CN117265075A - 用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂、试剂盒及使用方法 - Google Patents

用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂、试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂，所述冻干辅助试剂为包含缓冲液或保护成分、核酸扩增原料、激活盐、冻干赋形剂或冻干保护剂等恒温扩增反应的辅助试剂混合后的冻干制剂。该冻干辅助制剂与冻干前的液体试剂具有相同的活性，并且能够常温运输和储存、保质期长，也避免了冻融对辅助试剂活性的影响。另外，所述冻干辅助制剂可按多份量配置，再分装呈单份冻干。在使用时，将单份冻干辅助试剂与样本、酶混合，或者再添加少量水即可进行恒温扩增反应，对于体积微量且成分复杂的恒温扩增反应来说，极大方便了实验操作并减小了配液误差。

Description

用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂、试剂盒及使用方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及应用于恒温扩增体系下冻干辅助试剂、试剂盒及使用方法。
背景技术
近几年来，随着生物技术的飞速发展，核酸检测在临床诊断和动物疾病诊断等方面得到了广泛应用，恒温扩增技术也在此背景下出现。恒温扩增技术是指一种在恒温条件下即可实现快速、高效地获取大量核酸的方法。恒温扩增技术包括滚环核酸扩增(rollingcircle amolification，RCA)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymeraseamplification，RPA)、链替代扩增(strand displacement amplification，SDA)、依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence based amplification，NASBA)和解链酶扩增(helixdependent amplification，HAD)等等【Yan L,Zhou J,Zheng Y,et al.Isothermalamplified detection of DNA and RNA[J]Molecμlar Biosystems,2014,10(5):970-1003.】。该技术与传统的PCR相比有着高效、快速且不用专用设备等优点，已经运用到多个领域，特别是应用于微生物病原菌检测，例如非洲猪瘟病毒、2019-nCOV检测等领域【Cord CUphoff,Hans G Drexler.,Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures[J]Current Protocols in Molecμlar Biology,2014,28.4.1-28.4.14】。当前。
恒温扩增技术用到的试剂包括各种酶、缓冲液、盐离子、寡核苷酸等成分，为保护这些成分的活性及效果，需要在低温条件下储存、运输，成本较高，且需反复冻融降低了生物活性。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂、试剂盒及使用方法。
传统的核酸检测试剂，如PCR检测试剂，也存在低温运输及反复冻融问题。因此，市面上存在冻干检测试剂盒，该试剂盒中包含冻干的酶以及液体形式的其余组分。然而，恒温扩增技术用到的是多种衡量成分的混合体系，只将其中的一种或一部分组分进行冻干处理，剩余部分不进行冻干处理，或者将多种组分分开进行冻干处理，其产生的误差会影响后续的实验，使实验的重复性无法得到保障，其未冻干的液体部分仍需要考虑低温储存、运输问题。
一方面，本发明提供了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂。
该冻干辅助试剂由包含缓冲液或保护成分、核酸扩增原料、激活盐、冻干赋形剂或冻干保护剂的混合溶液冻干而成。
在一些方式中，所述冻干赋形剂或冻干保护剂包括以下一种或多种：
(1)糖醇类：海藻糖、棉籽糖、葡聚糖、糊精、聚乙二醇、甘露醇、甘油；
(2)氨基酸或蛋白质类：丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、牛血清蛋白、酪蛋白；
(3)表面活性剂：曲拉通X-100、吐温-80、乙基苯基聚乙二醇-40；
(4)无水溶剂：二甲基亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
优选地，所述冻干赋形剂或冻干保护剂由海藻糖、棉籽糖和甘露醇组成。
优选地，混合溶液中海藻糖、棉籽糖和甘露醇的质量百分比分别为5.0％～10.0％、1.0％～6.0％和1.0％～10.0％。
优选地，混合溶液中海藻糖、棉籽糖和甘露醇的质量百分比分别为6.0％～7.0％、1.5％～3.0％和1.0％～3.0％。
优选地，海藻糖、棉籽糖和甘露醇的质量百分比分别为6.5％、2.0％和2.0％。
进一步地，发明人对具体的冻干条件进行了优化，发现将所述辅助试剂的混合溶液以液滴的形式滴入液氮，可快速凝固成固体小球，再于冻干机中冻干，可进一步减小冻干损失。此外，恒温扩增反应体系的总体积微小，一滴混合溶液正好为一份恒温扩增反应辅助试剂的量。
具体地，所述混合溶液的冻干包括以下步骤：
S1将所述混合溶液滴入液氮中，液滴在液氮中迅速凝固成小球；
S2将步骤S1的小球置于冻干机中冻干。
在一些方式中，所述液滴的体积在200μl及以下，优选10～100μl。
与将混合溶液直接放入冻干机冻干相比，将固体小球于冻干机中冻干，活性损失率极大降低。
进一步，冻干机的冻干程序为：-45℃，0帕，1小时；-40℃，1帕，6小时；-30℃，1帕，20分钟；-20℃，1帕，20分钟；-10℃，1帕，20分钟；0℃，1帕，90分钟；10℃，1帕，30分钟；20℃，1帕，30分钟；25℃，1帕，1小时。在该条件下，即可是固体小球完全干燥，又能有效降低所述辅助试剂的质量和活性损失。
在一些方式中，所述混合溶液还包括以下的一种或多种物质：二硫苏糖醇、磷酸肌酸、咪唑、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)。
在一些方式中，所述激活盐包括以下一种或多种盐离子：镁离子、镍离子、锰离子。
在一些方式中，所述核酸扩增原料包括上游引物、下游引物、内引物、外引物、探针、脱氧核糖核苷酸(dNTP)、核糖核苷酸中(NTP)的一种或多种。
在一些方式中，所述缓冲液或保护成分包含以下一种或多种：三羟甲基氨基甲烷、钠离子、钾离子、氯离子、醋酸根离子、硫酸根离子。
在一些方式中，所述核酸恒温扩增反应为酶促重组扩增反应，所述混合溶液包括如下组分：
名称 浓度
三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液pH8.0 50-100mM
乙酸钾 50-100mM
乙酸镁 5-20mM
聚乙二醇(分子量20000) 2.5-10％
ATP 1-10mM
磷酸肌酸 10-50mM
咪唑 20mM
dNTP(25mM each) 0.45mM
海藻糖 6.0％～7.0％
棉籽糖 1.5％～3.0％
甘油 1.0％～3.0％
优选地，所述混合溶液中各组分的浓度如下：
所述酶促重组扩增反应用于检测草鱼呼肠孤病毒GCRV VP7时，所述混合溶液还包括：
上游引物GCRV-I-F：5’-CCCACGCCAACGTCAAGACCATTCAAGACTCC-3’；
下游引物GCRV-I-R：5’-TCCAATTCGTGATAGTCTACAGTACGGCTACC-3’；
荧光探针GCRV-I-PB：5’-CAAATGAAGCCATTCGCTCATTAGTCGAAG(Fam-dT)G(THF)G(BHQ1-dT)GACAAAGCGCAGACC(C3-SPACER)-3’。
优选地，上游引物GCRV-I-F和下游引物GCRV-I-R的浓度为0.42mM、荧光探针GCRV-I-PB的浓度为0.12mM。
所述酶促重组扩增反应用于检测SARS CoV 2假病毒时，所述混合溶液还包括：
上游引物CoVS-F：5’-TGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTT-3’；
下游引物CoVS-R：5’-TCTGAGAGAGGGTCAAGTGCACAGTCTAC-3’；
荧光探针CoVS-PB：5’-CTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCC(FAM-dT)(THF)G(BHQ1-dT)GATTCTTCTTCAGG-3’(C3-SPACER)。
优选地，上游引物CoVS-F和下游引物CoVS-R的浓度为0.42mM，荧光探针CoVS-PB的浓度为0.12mM。
所述酶促重组扩增反应用于检测嗜水气单胞菌时，所述混合溶液还包括：
上游引物AH-F：5’-CGGTTATGATGTCACCCTACGTTACGATAC-3’；
下游引物AH-R：5’-CACGGATTGCGACAGGGAGGTGGTGGTAGA-3’；
荧光探针AH-PB：5’-TCACCCTACGTTACGATACTGCCACCAAC(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)CCAAGACCAATACCTA-3’(C3-SPACER)。
优选地，上游引物AH-F和下游引物AH-R的浓度为0.42mM，荧光探针AH-PB为0.12mM。
在一些方式中，所述核酸恒温扩增反应为环介导等温扩增反应，所述混合溶液包括如下组分：
所述环介导等温扩增反应用于检测虾白斑综合症病毒时，所述混合溶液还包括：
内引物WSSV-FIP：CGCATATTTCCCTCTATCGCTATTATTTTTTAGCACAGATTTTTTGAT；
内引物WSSV-BIP：GGTCTGAAATATACATGGGTGCCTTTTTGAAAATGGGGTTTACGACAA；
外引物WSSV-F3：GGTAAAGGAACGTTTTGTTG；
外引物WSSV-B3：GCAATGGGAATGATAACTCTT。
优选地，内引物的浓度均为0.8μM，外引物的浓度均为0.1μM。
本发明的另一方面，提供了用所述冻干辅助试剂进行恒温扩增反应的方法和试剂盒。
所述方法包括将样品、酶混合溶液或冻干酶粉和所述冻干辅助试剂混合进行恒温扩增反应。
优选地，使用冻干酶粉。可将酶混合溶液冻干获得冻干酶粉，同样可以配置大量的酶混合溶液，再分装呈单份的量进行冻干。
在一些方式中，所述酶混合液或冻干酶粉包含以下的一种或多种物质：DNA聚合酶、RNA逆转录酶、重组酶、链置换酶、解旋酶、核酸内切酶、核酸外切酶、单链结合蛋白、肌酸激酶、无机焦磷酸酶。
在一些方式中，通过酶促重组扩增反应检测草鱼呼肠孤病毒GCRV VP7，所述酶混合溶液组成及最终浓度如下：
在一些方式中，通过酶促重组扩增反应检测SARS CoV 2假病毒，所述酶混合溶液组成及最终浓度如下：
在一些方式中，通过酶促重组扩增反应检测嗜水气单胞菌，酶混合溶液组成及最终浓度如下：
所述的冻干辅助试剂和酶混合溶液或冻干酶粉可组用于恒温扩增反应的试剂盒。在使用的时候，将冻干辅助试剂、酶混合溶液或冻干酶粉与样本混合即可进行恒温扩增反应。
在一些方式中，所述试剂盒还包括样本裂解液，该样本裂解液用于使样本细胞裂解，从而使核酸暴露出来。
在一些方式中，所述样本裂解液包含三羟甲基氨基甲烷-盐酸、氯化钠和吐温-100，例如50mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸、20mM氯化钠和2％吐温-100的混合水溶液。
本发明的优势在于，本发明将经过优化的冻干工艺用于核酸恒温扩增反应的缓冲液、激活剂等辅助试剂混合、冻干，获得了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂。该冻干辅助制剂与冻干前的液体试剂具有相同的活性，并且能够常温运输和储存、保质期长，也避免了冻融对辅助试剂活性的影响。另外，所述冻干辅助制剂可按多份量配置，再分装呈单份冻干，配液误差小、使用方便，对反应体系复杂且微量的恒温扩增反应体系具有重要意义。
附图说明
图1含不同浓度海藻糖、棉籽糖和甘油的冻干反应辅助试剂进行酶促重组扩增SARS CoV 2假病毒检测结果。
图2对比例1-4中的冻干小球外观，a：对比例1，b：对比例2，c：对比例3，d：对比例4。
图3用不同冻干辅助试剂(冻干保护剂或冻干赋型剂不同)进行酶促重组扩增SARSCoV 2假病毒的检测结果，1：实施例1中A4组；2：对比例1；3：对比例2；4：对比例3；5：对比例4
图4不同浓度海藻糖、棉籽糖和甘油组合下的冻干小球形态。
图5冻干辅助试剂的冻干小球分装到8联PCR反应管。
图6利用冻干辅助试剂和液态的辅助试剂体系进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒的对比图，A1、A2模板上样量为3000拷贝假病毒；A3、A4模板上样量为300拷贝假病毒；A5、A6模板上样量为30拷贝假病毒；A7、A8为阴性对照(模板为无菌水)；A1、A3、A5、A7使用液态的辅助试剂体系，A2、A4、A6、A8使用冻干辅助试剂。
图7利用300拷贝的SARS CoV 2假病毒进行冻干反应辅助试剂稳定性验证，A1:300拷贝模板(-20℃，7天)；A2:300拷贝模板(37℃，7天)；A3:300拷贝模板(-20℃，14天)；A4:300拷贝模板(37℃，14天)；A5:300拷贝模板(-20℃，28天)；A6:300拷贝模板(37℃，28天)A7:阴性对照(无菌水)；A8:阴性对照(无菌水)。
图8利用30拷贝的SARS CoV 2假病毒进行冻干反应辅助试剂稳定性验证，A1:30拷贝模板(-20℃，7天)；A2:30拷贝模板(37℃，7天)；A3:30拷贝模板(-20℃，14天)；A4:30拷贝模板(37℃，14天)；A5:30拷贝模板(-20℃，28天)；A6:30拷贝模板(37℃，28天)；A7:阴性对照(无菌水)；A8:阴性对照(无菌水)。
图9利用冻干辅助试剂检测草鱼呼肠孤病毒质粒DNA结果，A1：模板为10,000拷贝质粒DNA；A2：模板为1,000拷贝质粒DNA；A3：模板为200拷贝质粒DNA；A4：模板为50拷贝质粒DNA；A5：模板为20拷贝质粒DNA；A6：模板为10拷贝质粒DNA；A7：模板为5拷贝质粒DNA；A8：阴性对照(无菌水)。
图10线色法虾白斑综合症病毒检测结果，奇数：采用液态反应辅助试剂体系，偶数：冻干反应辅助试剂体系；1、2模板上样量为1000拷贝；3、4模板上样量为100拷贝；5、6模板上样量为20拷贝；7、8模板上样量为10拷贝；9、10模板上样量为5拷贝；11、12模板上样量为2拷贝；13、14模板上样量为1拷贝；15、16为阴性对照。
图11琼脂糖电泳法虾白斑综合症病毒检测结果，奇数：采用液态反应辅助试剂体系；偶数：冻干反应辅助试剂体系；试验采用的模板为虾白斑综合症病毒基因组DNA；其中1、2模板上样量为1000拷贝；3、4模板上样量为100拷贝；5、6模板上样量为10拷贝；7、8模板上样量为5拷贝；9、10模板上样量为2拷贝；11、12为阴性对照(模板为水)；M为DL10,000DNAMarker。
具体实施方式
本发明提供了用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂。该冻干辅助试剂由包含缓冲液或保护成分、核酸扩增原料、激活盐、冻干赋形剂或冻干保护剂的混合溶液(即辅助试剂体系)冻干而成。
冻干指真空冷冻干燥，是将含水物料冷冻呈固体，在低温低压条件下利用水的升华性能，使水升华呈气体除去从而实现脱水。将含水物料直接放入冻干机中冻干，往往会存在冻干损失的情况，如中国专利201710779133.7中一般冻干工艺下水蛭粗提取的活性损失率达45％左右，该专利提供的优化的冻干工艺的活性损失率也达15％左右。另外，在冻干过程中，也容易发生活性丧失的情况。特别地，本申请的辅助试剂体系中包含多种不同类别的组分，冻干过程即需要保证各组分冻干完全，又要使其冻干后与冻干前的活性或作用不变，如何进行辅助试剂体系的冻干是一大技术难题。
为了解决该问题，发明人在冻干保护剂或冻干赋形剂的选择上进行了大量研究，包括具体化合物及其组合的选择、化合物的浓度配比等等，发现：海藻糖、棉籽糖和甘油三者组合具有最好的冻干保护效果。优选地，辅助试剂体系中海藻糖、棉籽糖和甘油的质量百分比分别为6.0％～7.0％海藻糖、1.5％～3.0％棉籽糖和1.0％～3.0％甘油，最优为6.5％海藻糖、2.0％棉籽糖和2.0％甘油。
进一步地，发明人对冻干实验步骤进行了优化。通过大量实验、对冻干的条件和程序进行了多次对比研究。在此过程中，发明人意外发现，将混合溶液以液滴形式滴入液氮中，液滴能迅速凝固呈固体小球，该小球状的液滴和液态的液滴活性相同，几乎没有溶液或活性损失的情况。恒温扩增反应的体系的总体积小，如中国专利2021111345492.4中ERA(enzymatic recombinase amplification，酶促重组扩增)和中国专利202110922434.7中RPA的反应体系的总体积均为50μl，中国专利202111395102.4中RT-qRPA体系的优选的总体积为15～50μl。因此，该小体积的溶液正好能形成液滴，滴入液氮后能迅速形成固体小球，即相当与一个固体小球为一份恒温扩增反应体系所需的辅助试剂的量。再将该小球于冻干机中冻干，可以有效降低冻干损失。
在一些方式中，所述混合溶液的冻干包括以下步骤：
S1将所述混合溶液滴入液氮中，液滴在液氮中迅速凝固成小球；
S2将步骤S1的小球置于冻干机中冻干。
优选地，冻干机的冻干程序为：-45℃，0帕，1小时；-40℃，1帕，6小时；-30℃，1帕，20分钟；-20℃，1帕，20分钟；-10℃，1帕，20分钟；0℃，1帕，90分钟；10℃，1帕，30分钟；20℃，1帕，30分钟；25℃，1帕，1小时。
以下的具体实施例中以酶促重组扩增技术和环介导等温扩增技术的冻干辅助制剂为例对本发明进行详细说明，至于其他类别的恒温扩增技术，其辅助试剂的具体组成虽然存在一定差异，但辅助试剂中各组分类别是类似的，其冻干处理的方法或技术思想是相同的，故在此不一一列举。
酶促重组扩技术(enzymatic recombinase amplification，ERA)，是属于等温核酸扩增技术RPA的又一分支，其原理与RPA类似，主要依靠三种酶：能结合单链核苷酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白SSB和具有链置换活性的DNA聚合酶，在等温条件(37-42℃)下，重组酶与引物结合形成复合体，寻找双链DNA上的同源序列，一旦序列匹配，就可以发生链置换反应并启动DNA的合成，实现靶标DNA的指数扩增，而被替换的DNA链与SSB蛋白结合，阻止进一步替换。
用于酶促重组扩增技术时，本申请提供了一种除部分核算扩增原料以外的所述辅助制剂的配方，如下：
该配方为本申请优化获得的最优的酶促重组扩增技术的辅助制剂配方，按该配方配制成混合溶液，再分装冻干，其冻干活性损失最小，甚至无活性损失。
在用酶促重组扩增技术扩增具体的核酸时，需要添加对应的核酸扩增原料，包括引物、探针、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。将核酸扩增原料添加至按上表的配方配置的混合溶液中，再分装冻干，即可获得用于某一核酸进行酶促重组扩增的冻干辅助试剂。使用时，将该核酸用的冻干辅助试剂与样本、酶溶液或者冻干酶粉混合即可进行酶促重组扩增，进行该核酸的扩增和后续检测。
在一些方式中，用酶促重组扩增技术检测草鱼呼肠孤病毒GCRV VP7，将GCRV VP7质粒DNA模板的特异引物及荧光探针添加至上表的配方中，配置成溶液，冻干，即可获得用于酶促重组扩增技术检测草鱼呼肠孤病毒GCRV VP7的冻干辅助试剂。
同样，用酶促重组扩增技术检测SARS CoV 2假病毒、嗜水气单胞菌时，将各自的特异性引物和荧光探针加至上表的配方中，配置成溶液，冻干，即可获得各自用于酶促重组扩增技术的冻干辅助试剂。
进一步，本申请对冻干辅助试剂进行了评价，包括扩增性能和稳定性，结果发现：通过冻干辅助试剂进行酶促重组扩增的性能与冻干前的混合溶液相似；将冻干辅助试剂在37℃下放置28天再进行酶促重组扩增仍能保持很高的活性。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，60～65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10^9～10^10倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。
用于环介导等温扩增技术时，本申请提供了一种如下所示的辅助试剂配方。
名称 浓度
dNTP 400μM
甜菜碱 1M
三羟甲基氨基甲烷-盐酸 20mm
氯化钾 10mm
硫酸铵 4mm
曲拉通X-100 0.1％
海藻糖 6.5％
棉籽糖 2.0％
甘油 2.0％
该配方适用于环介导等温扩增技术，按该配方配制成混合溶液，再分装冻干，其冻干活性损失最小。
在一些方式中，用环介导等温扩增技术检测虾白斑综合症病毒，将虾白斑综合症病毒核酸检测用的特异性内引物、外引物添加至上表的配方中、配置成混合溶液，分装冻干，即可获得用于环介导等温扩增检测虾白斑综合症病毒的冻干辅助试剂。
通过将恒温扩增反应中除酶和样品以外的各种辅助试剂按所需比例混合(即所述包含冲液或保护成分、核酸扩增原料、激活盐、冻干赋形剂或冻干保护剂的混合溶液或辅助试剂体系)，然后冻干(即获得所述冻干辅助试剂)。同时，可以先按大量恒温扩增反应所需的比例配置所述混合溶液，再分装，如按单份反应所需的量进行分装，然后冻干。这样，称量、配液的误差小，在配好混合溶液的时候也可以取少量混合溶液确认配置是否精准，后续再使用的时候取单份冻干试剂即可。另外，本申请对冻干过程需要使用的冻干保护剂或冻干赋形剂的组成以及冻干步骤进行了优化，使辅助试剂体系在冻干前后具有相同的活性。综上，本发明的冻干辅助试剂即方便存储运输，有效解决低温储存和运输问题，又能有效减少配液误差，提高恒温扩增反应的准确性。同时，本发明还解决了辅助试剂体系的冻干难题，保证了最终获得的冻干辅助试剂的活性和稳定性。
下面通过具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1酶促重组扩增技术检测SARS CoV 2假病毒的冻干辅助试剂及过程
配置用于酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒的冻干辅助试剂并进行酶促重组扩增。
(1)SARS CoV 2病毒核酸检测引物及探针为：
上游引物CoVS-F：5’-TGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTT-3’；
下游引物CoVS-R：5’-TCTGAGAGAGGGTCAAGTGCACAGTCTAC-3’；
荧光探针：CoVS-PB：5’-CTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCC(FAM-dT)(THF)G(BHQ1-dT)GATTCTTCTTCAGG-3’(C3-SPACER)。
(2)用于酶促重组扩增技术检测SARS CoV 2假病毒的辅助试剂体系如下表1。其中，海藻糖、棉子糖和甘油为冻干保护剂或冻干赋形剂，其具体浓度如下表2。按表1和表2分别配置混合溶液，按单份酶促重组扩增反应所需的量分装(50μl)、冻干，得编号分别为A1-A8的冻干辅助试剂。
表1 SARS-CoV-2假病毒的辅助试剂体系
表2各组海藻糖、棉子糖和甘油的浓度
组别编号 海藻糖(％) 棉籽糖(％) 甘油(％)
A1 5.0 1.0 1.0
A2 6.0 1.0 1.0
A3 6.0 1.5 1.0
A4 6.5 2.0 2.0
A5 7.0 3.0 3.0
A6 7.5 4.0 6.0
A7 8.0 5.0 8.0
A8 8.5 6.0 10.0
(3)检测过程
步骤1：按照表3配置样本裂解液，取5μl充分混匀的SARS-CoV-2假病毒样本加入到样本裂解液中，充分混匀，室温静置5分钟，得样品溶液；
表3样本裂解液组分
组分 浓度
三羟甲基氨基甲烷-盐酸 50mM
氯化钠 20mM
吐温-100 2％
步骤2：分别取1份编号A1至A8的冻干辅助试剂至反应管中，按下表4配置酶促重组扩增检测SARS-CoV-2假病毒样反应体系(50μl)，上下颠倒使其充分溶解并混匀；
表4酶促重组扩增检测SARS-CoV-2假病毒的反应体系
步骤3：将反应管放入荧光恒温扩增仪(先达基因，型号GS8)进行检测，反应温度：40℃，反应时间：25min。
(4)检测结果
结果如图1，由图可知，A1-A8组中：A3、A4、A5的酶促重组扩增的结果呈“S”型且荧光强度高，A1和A2组的扩增曲线成不规则“S”型，A6-A8组的荧光强度较低。该结果说明A3、A4和A5组的扩增效果更好，尤其是A4组的荧光强度明显高于其他各组，扩增效果最优。
对比A1-A8组的差异，上述结果说明，由海藻糖、棉子糖和甘油组成的冻干保护剂或冻干赋形剂中的海藻糖、棉子糖和甘油的浓度过高或者过低均会对冻干辅助试剂产生影响。其浓度过低时，可能是由于冻干保护剂或冻干赋形剂未能很好的发挥冻干保护作用，使液态的辅助试剂体系在冻干的过程中被破坏，导致活性降低；其浓度过高时，可能是由于冻干保护剂或冻干赋形剂浓度太高，影响了恒温扩增反应过程，也可能是高浓度时冻干保护的作用反而会下降；此外，海藻糖、棉子糖和甘油三者的之间的比例对冻干保护剂或冻干赋形剂的功能也会产生影响，其具体的原因仍有待进一步研究。值得注意的是，在制备酶促重组扩增技术检测SARS CoV 2假病毒的冻干辅助试剂时，优选地，辅助试剂体系含有6.0％～7.0％海藻糖、1.5％～3.0％棉籽糖和1.0％～3.0％甘油，最优为6.5％海藻糖、2.0％棉籽糖和2.0％甘油。
对比例1
辅助试剂体系的冻干保护剂或冻干赋形剂为海藻糖、葡萄糖和DMSO，分别为6.5％、2.0％、2.0％，其他同实施例1，分装、冻干(图2a)。
对比例2
辅助试剂体系的冻干保护剂或冻干赋形剂为海藻糖、丙氨酸和DMF，分别为6.5％、2.0％、2.0％，其他同实施例1，分装、冻干(图2b)。
对比例3
辅助试剂体系的冻干保护剂或冻干赋形剂为葡萄糖、糊精和甘油，分别为6.5％、2.0％、2.0％，其他同实施例1，分装、冻干(图2c)。
对比例4
辅助试剂体系中不添加冻干保护剂或冻干赋形剂(即无海藻糖、棉籽糖和甘油)，其他同实施例1，分装，冻干(图2d)。
取实施例1中组A4冻干辅助试剂、对比例1-4冻干获得的冻干辅助试剂体，分别按实施例1的方法进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒的实验，实验结果如图3。由图中结果可知，在进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒的实验时，组A4的荧光强度最高，对比例4的荧光强度最低。该结果说明，不添加冻干保护剂或赋形剂时，辅助试剂体系经过冻干过程后，其活性会明显降低；相对于对比例1-3中的组合，A4组的荧光强度更高，说明A4组的冻干辅助试剂活性最高，可能由海藻糖、棉籽糖和甘油组成的冻干保护剂或冻干赋形剂具有最好的冻干保护效果，而对比例1-3的组合的冻干保护效果较差。
此外，取对比例1至对比例3中的液态的辅助试剂体系和冻干后的辅助试剂体系分别进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒的实验。与液态的辅助试剂体系相比，用冻干后的辅助试剂体系进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒的实验时，其荧光强度较低，进一步说明对比例1-3中的冻干保护剂或冻干赋形剂不能起到很好的冻干保护作用。
实施例3冻干方法
步骤1：配置液态的辅助试剂体系(混合溶液)，如按实施例1的配方。
步骤2：取混合溶液按单份反应体系的量，按50μl体积(或单份恒温扩增反应所需的量)滴入装有液氮的保温杯中，液滴在液氮中迅速凝固成小球；
步骤3：收集凝固的小球并放入预冷的冻干机中(型号：新芝PI8070)进行冻干，冻干反应条件与程序如表5，冻干反应结束后，在氮气环境下封装。
表5冻干条件与程序
步骤4：经过上述步骤处理后，辅助试剂体系被冷冻干燥为冻干小球。
值得注意的是，按实施例1中A1组至A8组配制的液态的辅助试剂体系经冻干后获得的冻干小球形态(图4)存在一定的差异，具体如下表6。
表6冻干小球形态及冻干损失情况
备注：冻干损失率＝(理论重量-实际重量)/理论重量×100％。
由表6中结果可知，组A6的冻干小球外观最佳，呈规则的圆球状、表面光滑。对于冻干小球来说，形状越规则，则表面积越大，在低温冻干的过程中越容易使水分升华，有利于充分冻干；表面光滑，则说明冻干小球表面粉末少，本领域的人员知道在冻干的过程中是需要抽真空的，存在粉末被抽走导致样品损失的情况，粉末越少的话，则冻干过程中样品损失越小。表中冻干小球形态为易碎、掉粉的组中(如A1组、A2组)，其冻干损失较多；而冻干小球形态为不规则、有气泡孔的组(如A7组、A8组)，由表中数据可知其冻干损失也大于形状较规则的A3-A5组，可能是由于其在冻干的过程易产生气泡，加大了冻干损失。组A4的冻干小球形状规则且表面光滑，并且冻干损失率低，说明组A4组的冻干效果较好。这也说明6.5％海藻糖、2.0％棉籽糖和2.0％甘油作为辅助实际体系中的冻干保护剂或冻干赋形剂在冻干过程中对维护小球的形态起到了一定作用，有利于辅助试剂体系的冻干，也进一步解释了组A4的冻干辅助试剂在进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒时为什么具有更高的活性。
此外，发明人将液态的辅助试剂体系(具体配方同组A4)没有经过液氮处理，取5000μl体积直接置于PCR管中，冻干，其最终固体的质量为190.3mg，冻干损失为(315.7-190.3)/315.7＝39.72％，明显高于上述先液氮处理凝固小球再置于冻干机中冻干的情况。
实施例2冻干前后的活性对比研究
同实施例2，取A4组的冻干辅助试剂(由含6.5％海藻糖、2.0％棉籽糖和2.0％甘油的辅助试剂体系冻干获得)置于8联管中(图5)，进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒，同时，取液态的辅助试剂体系(未冻干)进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒，比较冻干过程是否会对辅助试剂体系及酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒产生影响。
需要说明的是，这里的液态的辅助试剂体系(未经过冻干过程)中各组分的浓度在配制时是等比例的高于上述表1或表2的，使用的时候会与酶、样品等溶液进行混合，其浓度会降低，表1或表2的浓度为最终在酶促重组扩增检测SARS-CoV-2假病毒的反应体系中的终浓度(下同)。
实验结果如图6，由图可知，使用冻干辅助试剂和液态的辅助试剂体系进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒，其扩增曲线基本一致。说明冻干辅助试剂和冻干前液态的辅助试剂体系具有相同的作用，冻干过程不会影响SARS CoV 2假病毒的辅助试剂体系的活性。
实施例7冻干辅助试剂的稳定性考察
将实施例1中A4组的冻干辅助试剂分别置于-20℃和37℃下储存，分别于7天、14天和28天进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒的实验。
实验结果如图7和8所示，由图中结果，(a)随着时间增加，荧光强度呈递减趋势，说明冻干辅助试剂的活性呈下降趋势，这一趋势是可以预期的；(b)使用28天的冻干辅助试剂进行实验，荧光强度仍然很高，说明储存28天后，冻干辅助试剂仍然有效；(c)-20℃和37℃两种温度下的荧光强度基本相同，说明冻干辅助试剂在室温下储存和在低温下储存的效果相当，因此，可在室温下储存冻干辐射试剂。
此外，将液态的辅助试剂体系分别置于相同的-20℃和37℃下储存，在第7天时进行酶促重组扩增检测SARS CoV 2假病毒的实验，结果发现，其扩增60个循环的荧光强度值比使用冻干辅助试剂的低21％(-20℃)和73％(37℃)。
上述结果说明冻干辅助试剂比液态的辅助试剂体系具有更高的稳定性，能够在室温下进行较长时间的储存。
实施例4酶促重组扩增技术检测草鱼呼肠孤病毒GCRV VP7的冻干辅助试剂及过程
以草鱼呼肠孤病毒GCRV VP7的质粒DNA为模板，通过所述冻干辅助试剂进行酶促重组扩增。
(1)草鱼呼肠孤病毒GCRV VP7核酸检测引物及探针为：
上游引物GCRV-I-F：5’-CCCACGCCAACGTCAAGACCATTCAAGACTCC-3’；
下游引物GCRV-I-R：5’-TCCAATTCGTGATAGTCTACAGTACGGCTACC-3’；
荧光探针GCRV-I-PB：5’-CAAATGAAGCCATTCGCTCATTAGTCGAAG(Fam-dT)G(THF)G(BHQ1-dT)GACAAAGCGCAGACC(C3-SPACER)-3’
(2)辅助试剂体系：除上下游引物和荧光探针外，其余组分同实施例1中的组4，具体如下表7。
表7草鱼呼肠孤病毒GCRV检测的辅助试剂体系
(3)按表3将各组分混合配制成溶液，同实施例2的方法冻干。
(4)按下表8，取一份冻干辅助试剂，加入酶促重组扩增的酶体系、无菌水和样本，混匀，在荧光恒温扩增仪(先达基因，型号GS8)进行荧光检测。
表8促重组扩增反应检测草鱼呼肠孤病毒GCRV VP7的反应体系
(5)试验结果如图9所示，该结果表明：按表7配置的辅助试剂体系经分装冻干后获得的冻干辅助试剂能用于草鱼呼肠孤病毒GCRV VP7的酶促重组扩增。
实施例5酶促重组扩增技术检测嗜水气单胞菌的冻干辅助试剂及方法
(1)酶促重组扩增技术体系检测嗜水气单胞菌的引物探针如下：
上游引物AH-F：5’-CGGTTATGATGTCACCCTACGTTACGATAC-3’；
下游引物AH-R：5’-CACGGATTGCGACAGGGAGGTGGTGGTAGA-3’；
荧光探针AH-PB：5’-TCACCCTACGTTACGATACTGCCACCAAC(FAM-dT)G(THF)(BHQ1-dT)CCAAGACCAATACCTA-3’(C3-SPACER)。
(2)辅助试剂体系：除上下游引物和荧光探针外，其余组分同实施例1中的组4，具体如下表9。取各组分配制呈混合溶液，同实施例2的方法冻干(按100μl反应体系的量分装)。
表9嗜水气单胞菌检测的辅助试剂体系
名称 浓度(mM)
上游引物AH-F 0.42mM
下游引物AH-R 0.42mM
荧光探针AH-PB 0.12mM
三羟甲基氨基甲烷-醋酸PH8.0 30mM
KAc 100mM
MgAc 14mM
PEG20000 5％
ATP 2mM
CP 20mM
咪唑 20mM
dNTP(25mM each) 0.45mM
海藻糖 6.5％
棉籽糖 2％
甘油 2％
(3)检测过程
步骤1：按下表10配置样本裂解液，吸取10μl嗜水气单胞菌培养液(106cfu/ml)至90μl样本裂解液中进行裂解，并利用样本裂解液稀释。
表10样本裂解液组分
组分 浓度
三羟甲基氨基甲烷-盐酸 50mM
氯化钠 20mM
吐温-100 2％
步骤2：配制酶促重组扩增反应体系(100μl反应体系)，如表11，以不同稀释倍数的嗜水气单胞菌裂解液为模板进行测试，以无菌水为阴性对照；
表11优化后New ERA扩增体系
步骤3：将反应管放入恒温核酸扩增分析仪(先达基因，型号：GD-100B)中，启动检测，10分钟后采集ROX通道终点荧光值，
(3)检测结果
结果如表12所示，该结果表明上述经冻干后的辅助试剂体系仍然适用于酶促重组扩增检测嗜水气单胞菌。
表12检测结果终点法
实施例6环介导等温扩增技术(LAMP)检测虾白斑综合症病毒的冻干辅助试剂及方法
本实施例以虾白斑综合症病毒基因组DNA为测试模板进行冻干辅助反应体系的功能验证并与液态反应辅助试剂体系进行对比。
(1)虾白斑综合症病毒核酸所采用的LAMP引物序列如下：
内引物WSSV-FIP：CGCATATTTCCCTCTATCGCTATTATTTTTTAGCACAGATTTTTTGAT；
内引物WSSV-BIP：GGTCTGAAATATACATGGGTGCCTTTTTGAAAATGGGGTTTACGACAA；
外引物WSSV-F3：GGTAAAGGAACGTTTTGTTG；
外引物WSSV-B3：GCAATGGGAATGATAACTCTT。
(2)按下表13配置虾白斑综合症病毒检测的辅助试剂体系(冻干保护剂或冻干赋形剂与实施例1相同)，同实施例2的方法按20μl反应体的量分装、冻干，获得用于环介导等温扩增技术(LAMP)检测虾白斑综合症病毒的冻干辅助试剂。
表13虾白斑综合症病毒检测的辅助试剂体系
(3)按下表(表中浓度为各组分在LAMP扩增反应体系的终浓度)配置不加冻干保护剂或冻干赋形剂的液态的辅助试剂体系(记为液体辅助试剂体系)。
表14虾白斑综合症病毒检测的液体辅助试剂体系
反应试剂 终浓度
内引物FIP 0.8μM
引物BIP 0.8μM
外引物F3 0.1μM
外引物B3 0.1μM
dNTP 400μM
甜菜碱 1M
三羟甲基氨基甲烷-盐酸 20mM
氯化钾 10mM
硫酸铵 4mM
曲拉通X-100 0.1％
(4)检测过程
①取一份冻干辅助试剂，加入19μl水和样品，以及1μl(浓度：20U/μl)Bst2.0 DNA聚合酶大片段(NEB，货号：#M0275S)，配置LAMP扩增反应体系。
②将液体辅助试剂体系、样品以及1μl(浓度：20U/μl)Bst2.0 DNA聚合酶大片段(NEB，货号：#M0275S)混合，配置LAMP扩增反应体系。
进行LAMP扩增，观察显色变化，显色染料为SYBR green I，紫外光照射下发出绿色荧光的为阳性、为发出绿色荧光的为阴性。将试剂置于恒温金属浴中进行反应，反应温度65℃，反应时间60分钟。反应结束后，将反应管置于紫外灯下观察荧光显色变化，若反应管显示绿色荧光，而阴性对照无显色变化，则表明待测样本含虾白斑综合症病毒基因，若待测样本和阴性对照的反应管都不显示荧光，则表明待测样本不含有虾白斑综合症病毒基因。
(5)检测结果
结果如图10和11所示，图中采用液体反应辅助试剂和冻干辅助试剂的进行LAMP扩增反应的结果相同，该结果表明，冻干辅助试剂能应用于环介导等温扩增技术(LAMP)检测虾白斑综合症病毒，且与液体反应辅助试剂具有相同的效果。此外，也说明海藻糖、棉籽糖和甘油对辅助试剂体系在发挥冻干保护作用的同时，对LAMP不会产生影响。
应当理解，上述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡是在本发明的技术思想下，在技术方案基础上所做的改动，均在本发明的保护范围之内。本发明中用到的物料和试剂等除特许说明外，均可从商业途径获得。

Claims (10)

1.用于核酸恒温扩增反应的冻干辅助试剂，其特征在于，所述冻干辅助试剂由包含缓冲液或保护成分、核酸扩增原料、激活盐、冻干赋形剂或冻干保护剂的混合溶液冻干而成。
2.如权利要求1所述的冻干辅助试剂，其特征在于，所述冻干赋形剂或冻干保护剂由海藻糖、棉子糖和甘油组成。
3.如权利要求2所述的冻干辅助试剂，其特征在于，海藻糖、棉子糖和甘油占所述混合溶液的质量百分比分别为6.0％～7.0％、1.5％～3.0％和1.0％～3.0％。
4.如权利要求2所述的冻干辅助试剂，其特征在于，海藻糖、棉子糖和甘油占所述混合溶液的质量百分比分别为6.5％、2.0％和2.0％。
5.如权利要求1所述的冻干辅助试剂，其特征在于，所述混合溶液的冻干包括以下步骤：
S1将所述混合溶液滴入液氮中，液滴在液氮中迅速凝固成小球；
S2将步骤S1的小球放入冻干机中，冻干程序为：-45℃，0帕，1小时；-40℃，1帕，6小时；-30℃，1帕，20分钟；-20℃，1帕，20分钟；-10℃，1帕，20分钟；0℃，1帕，90分钟；10℃，1帕，30分钟；20℃，1帕，30分钟；25℃，1帕，1小时。
6.如权利要求1所述的冻干辅助试剂，其特征在于，所述激活盐包括以下一种或多种盐离子：镁离子、镍离子、锰离子；
所述核酸扩增原料包括以下一种或多种：上游引物、下游引物、内引物、外引物、探针、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸；
所述缓冲液或保护成分包含以下一种或多种：三羟甲基氨基甲烷、钠离子、钾离子、氯离子、醋酸根离子、硫酸根离子；
所述冻干赋形剂或冻干保护剂包括以下一种或多种：海藻糖、棉籽糖、葡聚糖、糊精、聚乙二醇、甘露醇、甘油、丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸钠、牛血清蛋白、酪蛋白、曲拉通X-100、吐温-80、乙基苯基聚乙二醇-40、DMSO、DMF；
所述混合溶液还包括以下的一种或多种物质：二硫苏糖醇、磷酸肌酸、咪唑、腺嘌呤核苷三磷酸。
7.如权利要求1所述的冻干辅助试剂，其特征在于，所述核酸恒温扩增反应为酶促重组扩增反应，所述混合溶液由上下游引物、荧光探针、三羟甲基氨基甲烷-醋酸、乙酸钾、乙酸镁、聚乙二醇、ATP、磷酸肌酸、咪唑、dNTP、海藻糖、棉籽糖、甘油和水组成。
8.如权利要求1所述的冻干辅助试剂，其特征在于，所述核酸恒温扩增反应为环介导等温扩增反应，所述混合溶液由内外引物、dNTP、甜菜碱、三羟甲基氨基甲烷-盐酸、氯化钾、硫酸铵、曲拉通X-100、海藻糖、棉籽糖、甘油和水组成
9.一种通过权利要求1-8之一所述的冻干辅助试剂进行恒温扩增反应的方法，其特征在于，所述方法包括将样品、酶混合溶液或冻干酶粉和所述冻干辅助试剂混合进行恒温扩增反应。
10.一种核酸恒温扩增反应的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1-8之一所述的冻干辅助试剂。
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