CN118127243A - 一种试剂盒及其在检测马疱疹病毒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种试剂盒及其在检测马疱疹病毒中的应用。所述方法基于特定的引物对和Cas12a‑crRNA，所述引物对包括：马疱疹病毒RAA上游引物和马疱疹病毒RAA下游引物；所述马疱疹病毒RAA上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，所述马疱疹病毒RAA下游引物的序列如SEQ ID No.5所示。本发明针对研究得到的包含PAM位点且高度保守、敏感性较高的马疱疹病毒的靶点区域设计引物和crRNA，并且提供了相应的RAA‑CRISPR CAS12a检测方法，其可以对马疱疹病毒进行准确且高效的检测，这在病毒检测领域具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种试剂盒及其在检测马疱疹病毒中的应用。
背景技术
马疱疹病毒1型(EquineherpesvirusI，简称EHV-1)是引起马传染性鼻肺炎(Equinerhinopneumonitis，简称ER)的病原之一，是发生在马身上的一种常见病害。EHV-1具有疱疹病毒的一般共性，而且其不仅能在马属动物的组织细胞内增殖，还能在一些异种动物的组织细胞内生长。ER是马的一种急性、热性传染病，可导致母马流产、初生驹死亡或神经机能障碍。ER在易感马群中具有高度传染性，在多个地区长期、广泛存在和流行，严重阻碍了马养殖业的健康稳定发展。
常规的马传染性病毒检测技术包括病毒的分离鉴定、免疫技术、PCR技术等，但是这些技术存在一定的缺陷，病毒分离法操作复杂、耗时较长、试验条件要求苛刻、存在病毒散播的危险；血清学检测中其血清与EHV-4有交叉反应，不利于病毒基因分型的研究。PCR技术对于检测环境和检测条件具有较高的要求，这两者控制不当容易引起交叉污染，出现假阳性或假阴性的检测结果。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种试剂盒及其在检测马疱疹病毒中的应用。
本发明针对马疱疹病毒1型的基因序列区域进行研究得到了同时具备高度保守、含有PAM位点和敏感性较高多个要求的靶点区域，并且基于该靶点区域，本发明设计了相应引物对和Cas12a-crRNA，其具有较高的特异性和敏感性，可以对马疱疹病毒1型实现准确高效的检测。
第一方面，本发明提供一种引物对，包括马疱疹病毒RAA上游引物和马疱疹病毒RAA下游引物；所述马疱疹病毒RAA上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，所述马疱疹病毒RAA下游引物的序列如SEQ ID No.5所示。
本发明进一步提供一种Cas12a-crRNA，，其序列如SEQ ID No.6所示。
本发明进一步提供一种试剂或试剂盒，包括：所述的引物对，以及所述的Cas12a-crRNA。
优选地，所述试剂或试剂盒还包括ssDNA；所述ssDNA的序列如SEQ IDNo.10所示。
进一步优选地，所述ssDNA两端标记荧光基团和淬灭基团。
第二方面，本发明提供所述的引物对，或所述的试剂或试剂盒在检测马疱疹病毒中的应用。
进一步地，本发明提供的应用不仅仅涉及疾病诊断和疾病治疗。其可以应用于药物筛选(例如检测药物对于病毒的抑制效率)、疫苗研制、评估针对EHV的病毒特性研究等方面。
第三方面，本发明提供一种检测马疱疹病毒的方法，包括：
基于所述的引物对和所述的Cas12a-crRNA，或基于所述的试剂或试剂盒，对待测样本中的马疱疹病毒进行检测。
与以上的应用相同，本发明提供的方法同样不仅仅涉及疾病诊断和疾病治疗，其还可以应用药物筛选、疫苗研制、评估针对EHV的基因编辑策略的有效性和病毒特性研究等方面。
进一步地，所述检测为：
采用RAA-CRISPR CAS12a方法进行一管式核酸检测。
进一步地，所述一管式核酸检测包括：
提取所述待测样本的基因组DNA；
向冻干反应体系中加入聚乙二醇复融，混合所述基因组DNA、醋酸镁溶液和氯化镁溶液之后进行扩增。
进一步地，所述冻干反应体系包括：
2.0～8.0mmol/L dNTP、0.1～1.2μmol/L单链结合蛋白、0.5～2.5μmol/L重组酶蛋白、0.1～1.5U/μL DNA聚合酶、10～100mmol/LTrisHCl、20～80mmol/LNaCl、4～10mmol/L二硫苏糖醇、0.5～5.0μmol/L所述的引物对、0.5～3.0μmol/L所述Cas12a-crRNA、0.1～1.0μmol/L LbCas12a、0.1～1.0U/μL Exo核酸外切酶、10～50nmol/L ssDNA、0.2～1.0U/μLRNase Inhibitor、10～15mmol/L海藻糖、20～30mmol/L甘露醇、5～10％牛血清白蛋白。
以本发明进行检测时，总反应体系中还包括待测样本核酸、预混液BufferA(20～60％聚乙二醇)和预混液Buffer B(200～350mmol/L醋酸镁和50～150mmol/L氯化镁)。
本发明优化冻干反应体系，其尤其适用于马疱疹病毒的检测场景，具有较高的稳定性，易于保存和运输，且在实际检测时操作简便，在封闭的反应体系中减少了污染的可能性。
进一步地，所述冻干反应体系经过如下处理：
在-80℃以下的条件下处理1～2小时，之后进行设备冻干；
所述设备冻干包括：预冻、设备抽真空、冷冻干燥和解析干燥；
所述解析干燥包括：
将隔板温度升至-20～-25℃保持12～14h，然后将隔板温度升至4～8℃并保持0.5～1h，最后将隔板降至20～25℃并保持3～6h。
进一步地，所述一管式核酸检测的反应程序包括：
36～38℃，预热60～180s；38～42℃，扩增30～40s，35～50个循环。
进一步地，对于所述一管式核酸检测的扩增产物可以采用多种方法进行读取检测，例如可以可通过real-time PCR对扩增过程进行实时监控，还可以在紫外灯下进行可视化显示。
进一步地，所述马疱疹病毒为马疱疹病毒1型。
本发明具有如下有益效果：
本发明经过研究得到了马疱疹病毒高度保守、包含PAM位点并且敏感性较高的区域。基于该区域，本发明设计了特异性引物对和Cas12a-crRNA，提供了相应的马疱疹病毒检测方法。本发明提供的检测方法具有较高的特异性和灵敏度，同时还有着扩增条件不需变温循环、耗时短、反应体系可常温保存、结果读取方式灵活等优点，在检测马疱疹病毒的领域具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例。
图1是本发明实施例1提供的马疱疹病毒1型最佳RAA-CRISPR/CAS12a筛选结果图；其中1为EHV1-F、EHV1-R、Cas12a-crRNA检测马疱疹病毒1型核酸；2为EHV1-F1、EHV1-R1、Cas12a-crRNA1检测马疱疹病毒1型核酸；3为EHV1-F2、EHV1-R2、Cas12a-crRNA2检测马疱疹病毒1型核酸；4为EHV1-F、EHV1-R、Cas12a-crRNA检测无核酸酶水；5为EHV1-F1、EHV1-R1、Cas12a-crRNA1检测无核酸酶水；6为EHV1-F2、EHV1-R2、Cas12a-crRNA2检测无核酸酶水。
图2是本发明实施例1提供的马疱疹病毒1型最佳RAA-CRISPR/CAS12a筛选产物在紫外灯下的检测结果；其中1为EHV1-F、EHV1-R、Cas12a-crRNA检测马疱疹病毒1型核酸；2为EHV1-F1、EHV1-R1、Cas12a-crRNA1检测马疱疹病毒1型核酸；3为EHV1-F2、EHV1-R2、Cas12a-crRNA2检测马疱疹病毒1型核酸；4为EHV1-F、EHV1-R、Cas12a-crRNA检测无核酸酶水；5为EHV1-F1、EHV1-R1、Cas12a-crRNA1检测无核酸酶水；6为EHV1-F2、EHV1-R2、Cas12a-crRNA2检测无核酸酶水。
图3是本发明实施例2提供的马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a对马疱疹病毒1型NZA-77株目的基因合成质粒检测结果，其中1为马疱疹病毒1型NZA-77株目的基因合成质粒，2为阴性对照。
图4是本发明实施例2提供的马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a产物紫外灯检测结果，其中1为马疱疹病毒1型NZA-77株目的基因合成质粒，2为阴性对照。
图5是本发明实施例2提供的马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a的特异性检测结果；其中1为马疱疹病毒1型核酸；2为马疱疹病毒2型核酸；3为马疱疹病毒3型核酸；4为马疱疹病毒4型核酸；5为马疱疹病毒5型核酸；6为马疱疹病毒8型核酸；7为马疱疹病毒9型核酸；8为马流行性感冒病毒核酸；9为传染性支气管炎病毒核酸；10为阴性对照。
图6是本发明实施例2提供的马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a产物紫外灯特异性检验结果；其中1为马疱疹病毒1型核酸；2为马疱疹病毒2型核酸；3为马疱疹病毒3型核酸；4为马疱疹病毒4型核酸；5为马疱疹病毒5型核酸；6为马疱疹病毒8型核酸；7为马疱疹病毒9型核酸；8为马流行性感冒病毒核酸；9为传染性支气管炎病毒核酸；10为阴性对照。
图7是本发明实施例2提供的马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a对马疱疹病毒1型阳性质粒的敏感性检测结果；其中，1为1×107copies/mL；2为1×106copies/mL；3为1×105copies/mL；4为1×104copies/mL；5为1×103copies/mL；6为1×102copies/mL；7为50copies/mL；8为25copies/mL；9为12.5copies/mL；10为阴性对照。
图8是本发明实施例2提供的马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a对马疱疹病毒1型阳性质粒的敏感性检测产物的紫外灯特异性检验结果；其中，1为1×107copies/mL；2为1×106copies/mL；3为1×105copies/mL；4为1×104copies/mL；5为1×103copies/mL；6为1×102copies/mL；7为50copies/mL；8为25copies/mL；9为12.5copies/mL；10为阴性对照。
图9是本发明实施例2提供的马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a批内重复性检测结果；其中1-3是浓度为1×107copies/mL的马疱疹病毒1型阳性质粒，4是阴性对照。
图10是本发明实施例2提供的马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a批内重复性检测产物的紫外灯检测结果；其中1-3是浓度为1×107copies/mL的马疱疹病毒1型阳性质粒，4是阴性对照。
图11是本发明实施例2提供的马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a三批批间重复性检测结果；其中，1-3是三批检验浓度为1×107copies/mL的马疱疹病毒1型阳性质粒，4是无核酸酶水。
图12是本发明实施例2提供的马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a三批批间重复性检测产物的紫外灯检测结果；其中，1-3是三批检验浓度为1×107copies/mL的马疱疹病毒1型阳性质粒，4是无核酸酶水。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、最佳RAA-CRISPR/CAS12a引物筛选
本发明提供了一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a检测方法，该方法包括1管反应液，成分如下:2.0～8.0mmol/L dNTP、0.1～1.2μmol/L单链结合蛋白、0.5～2.5μmol/L重组酶蛋白、0.1～1.5U/μl DNA聚合酶、10～100mmol/LTrisHCl、20～80mmol/LNaCl、4～10mmol/L二硫苏糖醇、0.5～5.0μmol/L马疱疹病毒1型RAA上游引物、0.5～5.0μmol/L马疱疹病毒1型RAA下游引物、0.5～3.0μmol/L Cas12a-crRNA、0.1～1.0μmol/L LbCas12a、0.1～1.0U/μL Exo核酸外切酶、10～50nmol/L ssDNA、0.2～1.0U/μL RNase Inhibitor、20～60％聚乙二醇，模板5μL；2μL预混液Buffer(成分如下：200～350mmol/L醋酸镁和50～150mmol/L氯化镁)加在盖上，反应总体系为50μL。
根据Genbank中登录的马疱疹病毒1型的KT324724.1，以马疱疹病毒1型核酸为模板，将设计的三对RAA-CRISPR/CAS12a引物(表1)结合ssDNA探针进行RAA-CRISPR/CAS12a荧光检测。具体优化筛选的反应体系见下表2。将2.0μL终浓度290mmol/L醋酸镁和120mmol/L氯化镁试剂加在管盖上，
表1RAA-Cas12a-crRNA引物表
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| EHV1-F | ACGCCCGAGGCGCTTATTGCCCACTGGGTA(SEQ ID NO.1) |
| EHV1-R | TGCAGCCGAGGCAATCACGGGGACAGCTAT(SEQ ID NO.2) |
| Cas12a-crR | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUGUGUAACGUCCCACCGGUGU(SEQ ID NO.3) |
| EHV1-F1 | CAGAAACTTTCAGGTCTTTGGATACGAGGA(SEQ ID NO.4) |
| EHV1-R1 | AACGTATAGGAAGAGTAAGTGGTCGCAGCT(SEQ ID NO.5) |
| Cas12a-crR1 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAGUUCAAAGGACUAUCUGACAG(SEQ ID NO.6) |
| EHV1-F2 | TGCAACTCTCCCAGCGAACACGACCGCCTC(SEQ ID NO.7) |
| EHV1-R2 | AGTACGACTGCGACGAGGACGGGGAGGAGT(SEQ ID NO.8) |
| Cas12a-crR2 | UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCGUUUAUUUUCUCGCTGGCGCU(SEQ ID NO.9) |
| ssDNA | FAM-TTTTTTTTTT-BHQ1(SEQ ID NO.10) |
表2RAA-CRISPRCAS12a体系配制表
| 体系 | 终浓度 |
| dNTP | 5.5mmol/L |
| 单链结合蛋白 | 1.0μmol/L |
| 重组酶蛋白 | 1.8μmol/L |
| DNA聚合酶 | 1.0U/μL |
| TrisHCl | 46mmol/L |
| NaCl | 62mmol/L |
| 二硫苏糖醇 | 7mmol/L |
| RAACAS12a上游引物 | 4.0μmol/L |
| RAACAS12a上游引物 | 4.0μmol/L |
| Cas12a-crRNA | 2.5μmol/L |
| LbCas12a | 0.4μmol/L |
| Exo核酸外切酶 | 0.8U/μL |
| ssDNA | 20nmol/L |
| RNaseInhibitor | 0.6U/μL |
| 聚乙二醇 | 50％ |
| 模板 | 5μL |
| 无核酸酶水 | 补足至50μL |
将所有的反应试剂混匀为CRISPR/Cas12a初始检测体系进行离心，离心完立即进行荧光扩增检测，选择FAM通道，扩增程序：38℃，100s预热；40℃，30s扩增，40循环；结束后保存数据进行荧光信号分析，结果如图1所示。RAA-CRISPR-Cas12a扩增反应物用凝胶成像仪在紫外灯302nM激发，肉眼进行结果判读并拍照，结果如图2所示。通过比较Ct值、荧光强度来筛选最佳RAA引物和Cas12a-crRNA，最终得到的组合为EHV1-F1、EHV1-R1和Cas12a-crRNA1。
2、Cas12a-crRNA与LbCas12a蛋白最适浓度的选择
以上一步骤的马疱疹病毒1型核酸为模板，无核酸酶水为阴性对照，基于EHV1-F1、EHV1-R1和Cas12a-crRNA1组合进行RAA-CRISPR/CAS荧光检测。具体反应体系见表3，其中Cas12a-crRNA终浓度为X和LbCas12a终浓度为Y，X和Y为变量，需以总反应体积为50μL的体系算出不同浓度所需加入LbCas12a蛋白和Cas12a-crRNA的体积，其他组分终浓度不变。
选择的LbCas12a蛋白浓度分别为0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM、1.0μM；选择的Cas12a-crRNA浓度分别是0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM进行交叉反应。
将2.0μL终浓度290mmol/L醋酸镁和120mmol/L氯化镁试剂加在管盖上，混合均匀后离心并立即进行扩增反应，选用的报告分子为荧光报告分子，扩增程序为38℃，60s预热1循环；38℃，30s扩增，40循环。
最终得到核酸扩增产物，将反应完成后的Ct值数据保存分析。结果如表4所示，对实验结果进行分析并确定最佳反应体系中LbCas12a蛋白终浓度为0.6μmol/L，Cas12a-crRNA的终浓度为2.0μmol/L。
表3RAA-CRISPRCAS12a体系配制表
表4LbCas12a与Cas12a-crRNA的比例筛选结果
实施例2
1、一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a检测方法的建立
(1)一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a冻干反应液制备
一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a冻干反应液为5.5mmol/L dNTP、1.0μmol/L单链结合蛋白、1.8μmol/L重组酶蛋白、1.0U/μL DNA聚合酶，46mmol/LTrisHCl、62mmol/LNaCl、7mmol/L二硫苏糖醇、4.0μmol/L EHV1-F1、4.0μmol/L EHV1-R1、2.0μmol/LCas12a-crRNA1、0.6μmol/L LbCas12a、0.8U/μLExo核酸外切酶、20nmol/L ssDNA、0.6U/μLRNase Inhibitor、12mmol/L海藻糖、25mmol/L甘露醇、8％牛血清白蛋白及无核酸酶水补充至50μL于0.2mL八连排PCR管中。
将冻干反应液先于-80℃冷冻1h，之后进行设备冻干。设备冻干条件为：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为0.5h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持13h，然后将隔板温度升至5℃并保持40min，最后将隔板降至25℃并保持5h。
(2)质粒合成
马疱疹病毒1型NZA-77株(Genbank：KT324724.1)目的基因合成质粒作为待测样本。
(3)RAA-CRISPR Cas12a扩增
向一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a冻干管(前述50μL体系的冻干反应液)中，加入43μL预混液BufferA(50％聚乙二醇)复融，再加入5μL待检核酸，然后加2.0μL的BufferB(290mmol/L醋酸镁和120mmol/L氯化镁)溶液在管盖上，盖上反应管的管盖后，简单旋转将BufferB离心管管底，共50μL体系，混合均匀，进行扩增反应，扩增程序为：38℃，100s预热；40℃，30s扩增，40循环。得到核酸扩增产物；
(4)实验结果
从图3可知本发明马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a的检测方法可检测到马疱疹病毒1型NZA-77株目的基因合成质粒，产生扩增曲线，而阴性对照无扩增曲线。所述检测方法对马疱疹病毒1型NZA-77株可检出。
从图4可知本发明RAA-CRISPR CAS12a的检测方法对马疱疹病毒1型NZA-77株目的基因合成质粒检测为白光，而阴性对照无色。说明本发明提供的方法可以对马疱疹病毒1型进行准确检测。
2、一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a检测方法的特异性检验
(1)用马疱疹病毒2型核酸、马疱疹病毒3型核酸、马疱疹病毒4型核酸、马疱疹病毒5型核酸、马疱疹病毒8型核酸、马疱疹病毒9型核酸、马流行性感冒病毒核酸、传染性支气管炎病毒核酸与马疱疹病毒1型核酸及阴性对照一起验证马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a特异性。
(2)将如上9种病原核酸作为模板，进行RAA-CRISPR CAS12a扩增检测，按照步骤1的一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a检测方法进行检测。
(3)反应体系：向一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a冻干管中加入43μL预混液BufferA及5μL待检核酸，然后加2μL的BufferB溶液在管盖上，盖上反应管的管盖后，简单旋转将BufferB离心管管底，共50μL体系，混合均匀，进行扩增反应，扩增程序为：38℃，60s预热；38℃，30s扩增，40循环。得到核酸扩增产物。
(4)实验结果
结果如图5和图6所示，仅马疱疹病毒1型核酸有扩增曲线，马疱疹病毒2型核酸、马疱疹病毒3型核酸、马疱疹病毒4型核酸、马疱疹病毒5型核酸、马疱疹病毒8型核酸、马疱疹病毒9型核酸、马流行性感冒病毒核酸、传染性支气管炎病毒核酸的检测结果均无扩增曲线，图6显示本发明提供的检测方法对马疱疹病毒1型核酸检测为白光，对其他种类病原无扩增，为无色透明，说明没有发生非特异性扩增，表明本发明提供的RAA-CRISPR CAS12a检测方法具有良好的特异性。
3、一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a检测方法的敏感性检验
(1)将浓度为1×107copies/mL的阳性质粒进行10倍梯度稀释。取102copies/mL的质粒进行2倍稀释。取1×107copies/mL、1×106copies/mL、1×105copies/mL、1×104copies/mL、1×103copies/mL、102copies/mL、50copies/mL、25copies/mL和12.5copies/mL各梯度浓度质粒作为模板，无核酸酶水作为阴性对照，进行RAA-CRISPR-Cas12a试剂的敏感性检测。
(2)反应条件和反应体系同步骤1的一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a检测方法。
(3)实验结果
结果如图7和图8所示：采用本发明提供的RAA-CRISPR CAS12a检测方法进行检测，马疱疹病毒1型阳性质粒的最低检测限为25copies/mL，这说明了本发明提供的方法具有较高的敏感性。
4、一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a检测方法的重复性检验
(1)选取1×107copies/mL的马疱疹病毒1型阳性质粒，分别进行批内重复检测和批间重复检测。
批内重复检测：将阳性质粒在同一批实验中进行3个重复。
批间重复实验：将阳性质粒分3个批次检测。
(2)反应条件和反应体系同步骤1的一管式马疱疹病毒1型RAA-CRISPR CAS12a检测方法。
(3)实验结果
结果如图9-图12所示：
图9的结果显示本发明提供的RAA-CRISPR CAS12a检测方法对于马疱疹病毒1型阳性质粒的1×107copies/mL均有扩增曲线且批内荧光信号，CT值基本一致。图10结果显示紫外灯下同一批次的1×107copies/mL阳性质粒的扩增产物可检测到白光，说明本发明提供的RAA-CRISPR CAS12a检测方法批内重复较好。
图11的结果显示本发明提供的RAA-CRISPR CAS12a检测方法对三批马疱疹病毒1型阳性质粒的1×107copies/mL均有扩增曲线，且批间荧光信号，CT值基本一致。图12结果显示紫外灯下三批1×107copies/mL阳性质粒的扩增产物可检测到白光，说明本发明提供的RAA-CRISPR CAS12a检测方法批间重复较好。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种引物对，其特征在于，包括：马疱疹病毒RAA上游引物和马疱疹病毒RAA下游引物；所述马疱疹病毒RAA上游引物的序列如SEQ ID No.4所示，所述马疱疹病毒RAA下游引物的序列如SEQ ID No.5所示。
2.一种Cas12a-crRNA，其特征在于，包括序列如SEQ ID No.6所示。
3.一种试剂或试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的引物对，以及权利要求2所述的Cas12a-crRNA；
优选地，所述试剂或试剂盒还包括ssDNA；所述ssDNA的序列如SEQ ID No.10所示。
4.权利要求1所述的引物对，或权利要求2所述的Cas12a-crRNA，或权利要求3所述的试剂或试剂盒在检测马疱疹病毒中的应用。
5.一种检测马疱疹病毒的方法，其特征在于，包括：
基于权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的Cas12a-crRNA，或基于权利要求3所述的试剂或试剂盒，对待测样本中的马疱疹病毒进行检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述检测为：
采用RAA-CRISPR CAS12a方法进行一管式核酸检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一管式核酸检测包括：
提取所述待测样本的基因组DNA；
向冻干反应体系中加入聚乙二醇复融，混合所述基因组DNA、醋酸镁溶液和氯化镁溶液之后进行扩增。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述冻干反应体系包括：
2.0～8.0mmol/L dNTP、0.1～1.2μmol/L单链结合蛋白、0.5～2.5μmol/L重组酶蛋白、0.1～1.5U/μL DNA聚合酶、10～100mmol/LTrisHCl、20～80mmol/L NaCl、4～10mmol/L二硫苏糖醇、0.5～5.0μmol/L权利要求1所述的引物对、0.5～3.0μmol/L权利要求2所述Cas12a-crRNA、0.1～1.0μmol/L LbCas12a、0.1～1.0U/μL Exo核酸外切酶、10～50nmol/L ssDNA、0.2～1.0U/μL RNase Inhibitor、10～15mmol/L海藻糖、20～30mmol/L甘露醇、5～10％牛血清白蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述冻干反应体系经过如下处理：
在-80℃以下的条件下处理1～2小时，之后进行设备冻干；
所述设备冻干包括：预冻、设备抽真空、冷冻干燥和解析干燥；
所述解析干燥包括：
将隔板温度升至-20～-25℃保持12～14h，然后将隔板温度升至4～8℃并保持0.5～1h，最后将隔板降至20～25℃并保持3～6h。
10.根据权利要求5～9任一项所述的方法，其特征在于，所述一管式核酸检测的反应程序包括：
36～38℃，预热60～180s；38～42℃，扩增30～40s，35～50个循环。
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