CN107365769A - 一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用，所述鼓泡状引物为核酸单链结构，所述鼓泡状引物包括依次相连的四个部分：5p臂、通用序列、分子标签和3p臂；所述5p臂在鼓泡状引物的5’端，且在第一轮PCR反应中，根据碱基互补配对原则与模板序列结合；所述通用序列在第一轮PCR反应中，与模板DNA序列不互补而呈凸起的鼓泡状，且所述通用序列与第二轮PCR反应中的通用引物的3’端序列至少有一部分相同；所述分子标签由多个简并碱基组成；所述3p臂在鼓泡状引物的3’端，且根据碱基互补配对原则与模板序列结合。本发明鼓泡状引物大大的提高了测序数据的分析检测灵敏性，可以同时进行多个位点和多种类型的检测，检测灵敏度高、通量高、准确度高，适用于多种肿瘤的检测。

Description

一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及医学分子诊断及生物技术，涉及一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用。
背景技术
近10多年来，癌症的发病率明显上升，其中肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，5年生存率仅为16.8％，每年新确诊肺癌患者达到160万。同时肺癌也是癌症患者死亡的首要病因，每年有140万的人口死于肺癌。根据《2015年中国癌症统计》报道，预计2015年中国约有429.2万癌症新发病例，281.4万癌症死亡病例。其中。肺癌以新发病例73.3万例(占整体17.1％)、死亡病例61万例(占整体21.1％)，成为中国人罹癌或因癌致死的最大威胁。另外种族、家属史与吸烟对肺癌的发病均有影响。临床上对肺癌有一个简单的分法，将之分为小细胞肺癌(缩写SCLC)以及非小细胞肺癌(缩写NSCLC)。
小细胞肺癌约占所有肺癌病理类型中的15％，非小细胞肺癌约占所有肺癌病理类型中的85％。这两种类型的肺癌的治疗方案是截然不同的。小细胞肺癌患者主要用化学疗法治疗，外科手术治疗对这种类型肺癌患者并不起主要作用。但是，外科手术治疗对非小细胞肺癌患者来说确实是一个很重要的治疗手段。目前对于肺癌的检测包括X-射线扫描、CT、PET-CT、核磁共振、穿刺活检等，但是大于70％的患者确诊时已处于癌症晚期。肿瘤的治疗效果与肿瘤的早期发现有很大的关系，越早发现就越有可能治愈。
传统的肺癌治疗方式包括外科手术治疗、放疗和化疗等。外科手术治疗虽然可以切除肿瘤，但是手术过程中可能无法完全切除或引起肿瘤转移，还可能造成器官损伤及身体免疫力降低；化疗是一种全身性的治疗，效果明显和迅速，在某些肿瘤方面可以达到手术切除的效果，但放疗成本高，周期长，并发症也较多。靶向治疗，由于其毒性小，副作用少并且能够大大提升患者生存周期以及生活质量而得到广泛的应用。但与此同时，靶向药物的选择依赖于患者的基因分型，靶向药物往往有其对应的靶基因，当该基因发生突变时某条调控细胞增殖分裂的信号通路被持续激活，或者是调控细胞凋亡的信号通路被抑制，当使用相应的靶向药物之后，该通路被阻断，肿瘤细胞被杀死。
现有的肿瘤基因检测方法主要包括Sanger测序、QPCR、Fish、IHC等。CN 105969857A公开了一种非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法，该方法基于多重PCR和高通量测序技术开发出一种用于检测12个致癌基因的466个突变的方法，所述的致癌基因为AKT1、ALK、BRAF、EGFR、ERBB4、FGFR1、FGFR2、FGFR3、KRAS、MET、PIK3CA和PTEN，所述突变可以是一个或多个碱基的置换、插入和/或缺失。CN 103305625 A公开一种检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的方法及试剂盒与应用，该方法包括如下步骤：设计扩增非小细胞肺癌七种相关基因外显子区段的扩增引物，共15对，将扩增引物分组配制成扩增引物混合液，分为6组，使用扩增引物混合液分别对待检样品进行多重PCR扩增后进行酶消化；设计用于检测突变热点位点的延伸引物，共39条，将延伸引物分组配制成延伸引物混合液，对应于扩增引物混合液，也为6组，将前述消化后的PCR产物进行延伸反应，接着酶消化，得到的产物进行毛细管电泳，通过软件分析，作出结果判断。这些方法基本上都只能针对若干个已知的基因突变信息进行检测，具有检测基因的数量少，且敏感度低，实际需要DNA起始量大等缺点。病人使用某个试剂盒检测后，往往只能够对于有限的某几种药物进行指导。当有其他的用药需求时，还需要重新进行额外检测，并且Fish、IHC等方法对于实验人员操作要求较高。
因此，针对肿瘤的靶基因以及其驱动基因的检测技术的开发是应用靶向治疗的基础，研发一种为肿瘤早期诊断提供参考信息的检测技术迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供了一种鼓泡状引物及其应用，本发明鼓泡状引物大大的提高了测序数据的分析检测灵敏性，可以同时进行多个位点和多种类型的检测，检测灵敏度高、通量高、准确度高，适用于多种肿瘤的检测。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种鼓泡状引物(Bubble Primer)，所述鼓泡状引物为核酸单链结构，所述鼓泡状引物包括依次相连的四个部分：5p臂、通用序列、分子标签和3p臂；
所述5p臂在鼓泡状引物的5’端，且在第一轮PCR反应中，根据碱基互补配对原则与DNA模板序列结合；所述通用序列在第一轮PCR反应中，与模板序列不互补而呈凸起的鼓泡状，且所述通用序列与第二轮PCR反应中的通用引物的3’端序列至少有一部分相同；所述分子标签由多个简并碱基组成；所述3p臂在鼓泡状引物的3’端，且根据碱基互补配对原则与模板序列结合。
本发明中，所述鼓泡状引物包括正向鼓泡状引物和反向鼓泡状引物，所述正向鼓泡状引物和反向鼓泡状引物都是由所述四个部分组成，所述鼓泡状引物的结构为：正向鼓泡状引物：5p臂+通用序列+分子标签+3p臂；反向鼓泡状引物：5p臂+通用序列+分子标签+3p臂。
本发明中，所述3p臂、5p臂和通用序列本领域技术人员都可以根据需要检测的疾病的相关基因进行设计，随着需要检测的疾病的相关基因的不同，所述3p臂、5p臂和通用序列均不相同，若同一个疾病有多个相关基因要同时进行检测，可以设计多对鼓泡状引物从而实现一次性检测多个位点。根据本发明，所述鼓泡状引物中的5p臂的长度为16-30nt，例如可以是16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt或30nt，优选为20-25nt。
根据本发明，所述鼓泡状引物中的通用序列的长度为20-25nt，例如可以是20nt、21nt、22nt、23nt、24nt或25nt，优选为22-23nt。
根据本发明，针对不同疾病的检测，所述通用序列是固定的，在第二轮PCR反应中，所述通用序列结合到第一轮PCR扩增产物上，在DNA聚合酶的作用下进行延伸。根据本发明，所述通用序列为如SEQ ID NO.1-2所示的核酸序列，所述SEQ ID NO.1-2所示的核酸序列如下：
正向通用序列(SEQ ID NO.1)：5’-CGACATGGCTACGATCCGACTT-3’；
反向通用序列(SEQ ID NO.2)：5’-TAAGACCACTTGACCGTCAGCAT-3’。
根据本发明，所述所述分子标签的长度为3-10nt，例如可以是3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt或10nt，优选为7nt。
本发明中，所述分子标签有3-10个简并碱基N可以进行选择，其中N代表着A/T/C/G四种中的任一种，根据排列组合公式，可列出分子标签所对应的不同碱基序列排列方式有46-420种选择。如：分子标签为6个简并碱基N时，则有46中碱基排列方式，即4096个分子标签选择。由于是由多个简并碱基N组成，其分子标签排列方式便有多种选择，所述鼓泡状引物加上分子标签后仍然是简并的，但具体到每个引物，其具有特定的序列，保证了得到的每个原始模板在原始文库里都具有独一无二的分子标签序列，从而大大提高了测序数据分析的检测灵敏性。
根据本发明，所述鼓泡状引物中的3p臂的长度为5-15nt，例如可以是5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt，优选为8-15nt。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的鼓泡状引物用于制备肿瘤相关突变热点基因的检测试剂盒的应用。
根据本发明，所述肿瘤包括非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌或卵巢癌中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供一种用于检测非小细胞肺癌相关突变热点基因的鼓泡状引物，所述鼓泡状引物的正向引物如SEQ ID NO.3-74所示，所述鼓泡状引物的反向引物如SEQID NO.75-146所示。
本发明中，基于多重PCR技术进行的靶向文库制备，所采用的鼓泡状引物共72对，所述鼓泡状引物对的每对正向引物与反向引物对应的特异性序列分别为SEQ ID NO.m与SEQ ID NO.(m+72)，其中m为3-74中的任意整数，所述鼓泡状引物SEQ ID NO.3-146所示的核酸序列如下：
第四方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的鼓泡状引物和/或如第三方面所述的用于检测非小细胞肺癌相关突变热点基因的鼓泡状引物。
根据本发明，所述试剂盒还包括用于第二轮PCR反应的通用引物。
根据本发明，所述通用引物包括正向通用引物和反向通用引物。
根据本发明，所述通用引物的正向通用引物和反向通用引物的3’端序列分别与所述的鼓泡状引物的正向鼓泡状引物和反向鼓泡状引物中的通用序列至少部分相同。
本发明中，第二轮PCR反应中，正向通用引物和反向通用引物分别结合在第一轮PCR扩增产物中的通用序列处，以此作为第二轮PCR反应的起始点。
根据本发明，所述正向通用引物如SEQ ID NO.147所示，所述反向通用引物为SEQID NO.148-235的任意一种或至少两种的组合。
所述通用引物SEQ ID NO.148-235所示的核酸序列如下：
其中，划线部分序列为标签序列(barcode)，每一种样本使用一个标签序列标记，以便在构建混合测序文库时将每个样本进行区分。
本发明中，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包括PCR缓冲液、PfuTurbo Cx DNA聚合酶和纯水。
其中，所述PCR缓冲液包括10×PfuTurbo Cx缓冲液、dNTPs、二甲基亚砜、甜菜碱和硫酸镁；进一步优选地，；所述dNTPs是浓度为0.1Mm-25mM的dNTPs混合液；所述甜菜碱是摩尔浓度为1M-4M的甜菜碱溶液；所述二甲基亚砜是质量百分浓度为100％的二甲基亚砜；所述硫酸镁是摩尔浓度为1Mm-1M的硫酸镁溶液；所述DNA聚合酶为PfuTurbo Cx热启动DNA聚合酶。
第五方面，本发明提供一种文库的构建方法，采用如第一方面和/或第三方面所述的鼓泡状引物，包括如下步骤：
1)提取样本核酸；
2)第一轮PCR反应，捕获目的基因编码序列：以步骤(1)所述核酸为模板，采用所述鼓泡状引物进行第一轮PCR反应，获得第一轮PCR扩增产物；
3)纯化：纯化步骤2)获得的第一轮PCR扩增产物；
4)第二轮PCR反应，构建测序文库：以步骤3)纯化后的第一轮PCR扩增产物为模板，采用通用引物进行第二轮PCR反应，获得测序文库；
5)纯化：纯化步骤4)获得的测序文库。根据本发明，步骤1)所述的样本来自于人的外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓或肝脏中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述样本核酸的提取采用试剂盒进行提取，本申请采用石蜡样本提取试剂盒(MagPure FFPE DNA KF Kit)进行提取，提取后的DNA进行Nanodrop检测DNA的质量，所述提取后的基因组DNA的OD260/OD230＝1.8-2.5，所述提取后基因组DNA合格，可用于下一步PCR扩增。
根据本发明，步骤2)所述第一轮PCR反应为多重PCR反应。
根据本发明，步骤4)所述第二轮PCR反应为多重PCR反应。
优选地，步骤2)所述第一轮PCR反应中，加入的鼓泡状引物的终浓度为0.1-5nM，例如可以是0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1nM、1.2nM、1.3nM、1.4nM、1.5nM、1.6nM、1.7nM、1.8nM、1.9nM、2.0nM、2.1nM、2.2nM、2.3nM、2.4nM、2.5nM、2.6nM、2.7nM、2.8nM、2.9nM、3.0nM、3.1nM、3.2nM、3.3nM、3.4nM、3.5nM、3.6nM、3.7nM、3.8nM、3.9nM、4.0nM、4.1nM、4.2nM、4.3nM、4.4nM、4.5nM、4.6nM、4.7nM、4.8nM、4.9nM或5nM，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，步骤2)所述第一轮PCR中加入PfuTurbo Cx DNA聚合酶。
优选地，所述PfuTurbo Cx DNA聚合酶的终浓度为0.01-0.5U，例如可以是0.01U、0.02U、0.03U、0.04U、0.05U、0.06U、0.07U、0.08U、0.09U、0.1U、0.15U、0.2U、0.25U、0.3U、0.35U、0.4U、0.45U或0.5U，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，步骤2)所述的PCR反应的条件为：96-98℃4-10min，1循环；96-98℃0.5-1.5min、55-60℃15-30min、68-72℃1.5-3min，5-10个循环；68℃8-10min，1循环；保存在4-12℃。
优选地，步骤3)和步骤5)所述的纯化采用磁珠法进行。
根据本发明，步骤3)和步骤5)所述的纯化为本来领域的常规技术，所述纯化包括如下具体步骤：
(a)向步骤2)所述第一轮PCR扩增产物或步骤4)所述测序文库中加入体积比为1:(0.5-1)，优选为1:(0.8-0.9)的磁珠，混匀后静置4-10min，优选为5min，放置在磁力架上静置3-8min，优选为5min，弃上清液；
(b)向步骤(a)弃上清液后的磁珠中加入75％的乙醇，混匀后，静置3-8min，优选为5min，待溶液澄清后，弃上清液；优选地，步骤(b)重复2-4次，优选为2次；
(c)将步骤(b)弃上清液后的磁珠晾干，加入TE溶液溶解磁珠上吸附的DNA，取上清液即得纯化后的产物或文库。
根据本发明，所述磁珠为Ampure XP磁珠。
本发明中，经过步骤3)纯化步骤后，能够去除多余的鼓泡状引物对，还能够去除引物-引物二聚体，使得PCR扩增的特异性显著增强。
优选地，步骤4)所述第二轮PCR中，加入的通用引物的终浓度为200-1000nM，例如可以是200nM、210nM、230nM、250nM、280nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM、750nM、800nM、850nM、900nM、950nM或1000nM，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，步骤4)所述第二轮PCR反应的条件为：96-98℃4-10min，1循环；96-98℃0.5-1.5min、60-62℃0.5-1.5min、68-72℃1.5-3min，18-20个循环；68℃8-10min，1循环；保存在4-12℃。
优选地，所述构建方法还包括步骤6)单链环化：将步骤(5)获得的所述测序文库进行变性，获得核酸单链文库，并将所述核酸单链文库进行环化，获得单链环状文库。
优选地，所述环化具体步骤为利用介导片段实现所述核酸单链文库的环化。
优选地，所述介导片段具有相应互补序列用于连接核酸单链的两端。
作为优选技术方案，所述非小细胞肺癌相关突变热点基因的文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)提取样本核酸；
(2)第一轮PCR反应，捕获非小细胞肺癌相关突变热点基因的编码序列：以步骤(1)所述核酸为模板，采用所述鼓泡状引物进行第一轮PCR反应，获得第一轮PCR扩增产物；
(3)纯化：纯化步骤(2)获得的第一轮PCR扩增产物；
(4)第二轮PCR反应，构建测序文库：以步骤(3)纯化后的第一轮PCR扩增产物为模板，采用通用引物进行第二轮PCR反应，获得测序文库；
(5)纯化：纯化步骤(4)获得的测序文库。
优选地，步骤(2)所述鼓泡状引物的正向引物如SEQ ID NO.3-74所示，所述鼓泡状引物的反向引物如SEQ ID NO.75-146所示。
根据本发明，步骤2)所述的第一轮PCR反应的条件为：96-98℃4-10min，1循环；96-98℃0.5-1.5min、55-60℃15-30min、68-72℃1.5-3min，5-10个循环；68℃8-10min，1循环；保存在4-12℃。
优选地，步骤(4)所述正向通用引物的核酸序列如SEQ ID NO.147所示，所述反向通用引物的核酸序列为SEQ ID NO.148-235中的任意一种或至少两种的组合。
根据本发明，步骤(4)所述第二轮PCR反应的条件为：96-98℃4-10min，1循环；96-98℃0.5-1.5min、60-62℃0.5-1.5min、68-72℃1.5-3min，18-20个循环；68℃8-10min，1循环；保存在4-12℃。
第六方面，本发明提供一种用于非诊断目的的非小细胞肺癌相关突变热点基因突变的检测方法，采用如第五方面所述的方法构建文库，包括如下步骤：
(1)提取样本核酸；
(2)第一轮PCR反应，捕获非小细胞肺癌相关突变热点基因的编码序列：以步骤(1)的所述核酸为模板，采用所述鼓泡状引物进行第一轮PCR反应，获得第一轮PCR扩增产物；
(3)纯化：纯化步骤(2)获得的第一轮PCR扩增产物；
(4)第二轮PCR反应，构建测序文库：以步骤(3)纯化后的第一轮PCR扩增产物为模板，采用通用引物进行第二轮PCR反应，获得测序文库；
(5)纯化：纯化步骤(4)获得的测序文库；
(6)单链环化：将步骤(5)获得的所述测序文库进行变性，获得核酸单链文库，并将所述核酸单链文库利用介导片段实现所述核酸单链文库的环化，获得单链环状文库，其中，所述介导片段具有相应互补序列用于连接核酸单链的两端；
(7)测序：对步骤(6)获得的单链环状文库进行测序；
(8)分析：对测序后获得的测序结果进行分析，获得所述非小细胞肺癌相关突变热点基因突变的结果。
本发明中，所述用于检测非小细胞肺癌相关热点基因突变的方法，虽然在某些情况下，对这些基因的检测对于相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的辅助意义，但这些基因的突变不是必然导致所述疾病的发生，因此对这些基因的检测并不涉及疾病的诊断或治疗方法。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明方法操作简单，只涉及PCR试剂及引物组合、成本低；
(2)本发明在鼓泡状引物中引入用来增加特异性捕获文库构建多样性的简并碱基作为分子标签(UID)，以及在通用引物序列中再次引入用来区分同批次文库构建中的不同样本的标签序列(barcode)，这种同时引入双标签来进行文库构建的方法，不仅可以区分不同样本间的文库信息，而且由于鼓泡状引物含带分子标签(UID)使序列更加多样化，从而大大提高了检测的灵敏性，降低假阳性、假阴性结果的出现，实现高通量样本的测序检测；
(3)本发明的文库构建方法，在使用鼓泡状引物进行第一轮PCR扩增之后，采用磁珠对所获得的扩增产物进行纯化，再进行第二轮PCR富集，可大大减少引物-引物二聚体的生成，使第二轮PCR扩增的特异性显著增强。
附图说明
图1为本发明特异性鼓泡状引物的结构设计示意图；
图2为本发明的文库构建方法简略示意图；
图3为本发明检测突变所采用的生物信息学分析的流程示意图；
图4为本发明第一轮PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
除非另有说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不构成对本发明的限制。对于本领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，技术、方法和设备应当被视为本说明的一部分。
测序系统 BGI-SEQ500
实施例1非小细胞肺癌相关热点基因鼓泡状引物的设计
(1)靶向位点的选择：通过文献与各大非小细胞肺癌治疗指南阅读，确定与非小细胞肺癌用药最为相关的基因，并且通过cosmic数据库，查找在肺癌病人中突变率最高的突变位点与亚型，或者是与药物抵抗直接相关的重要突变位点。
(2)设计通用序列：通过对序列的反复设计与测试，获得如SEQ ID NO.1-2所示的核酸序列，如下所示：
正向引物的通用序列(SEQ ID NO.1)：5’-CGACATGGCTACGATCCGACTT-3’；
反向引物的通用序列(SEQ ID NO.2)：5’-TAAGACCACTTGACCGTCAGCAT-3’；
(3)设计鼓泡状引物，如图1所示，所述鼓泡状引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物都是由所述四个部分组成，所述鼓泡状引物的结构为：正向引物：5p臂+通用序列+分子标签+3p臂；反向引物：5p臂+通用序列+分子标签+3p臂，所述鼓泡状引物如SEQ ID NO.3-146所示的核酸序列.
基于多重PCR技术进行的靶向文库制备，所采用的鼓泡状引物共72对，所述鼓泡状引物对的每对正向引物与反向引物对应的特异性序列分别为SEQ ID NO.m与SEQ ID NO.(m+72)，其中m为3-74中的任意整数。
实施例2试剂盒的组装
具体地，根据本发明的试剂盒中的主要试剂包括：
PCR扩增试剂：2×PCR缓冲液Pfu DNA聚合酶、纯水、实施例1的鼓泡状引物和用于二次PCR的通用引物，其中，所述2×PCR缓冲液由10×PfuTurbo Cx缓冲液、dNTPs、甜菜碱、二甲基亚砜、硫酸镁组成；所述dNTPs是浓度为0.1Mm-25mM的dNTPs混合液；所述甜菜碱是摩尔浓度为1M-4M的甜菜碱溶液；所述二甲基亚砜是质量百分浓度为100％的二甲基亚砜；所述硫酸镁是摩尔浓度为1Mm-1M的硫酸镁溶液；所述DNA聚合酶为PfuTurbo Cx热启动DNA聚合酶；
所述通用引物包括正向通用引物和反向通用引物，所述正向通用引物如SEQ IDNO.147所示，所述反向通用引物为SEQ ID NO.148-235中的任意一种或至少两种的组合。
实施例3非小细胞肺癌相关热点基因突变的检测
所述方法如图2所示，包括如下步骤：
1)提取样本基因组DNA：采用石蜡样本提取试剂盒(MagPure FFPE DNA KF Kit)进行提取，提取后的DNA进行Nanodrop检测DNA的质量，所述提取后的基因组DNA的D260/OD230＝1.8-2.5，所述提取后基因组DNA合格，可用于下一步PCR扩增。
2)第一轮PCR反应，捕获非小细胞肺癌相关突变热点基因的编码序列：以步骤(1)的基因组DNA为模板，采用实施例1的鼓泡状引物进行第一轮特异性多重PCR反应，得到PCR扩增产物，所述PCR反应的体系和条件如下：
所述PCR反应体系如下：
所述PCR的反应条件如下：
3)纯化：纯化步骤2)得到的PCR扩增产物，具体包括：先将Ampure XP磁珠放置室温下平衡30min，再将上一步得到的PCR产物文库移至一新的1.5ml的EP管中，加入体积比为1：0.8～0.9X的Ampure XP磁珠，震荡混匀，静置反应5min，再放置磁力架上静置5min，待溶液澄清后，弃掉澄清液；于磁力架上加入200ul的75％乙醇，上下吹打10次，静置5min，待溶液澄清后，弃掉澄清液，该步重复2次；再将EP管置室温下静置3min，晾干，再加入TE溶液溶解DNA，混匀室温放置5min，移至磁力架上，取上清液，即得纯化后的PCR扩增产物；
4)第二轮PCR扩增，构建测序文库：以步骤3)纯化后的PCR扩增产物为模板，采用实施例2所述通用引物中的至少一对引物进行第二轮PCR扩增，获得测序文库，所述PCR扩增的体系和条件如下：
所述PCR扩增的反应体系如下：
组分 体积
模板DNA(第一轮PCR引物) 15μl
2×PCR缓冲液 25μl
通用引物的正向引物(10μM) 0.5μl
通用引物的反向引物(10μM) 0.5μl
PfuTurbo Cx DNA聚合酶(2.5U/μl) 0.5μl
H2O 8.5μl
总共 50μl
所述PCR扩增的反应条件如下：
5)纯化：纯化步骤4)得到的测序文库，具体参考步骤3)的方法，此处不再累述；对纯化后的文库进行定量检测；
6)单链环化制备：根据定量结果对样本进行等体积取样混合，加水，得到65μl的PCR纯化产物混合液，再通过先变性再利用相关互补片段对产物混合液进行环化操作，得到单链环状文库；
7)测序：按照BGISEQ-500测序仪的操作说明书对单链环状文库进行测序。8)分析：根据引物对中的标签序列(barcode)的信息，将测序数据与样品一一对应。然后对测序数据进行分析，如图3，使用测序领域常用的比对程序，例如BLAST和SOAP，将每个样品的测序序列与人基因组序列进行比对，并针对比对上的测序序列进行目标区域覆盖率以及多重PCR引物均一性的评估。
结果分析
取5μl步骤4)的PCR产物在6％的PAGE胶上进行电泳检测，结果如图4所示，1为所述文库，片段大小在200-400bp，文库构建成功。
上机样品的测序数据质量评估：Q30为83.97％；样本参考序列比对及测序深度统计：去重后平均测序深度为4629X，目标区域覆盖率为96.99％，测序深度不低于10X的覆盖率为93.56％，测序深度在0.2x平均测序深度时的覆盖率为82.57％，这些目标区域覆盖率数据统计表明本实例所设计并优化的多重引物组合是非常有效的。
对比例1
与实施例3相比，除不具有步骤3)的纯化步骤之外，其它步骤与实施例3相同。
上机样品的测序数据质量评估：Q30为83.31％；样本参考序列比对及测序深度统计：未进行纯化步骤时，去重后平均深度为2158X，目标区域覆盖率为71.53％，测序深度不低于10X的覆盖率为86.73％，测序深度在0.2x平均测序深度时的覆盖率为82.27％，与实施例3相关目标区域数据统计相对比，表明本对比例中，未进行纯化步骤对目标区域捕获的整体测序数据显示劣于采用纯化步骤的整体测序数据，即利用本发明的方法进行建库更有优势。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大智造科技有限公司
<120> 一种鼓泡状引物及其组成的试剂盒和应用
<130> 2017
<160> 235
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成序列
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cgacatggct acgatccgac tt 22
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ggatcatatt cgtccacaaa atgattccga catggctacg atccgacttn nnnnntcaag 60
gcactcttgc 70
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acacaaagaa agccctcccc agtcctcatg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnat 60
tgcactgtac tcc 73
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taccatccac aaaatggatc cagacaactg cgacatggct acgatccgac ttnnncactc 60
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tcactgatga ccctctctgt atgatcactg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnngg 60
agatctcaat cag 73
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<213> 人工合成序列
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gaaatttaac agggtgttgt tgtgcacagg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnca 60
ttcttttctt tac 73
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<213> 人工合成序列
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cttgacctgt gagatgattg tattctctgc cgacatggct acgatccgac ttnnnacaga 60
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ccaatgaagg tgccatcatt cttgaggagg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnngc 60
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catggcactg tac 73
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catcccgaag tc 72
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gcaaagactg gttctcactc accgggcgag cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnga 60
ggaaggactt gag 73
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tgtctctctg tggctttacc tgatgatcag cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnat 60
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aagaagctgg aggagctaga gcttgatgag cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnag 60
cgccttgagg cct 73
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ctcttaccca cgacatccag ctggtatgtc gacatggcta cgatccgact tnnnnnntac 60
tcattctcca ca 72
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ggttgtgtat atcatgggac tttgttggac cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnag 60
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<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
tgttgtaatt tagtgttagt caatagaggc cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnac 60
ttccttcaga agt 73
<210> 43
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 43
tcctcgcggc cgtagtaggg gaagatcatc cgacatggct acgatccgac ttnnnnnngt 60
gcgtcacgct tga 73
<210> 44
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 44
gctcccagac atgacagcca tcatcaaaga cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnag 60
aaacaaaagg aga 73
<210> 45
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 45
gtttcacttt tgggtaaata cattcttcat cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnga 60
ggaaacctca gaa 73
<210> 46
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 46
ttaacaaaaa atgatcttga caaagcaaat cgacatggct acgatccgac ttnnnnnncc 60
aaccgatact ttt 73
<210> 47
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 47
ttatttcagt tgatttgctt gagatcaaga cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnca 60
gaatccatat ttc 73
<210> 48
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 48
tatttatgaa atggggattg taatactgag cgacatggct acgatccgac ttnnnnnntg 60
tgaggattaa atc 73
<210> 49
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 49
gtcttcttgt tcctctaggt cagcctgcca cgacatggct acgatccgac ttnnnnnngc 60
catagtgaag gac 73
<210> 50
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 50
tattttaatc cagttgtttt gggtgcatta cgacatggct acgatccgac ttnnnnnntc 60
ccctcccttt acc 73
<210> 51
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 51
gtcacttgat taatttagaa tgtagggagg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnat 60
caccctgtcc ctc 73
<210> 52
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 52
aaataaaaat ggaatttttg ttgtcttttc cgacatggct acgatccgac ttnnnnnntg 60
ttcacaatga gct 73
<210> 53
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 53
tcatagtatg aaatgttttt tcttaaaagg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnntg 60
cgtcagtgtc atc 73
<210> 54
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 54
gtggtgaaga cagaggtgtc cttgagtcca cgacatggct acgatccgac ttnnnnnngg 60
tccagcagcc acg 73
<210> 55
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 55
gaaaccgtag ctgccctggt aggttttctg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnga 60
agatgacagg ggc 73
<210> 56
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 56
ccacccttaa cccctcctcc cagagacccc cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnca 60
gacctcaggc ggc 73
<210> 57
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 57
tccaacctag gaaggcaggg gagtagggcc cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnct 60
gaggtcactc acc 73
<210> 58
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 58
gagctaaccc tggctatcat tctgcttttc cgacatggct acgatccgac ttnnnnnntt 60
cagatttgac ttt 73
<210> 59
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 59
gaaggcgtac atttgtcctt ccaaatgagc cgacatggct acgatccgac ttnnnnnncg 60
tgtcctggca ccc 73
<210> 60
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 60
ttgccagtta acgtcttcct tctctctctg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnat 60
cccagaaggt gag 73
<210> 61
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 61
ttctggccac catgcgaagc cacactgacg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnag 60
gaagcctacg tg 72
<210> 62
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 62
tggcagccag gaacgtactg gtgaaaacac cgacatggct acgatccgac ttnnnnnntc 60
acagattttg ggc 73
<210> 63
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 63
tcccaggacc tgctgaactg gtgtatgcag cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnta 60
tgcacctggg ctc 73
<210> 64
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 64
ccctgctttt gttggtgagg agcattaatg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnct 60
cttcagcttc cag 73
<210> 65
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 65
agagtagaga gtttcaaaca ggaagctgac cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnaa 60
tgagaaagga aat 73
<210> 66
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 66
ctgattaatc ttttttggac tgtactggat cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnac 60
agtgattatc tga 73
<210> 67
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 67
caagtttagt agttcttccc caagtttagt cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnct 60
actccatagt tcc 73
<210> 68
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 68
atggacactg gattaagaag caatgccctc cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnaa 60
aacatttact aaa 73
<210> 69
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 69
tgggcctgtg ctggaacacc cagattgttt cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnga 60
ctgcagcagc aaa 73
<210> 70
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 70
caggtcagcc tgcctgctcc tagaggacat cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnct 60
gtggtcacag cca 73
<210> 71
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 71
ggtccccagc ccaacccttg tccttaccag cgacatggct acgatccgac ttnnnnnntc 60
aggaagtctg aaa 73
<210> 72
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 72
gggcagctgc ttgcctgtga accagtaaac cgacatggct acgatccgac ttnnnnnntt 60
tcatggttgc tcc 73
<210> 73
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 73
cccatgatat ttcaggagga atagaatgag cgacatggct acgatccgac ttnnnnnngt 60
gtcaatttct ctg 73
<210> 74
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 74
tgctttagcc actggatgtg cggctgcggg cgacatggct acgatccgac ttnnnnnnac 60
cttacacatg aac 73
<210> 75
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 75
gaagtacagt tcattacgat acacgtctgc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
ttttcatgat tga 73
<210> 76
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 76
ggaacaatgt cttttcaagt cctttgccca taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
ttgttgttga gttg 74
<210> 77
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 77
tacagaatta tagaaattag atctcttacc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
cttgctctga tagg 74
<210> 78
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 78
cagctgctcc attattccct gcacactgac taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
gaacattgat acac 74
<210> 79
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 79
cacaggtcca catccattca tccccaacag taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
cttggtctcg gaag 74
<210> 80
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 80
ccattctgca cctcctcacc ttctccagca taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
cctccagagg atga 74
<210> 81
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 81
gtcgctggcc ctaagaaaca gctcccgtac taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
ggactcaggc atcc 74
<210> 82
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 82
ttaagattac gaaggtattg gtttagacag taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
gaaagggaca acag 74
<210> 83
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (53)..(58)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 83
taatgtgcca actaccaatg tagtatgatt aagaccactt gaccgtcagc atnnnnnntt 60
tacaaccatt gt 72
<210> 84
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 84
cctatgcaat cggtctttgc ctgctgagag taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
aatccagagt gagc 74
<210> 85
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (56)..(61)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 85
ctttaagaac caaatggaag gtcacactag ggtaagacca cttgaccgtc agcatnnnnn 60
nccattgatt ataga 75
<210> 86
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 86
agataggcag aaatgggctt gaatagttag taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
ccttggcaat agca 74
<210> 87
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(63)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 87
ctatactaaa ggaaatatag ggaagggaag gaactaagac cacttgaccg tcagcatnnn 60
nnncttcagc ttggagat 78
<210> 88
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 88
cagtttaaga tttgcccaga ctcagctcag taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
atccctctct gctc 74
<210> 89
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 89
cctcattatt gtggcctgtt tgactctgtc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
ctcctttgca cagg 74
<210> 90
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 90
ccaattacct gttaatcaag gcaaactcac taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
gaccaggcca gaag 74
<210> 91
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (64)..(69)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 91
atatggaggg caggtgccac ggggtgccga cattgtcatg taagaccact tgaccgtcag 60
catnnnnnnt ctggaccctc aatg 84
<210> 92
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 92
ctctgcgtct cttagaggtc tcatgtcctg taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
gttgtctctt ctag 74
<210> 93
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(57)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 93
cttgctgcca ttcacctcca cgtgcttgta agaccacttg accgtcagca tnnnnnnggc 60
tgtgcgtcac tg 72
<210> 94
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(57)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 94
ccaataaatt ctcagatcca ggaagaggta agaccacttg accgtcagca tnnnnnnaaa 60
taacttacct t 71
<210> 95
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 95
gagtaagcaa aacacctgca gatctaatag taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
ttccttacat gtca 74
<210> 96
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 96
atctgttcac ttgtgccctg actttcaact taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
ttcctacagt actc 74
<210> 97
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 97
gcctgggcga cagagcgaga ttccatctca taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
gcttgccaca ggtc 74
<210> 98
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 98
tctcctccac ctacctggag ctggagctta taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
ggttgggagt ag 72
<210> 99
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 99
caacaatgtc acaacccact gaggtatatg taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
aacaataaac tgaa 74
<210> 100
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 100
ttagggtgaa acataaggtt ttctttttct taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
cttttttact gttt 74
<210> 101
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 101
actcacctcc ccaaactgtc cttctcccag taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
aggagtttcc tggg 74
<210> 102
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 102
tctaggtttg cgggagtcat atctccccaa taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
accagagccc agac 74
<210> 103
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 103
aacaaattcc tttgttatgc agacaccatt taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
ttcggaaccc atgg 74
<210> 104
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 104
gaacaatgtg acggcagatg ctacggacct taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
gccatcgaga atgt 74
<210> 105
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 105
aggcctgcat gaatttcaat gacagtggag taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
tccccaaacc tttg 74
<210> 106
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 106
aaagaaatct actctatctt gggggcaatt taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
aaccaagcaa gtac 74
<210> 107
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 107
tctttttttt tcgttttcac atttcagggt taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
agtgctctca tttt 74
<210> 108
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 108
attttttctc caatatagga gttactatat taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
tggaggaaaa ccct 74
<210> 109
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 109
tatcctcatt gccactttat cttagtacct taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
ttacctgttt ccca 74
<210> 110
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 110
cgcacaggaa ctgttcttaa acagtttcca taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
tcactaaggg agca 74
<210> 111
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 111
tttctgttac ctgtcgcttg agcgggaagc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
ggtgggggag ccca 74
<210> 112
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 112
ggggagtggc tgtgcaccag cagcagggtg taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
tcacattgtt gggg 74
<210> 113
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 113
ctcctacccc cttactaatg agggctctga taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
aagtagttca ataa 74
<210> 114
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 114
catctgactt ggtggtaaac ttttgagttt taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
catccacttc actg 74
<210> 115
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 115
gccccctgta cgaccagtac tgcaaggacc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
ctgcgaccag ggct 74
<210> 116
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 116
gcttgacact tgcaaccagg caagagttcc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
cctaggttga atac 74
<210> 117
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 117
taatacataa gttaaaaact tgtcaagcaa taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
actcctagaa ttaa 74
<210> 118
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 118
catttagccc cctcccgcac ctttgcccca taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
gaagaattag gaaa 74
<210> 119
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 119
ttggaggaat atatcttcac ctttagctgg taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
gatctgcatg gtta 74
<210> 120
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 120
tttcttagga tgaaagcaaa gtctacttac taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
aactcgttcg tagt 74
<210> 121
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 121
ctacttccag tccaggtggt agtgctgtct taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
atgggttaat ttgc 74
<210> 122
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 122
acccaaacaa aagcgatctc ctccagaagg taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
acagtaacaa tagg 74
<210> 123
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 123
gtctaaaggt tgtgggtctg caatcggcat taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
tctaggagct ggag 74
<210> 124
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 124
gatgagtatt gtactcatct gagaagtgac taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
agcctgtgtt tgtg 74
<210> 125
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 125
aaagcatact tactgatagc tggagctatt taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
ggccagggat gttt 74
<210> 126
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 126
ctccctgggg ctgcgggcag agggatgagg taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
ggtcagagag cggg 74
<210> 127
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 127
cgacaggacc tggtcctctg actgctcttt taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
ccccttgccg tccc 74
<210> 128
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 128
gcgccatggc catctacaag cagtcacagc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
gaggcgctgc cccc 74
<210> 129
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 129
agtatatact tacttctccc cctcctctgt taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
gcgtgagcgc ttcg 74
<210> 130
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 130
acaggacttg ggaggtatcc acatcctctt taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
accactcaga gaag 74
<210> 131
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 131
ccctgcggcc cagcccagag gcctgtgcca taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
caccgtgccg aacg 74
<210> 132
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 132
gaggccagtg ctgtctctaa ggggagggag taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
tagaaaggga aag 73
<210> 133
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 133
gcacacacca gttgagcagg tactgggagc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
ggacatagtc cag 73
<210> 134
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 134
ggataacatc ctcattcact gtcccagcaa taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
agctctggct cac 73
<210> 135
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 135
gccagcccga agtctgtaat tttgacatgg taagaccact tgaccgtcag catnnnnnna 60
gcacgttccg agcg 74
<210> 136
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 136
tttattggcc aaaaataagt ttctcaatcc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
gtttctacag cttg 74
<210> 137
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 137
gtggaatgca gagactggag aatgtataca taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
acttccactg tgcg 74
<210> 138
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 138
ttctcgagat gccactctta gggtttggga taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
tgtttacatg tttt 74
<210> 139
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 139
tgatgcccag ccccacatcc agtggatcaa taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
ggcagtaaat acgg 74
<210> 140
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 140
tctttcccag agaacaaatt aaaagagtta taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
acctatggtc ctag 74
<210> 141
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 141
tgaaccggtc ctttacagat gaaaggactt taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
caccacacag tcag 74
<210> 142
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 142
catcctcgat gtcgaagagg tcctcgtcct taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
gtcctccaag tacg 74
<210> 143
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 143
cagcagccag actgccttcc gggtcactgc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
tcagatccta gcgt 74
<210> 144
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 144
agatccagcg agtgccatcc cgactgtaat taagaccact tgaccgtcag catnnnnnng 60
ggcaaactcg atgc 74
<210> 145
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 145
agaaactgat tgagatctcc attctccatg taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnc 60
agagagggtc atca 74
<210> 146
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (54)..(59)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 146
gggcgcaggt gagcccaccc ctctttagcc taagaccact tgaccgtcag catnnnnnnt 60
gacaagtgcc tcct 74
<210> 147
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 147
cacagaacga catggctacg atccgactt 29
<210> 148
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 148
agccaaggag ttggtaaagt ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 149
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 149
agccaaggag ttgtagggac ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 150
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 150
agccaaggag ttgagctctt ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 151
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 151
agccaaggag ttgcctctag ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 152
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 152
agccaaggag ttgggcagca ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 153
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 153
agccaaggag ttgtttgtcc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 154
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 154
agccaaggag ttgcagcagg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 155
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 155
agccaaggag ttgccatctt ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 156
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 156
agccaaggag ttgaaggaga ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 157
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 157
agccaaggag ttggtaagcc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 158
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 158
agccaaggag ttgagcttag ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 159
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 159
agccaaggag ttggatccta ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 160
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 160
agccaaggag ttgtcaacaa ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 161
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 161
agccaaggag ttgtctgttt ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 162
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 162
agccaaggag ttgagttagg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 163
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 163
agccaaggag ttgcactgcc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 164
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 164
agccaaggag ttgatgctca ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 165
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 165
agccaaggag ttgggacaac ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 166
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 166
agccaaggag ttgctgggtt ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 167
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 167
agccaaggag ttgtacatga ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 168
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 168
agccaaggag ttggcttcag ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 169
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 169
agccaaggag ttgatagggc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 170
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 170
agccaaggag ttgtgcacta ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 171
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 171
agccaaggag ttgcctgact ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 172
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 172
agccaaggag ttgaggcatg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 173
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 173
agccaaggag ttggagctgc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 174
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 174
agccaaggag ttgttatgat ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 175
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 175
agccaaggag ttgaccaaca ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 176
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 176
agccaaggag ttgctctctg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 177
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 177
agccaaggag ttggaagtct ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 178
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 178
agccaaggag ttgtggatgc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 179
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 179
agccaaggag ttgactggat ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 180
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 180
agccaaggag ttgcagcctc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 181
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 181
agccaaggag ttgggcacag ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 182
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 182
agccaaggag ttgtcatgga ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 183
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 183
agccaaggag ttgcttcaat ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 184
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 184
agccaaggag ttgggatatg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 185
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgaaggtcc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 186
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 186
agccaaggag ttgcttagct ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 187
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 187
agccaaggag ttgttccaca ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 188
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 188
agccaaggag ttggccttgg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 189
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 189
agccaaggag ttgagggcag ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 190
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 190
agccaaggag ttgcaaagga ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 191
agccaaggag ttgtcttctc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 192
agccaaggag ttggctcaaa ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 193
agccaaggag ttgatcattt ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 194
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 194
agccaaggag ttgtgagacc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 195
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 195
agccaaggag ttgaatctgg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 196
agccaaggag ttgcaggcct ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttggtcaggg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 198
agccaaggag ttgtggtgta ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 199
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<210> 200
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 200
agccaaggag ttgcttactc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 201
agccaaggag ttgaagtgat ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 202
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 202
agccaaggag ttggcagagg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgcacctta ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 204
agccaaggag ttgggtacct ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 205
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<213> 人工合成序列
<400> 206
agccaaggag ttgagcctgc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 207
agccaaggag ttgctagatg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 208
agccaaggag ttgccaagag ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 209
agccaaggag ttgaattgca ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 210
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 210
agccaaggag ttgtgtcagc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 211
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 211
agccaaggag ttgttgacat ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 212
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 212
agccaaggag ttggcctacc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 213
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 213
agccaaggag ttgggaggtt ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 214
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 214
agccaaggag ttgcagttga ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 215
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 215
agccaaggag ttgacaccag ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 216
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgcttgtta ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgaacaaag ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 218
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttggggcctt ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgtgagtag ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<213> 人工合成序列
<400> 220
agccaaggag ttgtatggct ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttggtctaga ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgaccaggc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgacaatcc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttggagccag ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgcctggga ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgtgctatc ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgctaacca ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgaagcttt ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgtttccac ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgggccagg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttggcatgct ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
<210> 232
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgctggtac ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgtgggatt ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<213> 人工合成序列
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agccaaggag ttgaaatggg ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52
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<213> 人工合成序列
<400> 235
agccaaggag ttgcctatca ttgtcttcct aagaccactt gaccgtcagc at 52

Claims (10)

1.一种鼓泡状引物，其特征在于，所述鼓泡状引物为核酸单链结构，所述鼓泡状引物包括依次相连的四个部分：5p臂、通用序列、分子标签和3p臂；
所述5p臂在鼓泡状引物的5’端，且在第一轮PCR反应中，根据碱基互补配对原则与DNA模板序列结合；所述通用序列在第一轮PCR反应中，与模板序列不互补而呈凸起的鼓泡状，且所述通用序列与第二轮PCR反应中的通用引物的3’端序列至少有一部分相同；所述分子标签由多个简并碱基组成；所述3p臂在鼓泡状引物的3’端，且根据碱基互补配对原则与模板序列结合。
2.根据权利要求1所述的鼓泡状引物，其特征在于，所述5p臂的长度为16-30nt，优选为20-25nt；
优选地，所述通用序列的长度为20-25nt，优选为22-23nt；
优选地，所述通用序列为如SEQ ID NO.1-2所示的核酸序列；
优选地，所述分子标签的长度为3-10nt，优选为7nt；
优选地，所述3p臂的长度为5-15nt，优选为8-15nt。
3.一种如权利要求1或2所述的鼓泡状引物用于制备肿瘤相关突变热点基因的检测试剂盒的应用；
优选地，所述肿瘤包括非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌或卵巢癌中的任意一种或至少两种的组合。
4.一种用于检测非小细胞肺癌相关突变热点基因的鼓泡状引物，其特征在于，所述鼓泡状引物的正向引物如SEQ ID NO.3-74所示，所述鼓泡状引物的反向引物如SEQ IDNO.75-146所示。
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的鼓泡状引物和/或如权利要求4所述的用于检测非小细胞肺癌相关突变热点基因的鼓泡状引物；
优选地，所述试剂盒还包括用于第二轮PCR反应的通用引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述通用引物包括正向通用引物和反向通用引物；
优选地，其中所述通用引物的正向通用引物和反向通用引物的3’端序列分别与所述的鼓泡状引物的正向鼓泡状引物和反向鼓泡状引物中的通用序列至少部分相同；
优选地，所述正向通用引物的核酸序列如SEQ ID NO.147所示；
优选地，所述反向通用引物的核酸序列为SEQ ID NO.148-235中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包括PCR缓冲液PfuTurboCx DNA聚合酶和纯水；
其中，所述PCR缓冲液包括10×PfuTurbo Cx缓冲液、dNTPs、二甲基亚砜、甜菜碱和硫酸镁；进一步优选地，所述dNTPs是浓度为0.1mM-25mM的dNTPs混合液；所述甜菜碱是摩尔浓度为1M-4M的甜菜碱溶液；所述二甲基亚砜是质量百分浓度为100％的二甲基亚砜；所述硫酸镁是摩尔浓度为1mM-1M的硫酸镁溶液；所述DNA聚合酶为PfuTurbo Cx热启动DNA聚合酶。
7.一种文库的构建方法，其特征在于，采用如权利要求1、2或4中任一项所述的鼓泡状引物，包括如下步骤：
1)提取样本核酸；
2)第一轮PCR反应，捕获目的基因编码序列：以步骤(1)所述核酸为模板，采用所述鼓泡状引物进行第一轮PCR反应，获得第一轮PCR扩增产物；
3)纯化：纯化步骤2)获得的第一轮PCR扩增产物；
4)第二轮PCR反应，构建测序文库：以步骤3)纯化后的第一轮PCR扩增产物为模板，采用通用引物进行第二轮PCR反应，获得测序文库；
5)纯化：纯化步骤4)获得的测序文库；
优选地，所述第一轮PCR反应为多重PCR反应；
优选地，所述第二轮PCR反应为多重PCR反应。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，步骤1)所述样本来自于人的外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓或肝脏中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，步骤2)所述第一轮PCR反应中，鼓泡状引物的终浓度为0.1-5nM；
优选地，在步骤2)所述第一轮PCR反应中，加入PfuTurbo Cx DNA聚合酶；
优选地，所述PfuTurbo Cx DNA聚合酶的终浓度为0.01-0.5U；
优选地，步骤2)所述第一轮PCR反应的条件为：96-98℃4-10min，1循环；96-98℃0.5-1.5min、55-60℃15-30min、68-72℃1.5-3min，5-10个循环；68℃8-10min，1循环；保存在4-12℃；
优选地，步骤3)和步骤5)所述的纯化采用磁珠法进行；
优选地，所述纯化包括如下具体步骤：
(a)向步骤2)所述第一轮PCR扩增产物或步骤4)所述测序文库中加入体积比为1:(0.5-1)，优选为1:(0.8-0.9)的磁珠，混匀后静置4-10min，优选为5min，放置在磁力架上静置3-8min，优选为5min，弃上清液；
(b)向步骤(a)弃上清液后的磁珠中加入75％的乙醇，混匀后，静置3-8min，优选为5min，待溶液澄清后，弃上清液；
优选地，步骤(b)重复2-4次，优选为2次；
(c)将步骤(b)弃上清液后的磁珠晾干，加入TE溶液溶解磁珠上吸附的DNA，取上清液即得纯化后的产物或文库；
优选地，所述磁珠为Ampure XP磁珠；
优选地，步骤4)所述第二轮PCR反应中，通用引物的终浓度为200-1000nM；
优选地，步骤4)所述第二轮PCR反应的条件为：96-98℃4-10min，1循环；96-98℃0.5-1.5min、60-62℃0.5-1.5min、68-72℃1.5-3min，18-20个循环；68℃8-10min，1循环；保存在4-12℃；
优选地，所述构建方法还包括步骤6)单链环化：将步骤(5)获得的所述测序文库进行变性，获得核酸单链文库，并将所述核酸单链文库进行环化，获得单链环状文库；
优选地，所述环化具体步骤为利用介导片段实现所述核酸单链文库的环化；
优选地，所述介导片段具有相应互补序列用于连接核酸单链的两端。
9.根据权利要求7或8所述的构建方法，其特征在于，步骤2)所述鼓泡状引物的正向引物如SEQ ID NO.3-74所示，所述鼓泡状引物的反向引物如SEQ ID NO.75-146所示；
优选地，步骤4)所述正向通用引物的核酸序列如SEQ ID NO.147所示，所述反向通用引物的核酸序列为SEQ ID NO.148-235中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种用于非诊断目的的非小细胞肺癌相关突变热点基因突变的检测方法，其特征在于，将权利要求7-9任一项所述的文库进行测序，并对测序的数据进行分析，获得所述非小细胞肺癌相关突变热点基因突变的结果。
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