CN113679716B - 溴酚-吡唑啉化合物在治疗猫冠状病毒疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及溴酚‑吡唑啉类化合物在治疗猫冠状病毒疾病中的应用。本发明研究发现溴酚‑吡唑啉类化合物能够抑制抑制猫传染性腹膜炎病毒主蛋白酶（FIPV Mpro）的活性，干扰细胞中猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）的复制。在临床实验中，溴酚‑吡唑啉类化合物能够治疗FIPV自然感染的猫传染性腹膜炎，极大的提高病猫的存活率，可用于制备治疗猫传染性腹膜炎的药物。

Description

溴酚-吡唑啉化合物在治疗猫冠状病毒疾病中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及溴酚-吡唑啉类化合物的新用途，尤其是溴酚-吡唑啉类化合物在预防/治疗猫冠状病毒疾病中的应用。

背景技术

猫冠状病毒(FCV)属于冠状病毒科尼多病毒目，是一种有囊膜的不分节段单股正链RNA病毒。猫肠道冠状病毒(FECV)是最常见的FCV，其在全世界的猫中普遍存在，能够通过粪口传播，但本身不是严重病原体。大约有5％的FECV持续感染的猫会产生高度致死性突变体猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。FECV突变为FIPV后，失去感染健康猫咪的能力，但致病性和致死率大大提高。

FIPV能够在单核巨噬细胞内有效的可持续复制，并随着单核巨噬细胞在体内的循环而扩算到全身各处，引起宿主猫的免疫系统的过激反应，从而发病、死亡。传染性腹膜炎(FIP)的常见发生病变的部位是浆膜、肾脏、肠系膜淋巴结、脑、眼睛、肝脏、脾脏和肺脏，临床症状包括腹水、呼吸困难、葡萄膜炎、共济失调、顽固性发热、嗜睡、厌食、黄疸和体重减轻。

FIP被认为是猫咪界的“不治之症”，如果不及时治疗，一般两个月左右病猫就会死亡，致死率接近100％。在美国和一些欧洲国家有一种FCoV疫苗，该疫苗通过鼻腔给药，可针对温度敏感性FCoV突变毒株，但其功效存在争议。因为实验过程中观察到抗体依赖性增强现象，导致接种疫苗后发生FIP的猫却比对照组多。

针对FIP，目前还没有简单、明确的治疗方法。现多采取对症下药的支持疗法进行治疗，治疗思路是通过抑制病毒复制、抑制炎症反应、刺激免疫系统及减少再感染风险以帮助猫机体自主克服该病。一种处于研发阶段的核苷类似物(GS-441524)被发现可通过直接干扰病毒编码的复制过程，可用于治疗自然感染的FIP。注射4mg/kg的GS-441524连续治疗4周后，60％左右FIP病猫病情有所缓解。虽然GS-441524可用于治疗FIP，但是价格昂贵(每月1.32万)，治愈率不高且易复发，开发口服、高效的靶向性FIP新药具有重要意义。

溴酚-吡唑啉类化合物是发明人前期研究开发设计的具有抑制人新型冠状病毒活性的化合物，在制备治疗人冠状病毒肺炎的药物中具有广阔的应用前景。后续研究发现其在猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)也有治疗作用。因此，溴酚-吡唑啉类化合物是一类极具药用潜力的化合物，进一步发现其新的药用功效，特别是本发明的猫冠状病毒疾病的预防/治疗将具有十分重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供溴酚-吡唑啉类化合物新的医药用途。

发明研究发现，溴酚-吡唑啉类化合物能够抑制猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的复制；在临床试验中能够治疗猫传染性腹膜炎，极大提高病猫的存活率，可用于制备治疗猫冠状病毒疾病的药物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的提供一类溴酚-吡唑啉类化合物在制备治疗猫冠状病毒疾病的药物中的应用。

上述应用中，所述溴酚-吡唑啉类化合物具有如下式I所示的结构通式：

其中：R₁、R₂、R₃、R₄、R₅分别选自H、F、Br、OH、OCH₃中的任一种；

R₆选自H、CHO、COCH₃、COCH₂CH₃、COCH₂CH₂CH₃、COOCH₃、COOCH₂CH₃、Ph、CH₂Ph、CONH₂、CSNH₂或中的任一种；

R₇、R₈、R₉分别选自H、F、Cl、Br、NO₂、OH、CH₃、OCH₃或中的任一种；

所述中的R₁₀、R₁₁、R₁₂分别选自H、F、Cl、Br、NO₂、OH、CH₃、C₂H₅、OCH₃、OC₂H₅、异丙基、异丁基、叔丁基、特戊基中的任一种。

上述应用中，所述猫冠状病毒疾病是由猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)引起的猫传染性腹膜炎(FIP)。

本发明的有益效果：

本发明首次研究发现，溴酚-吡唑啉类化合物能够抑制猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的复制；临床试验证明，溴酚-吡唑啉类化合物能够治疗由FIPV等引起的猫传染性腹膜炎(FIP)，极大提高病猫的存活率，可用于制备治疗FIP的药物。

附图说明

图1为本发明实施例提供的化合物1-8对FIPV M^pro的抑制活性测定结果。测定不同浓度的化合物对FIPVM^pro活性的影响，通过非线性回归确定半数最大抑制浓度(IC₅₀)值；

图2为本发明实施例提供的化合物1-8在细胞中抑制FIPV复制的测定结果，评价不同浓度的化合物对病毒RNA复制的影响。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。具体实施例中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)引起猫传染性腹膜炎具有非常高的致死率，但目前尚无针对猫传染性腹膜炎的有效治疗药物。

针对2019年底爆发的新冠病毒肺炎疫情，发明人研发一种能够高效抑制新型冠状病毒(COVID-19)的溴酚-吡唑啉类化合物，其具有治疗冠状病毒肺炎的功效(具体见中国专利公开号CN111848516A)。后续的研究发现，溴酚-吡唑啉类化合物能够治疗猪冠状病毒PEDV和TGEV引起的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒(具体见中国专利公开号CN112472698A)。

虽然FIPV与COVID-19、PEDV和TGEV同属冠状病毒，但是在宿主、病毒特性、感染细胞种类、病变组织、发病症状等方面具有较大不同：

(1)宿主不同。FIPV与COVID-19、PEDV和TGEV同源性较低，亲缘关系较远，病毒结构具有很大不同，相互之间不具有跨物种传染性。目前还未发现有人源性冠状病毒、猪冠状病毒与猫冠状病毒跨物种感染的现象；

(2)病毒特性不同。FIPV都是由猫肠道冠状病毒(FECV)变异而来，病猫的FIPV不具备传染性。与之不同，COVID-19、PEDV和TGEV具有较强的传染性；

(3)感染细胞种类不同。FIPV感染猫的单核巨噬细胞，引起全身免疫系统过激反应。COVID-19感染人的肺部细胞，PEDV和TGEV感染猪的肠道上皮细胞；

(4)病变组织不同。FIPV能够引起猫的浆膜、肾脏、肠系膜淋巴结、脑、眼睛、肝脏、脾脏和肺脏等多个组织和器官的病变。COVID-19引发人的肺炎，PEDV和TGEV引发肠炎；

(5)发病症状不同。FIPV的发病症状较多，包括腹水、呼吸困难、葡萄膜炎、共济失调、顽固性发热、嗜睡、厌食、黄疸和体重减轻。COVID-19症状有发热、咳嗽、胸闷、呼吸困难。PEDV和TGEV的症状是腹泻。

因此，猫冠状病毒FIPV与人冠状病毒COVID-19、猪冠状病毒PEDV和TGEV属于不同类型的病毒，能够抑制人新型冠状病毒、猪冠状病毒的物质是难以预知其对猫冠状病毒的作用和效果的。

为进一步拓展溴酚-吡唑啉类化合物的药用领域，本发明进行了大量的尝试，结果意外的发现，溴酚-吡唑啉类化合物对猫冠状病毒具有较好的抑制活性，能够抑制FIPV的复制；临床试验证明，溴酚-吡唑啉类化合物能够治疗由FIPV引起的猫传染性腹膜炎，极大提高病猫的存活率，由此提出了本发明。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

其中：示例化合物1-8的结构式如下所示：

化合物1-8的合成方法参照发明人申请专利CN111848516A。

实施例1：溴酚-吡唑啉类化合物对猫传染性腹膜炎主蛋白酶FIPVM^pro抑制活性测定

(1)FIPVM^pro的表达纯化

将FIPVM^pro基因通过PCR、酶切以及连接等常规技术手段插入到p GEX-6P-1载体上。构建的载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞体内，37℃下在含有100mg/mL的氨苄青霉素的LB中培养至菌体的OD600达到0.6。0.5mM IPTG、16℃诱导蛋白表达16-18小时。收集的菌体使用悬菌缓冲液(140mM NaCl，10mM Na₂HPO₄，2.7mM KCl，1.8mM KH₂PO₄，1mM DTT,10％glycerol，pH 7.3)重悬，4℃高压破碎菌体。将菌体碎片离心去除，经GST亲和介质富集GST与FIPV M^pro的融合蛋白，PPase切除FIPV M^pro N端的GST标签。切除标签的FIPV M^pro经HiTrap Q(GE)与Superdex7510/300(GE)进一步纯化，得到纯度高于95％的FIPVM^pro。

(2)FIPVM^pro酶活测定方法

FIPV M^pro的活性测定使用缓冲液为50mM Tris-HCl pH 7.3，FIPV M^pro的浓度为1μM，荧光底物为MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys NH2(冠状病毒主蛋白酶荧光底物)，浓度为40μM，激发波长为320nm，检测波长为405nm。化合物1-8浓度梯度为20μM、10μM、5μM、2.5μM、1μM、0.5μM。分别测定化合物1-8对对FIPV主蛋白酶的抑制效果。

(3)化合物对FIPVM^pro抑制活性测定结果

如图1所示，溴酚-吡唑啉类化合物(1-8)对FIPVM^pro蛋白酶表现出显著的抑制作用，具有良好的治疗猫传染性腹膜炎的应用前景。

实施例2：溴酚-吡唑啉类化合物干扰细胞中FIPV病毒复制

为了进一步证实体外的酶促抑制结果，本发明评估了溴酚-吡唑啉类化合物是否可以在临床野生型FIPV感染的猫肾细胞(CRFK)细胞中阻止FIPV病毒复制。

具体操作：

于37℃，含5％CO₂的细胞培养箱中，用含有8％胎牛血清的DMEM培养CRFK细胞。待细胞长至密度为80％左右时，用5μM的待测溴酚-吡唑啉类化合物预处理1h，然后将FIPV野生株(MOI为0.1)接种CRFK细胞。同时设立接毒但不加化合物的CRFK细胞作为对照。24h后，收集细胞上清液，并对上清液中的vRNA进行qRT-PCR分析。

实验结果：

如图2所示，在野生型FIPV感染的CRFK细胞中，5μM浓度的化合物1-8都显示出较强的干扰FIPV病毒复制的能力，其中化合物5抑制FIPV病毒复制的能力最强。

实施例3：化合物5治疗猫传染性腹膜炎的临床试验

(1)传染性腹膜炎病猫的检测

血清学或形态学不能区分猫肠道冠状病毒和猫传染性腹膜炎病毒。根据发病史、流行病学、临床症状、实验室诊断、影像学检查和组织病理学检查等方法，排除其他疾病后，对病猫进行综合诊断。当病猫体重逐渐减轻、食欲减退、体温升高、血项出现轻度非再生性贫血、淋巴细胞减少症、血清球蛋白浓度增加、白球比相对于正常猫显著降低时，可认定为猫传染性腹膜炎病毒感染。

(2)临床试验分组和治疗方案

根据是否有明显的胸腔、腹腔积液、呼吸困难等症状(纤维性胸膜炎和腹膜炎)，将30只FIPV感染病猫分为湿性FIP组(17只)和干性FIP组(13只)。湿性FIP组(17只)随机分为对照组(3只)、GS-441524组(6只)、化合物5组(8只)。干性FIP组(13只)随机分为对照组(2只)、GS-441524组(5只)、化合物5组(6只)。

如表1所示，所有FIPV感染病猫根据各自症状进行对症常规治疗。湿性和干性GS-441524组：4.0mg/kg的剂量经皮下注射给药，每隔24小时皮下注射一次；湿性和干性化合物5组：3mg/kg，一日1次，给药方式为葡萄糖溶液冲服。

表1：FIPV感染病猫实验分组和治疗方案

每日至少一次测量直肠温度，同时观察体重、呼吸、食欲和活动情况。安排专人进行喂养，每日清洗并消毒食用器皿。对于食欲好的猫采用常规猫粮进行饲喂，并配合高蛋白宠物罐头作为营养补充；对于食欲不好的猫采用鼻饲、静脉注射等介入性营养补充方式进行营养补充，确保试验猫的营养摄入。同时观察排便以及排尿的量和形态。根据实际情况进行血常规指标、血清生化指标、腹部B超检查。

(3)临床试验结果

定义完成4周治疗时食欲、体重、呼吸、体温等体况良好、2次(间隔1周以上)血常规及血清生化检测指标的病例为有效。

临床试验结果如表2所示，化合物5治疗组，治疗1日后，开始进食正常猫粮，体温逐渐降低。治疗7日后，体温恢复正常，体重增加。腹水、呼吸困难、黄疸、淋巴结等症状消失。部分猫的眼部病变在48小时内开始明显消退，房水逐渐清澈。与阳性药GS-441524组相比，化合物5治疗组起效更快，死亡更少，有效率更高。以上结果说明，化合物5能够治疗FIPV感染的猫传染性腹膜炎。

表2：FIPV感染病猫临床试验结果

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (1)

1.溴酚-吡唑啉类化合物在制备治疗猫冠状病毒疾病的药物中的应用；所述猫冠状病毒疾病是由猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)引起的猫传染性腹膜炎；所述溴酚-吡唑啉类化合物具有如下式I所示的结构通式：

其中：R₁、R₂、R₄分别选自H、F、Br、OH、OCH₃中的任一种；

R₃为OH；R₅为H；

R₆选自H、CHO、COCH₃、COCH₂CH₃、COCH₂CH₂CH₃、COOCH₃、COOCH₂CH₃、Ph、CH₂Ph、CONH₂、CSNH₂、中的任一种；

R₇、R₈均为H；R₉分别选自H、Br、NO₂、OH、CH₃、OCH₃或中的任一种；

所述中的R₁₀、R₁₁、R₁₂分别选自H、Br、NO₂、OH、CH₃、C₂H₅、OCH₃、OC₂H₅、异丙基、异丁基、叔丁基、特戊基中的任一种。