JP6694318B2

JP6694318B2 - ヒト細胞の定量的検出方法

Info

Publication number: JP6694318B2
Application number: JP2016085962A
Authority: JP
Inventors: 里枝武田; 強石井
Original assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-04-22
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2020-05-13
Anticipated expiration: 2036-04-22
Also published as: JP2017192365A

Description

本発明は、非ヒト動物に投与したヒト細胞を検出する方法に関する。

近年、細胞を移植することによって治療を試みる再生医療が着目されている。このような細胞を含む治療剤であっても従来の医薬品と同様に安全性および有効性を担保するためインビボでの体内動態を調べる必要がある。そこで従来、標識処理をした細胞を投与し、当該標識物質を検出することでその分布を調べる方法が実施されているが、標識物質が引き起こす免疫拒絶など、体内動態への標識物質の影響を否定することができない。また、このような方法では、大規模な研究設備を必要とするほか、少量の細胞の残存を定量的にとらえることは難しいことから、ＰＣＲ法を利用した体内動態解析が試みられている。このようなＰＣＲ法を利用する場合、非ヒト動物へヒト細胞を投与することから、Ａｌｕ配列を利用することが提案されている（非特許文献１）。

Ａｌｕは、ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄｅｌｅｍｅｎｔ（ＳＩＮＥ）の一つであり、およそ６５００万年以上前からヒトゲノムへ挿入され、さらにこれらがコピーされることで、現在のヒトゲノムのおよそ１０%以上も占めている。また、Ａｌｕは、進化の過程でその配列が変化しており、３種のサブファミリー、ｏｌｄｅｒ（ＡｌｕＪｏ，Ｊｂなど）、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ（ＡｌｕＳｃ，Ｓｘ，Ｓｑなど）、およびｙｏｕｎｇｅｒ（ＡｌｕＹ，Ｙａ，Ｙｂなど）に分類される（非特許文献２）。

Ａｌｕに対するＰＣＲ法では非ヒト細胞で陽性反応が起こることを避けるため、ｙｏｕｎｇｅｒのＡｌｕでもさらに新しいサブファミリーであるＡｌｕ‐Ｙｄ６のみをＰＣＲ法により増幅して、ヒト細胞を検出する方法が提案されている（非特許文献３）。

しかし、Ａｌｕは、上述のとおりヒトゲノム内に多数の配列を有しているため、実験者のわずかな遺伝子でさえ試料に混入することで検出してしまい、感度が高すぎることが問題となっている。

ＭｃＢｒｉｄｅＣ，ｅｔａｌ，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．５：７‐１８，２００３．ＢａｔｚｅｒＭＡ，ｅｔａｌ，ＪＭｏｌＥｖｏｌ．４２：３‐６，１９９６．ＷａｌｋｅｒＪＡ，ｅｔａｌ，ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ．３１５：１２２‐１２８，２００３．

ゲノムＤＮＡを含む試料におけるＡｌｕ配列をＰＣＲ法により増幅し検出する場合、ヒト細胞を含まない陰性対照においても手技者のＤＮＡの混入等により陽性と判定してしまう可能性がある。そこで、陰性対照での偽陽性を抑制できるようＡｌｕを検出するＰＣＲ法を改良する必要がある。

本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、ＰＣＲ法によるＡｌｕの増幅量を適宜調節し、陰性対照での反応を抑制する検出方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーを用いることで、陰性対照での偽陽性を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、下記に関するものである：
［１］次の工程を含む、動物組織におけるヒト細胞を検出する方法；
（ｉ）ヒト細胞を投与した動物から単離した組織よりゲノムＤＮＡを含む試料を調製する工程、
（ｉｉ）Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーを用いたＰＣＲ法により前記工程（ｉ）で調製された試料に含まれるＡｌｕ‐Ｙｄ６配列を増幅する工程、および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で増幅されたＤＮＡを検出し、定量する工程。
［２］前記Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号４の塩基配列を含むプライマーと配列番号５の塩基配列を含むプライマーの組み合わせ、配列番号６の塩基配列を含むプライマーと配列番号３の塩基配列を含むプライマーの組み合わせ、配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号８の塩基配列を含むプライマーの組み合わせ、ならびに配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号１３の塩基配列を含むプライマーの組み合わせから成る群から選択されるいずれか一つの組み合わせである、［１］に記載の方法。
［３］前記Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号８の塩基配列を含むプライマーの組み合わせである、［２］に記載の方法。
［４］前記Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号７の塩基配列から成るプライマーと配列番号８の塩基配列から成るプライマーの組み合わせである、［３］に記載の方法。
［５］前記工程（ｉｉｉ）が、加水分解プローブを用いて行われる、［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記加水分解プローブが、配列番号１６の塩基配列、配列番号１９の塩基配列および配列番号２０の塩基配列から成る群より選択されるいずれか一つの配列を含む、［５］に記載の方法。
［７］前記加水分解プローブが、配列番号１６の塩基配列、配列番号１９の塩基配列および配列番号２０の塩基配列から成る群より選択されるいずれか一つの配列から成る、［６］に記載の方法。
［８］（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）において定量されたＤＮＡ量から、動物組織の単位量あたりに含まれるヒト細胞数を算出する工程
をさらに含む、［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［９］［１］から［７］のいずれかに記載の方法で検出されたＤＮＡ量から、動物組織の単位量あたりに含まれるヒト細胞数を定量する方法。
［１０］Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーを含んでなる、［１］から［９］のいずれかに記載の方法に用いるためのヒト細胞検出用キット。
［１１］前記Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号４の塩基配列を含むプライマーと配列番号５の塩基配列を含むプライマーの組み合わせ、配列番号６の塩基配列を含むプライマーと配列番号３の塩基配列を含むプライマーの組み合わせ、配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号８の塩基配列を含むプライマーの組み合わせ、ならびに配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号１３の塩基配列を含むプライマーの組み合わせから成る群から選択されるいずれか一つの組み合わせである、［１０］に記載のキット。
［１２］前記Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号８の塩基配列を含むプライマーの組み合わせである、［１１］に記載のキット。
［１３］前記Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号７の塩基配列から成るプライマーと配列番号８の塩基配列から成るプライマーの組み合わせである、［１２］に記載のキット。
［１４］ＤＮＡを検出する加水分解プローブをさらに含む、［１０］から［１３］のいずれかに記載のキット。
［１５］前記加水分解プローブが、配列番号１６の塩基配列、配列番号１９の塩基配列および配列番号２０の塩基配列から成る群より選択されるいずれか一つの配列を含む、［１４］に記載のキット。
［１６］前記加水分解プローブが、配列番号１６の塩基配列、配列番号１９の塩基配列および配列番号２０の塩基配列から成る群より選択されるいずれか一つの配列から成る、［１４］に記載のキット。
［１７］Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーを製造する方法。
［１８］前記Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号４の塩基配列を含むプライマーと配列番号５の塩基配列を含むプライマーの組み合わせ、配列番号６の塩基配列を含むプライマーと配列番号３の塩基配列を含むプライマーの組み合わせ、配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号８の塩基配列を含むプライマーの組み合わせ、ならびに配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号１３の塩基配列を含むプライマーの組み合わせから成る群から選択されるいずれか一つの組み合わせである、［１７］に記載の方法。
［１９］前記Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号８の塩基配列を含むプライマーの組み合わせである、［１８］に記載の方法。
［２０］前記Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーセットが、配列番号７の塩基配列から成るプライマーと配列番号８の塩基配列から成るプライマーの組み合わせである、［１８］に記載の方法。
［２１］［１７］から［２０］に記載のプライマーで増幅されるＤＮＡを検出するための加水分解プローブを製造する方法。
［２２］前記加水分解プローブが、配列番号１６の塩基配列、配列番号１９の塩基配列および配列番号２０の塩基配列から成る群より選択されるいずれか一つの配列を含む、［２１］に記載の方法。
［２３］前記加水分解プローブが、配列番号１６の塩基配列、配列番号１９の塩基配列および配列番号２０の塩基配列から成る群より選択されるいずれか一つの配列から成る、［２２］に記載の方法。

本発明によれば、ヒト細胞を動物に投与した後の動物組織における当該ヒト細胞を検出することが可能となる。また、当該方法に用いるヒト細胞検出用キットを提供することができる。さらに、本発明によれば、Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーを製造することができる。

図１は、各プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。図中「＋」は、ｈＭＳＣ‐ＤＮＡ溶液の結果を示し、「−」は、陰性対照の結果を示す。図２は、各プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。図中「＋」は、ｈＭＳＣ‐ＤＮＡ溶液の結果を示し、「−」は、陰性対照の結果を示す。

本発明は、次の工程を含む、動物組織におけるヒト細胞を検出する方法を提供する；
（ｉ）ヒト細胞を投与した動物から単離した組織よりゲノムＤＮＡを含む試料を調製する工程、
（ｉｉ）Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーを用いたＰＣＲ法により前記（ｉ）で調製された試料に含まれるＡｌｕ‐Ｙｄ６配列を増幅する工程、および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で増幅されたＤＮＡ量を検出する工程。

本発明の方法は、（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）において定量されたＤＮＡ量から、動物組織の単位量あたりに含まれるヒト細胞数を算出する工程
をさらに含むことができる。

本発明において、動物組織とは、ヒト細胞を投与された動物の組織を意味し、当該動物は、特に限定されないが、ヒトを除く哺乳動物である。ヒトを除く哺乳動物は、マウス、ラットまたはハムスターなどのネズミ目、ウサギなどのウサギ目、が挙げられるが、これらに限定されない。この他にも、ヒトを除く哺乳動物として、ネコ科（ネコ）、イヌ科（イヌ）を含む食肉目、ウシ科（ウシ）、ブタ科（ブタ）を含むウシ目、ウマ科（ウマ）を含むウマ目、サル目、セボイド目、シモイド目（サル）、または霊長目（猿人類）などが挙げられる。動物を用いた体内動態を検出する場合、マウスが好適に用いられる。また、組織は、臓器や器官を意味し、ヒト細胞の投与経路に依存して、所望の組織が適宜選択される。従って、本発明において、組織は、特に限定されないが、舌、咽喉頭、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、唾液腺、気管、肺、気管支、胸腺、脾臓、骨、心臓、腎臓、膀胱、精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、卵巣、子宮、腟、下垂体、甲状腺、副腎、脳（大脳、小脳、延髄または橋）、脊髄、筋肉、皮膚、乳腺、脂肪組織、血管および血液などが例示される。

本発明において、ヒト細胞とは、ヒト由来の細胞であれば、特に限定されないが、好ましくは、治療等のため対象への投与を予定された医薬用途の細胞である。従って、本発明の方法は、医薬用途のヒト細胞を動物へ投与した際の当該細胞の組織への分布を解析する方法である。このような医薬用途のヒト細胞は、ヒトから単離した細胞であってもよく、ヒトから単離した細胞を培養や遺伝子導入等により加工した細胞であっても良い。このような細胞として、特に限定されないが、多能性幹細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、間質細胞、神経細胞、内皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、またはこれらの前駆細胞等が例示される。

本発明において、動物組織からゲノムＤＮＡを含む試料の調製は、当業者に周知の方法を用いて行うことができる。組織からゲノムＤＮＡを含む試料を調製するためのキットは、タカラバイオ社、Ｑｉａｇｅｎ社、オメガバイオテック社、モーバイオラボラトリーズ社、プロメガ社、ジェンスクリプト社等から購入して用いることができる。

本発明において、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法に供する試料に含まれるゲノムＤＮＡの容量は、特に限定されないが、２５ｎｇ以上、５０ｎｇ以上、７５ｎｇ以上、１００ｎｇ以上、１２５ｎｇ以上、１５０ｎｇ以上、１７５ｎｇ以上または２００ｎｇ以上が例示される。微小量のヒト細胞の混入を検出できるとの観点から、より多くの容量のゲノムＤＮＡをＰＣＲ法に供することが有利であるが、より多くの容量のゲノムＤＮＡにてＰＣＲ法を行うことで、非ヒトゲノムＤＮＡを検出される非特異的な検出が起きる危険性が高くなる。一方、本発明では、後述の実施例に示されているとおり、Ａｌｕ‐Ｙｄ６を特異的に増幅するプライマーを用いた場合、１００ｎｇの動物組織から調製されたゲノムＤＮＡをＰＣＲ法へ供したところ非ヒト動物由来のゲノムＤＮＡを検出しないことが確認されていることから、少なくとも１００ｎｇの動物組織から調製されたゲノムＤＮＡをＰＣＲ法へ供することができる。

ＰＣＲ法に供する試料の調製にあたり、微小量の手技者の細胞またはＤＮＡ等が試料へ混入することは避けられない。このため、すべてのＡｌｕ配列を標的として検出する場合、コピー数が多いことから、感度が高くなり、陰性対照の試料に対しても偽陽性として検出されてしまう。そこで、検出に適したヒトゲノム中でのコピー数を有するＡｌｕサブファミリーを用いることで、偽陽性の検出を抑制するとの観点から、Ａｌｕ‐Ｙｄ６を標的として検出することが望ましい。

本発明において、Ａｌｕ‐Ｙｄ６とは、配列番号１に示される塩基配列を有する核酸または、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基またはそれ以上の置換が行われている核酸でもよく、例えば、当該配列に相補的な核酸に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の塩基配列を有する核酸も含まれる。また、Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーとは、配列番号１において連続する少なくとも５０塩基、連続する少なくとも６０塩基、連続する少なくとも７０塩基、連続する少なくとも１００塩基、連続する少なくとも１５０塩基、連続する少なくとも２００塩基、または連続する少なくとも２５０塩基、もしくは、それらの配列に実質的に同一な配列を有する核酸を増幅できるプライマーを意味する。好ましくは、配列番号１において連続する少なくとも１００塩基を増幅できるプライマーである。本発明において、実質的に同一な配列とは、当該配列に相補的な核酸に対してストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の配列であり、好ましくは、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％一致する配列である。

本発明において、プライマーは、ｐｒｉｍｅｒ３またはベクターＮＴＩ等のソフトウェアを用いて適宜選択でき、例えば、プライマーの配列において、Ｇ／Ｃ量が２０から８０％の領域内で選択される。なぜならば、Ｇ／Ｃ量がこれを越える領域は、加熱サイクルにおいて変性が起こらず、ＰＣＲ反応が効果的に進まない場合があるためである。この他にも、Ｇ／Ｃが多い配列は、反応効率の低下を招く、非特異的な相互作用を起こしやすいため、Ｇ塩基が４つ以上連続する配列を含むプライマーおよびプローブ配列は、一般的に避けられる。さらに、Ａ／Ｔが多い配列は、ＰＣＲにおいて推奨される融解温度を得るために、長いプライマーおよびプローブ配列が必要となる。従って、好ましいプライマーセットとして、例えば、配列番号４の塩基配列を含むプライマーと配列番号５の塩基配列を含むプライマー、配列番号６の塩基配列を含むプライマーと配列番号３の塩基配列を含むプライマー、配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号８の塩基配列を含むプライマーならびに配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号１３の塩基配列を含むプライマーから成る群から選択されるいずれか一つの組み合わせが挙げられる。より好ましいプライマーセットとして、例えば、配列番号４の塩基配列を含むプライマーと配列番号５の塩基配列を含むプライマー、配列番号６の塩基配列を含むプライマーと配列番号３の塩基配列を含むプライマーならびに配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号８の塩基配列を含むプライマーから成る群から選択されるいずれか一つの組み合わせが挙げられる。本発明においてプライマーは、１５塩基長から１００塩基長、好ましくは１５塩基長から５０塩基長、より好ましくは１６塩基長から３０塩基長の範囲を有するものが例示される。さらに好ましいプライマーとして、配列番号４の塩基配列から成るプライマーと配列番号５の塩基配列から成るプライマー、配列番号６の塩基配列から成るプライマーと配列番号３の塩基配列から成るプライマー、配列番号７の塩基配列から成るプライマーと配列番号８の塩基配列から成るプライマーならびに配列番号７の塩基配列から成るプライマーと配列番号１３の塩基配列から成るプライマーから成る群から選択されるいずれか一つの組み合わせ、もしくは、配列番号４の塩基配列から成るプライマーと配列番号５の塩基配列から成るプライマー、配列番号６の塩基配列から成るプライマーと配列番号３の塩基配列から成るプライマーならびに配列番号７の塩基配列から成るプライマーと配列番号８の塩基配列からなるプライマーから成る群から選択されるいずれか一つの組み合わせが挙げられる。本発明では、Ａｌｕ‐Ｙｄ６の検出感度が高いという観点から、配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号８の塩基配列を含むプライマーの組み合わせが好適に例示される。さらに好ましくは、配列番号７の塩基配列から成るプライマーと配列番号８の塩基配列から成るプライマーの組み合わせである。本発明において、プライマーの配列には、上述の配列と実質的に同一な配列も含有する。

本発明において、プライマーとして使用される核酸は、当業で公知の手法を用いて、化学的な合成、および／または酵素による核酸連結反応により調製できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（２００１）ａｎｄＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）を参照）。例えば、核酸は、天然のヌクレオチドや、分子の生物学的な安定性を向上させたり、ハイブリダイゼーション時の二本鎖の物理的安定性を向上させたりするように設計された様々な修飾ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート由来物、アクリジン置換ヌクレオチドなど）を用いて化学的に合成できる。核酸の産生に用いられる修飾ヌクレオチドとしては、例えば、５‐フルオロウラシル、５‐ブロモウラシル、５‐クロロウラシル、５‐ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４‐アセチルシトシン、５‐（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５‐カルボキシメチルアミノメチル‐２‐チオウリジン、５‐カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β‐Ｄ‐ガラクトシルケウオシン、イノシン、Ｎ６‐イソペンテニルアデニン、１‐メチルグアニン、１‐メチルイノシン、２，２‐ジメチルグアニン、２‐メチルアデニン、２‐メチルグアニン、３‐メチルシトシン、５‐メチルシトシン、Ｎ６‐置換アデニン、７‐メチルグアニン、５‐メチルアミノメチルウラシル、５‐メトキシアミノメチル‐２‐チオウラシル、β‐Ｄ‐マンノシルケウオシン、５´‐メトキシカルボキシメチルウラシル、５‐メトキシウラシル、２‐メチルチオ‐Ｎ６‐イソペンテニルアデニン、ウラシル‐５‐オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケウオシン、２‐チオシトシン、５‐メチル‐２‐チオウラシル、２‐チオウラシル、４‐チオウラシル、５‐メチルウラシル、ウラシル‐５‐オキシ酢酸メチルエステル、３‐（３‐アミノ‐３‐Ｎ‐２‐カルボキリプロピル）ウラシル、２，６‐ジアミノプリンが挙げられるが、特にこれらに限定されない。

本発明において、増幅されたＤＮＡ量の検出・定量は、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、またはデジタルＰＣＲを用いて行われても良い。当該ＰＣＲ法により検出・定量されるＤＮＡ量から、試料中に含まれる増幅対象となった配列のコピー数またはこれに準ずる値が数値として算出されるが、本発明において増幅対象となるＡｌｕ‐Ｙｄ６のコピー数は、ＰＣＲ法に供した試料中に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量と比例することから、本発明において、ＰＣＲ法で検出されるＤＮＡ量は、ヒトゲノムＤＮＡ量を意味する。なお、定量リアルタイムＰＣＲを用いる場合、ＤＮＡ量は、インターカレーティング色素または蛍光標識したプローブを用いて、蛍光強度として検出し、既知のヒトゲノムＤＮＡ量と当該蛍光強度の関係から予め作成した検量線に基づいて、ＰＣＲ法に供した試料中に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量を算出することができる。本発明においてインターカレーティング色素として、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ‐６０、ＳＹＴＯ‐６２、ＰＯＰＯ‐３、ＴＯＴＯ‐３、ＢＯＢＯ‐３、ＴＯ‐ＰＲＯ‐３、ＹＯ‐ＰＲＯ‐１、およびＳＹＴＯＸＯｒａｎｇｅが例示されるが、特にこれらに限定されない。増幅されたＤＮＡを特異的に検出するという観点から、好ましくは、蛍光標識したプローブを用いて検出する方法である。蛍光標識したプローブとして、蛍光部分と消光部分とを同一のプローブに有する複ラベルのプローブが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光は、プローブのハイブリダイズにより発せられ、このハイブリダイズは、複ラベルのオリゴヌクレオチドのステムループ構造の崩壊により消光部分を蛍光部分に近接する部位から外すことで検出できる。この他にも、増幅サイクルの間のタックＤＮＡポリメラーゼによるプローブの進行性の崩壊により、消光部分を蛍光部分から外すことで、蛍光が発せられる加水分解プローブが例示される。加水分解プローブとして、タックマンプローブ（登録商標）が例示される。本発明に用いられるプローブを標識する蛍光色素として、６‐ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＴＥＴ、ＣａｌＦＬＵＯＲＧｏｌｄ、ＣａｌＦＬＵＯＲＯｒａｎｇｅ、ＣａｌＦＬＵＯＲＲｅｄ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｑｕａｓａｒ５７０、Ｑｕａｓａｒ６７０、ＲＯＸ、テキサスレッドが挙げられ、消光剤としては、ＢＨＱ‐１、ＢＨＱ‐２、ＢＨＱ‐３、ＴＡＭＲＡが挙げられる。

本発明において、プローブとは、相補的な配列の標的核酸に結合（ハイブリダイゼーション）することができる核酸をいう。従って、プローブは、相補的な配列の標的核酸に結合することができれば、標的の核酸に対して完全な相補性を欠いてもよい。当該不適正塩基対の数は、ハイブリダイゼーション条件に依存する。プローブは、一本鎖または部分的に一本鎖、および部分的に二本鎖であってもよい。プローブの鎖は、標的配列の構造、組成、特性によって適宜決定される。本発明においてプローブの塩基長は、５〜５０塩基長、好ましくは５〜２５塩基長、より好ましくは８〜２０塩基長であるが、これらに限定はされない。一般に、プローブが長いほどハイブリダイゼーション効率が上昇し、感度は高くなり、短いほど感度は低くなるが、特異性が上昇する。本発明において好ましいプローブとして、配列番号１６の配列を含む核酸、配列番号１９の配列を含む核酸および配列番号２０の配列を含む核酸から成る群より選択されるいずれか一つの核酸が例示される。より好ましいプローブとして、配列番号１６の配列、配列番号１９の配列および配列番号２０の配列から成る群より選択されるいずれか一つの配列から成る核酸である。本発明において、プローブの配列には、上述の配列と実質的に同一な配列も含有する。ただし、プローブは、プライマーを用いて増幅されたＤＮＡに依存して検出できるとの観点から、例えば、配列番号６の塩基配列を含むプライマーと配列番号３の塩基配列を含むプライマーの組み合わせを用いた場合、プローブは、配列番号２０の配列を含む核酸であることが好ましく、配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号８の塩基配列を含むプライマーの塩基配列を含むプライマーの組み合わせ、または配列番号７の塩基配列を含むプライマーと配列番号１３の塩基配列を含むプライマーの組み合わせを用いた場合、プローブは、配列番号１６の配列を含む核酸、配列番号１９の配列を含む核酸および配列番号２０の配列を含む核酸から成る群より選択されるいずれか一つの核酸であることが好ましい。

上述の方法によって、試料中に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量が検出できるが、当該ヒトゲノムＤＮＡ量は、単位量あたりの動物組織に含まれるヒト細胞数に比例することから、動物組織の単位量あたりに含まれるヒト細胞数を算出することができる。算出にあたり、既知のヒト細胞数と検出されるヒトゲノムＤＮＡ量の関係から予め作成した検量線に基づいて、検出した試料中のヒトゲノムＤＮＡ量からヒト細胞数へと換算してもよく、または当業者に周知の通常のヒト細胞に含まれるヒトゲノムＤＮＡ量からヒト細胞数へと換算してもよい。従って、本発明は、動物組織の単位量あたりに含まれるヒト細胞数を定量する方法を提供することができる。さらに、ＰＣＲ法へ供する試料を調製するために用いた動物組織の量に基づいて、当該ヒト細胞数を補正することで、動物の組織に分布したヒト細胞数を算出することができる。従って、本発明を用いることで、ヒト細胞を投与した動物における当該細胞の組織分布を知ることができる。特に、ヒト細胞を静脈中に投与した場合、当該ヒト細胞が動物のどの組織にどれほどの数が到達し得るのかを検出することができる。この他にも、特定の動物組織に投与したヒト細胞が、他の組織へどれほど漏出し得るかを検出することもできる。このような検査は、ヒト細胞を有効成分として含む医薬品の安全性や有効性を考察するために重要である。

本発明は、さらに、上述したＡｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーを含んでなるヒト細胞検出用キットまたはヒト細胞の体内動態の検査キットを提供する。当該キットは、ゲノムＤＮＡを含む試料を調製する試薬、ＰＣＲ用の試薬、陽性対照試料、陰性対照試料または検量線作成用の試料等をさらに含んでもよい。ＰＣＲ用の試薬には、ポリメラーゼ、バッファー、上述のＤＮＡ検出用のプローブなどが含まれる。

さらに、当該キットは、本発明の方法の実施のための指示（すなわち、プロトコール）を含む指示書を備えていてもよい。指示書には、一般に、記載または印刷された紙が含まれるが、それらの指示を格納し、指示を使用者に伝えることができる電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学メディア（例えば、ＣＤＲＯＭ）等の任意のメディアであってもよい。メディアには、そのような指示書を提供するインターネットサイトのアドレスが含まれる。

以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

［実施例１］
試料調製
５×１０^５ｃｅｌｌｓのヒト脂肪由来幹細胞（Ｌｏｍｚａ）をＱＩＡａｍｐＤＮＡｍｉｃｒｏｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）用いてＤＮＡを抽出、精製し（ｈＭＳＣ-ＤＮＡ溶液という）、Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００を用いてＤＮＡ濃度を測定した。

プライマー
表１に記載のプライマーをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社またはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社へ製造依頼し、ＨＰＬＣ精製グレードを購入して用いた。

ＰＣＲ
ＥａｇｌｅＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘｗｉｔｈＲＯＸ（Ｒｏｃｈｅ）（５μＬ）、上述のＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌを０．９μＬ，終濃度：０．９μｍｏｌ／Ｌ）、上述のＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌを０．９μＬ，終濃度：０．９μｍｏｌ／Ｌ）を混和し、ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘを調製した。なお、プライマーの組み合わせとして、配列番号２と配列番号３（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ１）、配列番号４と配列番号５（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｓ）、配列番号６と配列番号３（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｍ）、配列番号７と配列番号８（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｌ）、配列番号９と配列番号１０（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ‐Ｙｄ８）、配列番号１１と配列番号１２（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ‐Ｙａ５）、および配列番号７と配列番号１３（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ‐Ｙｄ６）でそれぞれ示される塩基配列からなるプライマーセットを用いた。上述のｈＭＳＣ‐ＤＮＡ溶液（２ｎｇ／３．２μＬ）または陰性対照としてＨ_２Ｏ（ＰＣＲ‐ｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）（３．２μＬ）とＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（６．８μＬ）を９６ウェルホワイトプレートの各ウェル中で混和した（合計１０μＬ）。ＰＣＲ反応は、工程１として、９５℃で１０ｍｉｎを１ｃｙｃｌｅ、ならびに工程２として、９５℃，１５ｓｅｃ（Ｓｔｅｐ１）および６０℃，６０ｓｅｃ（Ｓｔｅｐ２）の２Ｓｔｅｐを４０ｃｙｃｌｅｓにてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いて行った。

得られたＰＣＲ産物へＬｏａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（バイオクラフト）を２μＬを添加し、２％のアガロースゲルを用いて電気泳動を行った。泳動後、イメージアナライザー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬａｓ４０００，ＧＥヘルスケアジャパン）を用いてゲルを撮影した。

その結果、ｈＭＳＣ‐ＤＮＡ溶液（＋）を添加したＰＣＲでは、いずれのプライマーセットを用いた場合でもバンドが検出された。一方、陰性対照（−）において、バンドが確認されなかったのはＡｌｕ‐Ｙｄ６のみであり、ｈＭＳＣ‐ＤＮＡ溶液と比較して陰性対照のバンドが薄いものはＡｌｕ１、Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｓ、Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐ＭおよびＡｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｌであった（図１）。

再度、Ａｌｕ‐Ｙｄ６、Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｌについて電気泳動を実施した結果、Ａｌｕ‐Ｙｄ６の陰性対照ではバンドが確認されなかった。Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐ＬについてもｈＭＳＣ‐ＤＮＡ溶液と比較して陰性対照のバンドの濃さが薄く、上述と同様の結果が得られた（図２）。

［実施例２］
試料調製
上述と同様にｈＭＳＣ‐ＤＮＡ溶液を調製した。

プローブ
５’末端にＦＡＭが標識された表２に記載のプローブをＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社またはＲｏｃｈｅ社より購入して用いた。

定量ＰＣＲ
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＰｒｏｂｅｓＭａｓｔｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）（１０ μＬ），ＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（１０ μｍｏｌ／Ｌを１．８ μＬ，終濃度：０．９ μｍｏｌ／Ｌ），ＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（１０ μｍｏｌ／Ｌを１．８ μＬ，終濃度：０．９ μｍｏｌ／Ｌ），およびプローブ（０．５ μＬ：Ａｌｕ１‐Ｐ、０．４８ μＬ：Ａｌｕ‐１Ｙｄ６‐Ｐ、０．４ μＬ：ＵＰＬ＃２、ＵＰＬ＃３０、ＵＰＬ＃３３、ＵＰＬ＃５１、ＵＰＬ＃７５およびＵＰＬ＃８７）へｈＭＳＣ‐ＤＮＡ溶液（２ｎｇＤＮＡ量）またはＨ_２Ｏ（ＰＣＲ‐ｇｒａｄｅ）を加えて合計２０ μＬとし、９６ウェルホワイトプレートの各ウェル中で混和した。なお、プライマーの組み合わせとして、配列番号２と配列番号３（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ１）、配列番号７と配列番号８（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｌ）、および配列番号７と配列番号１３（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ‐Ｙｄ６）を用いた。さらに、Ａｌｕ１については、半分の反応用量（合計１０ μＬ）についても用意した。ＰＣＲ反応は、工程１として、９５℃で１０ｍｉｎを１ｃｙｃｌｅ、工程２として、９５℃，１０ｓｅｃ（Ｓｔｅｐ１）、６０℃，５０ｓｅｃ（Ｓｔｅｐ２）および７２℃，１ｓｅｃ（Ｓｔｅｐ３）の３Ｓｔｅｐを４０ｃｙｃｌｅｓ、ならびに工程３として、４０℃，３０ｓｅｃを１ｃｙｃｌｅにてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いて行った。Ｃｐ値の算出には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩに付属のソフトウェアを用いた。Ｃｐ値の算出結果（Ｃｐ値）および工程２における４０ｃｙｃｌｅで検出された蛍光強度と１ｃｙｃｌｅで検出された蛍光強度の差（蛍光強度差）を表３に示す。

その結果、Ａｌｕ１については、陰性対照（Ｈ_２Ｏ）においてもＣｐ値が算出されることから、ヒト細胞の検出には不適切であることが示唆された。また、ｈＭＳＣ−ＤＮＡ溶液においてはＡｌｕ‐Ｙｄ６とＡｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｌでは、Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐ＬのＣｐ値の方が低く、より感度が高いとの理由により、Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｌが適していることが示唆された。さらに、プローブについては、ＵＰＬ＃２、ＵＰＬ＃５１、およびＵＰＬ＃７５を用いることで検出される蛍光強度が高く、プローブとしての検出感度が優れていることが確認された。以上より、配列番号７と配列番号８（ＰＣＲ産物名：Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｌ）をプライマーとして用い、ＵＰＬ＃２（配列番号１６）、ＵＰＬ＃５１（配列番号１９）、またはＵＰＬ＃７５（配列番号２０）にて検出する定量ＰＣＲがヒト細胞の検出に最適であることが確認された。

［実施例３］
ヒト試料調製
上述と同様にｈＭＳＣ‐ＤＮＡ溶液をヒトＤＮＡ溶液として調製した。

定量ＰＣＲ
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＰｒｏｂｅｓＭａｓｔｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）（１０ μＬ），ＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ（Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｌ‐Ｆ：配列番号７）（１０ μｍｏｌ／Ｌを１．８ μＬ，終濃度：０．９ μｍｏｌ／Ｌ），ＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒ（Ａｌｕ‐Ｙｄ６‐Ｌ‐Ｒ：配列番号８）（１０ μｍｏｌ／Ｌを１．８ μＬ，終濃度：０．９ μｍｏｌ／Ｌ），上述のプローブ（ＵＰＬ＃５１：配列番号１９）（０．４μＬ）およびＨ_２Ｏ（ＰＣＲ‐ｇｒａｄｅ）を混和し，リアルタイムＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘを調製した。後述の検量線用ヒトＤＮＡ溶液または各検体溶液（５ μＬ）とリアルタイムＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（１５ μＬ）を９６ウェルホワイトプレートの各ウェル中で混和した（合計２０ μＬ）。ＰＣＲ反応は、工程１として、９５℃で１０ｍｉｎを１ｃｙｃｌｅ、工程２として、９５℃，１０ｓｅｃ（Ｓｔｅｐ１）、６０℃，５０ｓｅｃ（Ｓｔｅｐ２）および７２℃，１ｓｅｃ（Ｓｔｅｐ３）の３Ｓｔｅｐを３５ｃｙｃｌｅｓ、ならびに工程３として、４０℃，３０ｓｅｃを１ｃｙｃｌｅにてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用いて行った。Ｃｐ値の算出と検量線の作成には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩに付属のソフトウェアを用いた。

ヒトＤＮＡ溶液での検量線の作成
ヒトＤＮＡ溶液を６濃度（２０、２、０．２、０．０２、０．００２または０．０００２ μｇ／ｍＬ）で調製した。当該検量線用ヒトＤＮＡ溶液を上述の定量ＰＣＲで測定した結果、表４に記載のとおり、０．００２ μｇ／ｍＬ（５μｌ中のＤＮＡ量として０．０１ｎｇ）の溶液についてもＤＮＡが検出されることが確認された。以上の結果より、本方法は５μｌ中のＤＮＡ量が０．０１ｎｇ以上の試料において検出可能であることが示唆された。以下の実施例では、当該検量線に従って反応液中のＤＮＡ量を算出した。

マウス組織ＤＮＡ溶液での測定
ＢＡＬＢ／ｃマウス雌雄各１匹からＥＤＴＡ‐２Ｎａ処理血液および表５に示す各組織を入手し、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（キアゲン）を用いて製造者プロトコールに従ってＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ濃度を測定し、適宜Ｈ_２Ｏ（ＰＣＲ‐ｇｒａｄｅ）を加えて２０、０．２、または０．００２ μｇ／ｍＬの濃度に調製し、マウス組織ＤＮＡ溶液を作製した。ただし、抽出したマウス組織ＤＮＡ溶液の濃度が２０ μｇ／ｍＬに満たなかったものは、最大濃度として、抽出したマウス組織ＤＮＡ溶液を調製せずそのまま用いた（すなわち、ＰＣＲに供したマウス組織ＤＮＡの最大量は、１００ｎｇ未満であった）。当該マウス組織ＤＮＡ溶液を上述の定量ＰＣＲで測定した結果、いずれも定量下限未満または検出限界以下であることが確認された。以上の結果より、本方法では、マウスＤＮＡを検出しないことが示された。

ヒトＤＮＡとマウス組織ＤＮＡの混合ＤＮＡ溶液での測定
主要組織（心臓、肺または肝臓）より同様にＤＮＡを抽出し、２５ｎｇ／μＬに調製したマウス組織ＤＮＡ溶液４ μＬを０．０１または１００ｎｇ／μＬの濃度のヒトＤＮＡ溶液１ μＬと混合したヒトＤＮＡとマウス組織ＤＮＡの混合ＤＮＡ溶液を調製した。当該ヒトＤＮＡとマウス組織ＤＮＡの混合ＤＮＡ溶液を上述のとおり定量ＰＣＲで測定した結果、以下の表６に記載のとおり、すべての検体でヒトＤＮＡを検出することができ、混入したヒトＤＮＡ量とＰＣＲの結果からの算出値は、ほぼ一致した。以上の結果より、マウスＤＮＡと混合しても、正確にヒトＤＮＡ量が検出できることが示された。

ヒトＤＮＡ混入マウス組織ＤＮＡ溶液での測定
凍結した主要組織（心臓，肺，肝臓）の一部（１５〜２０ｍｇ程度）へＡＴＬバッファーを入れ、ここへ２００、２０または２ｎｇ／μＬの濃度に調製したヒトＤＮＡ溶液を５ μＬ添加（ＤＮＡ量として１、０．１または０．０１ μｇ）し、上述と同様にＤＮＡの抽出を行い、２０ μｇ／ｍＬのヒトＤＮＡ混入マウス組織ＤＮＡ溶液を作製した（一部、２０ μｇ／ｍＬに満たないＤＮＡ溶液あり）。当該ヒトＤＮＡ混入マウス組織ＤＮＡ溶液を上述のとおり定量ＰＣＲで測定した結果、以下の表７に記載のとおり、ヒトＤＮＡを検出することができた。従って、細胞１個あたりのＤＮＡ量を６．７ｐｇと仮定すると、本方法を用いることで、採取した心臓に少なくとも１５００個程度のヒト細胞が分布すれば検出可能であることが示唆された。

Claims

次の工程を含む、動物組織におけるヒト細胞を検出する方法；
（ｉ）ヒト細胞を投与した動物から単離した組織よりゲノムＤＮＡを含む試料を調製する工程、
（ｉｉ）Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーを用いたＰＣＲ法により前記工程（ｉ）で調製された試料に含まれるＡｌｕ‐Ｙｄ６配列を増幅する工程であり、前記Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅するプライマーが、配列番号７の塩基配列から成るプライマーと配列番号８の塩基配列から成るプライマーの組み合わせであることを特徴とする工程、および
（ｉｉｉ）前記工程（ｉｉ）で増幅されたＤＮＡを検出し、定量する工程。
前記工程（ｉｉｉ）が、加水分解プローブを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
（ｉｖ）前記工程（ｉｉｉ）において定量されたＤＮＡ量から、動物組織の単位量あたりに含まれるヒト細胞数を算出する工程
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
前記加水分解プローブが、配列番号１６の塩基配列、配列番号１９の塩基配列および配列番号２０の塩基配列から成る群より選択されるいずれか一つの配列を含む、請求項２又は３に記載の方法。
Ａｌｕ‐Ｙｄ６配列を特異的に増幅する、配列番号７の塩基配列からなるプライマーと配列番号８の塩基配列からなるプライマーのプライマーセットを含んでなる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法に用いるためのヒト細胞検出用キット。
ＤＮＡを検出する加水分解プローブをさらに含む、請求項５に記載のキット。
前記加水分解プローブが、配列番号１６の塩基配列、配列番号１９の塩基配列および配列番号２０の塩基配列から成る群より選択されるいずれか一つの配列を含む、請求項６に記載のキット