CN103191444A - Hpv16l2重组腺病毒疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及HPV16L2重组腺病毒疫苗的制备方法。其特征在于，所述腺病毒含有密码子优化型HPV16L2的核苷酸序列SEQ ID No：1，包括如下步骤：使用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化重组腺病毒穿梭质粒pDC316，然后将回收片段和同样用内切酶EcoRI和HindIII双酶切的SEQ ID No：1所示的核苷酸片段连接，得到重组腺病毒穿梭质粒pDC316-HPV16L2；用制备的重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒骨架质粒共转染腺病毒包装细胞，得到携带有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的复制缺陷型重组腺病毒。所述病毒应用于制备预防和治疗HPV病毒引起的子宫颈癌以及食管癌的药物制剂。本发明产生良好的细胞免疫和体液免疫，得到良好的预防效果。

Description

HPV16L2重组腺病毒疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的复制缺陷型重组腺病毒的制备方法。

背景技术

人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）属乳多空病毒科，是无包膜的闭环双链DNA病毒。现已明确，高危型HPV如HPV16、18的持续感染与宫颈癌的发生密切相关，被确定为导致宫颈癌的主要病因，其中又以HPV16型最为常见（Bosch F X,J Natl Cancer Inst,1995,87:796–802.）。基于HPV的宫颈癌预防和治疗性疫苗已经开展了很长时间，其中又以HPV的主要衣壳蛋白L1为重点研究对象，目前临床上已经有了比较成功的疫苗诞生，分别是默克公司的四价疫苗和葛兰素史克公司的两价疫苗。

不同型别的HPV L1VLP在空间构想上存在差异，导致了其不可以产生很好的交叉保护，但只是简单的增加L1VLP的价位而谋求增加交叉保护的效果又会增加疫苗的安全风险和副作用，严重制约着基于L1的疫苗的研究。大量的实验证实，HPV16的次要衣壳蛋白L2的N端具有中和多种HPV基因型的交叉中和表位，是很有前景的候选宫颈癌疫苗（Kawana K，Virology,1998,245:353-359）。针对于L2的蛋白疫苗目前已经有报道，并且已经取得了一些阶段性的成果，但是蛋白疫苗纯化工艺繁琐，成本高昂，不利于在发展中国家进行推广，同时其免疫原性较差也严重制约了进一步研究。

本发明试图构建一种成本低廉，同时可有效激发机体产生特异性免疫反应的疫苗。研究表明，复制缺陷型重组腺病毒嗜性广泛，能够感染包括粘膜上皮细胞在内的多种细胞，介导外源基因在细胞内的稳定表达并刺激机体产生特异性体液及细胞免疫反应，重组腺病毒还可将抗原呈递给免疫系统，有效激发局部和远端粘膜表面的特异性免疫反应，被认为是最为理想的免疫载体之一（Xiang Z Q,J Immunol,1999,162:6716-6723）。与此同时，复制缺陷型重组腺病毒基因不与受体细胞基因组发生整合，具有良好的生物安全性（McConnell M J,Human Gene Therapy,2004,15(11):1022-1033.）。此外，重组腺病毒还具有便于大规模培养制备、成本低廉等优点，因此是理想的HPV候选预防性疫苗之一。所以我们确定以重组腺病毒作为HPV16L2基因的病毒载体。

发明内容

为了使SEQ ID No：1序列能够获得高效表达和呈递，本发明提供一种HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗，含有SEQ IDNo：1所示核酸序列。

本发明还提供制备上述HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗的方法，包括如下步骤：

（1）将SEQ ID No：1所示的核苷酸序列克隆到腺病毒穿梭质粒中，得到重组腺病毒穿梭质粒。

（2）用步骤（1）制备的重组腺病毒穿梭质粒和pBHGloxΔE1,3Cre质粒共转染腺病毒包装细胞，得到含有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒。

所述腺病毒穿梭质粒是质粒pDC316，所述腺病毒包装细胞是293细胞。

本发明更进一步提供一种HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗，其有效成分为上述HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒。

本发明提供的HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗可用于制备预防和治疗子宫颈癌和食管癌的药物。所述复制缺陷型重组HPV16L2腺病毒应用于制备预防和治疗有一种或多种HPV病毒引起的子宫颈癌以及食管癌的药物制剂，所述一种或多种HPV病毒选自16、18、31和45型。

本发明实现的技术效果如下：

本发明提供的HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒，用于制备HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗，产生良好的细胞免疫和体液免疫，得到良好的预防效果。

附图说明

图1：pDC316-HPV16L2重组穿梭质粒酶切验证结果图；

图2：HPV16L2细胞内蛋白表达Western印迹分析结果图；

图3：HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗细胞免疫结果图；

图4：HPV16L2复制缺陷型重组腺病毒疫苗体液免疫结果图。

具体实施方式

实施例1：含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒的构建

1.含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒穿梭质粒的构建（1）大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

从37℃培养16～20h的新鲜平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜（12～16h）。次日从上述培养物中吸取0.5ml按1:100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的OD600值为3时，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置1min，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。4℃,4000rpm离心10min，弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15％甘油的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，分装成200μl每管，-80℃保存备用。

（2）SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的获得：

以含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的p16L2H(provided byProf.John Schiller)质粒为模板进行PCR扩增，PCR体系：模板质粒1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，10×Pfu Buffer10μl，dNTP8μl，Pfu2μl，DMSO5μl，ddH₂O72μl，总体系100μl。经过30个循环（94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s）获得SEQ ID No：1所示的核苷酸序列片段，PCR反应产物通过切胶回收进行纯化，具体操作参见试剂盒说明书。

（3）pDC316腺病毒穿梭质粒及pBHGloxΔE1,3Cre腺病毒腺病毒骨架质粒的小量制备

分别挑取pDC316或pBHGloxΔE1,3Cre质粒转化单菌落分别接种于5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。将培养物移入1.5mlEppendorf管中，12000rpm离心60s，弃上清，用100μl预冷的溶液Ⅰ[50mmol/L Glucose,25mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0)]重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH,1%SDS），温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液Ⅲ(100ml中含5mol/L KAc60ml,冰乙酸11.5ml，水28.5ml)温和混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE（pH8.0）溶解沉淀，37℃水浴30min后置-20℃保存备用。

（4）含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒穿梭质粒的构建

上述实施例1.（2）中经过纯化的SEQ ID No：1所示的核苷酸序列片段用内切酶EcoRI和HindIII进行双酶切；使用EcoRI和HindIII对实施例1.（3）中小量制备的腺病毒穿梭质粒pDC316进行双酶切。酶切体系：SEQID No：1所示的核苷酸序列片段（或pDC316）20μl，BSA0.5μl，10×buffer45μl，内切酶EcoRI2μl，HindIII2μl，ddH₂O20.5μl，总的酶切体系50μl，37℃消化3h。双酶切反应产物分别使用凝胶回收试剂盒进行纯化，具体操作参见试剂盒说明书。建立连接反应体系，将含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列片段与pDC316片段进行连接，连接反应体系：含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列7μl，pDC3161μl，10×连接buffer1μl，T4连接酶1μl。16℃连接过夜。将过夜连接产物分别加入100μl DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入500μl不含抗生素的LB培养基，将管转移至37℃摇床上，温育45min（转速<150rpm）。取50μl已转化的感受态细胞，用一个无菌的弯头玻璃涂布棒轻轻涂到含相应抗生素的琼脂平板表面,将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h。分别挑取相应重组质粒转化单菌落接种于5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。将培养物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm离心60s，弃上清，用100μl预冷的溶液Ⅰ[50mmol/L Glucose,25mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0)]重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH,1%SDS)，温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液Ⅲ(100ml中含5mol/L KAc60ml,冰乙酸11.5ml，水28.5ml)温和混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE（pH8.0）溶解沉淀，37℃水浴30min后置-20℃保存备用，重组穿梭质粒命名为pDC316-HPV16L2。

（5）含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒穿梭质粒的鉴定

建立酶切反应体系，分别双酶切小量制备的pDC316-HPV16L2腺病毒穿梭质粒，酶切体系为：重组穿梭质粒5μl，BSA0.2μl，10×buffer42μl，内切酶EcoRI1μl，HindIII1μl，ddH₂O10.8μl，总的酶切体系20μl，37℃消化2h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果显示，重组质粒可以双酶切下1422bp左右特异性条带（参见图1）。酶切鉴定阳性菌落送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测序结果显示核酸序列正确。

实施例2：含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒的构建和纯化

（1）含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒质粒和骨架质粒的制备

使用QIAGEN Plasmid Giga Kits质粒大量提取试剂盒分别提取重组腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,3Cre及重组腺病毒穿梭质粒pDC316-HPV16L2。具体实验步骤见QIAGEN Plasmid Giga Kits使用手册。

（2）含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒的包装：

将新鲜消化的293细胞接种到75cm2细胞培养瓶中，加入15ml完全培养基，根据康碧泉QuickShuttle-293转染试剂说明进行转染：将40μg的pDC316-HPV16L2质粒、pBHGloxΔE1,3Cre质粒和100μl转染试剂分别稀释到400μl生理盐水中。合并上述两溶液并混匀。将上述复合物直接加入到细胞培养基中，轻摇细胞培养瓶以混匀。将细胞培养瓶移至37℃5%CO₂孵箱中进行培养。转染后7～10天，用细胞刮将细胞刮下，800rpm离心5min，弃上清，用2ml无菌PBS重悬细胞沉淀；-20℃和37℃反复冻融4次；3000rpm离心10min，吸取上清，即为原代病毒，命名为rAd-HPV16L2，-70℃保存备用。用1ml上清接种293细胞，37℃5%CO₂孵育1h，然后加入含2%小牛血清的DMEM维持液（6ml）并观察细胞病变。观察结果显示，被转染的293细胞出现细胞肿胀、圆缩等典型的细胞病变。

（3）含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒的纯化：

使用Biomiga ViraTrap^TM Adenovirus Purification Miniprep Kit腺病毒纯化试剂盒对重组腺病毒进行纯化。具体实验步骤见BiomigaViraTrap^TM Adenovirus Purification Miniprep Kit使用手册。

实施例3：含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒的鉴定及滴度分析:

（1）含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒中HPV16L2基因的表达：

分别以10个MOI的rAd-HPV16L2重组腺病毒和rAd-GFP病毒感染1×10⁶293细胞，48h后将细胞刮下，预冷PBS洗2遍，按照TRIzol试剂说明提取细胞总蛋白，溶于1%SDS溶液中，0.1%SDS透析3次，4℃10000g离心10min，收集上清，进行SDS-PAGE电泳，转膜，用鼠抗HPV16L2单克隆抗体为一抗，辣根酶标记羊抗鼠IgG抗体为二抗，进行Western印迹分析（参见图2）。结果显示，rAd-HPV16L2可见明显的特异性条带，而细胞对照和rAd-EGFP对照看不见条带。

（2）含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒滴度测定：

TCID₅₀实验的基础是应用极限稀释法使293细胞出现病变从而估计滴度。细胞的准备：准备10ml含2%胎牛血清的DMEM重悬细胞，将细胞浓度调至1×10⁵/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔加入100μl。细胞贴壁后将上清弃去。病毒的稀释：第一管中加入0.9ml含2%胎牛血清的DEME，其余则加入1.8ml。第一管中加入0.1ml病毒原液。上下抽吸5次使他们混匀。每一次稀释后都更换吸头。从第一管中吸取0.2ml加入第二管。重复这个稀释步骤直到最高稀释度。96孔板的每一排10孔作为一个稀释度。11,12列不加病毒作为阴性对照。实验孔每孔加入0.1ml不同稀释度病毒。把96孔板放在37℃孵箱培养10天，观察病变。只要有一个小病变此孔即作为阳性对待，如果不易判断可跟阴性对照做比较。最后按公式T=10^1+d(s-0.5)计算病毒的滴度（d为稀释度的对数值，s为病变比例的和）。结果显示，重组腺病毒的滴度达到1×10⁹PFU/ml。

实施例4：含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒免疫原性的研究:

（1）动物免疫：

4-6周龄，雌性BALB/c小鼠。共分3组，每组组各10只小鼠，分别为PBS对照组、rAd-EGFP对照组和重组腺病毒rAd-HPV16L2。使用剂量为1×10⁸PFU/只，肌肉注射，初次免疫后2周进行加强免疫。于加强免疫后2周摘取小鼠的脾脏并收集各组小鼠血清。

（2）血清标本和脾细胞的收集：

免疫前以眼眶取血方式分别采集各组小鼠血清，加强免疫2周后以摘眼球方式采集各组小鼠血清。室温静置30min后，5000rpm离心5min，收集血清，分装小份置-20℃保存。在超净台中取出小鼠脾脏。在35mm培养皿中放入4ml EZ-Sep　Mouse1×淋巴细胞分离液。研磨小鼠脾脏，把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到15ml离心管中，覆盖400uL的1640培养基（保持液面分界明显）。室温，800g离心30min。吸出淋巴细胞层，再加入10ml1640培养基，颠倒洗涤。室温，250g离心10min收集细胞。倾倒上清液，用无血清培养基重悬细胞，细胞计数。

（3）ELISPOT检测细胞免疫

向预包被的ELISPOT的板子中每孔加入200μl EZ-Culture　无血清培养基，室温静置5-10min后将其扣出，加入细胞悬液，每孔100μl，细胞浓度为3×10⁵cells/well，并设置好正负对照。每孔中选择好的预测好的刺激物10μl，所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入37℃，5％CO₂培养箱培养16-20hr。结果显示，含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒免疫诱导产生了良好的细胞免疫效果，每1×10⁶细胞可以产生870个免疫斑点，参见图3。

（4）抗HPV交叉中和抗体的检测

按文献报道的方法（Buck,C.B.,D.V.Pastrana,D.R.Lowy,et,al.J.Virol.2004,78:751–757.）制备HPV16、18、33、45假病毒颗粒。在检测前6h接种3×10⁴cells/well293FT细胞于96孔细胞培养板中，将HPV16、18、33、45假病毒颗粒与系列稀释的血清孵育1h，将假病毒颗粒-待测血清混合液加入接种有293FT细胞的96孔板上，继续孵育72h，取40μl细胞培养上清，按顺序加入新的96孔板中，加入20μl0.05%CHAPS，加入200μl显色底物，室温避光孵育2h，Bio-Rad550型酶标仪测定405nm波长下的OD值。结果判定：中和抗体的滴度定义为SEAP活性较阴性对照组降低50%的血清最大稀释度。结果显示，含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒免疫诱导的血清中和抗体平均滴度可达1:80（P<0.01），参见图4。

本发明提供如上限定的含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒作为预防和治疗子宫颈癌以及食管癌疫苗的应用。根据本发明含SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒的一个优选实施方案，含SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的重组腺病毒疫苗可诱导产生良好的细胞免疫，通过ELISPOT检测特异性斑点数不低于870/10⁶细胞，同时可在免疫小鼠体内诱导不小于1：40的抗HPV血清交叉中和抗体。

1.序列1

SEQ ID No：1所示的核苷酸序列：

1atgaggcaca agaggagcgc caagaggacc aagagggcca gcgccaccca gctgtacaag

61acctgcaagc aggccggcac ctgccccccc gacatcatcc ccaaggtgga gggcaagacc

121atcgccgacc agatcctgca gtacggcagc atgggcgtgt tcttcggcgg cctgggcatc

181ggcaccggca gcggcaccgg cggcaggacc ggctacatcc ccctgggcac caggcccccc

241accgccaccg acaccctggc ccccgtgagg ccccccctga ccgtggaccc cgtgggcccc

301agcgacccca gcatcgtgag cctggtggag gagaccagct tcatcgacgc cggcgccccc

361accagcgtgc ccagcatccc ccccgacgtg agcggcttca gcatcaccac cagcaccgac

421accacccccg ccatcctgga catcaacaac accgtgacca ccgtgaccac ccacaacaac

481cccaccttca ccgaccccag cgtgctgcag ccccccaccc ccgccgagac cggcggccac

541ttcaccctga gcagcagcac catcagcacc cacaactacg aggagatccc catggacacc

601ttcatcgtga gcaccaaccc caacaccgtg accagcagca cccccatccc cggcagcagg

661cccgtggcca ggctgggcct gtacagcagg accacccagc aggtgaaggt ggtggacccc

721gccttcgtga ccacccccac caagctgatc acctacgaca accccgccta cgagggcatc

781gacgtggaca acaccctgta cttcagcagc aacgacaaca gcatcaacat cgcccccgac

841cccgacttcc tggacatcgt ggccctgcac aggcccgccc tgaccagcag gaggaccggc

901atcaggtaca gcaggatcgg caacaagcag accttgagga ccaggagcgg caagagcatc

961ggcgccaagg tgcactacta ctacgacttg agcaccatcg accccgccga ggagatcgag

1021ctgcagacca tcacccccag cacttacacc accaccagcc acgccgccag ccccaccagc

1081atcaacaacg gcctgtacga catctacgcc gacgacttca tcaccgacac cagcaccacc

1141cccgtgccca gcgtgcccag caccagcctg agcggctaca tccccgccaa caccaccatc

1201cccttcggtg gcgcctacaa catccccctg gtgagcggcc ccgacatccc catcaacatc

1261accgaccagg cccccagcct gatccccatc gtgcccggca gcccccagta caccatcatc

1321gccgacgccg gcgacttcta cctgcacccc agctactaca tgctgaggaa gaggaggaag

1381aggctgccct acttcttcag cgacgtgagc ctggccgcct ga

2.序列2

上游引物：

tatagaattcatgaggcacaagaggagcgc

下游引物：

tatcaagctttcaggcggccaggctcacgt

Claims (4)

1.HPV16L2重组腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述腺病毒含有密码子优化型HPV16L2的核苷酸序列SEQ ID No：1，包括如下步骤：

(1)使用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化重组腺病毒穿梭质粒pDC316，然后将回收片段和同样用内切酶EcoRI和HindIII双酶切的SEQ ID No：1所示的核苷酸片段连接，得到重组腺病毒穿梭质粒pDC316-HPV16L2；

(2)用步骤（1）制备的重组腺病毒穿梭质粒和重组腺病毒骨架质粒共转染腺病毒包装细胞，得到携带有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的HPV16L2重组腺病毒疫苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的腺病毒骨架质粒是质粒pBHGloxΔE1,3Cre。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的腺病毒包装细胞是质293细胞。

4.根据权利要求1所述的方法制备的HPV16L2重组腺病毒疫苗的应用，其特征在于，所述复制缺陷型重组HPV16L2腺病毒应用于制备预防和治疗有一种或多种HPV病毒引起的子宫颈癌以及食管癌的药物制剂，所述一种或多种HPV病毒选自16、18、31和45型。

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