冻干制品 /
5×buffer 1×
N-F 0.2μM
N-R 0.2μM
N-P 0.125μM
同时以液体试剂组作为对照组，具体配方如下表3和4：
表3
Figure BDA0002611560580000091
Figure BDA0002611560580000101
表4
组份 浓度
逆转录酶 20U/μl
DNA聚合酶 0.5U/μl
RNA酶抑制剂 3.75U/μl
dNTP 5mM
5×buffer 1×
N-F 0.2μM
N-R 0.2μM
N-P 0.125μM
将ORF1ab假病毒样品和N基因假病毒样品分别按照病毒RNA提取试剂盒中相应的要求和步骤提取，提取的RNA可直接用于检测；将提取好的RNA样本根据检测量分别加入上述配制的扩增反应液中；
设置反应程序，如下表5：
表5
Figure BDA0002611560580000102
检测结果Ct值如下表6所示：
表6
Figure BDA0002611560580000111
从上述表格中结果可以看出，实验组5、10-12的数据优于实验组1-4和6-9，说明本发明提供的含有甘露醇、吐温、PVP和葡聚糖的冻干保护组方可以有效提高核酸扩增用试剂的稳定性，保持其生物活性。同时，实验组13-16的结果又优于实验组5、10-12，说明海藻糖和BSA的添加，进一步优化了冻干保护组方的配方，使得其效果进一步提高。
实施例3
采用实施例2中的试验方法进行37℃加速试验，时间为1个月，即将实施例1中的核酸扩增冻干制品分别在37℃条件下处理1个月后再配制核酸扩增反应体系进行检测。结果如下表7所示(表中“NT”表示无法读值)：
表7
Figure BDA0002611560580000121
可见，本发明提供的冻干保护组方可以有效延长核酸扩增反应体系中生物活性物质的有效期，实现常温运输，在37℃加速一个月后，利用该冻干保护组方制备的冻干核酸扩增用试剂的活性仍然保持稳定。
其中，实验组16的扩增曲线如图1-4所示，图1为0天实验组16检测ORF1ab基因样本103、104、105、106copy/ml扩增曲线；图2为0天实验组16检测N基因样本103、104、105、106copy/ml扩增曲线；图3为37℃1个月后实验组16检测ORF1ab基因样本103、104、105、106copy/ml扩增曲线；图4为37℃1个月后实验组16检测N基因样本103、104、105、106copy/ml扩增曲线。
实施例4
采用实施例2中实验组16的核酸扩增反应体系对新型冠状病毒和HIV的检测灵敏度进行检测，结果如下表8所示：
表8
检测基因 实验组16
新型冠状病毒ORF1ab 200copy/ml
新型冠状病毒N基因 150copy/ml
HIV 500copy/ml
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东菲鹏生物有限公司
<120> 核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ttgctgctgc ttgacagatt 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggcagtat tcatycacaa tt 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
attatgtcta ytattctttc ycctg 25
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
actgtayccc ccaatccccc ctt 23

Claims (10)

1.一种核酸扩增用试剂的冻干保护组方，其特征在于，所述冻干保护组方包括甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温。
2.根据权利要求1所述的冻干保护组方，其特征在于，甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温的含量分别独立地为：2-15w/v％、0.5-5w/v％、0.1-2w/v％和0.01-0.5v/v％；
优选地，甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温的含量分别独立地为：7-15w/v％、2-5w/v％、0.1-1w/v％和0.1-0.5v/v％；
优选地，甘露醇、葡聚糖、PVP和吐温的含量分别独立地为：8-13w/v％、2.5-4w/v％、0.1-0.5w/v％和0.1-0.3v/v％。
3.根据权利要求1所述的冻干保护组方，其特征在于，所述冻干保护组方还包括海藻糖，含量优选为3-20w/v％，进一步优选为5-20w/v％。
4.根据权利要求1所述的冻干保护组方，其特征在于，所述冻干保护组方还包括BSA，含量优选为0.05-1w/v％，进一步优选为0.1-1w/v％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的冻干保护组方，其特征在于，吐温包括吐温80或吐温20；
优选地，核酸扩增包括新型冠状病毒核酸检测或艾滋病毒核酸检测。
6.一种冻干核酸扩增用试剂的制备方法，其特征在于，将核酸扩增用试剂和权利要求1-5任一项所述的冻干保护组方的混匀液冷冻干燥，得到冻干核酸扩增用试剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，核酸扩增用试剂包括酶；
优选地，核酸扩增用试剂包括逆转录酶或DNA聚合酶；
优选地，核酸扩增用试剂还包括RNA酶抑制剂、dNTPS、引物、探针或盐离子；
优选地，逆转录酶的浓度为2-30U/μL；
优选地，DNA聚合酶的浓度为0.1-1U/μL；
优选地，RNA酶抑制剂的浓度为1-6U/μL；
优选地，dNTPS的浓度为1-10mM。
8.权利要求6或7所述的制备方法制备得到的冻干核酸扩增用试剂。
9.权利要求8所述的冻干核酸扩增用试剂在核酸扩增反应或制备核酸扩增产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，核酸扩增包括新型冠状病毒核酸检测或艾滋病毒核酸检测。
CN202010764532.8A 2020-07-31 2020-07-31 核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用 Pending CN114058684A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010764532.8A CN114058684A (zh) 2020-07-31 2020-07-31 核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用
PCT/CN2021/094418 WO2022022015A1 (zh) 2020-07-31 2021-05-18 核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010764532.8A CN114058684A (zh) 2020-07-31 2020-07-31 核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114058684A true CN114058684A (zh) 2022-02-18

Family

ID=80037480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010764532.8A Pending CN114058684A (zh) 2020-07-31 2020-07-31 核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114058684A (zh)
WO (1) WO2022022015A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113430251A (zh) * 2021-06-16 2021-09-24 成都博奥晶芯生物科技有限公司 一种恒温扩增试剂的浓缩方法及集成式生物芯片
CN114606300A (zh) * 2022-03-29 2022-06-10 武汉明德生物科技股份有限公司 一种用于核酸检测的冻干体系
CN115029423A (zh) * 2022-06-28 2022-09-09 武汉明德生物科技股份有限公司 一种多重荧光pcr检测试剂的冻干微球及其制备方法
CN114934107A (zh) * 2022-06-29 2022-08-23 广州生凌医疗科技有限公司 一种可冷冻保存多重逆转录荧光pcr预混反应液

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103911367A (zh) * 2014-03-20 2014-07-09 中国农业大学 一种核酸扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法
CN105463125A (zh) * 2016-02-02 2016-04-06 江苏正大天创生物工程有限公司 核酸扩增体系及其冻干保护剂
CN109593834A (zh) * 2019-01-29 2019-04-09 百康芯(天津)生物科技有限公司 一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050069898A1 (en) * 2003-09-25 2005-03-31 Cepheid Lyophilized beads containing mannitol
WO2008036544A1 (en) * 2006-09-18 2008-03-27 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Preparation of glassified biological reagents
CN112626175A (zh) * 2020-12-26 2021-04-09 杭州百迈生物股份有限公司 一种snp检测试剂的冻干保护剂及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103911367A (zh) * 2014-03-20 2014-07-09 中国农业大学 一种核酸扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法
CN105463125A (zh) * 2016-02-02 2016-04-06 江苏正大天创生物工程有限公司 核酸扩增体系及其冻干保护剂
CN109593834A (zh) * 2019-01-29 2019-04-09 百康芯(天津)生物科技有限公司 一种核酸扩增试剂所需的冻干保护体系及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022022015A1 (zh) 2022-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114058684A (zh) 核酸扩增用试剂的冻干保护组方、制品及其制备方法和应用
CN111560417B (zh) 一种rna扩增反应试剂的冻干保护剂及冻干方法
US20230052199A1 (en) Recombinase polymerase amplification reagents and kits
CA2663440C (en) Preparation of glassified biological reagents
US7361465B2 (en) Methods and compositions for tailing and amplifying RNA
JP5367078B2 (ja) ｍＲＮＡ定量のための改善された溶解および逆転写
JP5904153B2 (ja) 核酸増幅反応用試料の調製方法、核酸増幅方法、固相状核酸増幅反応用試薬及びマイクロチップ
CN106755414A (zh) 一种检测dna遗传标记的方法
WO2017184028A1 (en) Stabilized mixture of reagents for molecular diagnostics
KR20230019965A (ko) 검체 내 타겟 핵산 서열 검출을 위한 준비물을 제공하는 방법
US20100136547A1 (en) Pure miRNA Sample Preparation Method
CN112704062A (zh) 一种细胞保存液及其使用方法
CN117089653A (zh) 基于高通量扩增子测序的rna病毒检测的组合物
CN111876408A (zh) 一种真核生物低起始量转录组文库构建方法
WO2023082070A1 (zh) Dna末端修复、连接接头试剂、试剂盒及dna文库构建方法
US20100015628A1 (en) Ambient temperature stable chemical/biological reagents on membranes or filters
WO2023011162A1 (zh) 一种生物样本核酸释放保存剂
CN111607591B (zh) 一种病毒核酸的提取方法及其相关试剂盒
JP5409631B2 (ja) 酵素反応においてサンプル中でｃＤＮＡを合成するための方法
CN107254467B (zh) 常温保存核酸标本的方法及其产品与使用方法
CN112301116A (zh) 非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法
JP2002520073A (ja) ベクターの保管
JP2019129798A (ja) 加熱サンプルを用いたより迅速で効率的な等温増幅反応
KR100508606B1 (ko) 효소 안정화 조성물 및 상기 조성물을 이용한 효소 보관방법
CN113388702A (zh) 非洲马瘟病毒rna定性标准样品、应用及制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination