CN105031625A - 一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物，包括0.01重量份的LK蛋白、1.5重量份的卡拉胶、5重量份的卡波姆、50重量份的甘油、0.1重量份的尼泊金乙酯。该组合药物为凝胶剂、栓剂、敷料中一种。其能够预防和治疗女性人乳头瘤病毒感染，以及预防和治疗女性妇科革兰氏阴性细菌感染。

Description

一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及抗癌药物制取领域，具体涉及一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物及其制备方法。

背景技术

宫颈癌，是我国总癌症发病率的第四位，女性恶性肿瘤发病和死亡率的第二位，研究发现在99.7%左右宫颈癌患者中可检测到HPV，其中高危型HPV与宫颈癌密切相关。每年全球有超过50万新发宫颈癌病例，超过20万女性死于宫颈癌。中国每年有近10万宫颈癌新发病例，占了世界新发病例总数的将近20%。宫颈癌是第一个由世界卫生组织(WHO)确认的完全由HPV感染所引起的癌症。HPV属乳多空病毒科A亚群内的一组DNA病毒，为20面体立体的病毒，无包膜，直径45～55mm，相对分子质量为5×10⁶。该病毒常存在于人体各部，为嗜上皮性病毒。目前已分出100余种HPV的DNA，其中30多种与宫颈感染和病变有关。根据其致病力的大小分为高危型和低危型两种，其中HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、108等12种归为低危型，主要引起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤样变(CINⅠ),多呈一过性，可自然逆转；高危型主要为HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82等15种，主要导致CINⅡ-Ⅲ级病变和宫颈癌的发生,持续高危型HPV感染的CINⅠ级易进展为CINⅡ-Ⅲ。高危型HPV与CINⅢ和宫颈癌有关，是导致宫颈癌的主要原因，其中高危型HPV16和18与宫颈癌的发生相关性最强。

HPV广泛存在于自然界，人的皮肤、消化道、呼吸道等都携带有HPV。凡是有性生活的女性，都可能通过性接触感染HPV，有70-80%的女性在一生中至少一次会感染HPV。人类的各种癌症由于病因复杂，目前科学技术难以有效预防及时发现，并早期治疗，而宫颈癌是目前唯一能够确定病因是因为感染HPV病毒而发病，因而是所有癌症中，唯一能有效预防、及时发现、并能早期治疗的癌症。国际上以HPV为靶标的宫颈癌疫苗研究为主，部分疫苗已完成I/II期临床试验，准备进行更深入的研究，但临床应用尚有诸多问题，如临床副作用和对环境的安全性，HPV病毒的严格种属特异性，无法建立动物模型评价疫苗的免疫效果以及疫苗自身的安全性问题等，影响其研究进程。国内HPV疫苗还在起步阶段，大部分研究集中于中药制剂的开发。但由于检测手段的限制，HPV的检测采用的是组织病理学、阴道镜学或PCR等方法，尚未运用到HC2（HPVDNA第二代杂交捕获检测技术），且未能对其进行定量研究。

目前，国际国内都倾注了极大的热情在研发新型的对多种HPV毒株都具有预防及控制效应的药物及生物制剂上，但是一直没有突破性的进展。在国际上能有效预防和控制HPV病毒感染的药物还相对缺乏，而在治疗上由于没有特效药因而采用的免疫调节药物由于普遍存在无法有效地预防HPV感染、疗效不明确、价格昂贵等方面的缺陷而大大控制了其在临床上的使用，特别是在低收入的发展中国家。

发明内容

本发明的首要目的就是提供一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物及其制备方法，其能够预防和治疗女性人乳头瘤病毒感染，以及预防和治疗女性妇科革兰氏阴性细菌感染。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案进行实施：

一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物，包括0.01重量份的LK蛋白、1.5重量份的卡拉胶、5重量份的卡波姆、50重量份的甘油、0.1重量份的尼泊金乙酯。该组合药物为凝胶剂、栓剂、敷料中一种。

一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物的制备方法，包括如下操作步骤：

S1：按照配比称取各原料，将0.5g卡波姆在80℃的水中搅拌至充分溶胀，并加0.15g卡拉胶，搅拌至完全溶解，趁热经0.22μm膜过滤灭菌，得1号溶液；

S2：将0.01g尼泊金乙酯溶解于水中，再加入5g甘油，经0.22μm膜过滤灭菌，得2号溶液；

S3：将2号溶液在搅拌条件下加至1号溶液中混匀，加入适量三乙醇胺，调pH至5.5，得3号溶液；

S4：常温下低速搅拌将0.001gLK蛋白溶于适量水中，经0.22μm膜过滤灭菌，得4号溶液；

S5：在一定温度搅拌下，将4号溶液加入3号溶液中混匀，用已灭菌的三乙醇胺溶液调pH至5.5；

S6：最后加水至100g搅匀即得组合药物，组合药物为凝胶剂。

该组合药物可用于预防和治疗女性人乳头瘤病毒感染，以及用于预防和治疗女性妇科革兰氏阴性细菌感染。

本发明另一个目的是提供一种电荷修饰的乳铁蛋白制备方法，其包括如下操作步骤：

B1：将3-羟基-邻苯二甲酸酐溶于二甲基亚砜配制成饱和HP溶液，将乳铁蛋白溶于0.1M磷酸钠溶液配制成20mg/mL的蛋白溶液；

B2：将饱和HP溶液和20mg/mL的蛋白溶液混匀，调节pH至10，25℃静置1h，采用pH7.4的PBS透析，经0.45μm膜过滤除菌即得电荷修饰的乳铁蛋白。

乳铁蛋白具有广谱的抗病毒活性，并且其活性大小与其所带的负电荷多少密切相关。经过高新生物科技修饰后得到的活笥蛋白表面带有更多的负电荷，这些负电荷（阴离子）与病毒蛋白颗粒上的正电荷（阳离子）相互络合导致病毒蛋白构象变化而失活。同时，该活性蛋白对阴道正常菌群没有影响，非常适合在阴道产品中使用。因此，通过活性蛋白表面的负电荷与HPV颗粒上的正电荷相互络合，从而导致HPV蛋白构象变化而失活，阻止了病毒与宿主细胞的结合。另外，选择的卡拉胶除了可将失活的HPV吸附、包裹排出体外，本身还具有广谱的抗病毒活性，并对女性人乳头瘤病毒具有抑制效果，因此本产品适用于阻断HPV感染和传播；用于预防及治疗HPV感染引起的宫颈病变、生殖道疣以及治疗后的复发，安全有效预防宫颈癌的发生。此组合药物具有HPV感染转阴率最高，使用方便，安全无副作用等特点。

具体的说，该组合药物具有如下特点：

a、此组合药物相比其它抗HPV感染产品，具有转阴率最高，疗效好这一最大特点。

b、组合药物还适用于任何年龄的HPV感染女性，可以反复使用。即可预防宫颈癌又可治疗HPV感染，包括慢性宫颈炎、宫颈上皮发育不良，包括CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ度等，防治两用。

c、广谱抗HPV感染，不仅对HPV16和HPV18感染有效，对其它型别一样具有保护作用。

d、由于修饰的乳铁蛋白与卡拉胶均具有很强的抗病毒活性，它即可抑制由于HPV16和18的被抑制而导致的其它型别HPV繁殖。

e、不含任何可能对阴道有刺激性的物质。

f、使用方便，安全无副作用，无疼痛。

附图说明

图1为组合药物的制备流程图；

图2为电荷修饰的乳铁蛋白制备方法；

图3为S2和LK对假病毒感染的影响的数据分析图。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体说明。应当理解，以下文字仅仅用以描述本发明的一种或几种具体的实施方式，并不对本发明具体请求的保护范围进行严格限定。

下述所用原料，如无特别说明，均可通过商业途经购买得到，

实施例1：电荷修饰乳铁蛋白的制备

将1.65（0.8～16.5）重量份的3-羟基-邻苯二甲酸酐（HP）置于10mL小烧杯中，加入适量二甲基亚砜（DMSO），在磁力搅拌中以200～500rpm搅拌，同时逐滴加入DMSO至约10（5～100）重量份，配制成饱和HP溶液；在200～500rpm搅拌下，取2g乳铁蛋白溶于100mL0.1M磷酸钠缓冲溶液中配制成20mg/mL的蛋白溶液；再取饱和HP溶液和20mg/mL的蛋白溶液按1:100的比例混合，搅拌15～30min混合均匀，并用磷酸或磷酸钠调节pH至10，25℃静置1h，采用pH7.4的PBS透析，经0.45μm膜过滤除菌即得电荷修饰的乳铁蛋白，具体如图1所示。

实施例2：组合药物

该组合药物由0.01重量份的LK蛋白(电荷修饰的乳铁蛋白)、1.5重量份的卡拉胶和辅料组成，共计100重量份，辅料包括5重量份的卡波姆、50重量份的甘油、0.1重量份的尼泊金乙酯，该组合药物为凝胶剂、栓剂、敷料中一种。

实施例3：组合药物的制备方法

S1：按照配比称取各原料，将0.5g卡波姆在80℃的水中搅拌至充分溶胀，并加0.15g卡拉胶，搅拌至完全溶解，趁热经0.22μm膜过滤灭菌，得1号溶液；

S2：将0.01g尼泊金乙酯溶解于水中，再加入5g甘油，经0.22μm膜过滤灭菌，得2号溶液；

S3：将2号溶液在搅拌条件下加至1号溶液中混匀，加入0.8g三乙醇胺，调pH至5.5，得3号溶液；

S4：常温下低速搅拌将0.001gLK蛋白溶于适量水中，经0.22μm膜过滤灭菌，得4号溶液；

S5：在一定温度搅拌下，将4号溶液加入3号溶液中混匀，用已灭菌的三乙醇胺溶液调pH至5.5；

S6：最后加水至100g搅匀即得组合药物，组合药物为凝胶剂，具体如图2所示。

实施例4：组合药物的临床试验及其结果

临床前抗病毒试验的具体的操作为：

1、用DMEM-10（含10%FBS的DMEM高糖培养基）作为溶剂，配制样品溶液，备用；

2、参考http://home.ccr.cancer.gov/lco/pseudovirusproduction.htm进行假病毒PsV16及PsV18的生产、纯化及滴度测定。

3、进行假病毒感染抑制实验，具体方法如下：首先用DMEM-10分别对样品和假病毒进行稀释，PsV用量确定为可使15%的293TT细胞感染阳性的加入量，样品的用量如图3所示。然后将假病毒和样品稀释液混匀，取100μl混匀液加入预先接种293TT的96孔板中（3.0×104cells/well），37℃，5%CO2培养72h，收集细胞进行流式检测，分析感染细胞的百分比，计算感染抑制率，考察S2和Lactoferrin抑菌作用活性。抑制率的计算方法参照PLoSONE,9(5):e95448,2014。

4、同时观察两种样品溶液对细胞生长活性影响；

5、根据感染抑制率，分析两种样品抑制HPV假病毒（PsV）感染的差异。

临床前抗病毒试验的结果为：

1、电荷修饰乳铁蛋白(LK蛋白)与电荷修饰的β-乳球蛋白(S2蛋白)均有很好的抑菌作用，在DMEM-10，双抗培养基中，当S2和Lactoferrin的浓度分别为500ug/ml及250ug/ml时，虽未无菌过滤，但37℃，5%CO2培养5天后均未见细菌生长。

2、对细胞生长活性影响的分析：使用含样品的DMEM-10培养基，在不同时间（24h，48h，72h）点观察含不同浓度（250μg/ml，400μg/ml，500μg/ml）的S2或LK对293TT的生长活性的影响，发现500μg/ml的S2对293TT生长的影响不明显，而在500μg/ml的LK组则出现细胞成团现象，且有20%的细胞脱落，但当LK的浓度降低至400μg/ml时，细胞生长状况正常。表明293TT细胞对S2的耐受性较LK的高。另外，由于293TT细胞属增殖极为活跃的细胞，对于人体正常细胞来说，LK蛋白比S2耐受性会更好。

3、LK和S2均能有效抑制假病毒感染：本实验采用的PsV含GFP报告基因，感染细胞后可表达GFP，通过流式检测荧光阳性细胞的百分比可判定病毒的感染率。抗HPV感染物质与PsV共孵育后再感染细胞，可降低荧光阳性细胞的比率，计算可得出感染抑制率，目前认为感染抑制率≥50%，为有效抑制感染。结果如图3所示，LKS2与对PsV16，PsV18的感染抑制作用都是浓度依赖性的，本实验检测到的LK最大感染抑制率已接近100%，比S2对HPV感染抑制率更高。但两者最大感染抑制率均未达100%。IC50分析显示，S2和LK抑制PsV16感染的IC50分别为141.35μg/ml和49.68μg/ml（图3中左栏，对PsV16的感染抑制作用），抑制PsV18感染的IC50分别为146.73μg/ml和102.70μg/ml（图3中右栏，对PsV18的感染抑制作用）。结果表明，S2和LK均能有效抑制PsV16及PsV18的感染，LK对PsV16/18的感染抑制活性较S2的更强。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在获知本发明中记载内容后，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对其作出若干同等变换和替代，这些同等变换和替代也应视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物，包括0.01重量份的LK蛋白、1.5重量份的卡拉胶、5重量份的卡波姆、50重量份的甘油、0.1重量份的尼泊金乙酯。

2.根据权利要求1所述的电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物，其特征在于：该组合药物为凝胶剂、栓剂、敷料中一种。

3.一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物的制备方法，包括如下操作步骤：

S1：按照配比称取各原料，将0.5g卡波姆在80℃的水中搅拌至充分溶胀，并加0.15g卡拉胶，搅拌至完全溶解，趁热经0.22μm膜过滤灭菌，得1号溶液；

S2：将0.01g尼泊金乙酯溶解于水中，再加入5g甘油，经0.22μm膜过滤灭菌，得2号溶液；

S3：将2号溶液在搅拌条件下加至1号溶液中混匀，加入适量三乙醇胺，调pH至5.5，得3号溶液；

S4：常温下低速搅拌将0.001gLK蛋白溶于适量水中，经0.22μm膜过滤灭菌，得4号溶液；

S5：在一定温度搅拌下，将4号溶液加入3号溶液中混匀，用已灭菌的三乙醇胺溶液调pH至5.5；

S6：最后加水至100g搅匀即得组合药物，组合药物为凝胶剂。

4.一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物的用途，是将该组合药物用于预防和治疗女性人乳头瘤病毒感染。

5.一种电荷修饰的乳铁蛋白与卡拉胶组合药物的用途，是将该组合药物用于预防和治疗女性妇科革兰氏阴性细菌感染。