CN102614506A

CN102614506A - 重组hpv16l2蛋白疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102614506A
Application number: CN2012100543704A
Authority: CN
Inventors: 曾毅; 周玉柏; 郭艳涛; 李泽琳
Original assignee: Beijing University of Technology
Current assignee: Beijing University of Technology
Priority date: 2012-03-05
Filing date: 2012-03-05
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2032-03-05
Also published as: CN102614506B

Abstract

本发明属于重组蛋白制备领域，涉及重组HPV16L2蛋白疫苗及其制备方法，该蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）。该蛋白疫苗有两种形式：一种为HPV16L2Ne-PTD融合蛋白；一种为HPV16L2Ne和PTD按等比例混合的混合物HPV16L2Ne+PTD。本发明将转导域多肽PTD的穿膜活性与HPV16L2蛋白的免疫原性协同作用，免疫原性较高；本发明用于制备重组HPV16L2蛋白疫苗，产生中和抗体的滴度明显提高，得到良好的预防效果。

Description

重组HPV16L2蛋白疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于重组蛋白制备领域，涉及重组HPV16L2蛋白疫苗及其制备方法，该蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2 Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）。

背景技术

人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）属乳多空病毒科，是无包膜的闭环双链DNA病毒。现已明确，高危型HPV如HPV16、18的持续感染与宫颈癌的发生密切相关，被确定为导致宫颈癌的主要病因，其中又以HPV16型最为常见（Bosch F X, J Natl Cancer Inst ,1995 ,87: 796–802.）。

中国专利“人宫颈癌的一种治疗性疫苗（专利号：ZL200810112765.9）”中，公开了人宫颈癌的治疗性的疫苗，该疫苗的活性成分为重组腺病毒，该疫苗是将包括HPV16mE67、HPV18mE67、HPV58mE67以及连接三者的短核苷酸片段的转录融合三基因片段插入Adeno-X的表达系统的病毒DNA中得到重组腺病毒载体，再将该腺病毒载体导入细胞中得到重组腺病毒。该治疗性疫苗虽然能引起宿主产生强烈的细胞和体液免疫反应，但以前的感染可能对疫苗的效果产生负面影响。

HPV16病毒样颗粒（Virus-Like Particles）由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2一起共同构成。研究表明，主要衣壳蛋白L1可以自组装形成病毒样颗粒结构（Virus Like Particles，VLPs），L1 VLPs可诱导机体产生高滴度的血清中和抗体，该抗体具有型别特异性，不同基因型的HPV L1 VLPs 之间没有或仅有微弱的交叉保护效果。近来的研究显示，不同型别HPV L1 VLPs的混合制剂在免疫时相互之间会产生竞争，导致疫苗整体免疫效果的下降(Ting Zhang,Vaccine, 2010, 28(19):3479-3487)且多个VLPs的混合制剂增加了接种蛋白剂量，加大了疫苗接种个体过敏的几率。大量的实验证实，HPV16L2蛋白的N端具有中和多种HPV基因型的交叉中和表位，是很有前景的候选宫颈癌疫苗（Kawana K，Virology,1998,245:353-359），然而，其免疫原性偏低制约了该疫苗的进一步应用。因此，提高HPV16L2蛋白免疫原性是决定该疫苗能否进入实用化阶段的重要因素。源于HIV-1 Tat的转导域多肽具有穿膜活性，可以将外源蛋白（融合或非融合）带入细胞内。有研究显示，转导域多肽可显著提高外源蛋白进入胞内的水平（Haibin Xia, Nature Biotechnology,2001, 19: 640-644）。

因此，在宫颈癌疫苗的领域，需要研发出一种将转导域多肽PTD的穿膜活性与HPV16L2蛋白的免疫原性协同作用，显著提高HPV16L2蛋白免疫原性的新型重组蛋白疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供重组HPV16L2蛋白疫苗及其制备方法；该重组HPV16L2蛋白疫苗将转导域多肽PTD的穿膜活性与HPV16L2蛋白的免疫原性协同作用，免疫原性较高。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

重组HPV16L2蛋白疫苗，该蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2 Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）。

进一步地，所述HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2Ne）是HPV16L2 1-88aa多肽片段或HPV16L2 1-200aa多肽片段；编码所述的HPV16L2 1-88aa多肽片段的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：1；编码所述的HPV16L2 1-200aa多肽片段的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：2。

进一步地，编码所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：3；所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No：4。

进一步地，该蛋白疫苗有两种形式：一种为HPV16L2Ne -PTD融合蛋白；一种为HPV16L2Ne蛋白和PTD蛋白按等比例混合的混合物HPV16L2Ne+PTD。

图1为重组HPV16L2蛋白疫苗基因的结构模式图。

本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：

重组HPV16L2蛋白疫苗的制备方法，该蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2 Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）；制备方法包括如下步骤：

步骤一、构建含PTD和HPV16L2Ne融合基因的重组蛋白表达载体，以及仅含HPV16L2Ne基因的重组蛋白表达载体；

步骤二、用步骤一制备得到的两种重组蛋白表达载体分别转化相关蛋白表达细胞，诱导表达得到所述的HPV16L2Ne-PTD融合蛋白和所述的HPV16L2Ne蛋白；

步骤三、将PTD蛋白与所述的HPV16L2Ne蛋白按等比例混合制成混合制剂，得到所述的混合物HPV16L2Ne+PTD。

进一步地，用于制备所述重组蛋白表达载体的质粒是pET-30a或pET-22b；

进一步地，所述相关蛋白表达细胞是BL-21细胞 [基因型：F-，ompT，hsdS_B(r_B-m_B-)，gal dcm(DE3)]。

本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：

重组HPV16L2蛋白疫苗的应用，蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2 Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）；所述重组HPV16L2蛋白疫苗应用于制备预防和治疗子宫颈癌的药物制剂中。

本发明相比现有技术具有以下有益效果：

本发明将转导域多肽PTD的穿膜活性与HPV16L2蛋白的免疫原性协同作用，免疫原性较高；本发明用于制备重组HPV16L2蛋白疫苗，产生中和抗体的滴度明显提高，得到良好的预防效果。

附图说明

图1：重组HPV16L2蛋白疫苗基因结构模式图。

图2：实施例1中的8种重组蛋白表达载体的结构示意图。

图3：实施例1中的重组HPV16L2蛋白疫苗抗HPV 交叉中和抗体的检测结果。

具体实施方式

实施例1：

所述HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2Ne）是HPV16L2 1-88aa多肽片段或HPV16L2 1-200aa多肽片段；编码所述的HPV16L2 1-88aa多肽片段的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：1；编码所述的HPV16L2 1-200aa多肽片段的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：2。

编码所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：3；所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No：4。

该蛋白疫苗有两种形式：该蛋白疫苗有两种形式：一种为HPV16L2Ne -PTD融合蛋白；一种为HPV16L2Ne蛋白和PTD蛋白按等比例混合的混合物HPV16L2Ne+PTD。

图1为重组HPV16L2蛋白疫苗基因的结构模式图。

本实施例的重组HPV16L2蛋白疫苗的制备方法包括以下步骤：

步骤一的详细操作过程如下：

Ⅰ、构建重组HPV16L2蛋白多肽基因序列：

本实施例共构建以下四种形式的重组HPV16L2蛋白多肽基因序列：

P16L2-88基因序列：只含有L2 N端1~88个氨基酸的基因序列；即为编码所述的HPV16L2 1-88aa多肽片段的基因序列，核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：1；

P16L2-88-PTD基因序列:含有L2 N端1~88个氨基酸的基因序列和PTD的基因序列；

P16L2-200基因序列:只含有L2 N端1~200个氨基酸的基因序列；即为编码所述的HPV16L2 1-200aa多肽片段的基因序列，核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：2。

P16L2-200-PTD基因序列:含有L2 N端1~200个氨基酸的基因序列和PTD的基因序列。

以上P16L2-88-PTD基因序列、P16L2-200-PTD基因序列中含有的PTD基因序列，即为编码所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的基因序列，核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：3；所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No：4。

A、P16L2-88基因序列的构建：以含HPV16L2基因（Genbank登录号：NC_001526.2）的PUC-HPV16L2质粒为模板，以G88F1和G881R1为引物进行PCR扩增，PCR反应体系是：模板质粒1μl，G88F1 1μl，G881R1 1μl，10×Pfu Buffer 10μl，dNTP 8μl，Pfu 2μl，ddH₂O 77μl，总体系100μl。经过30个循环（94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s）获得P16L2-88基因序列，PCR反应产物通过切胶回收进行纯化，得到所述的P16L2-88基因序列；具体操作参见试剂盒说明书。

B、P16L2-88-PTD基因序列的构建：以含HPV16L2基因（Genbank登录号：NC_001526.2）的PUC-HPV16L2质粒为模板，以G88F1和G881R2为引物进行PCR扩增，PCR体系：模板质粒1μl，G88F1 1μl，G881R2 1μl，10×Pfu Buffer 10μl，dNTP 8μl，Pfu 2μl，DMSO 5μl，ddH₂O 72μl，总体系100μl。经过30个循环（94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s）获得P16L2-88-PTD基因序列，PCR反应产物通过切胶回收进行纯化，得到所述的P16L2-88-PTD基因序列；具体操作参见试剂盒说明书。

C、P16L2-200基因序列的构建：以含HPV16L2基因（Genbank登录号：NC_001526.2）的PUC-HPV16L2质粒为模板，以G88F1和G881R3为引物，PCR体系及循环参数同实施例1（1），P16L2-200 PCR反应产物通过切胶回收进行纯化，得到所述的P16L2-200基因序列；具体操作参见试剂盒说明书。

D、P16L2-200-PTD基因序列的构建：以含HPV16L2基因（Genbank登录号：NC_001526.2）的PUC-HPV16L2质粒为模板，以G88F1和G881R4为引物，PCR体系及循环参数同实施例1（2），P16L2-200-PTD PCR反应产物通过切胶回收进行纯化，得到所述的P16L2-200-PTD基因序列；具体操作参见试剂盒说明书。

所述的PUC-HPV16L2质粒的构建方法为：

通过PCR扩增反应，将所述的HPV16L2基因（Genbank登录号：NC_001526.2）的两端引入HindIII和EcoRI酶切位点，得到带有酶切位点的HPV16L2 的基因片段；

对PUC18质粒用HindIII和EcoRI酶进行酶切反应，得到带有酶切位点的大片段；

将所述的带有酶切位点的HPV16L2的基因片段、带有酶切位点的大片段进行连接反应，得到连接产物；

将上述连接产物进行蓝白斑筛选，得到所述的PUC-16L2质粒。

以上四种重组HPV16L2蛋白多肽基因序列的结构模式图见附件图1。

以上PCR引物序列为：

引物G88F1序列：agtacatatgatgcgacacaaacgttctgc；

引物G881R1序列：tagactcgagaggagcaagtgtatctgtag；

引物G881R2序列：

attactcgagcgcacgcgcctgacgcgccgccgcacgcgcataaggagcaagtgtatc；

引物G881R3序列：tagactcgagtgtatccataggaatttcttc；

引物G881R4序列：

tagactcgagcgcacgcgcctgacgcgccgccgcacgcgcatatgtatccataggaatttcttc；

Ⅱ、构建含有重组HPV16L2蛋白多肽基因序列的表达载体：

A、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：

从37℃培养16~20h的新鲜平板上挑取DH5α单菌落，接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜（12~16h）。次日从上述培养物中吸取0.5ml按1:100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的OD600 值为3时，在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置1min，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mmol/L CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min 。4℃,4000rpm 离心10min，弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15％甘油的100mmol/L CaCl₂ 溶液重悬细菌沉淀，得到所述的大肠杆菌DH5α感受态细胞；将所述的大肠杆菌DH5α感受态细胞分装为200μl 每管，-80℃保存备用。

B、pET-30a载体质粒、pET-22b载体质粒的小量制备：

分别挑取 pET-30a、pET-22b质粒转化单菌落分别接种于5ml含卡那霉素或氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。分别将培养物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm离心30-60s，弃上清，用100μl预冷的溶液Ⅰ[50mmol/L Glucose, 25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 10mmol/L EDTA(pH8.0)]重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH,1%SDS），温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液Ⅲ(100ml 中含5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)温和混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE（pH 8.0）溶解沉淀，37℃水浴30~60min，分别得到所述的pET-30a载体质粒、pET-22b载体质粒；分别将所述的pET-30a载体质粒、pET-22b载体质粒置-20℃保存备用。

C、构建P30a-88重组蛋白表达载体、P30a-88-PTD重组蛋白表达载体、P22b-88重组蛋白表达载体、P22b-88-PTD重组蛋白表达载体、P30a-200重组蛋白表达载体、P30a-200-PTD重组蛋白表达载体、P22b-200重组蛋白表达载体、P22b-200-PTD重组蛋白表达载体：

将步骤Ⅰ中得到的所述的P16L2-88基因序列、P16L2-88-PTD基因序列、P16L2-200基因序列、P16L2-200-PTD基因序列分别用内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切；使用NdeⅠ和XhoⅠ对步骤Ⅱ-B中得到的所述的pET-30a载体质粒或pET-22b载体质粒进行双酶切。每个酶切体系为：以上每种基因序列 20μl，BSA 0.5μl，10×buffer4 5μl，内切酶NdeⅠ2μl，XhoⅠ2μl，ddH₂O 20.5μl，总的酶切体系50μl，37℃消化3-4h，分别得到酶切产物：P16L2-88、P16L2-200、P16L2-88-PTD、P16L2-200-PTD。

双酶切反应产物分别使用凝胶回收试剂盒进行纯化，具体操作参见试剂盒说明书。建立连接反应体系，将所述的酶切产物：P16L2-88、P16L2-200、P16L2-88-PTD、P16L2-200-PTD分别与载体质粒pET-30a、pET-22b分别进行连接，连接反应体系：以上每种酶切产物 7μl，每种载体质粒 1μl，10×连接buffer 1μl，T4连接酶 1μl。16℃连接过夜，分别得到连接产物。

将所述的连接产物分别加入100μl DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入500μl不含抗生素的LB培养基，将管转移至37℃摇床上，温育45min（转速<150rpm）。分别取50μl已转化的感受态细胞，用一个无菌的弯头玻璃涂布棒轻轻涂到含相应抗生素的琼脂平板表面,将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h。分别命名为P30a-88、P30a-88-PTD、P30a-200、P30a-200-PTD、P22b-88、P22b-88-PTD、P22b-200、P22b-200-PTD。分别挑取相应重组质粒转化单菌落接种于5ml含卡那霉素或氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。分别将培养物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm离心30-60s，弃上清，用100μl预冷的溶液Ⅰ[50mmol/L Glucose, 25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 10mmol/L EDTA(pH8.0)]重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH,1%SDS)，温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液Ⅲ(100ml 中含5mol/L KAc 60ml,冰乙酸11.5ml，水28.5ml)温和混匀，冰浴10min，12000rpm离心10min，小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA(100μg/ml)的TE（pH 8.0）溶解沉淀，37℃水浴30-60min后置-20℃保存备用，分别命名为P30a-88重组蛋白表达载体、P30a-88-PTD重组蛋白表达载体、P30a-200重组蛋白表达载体、P30a-200-PTD重组蛋白表达载体、P22b-88重组蛋白表达载体、P22b-88-PTD重组蛋白表达载体、P22b-200重组蛋白表达载体、P22b-200-PTD重组蛋白表达载体。图2为以上8种重组蛋白表达载体的结构示意图。

所述的P30a-88-PTD重组蛋白表达载体、P30a-200-PTD重组蛋白表达载体、P22b-88-PTD重组蛋白表达载体、P22b-200-PTD重组蛋白表达载体为所述的含PTD和HPV16L2Ne融合基因的重组蛋白表达载体；

所述的P30a-88重组蛋白表达载体、P30a-200重组蛋白表达载体、P22b-88重组蛋白表达载体、P22b-200重组蛋白表达载体为所述的仅含HPV16L2Ne基因的重组蛋白表达载体。

D、重组蛋白表达载体的鉴定：

建立酶切反应体系，分别双酶切所述的P30a-88重组蛋白表达载体、P30a-88-PTD重组蛋白表达载体、P30a-200重组蛋白表达载体、P30a-200-PTD重组蛋白表达载体、P22b-88重组蛋白表达载体、P22b-88-PTD重组蛋白表达载体、P22b-200重组蛋白表达载体、P22b-200-PTD重组蛋白表达载体；每个酶切体系为：以上每种重组蛋白表达载体5μl，BSA 0.2μl，10×buffer4 2μl，内切酶NdeⅠ1μl，XhoⅠ1μl，ddH₂O 10.8μl，总的酶切体系20μl，37℃消化2h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，酶切鉴定阳性菌落送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，确定以上各种重组蛋白表达载体构建正确。

步骤二、用步骤一制备得到的重组蛋白表达载体分别转化相关蛋白表达细胞，诱导表达得到所述的HPV16L2Ne-PTD融合蛋白和所述的HPV16L2Ne蛋白；

步骤二的详细操作过程如下：

Ⅲ、重组HPV16L2蛋白疫苗的表达和纯化：

Ａ、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL-21的构建：

将1μl实施例1中构建并经测序鉴定正确的P30a-88重组蛋白表达载体、P30a-88-PTD重组蛋白表达载体、P30a-200重组蛋白表达载体、P30a-200-PTD重组蛋白表达载体、P22b-88重组蛋白表达载体、P22b-88-PTD重组蛋白表达载体、P22b-200重组蛋白表达载体、P22b-200-PTD重组蛋白表达载体分别加入100μl BL-21感受态细胞[基因型：F-，ompT，hsdS_B(r_B-m_B-)，gal dcm(DE3)]中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。分别将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。分别将每管加入500μl不含抗生素的LB培养基，将管转移至37℃摇床上，温育45min（转速<150rpm）。分别取50μg已转化的感受态细胞，用一个无菌的弯头玻璃涂布棒轻轻涂到含有相应抗生素的琼脂平板表面,将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h，得到含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞，分别为：

含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-88、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-88-PTD、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-200、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-200-PTD、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-88、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-88-PTD、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-200、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-200-PTD。

B、重组HPV16L2蛋白的诱导表达：

分别挑取上述含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-88、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-88-PTD、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-200、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-200-PTD、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-88、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-88-PTD、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-200、含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-200-PTD的单菌落接种于50ml含卡那霉素（50μg/ml）或氨苄青霉素（60μg/ml）的LB培养基中，20℃振荡培养过夜。分别将50ml过夜培养物接入1L含卡那霉素（50μg/ml）或氨苄青霉素（60μg/ml）的LB培养液中，37℃搅拌培养2h以上，至对数中期（A₅₅₀=0.5-1.0）。分别在培养物中加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃诱导表达4h，得到诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-88、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-88-PTD、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-200、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-200-PTD、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-88、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-88-PTD、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-200、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-200-PTD。

C、重组HPV16L2蛋白的纯化：

a. HPV16L2重组蛋白P16L2-88和HPV16L2重组蛋白P16L2-88-PTD的纯化：

将步骤Ⅲ-B中得到的诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-88、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-88-PTD、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-88、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-88-PTD的菌液分别于4℃以5000g离心15min收集细胞。每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml结合缓冲液。分别加入溶菌酶至浓度1mg/ml，冰上放置30min。分别将混合物于4℃摇床上孵育10min。分别加入Triton-X100、DNase和RNase，终浓度分别为1%、5μg/ml和5μg/ml，再于4℃摇床上孵育10min裂解菌体。分别于4℃ 3000g离心30min，去除不溶性细胞碎片，收集上述各个蛋白表达细胞的细胞裂解上清液。

分别使用5ml的HiTrap FF预装柱，用10个柱体积的buffer1(20mM磷酸钠，500mM NaCl，PH 7.8)平衡柱子，将上述每种细胞裂解上清液以1ml/min流速上柱；用10个柱体积的buffer1(20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，PH 7.8)清洗5ml的HiTrap FF预装柱；再用10个柱体积的buffer2(20mM磷酸钠，500 mmol/L NaCl，PH 6.0)清洗5ml的HiTrap FF预装柱，直至穿透液A₅₅₀<0.5-1.0；用6个柱体积的洗涤缓冲液(20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，PH 5.5)洗柱子。分别用6个柱体积的低pH洗脱缓冲液(20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，PH 4.0)洗脱结合的蛋白；最后得到HPV16L2重组蛋白P16L2-88和HPV16L2重组蛋白P16L2-88-PTD。

其中，所述的诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-88、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-88经纯化后均得到所述的HPV16L2重组蛋白P16L2-88；诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-88-PTD、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-88-PTD经纯化后均得到所述的HPV16L2重组蛋白P16L2-88-PTD。

b. HPV16L2重组蛋白P16L2-200和HPV16L2重组蛋白P16L2-200-PTD的纯化：

将步骤Ⅲ-B中得到的诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-200、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-200-PTD、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-200、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-200-PTD的菌液于4℃以5000g离心15min。弃上清，称菌体沉淀湿重，每克湿重菌体加入3ml细胞裂解缓冲液[50mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，1mmol/L EDTA (pH 8.0)，100mmol/L NaCl]，用玻璃棒轻轻搅动，使菌体悬起。每克湿重菌体加入4μl 100mmol/L PMSF，80μl 10mg/ml溶菌酶，搅动20min。每克湿重菌体加入4mg脱氧胆酸，继续搅动。分别悬液37℃放置，不时用玻璃棒搅动，待其变粘时每克湿重菌体加入20μl 1mg/ml DNaseⅠ，得到上述各个蛋白表达细胞的细胞裂解液。分别将所述的细胞裂解液室温放置，直至不再粘稠，大约1h。分别将所述的细胞裂解液于4℃高速离心15min。弃上清，每克沉淀依次重悬于100μl含不同浓度（0.5、1、2mol/L）尿素的0.1mol/L Tris-Cl (pH 8.5)，44℃高速离心15min。分别弃上清，每克沉淀重悬于100μl含0.1mmol/L PMSF的包涵体溶解缓冲液Ⅰ[50mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，1mmol/L EDTA (pH 8.0)，100mmol/L NaCl，8mol/L尿素，0.1mmol/L PMSF]，室温放置1h，室温高速离心15min。弃沉淀，分别收集包涵体溶解上清纯化备用。

分别使用GE公司HiTrap FF 5ml预装柱，用10个柱体积含8mol/L尿素的buffer1(20mM磷酸钠，500mM NaCl，PH 7.8)平衡柱子，将上述收集的每种包涵体溶解上清以1ml/min流速上柱；用10个柱体积含8mol/L尿素的buffer1(20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，PH 7.8)清洗5ml的HiTrap FF预装柱；再用10个柱体积含8mol/L尿素的buffer2(20mM磷酸钠，500 mmol/L NaCl，PH 6.0)清洗5ml的HiTrap FF预装柱，直至穿透液A₅₅₀<0.5-1.0；用6个柱体积含8mol/L尿素的洗涤缓冲液(20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，PH 5.5)洗柱子；用6个柱体积低pH含8mol/L尿素的洗脱缓冲液(20 mmol/L磷酸钠，500 mmol/L NaCl，PH 4.0)洗脱结合的蛋白。分别将纯化的蛋白于4℃置于含6mol/L、4mol/L、2mol/L、0mol/L尿素的PBS缓冲液中进行透析以除去溶液中的尿素。使分别用BCA法对纯化蛋白进行定量，具体操作参见试剂盒说明书。最后得到HPV16L2重组蛋白P16L2-200和HPV16L2重组蛋白P16L2-200-PTD。

其中，诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-200、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-200经纯化后均得到所述的HPV16L2重组蛋白P16L2-200；诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL30a-200-PTD、诱导表达后的含重组HPV16L2基因序列的蛋白表达细胞BL22b-200-PTD经纯化后均得到所述的HPV16L2重组蛋白P16L2-200-PTD。

所述的HPV16L2重组蛋白P16L2-88-PTD、HPV16L2重组蛋白P16L2-200-PTD为所述的HPV16L2Ne-PTD融合蛋白；所述的HPV16L2Ne -PTD融合蛋白即可作为HPV16L2蛋白疫苗的形式之一。

所述的HPV16L2重组蛋白P16L2-88、HPV16L2重组蛋白P16L2-200为所述的HPV16L2Ne蛋白。

所述的PTD蛋白由中科亚光科技有限公司合成；所述的PTD蛋白即为所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）；编码所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：3；所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No：4。

本实施例中所述的重组HPV16L2蛋白疫苗免疫原性的研究:

Ａ、动物免疫：

4-6周龄，雌性BALB/c小鼠。共分14组，每组组各6只小鼠。PBS剂量为100μl/只，HPV16L2Ne-PTD融合蛋白疫苗（即HPV16L2蛋白疫苗的形式之一）、HPV16L2Ne和PTD按等比例混合的HPV16L2Ne+PTD（即HPV16L2蛋白疫苗的形式之二）及PTD单独免疫使用的剂量均为20μg/只，将上述剂量的重组HPV16L2蛋白疫苗分别与完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂充分混合，各组疫苗在0、2、4周于小鼠单侧胫前肌皮下注射，初次免疫使用完全弗氏佐剂混合疫苗，加强免疫使用不完全弗氏佐剂混合疫苗。动物免疫具体规程见表1。

表1：

B、血清标本的收集：

免疫前以眼眶取血方式分别采集各组小鼠血清，最后一次加强免疫2周后以摘眼球方式采集各组小鼠血清。室温静置30min后，5000rpm离心5min，收集血清，分装小份置-20℃保存。

C、抗HPV 交叉中和抗体的检测

按文献报道的方法（Buck,C.B.,D.V.Pastrana,D.R.Lowy, et, al. J. Virol. 2004, 78:751–757.）制备HPV16、18、31、45、58假病毒颗粒。在检测前6h接种3ｘ10⁴ /孔293FT细胞于96孔细胞培养板中，将HPV16、18、31、45、58假病毒颗粒与系列稀释的血清孵育1h，将假病毒颗粒-待测血清混合液加入接种有293FT细胞的96孔板上，继续孵育72h，取40μl细胞培养上清，按顺序加入新的96孔板中，加入20μl 0.05% CHAPS，加入200μl显色底物，室温避光孵育2h，Bio-Rad 550型酶标仪测定405nm波长下的OD 值。结果判定：中和抗体的滴度定义为SEAP活性较阴性对照组降低50%的血清最大稀释度。图3为以上抗HPV 交叉中和抗体的检测的结果，结果显示，含有PTD的重组HPV6L2蛋白疫苗对于以上5种假病毒颗粒的抑制率显著高于不含有PTD的重组HPV6L2蛋白疫苗。

本实施例提供如上限定的重组蛋白作为子宫颈癌预防性疫苗的应用。根据本实施例重组蛋白的一个优选实施方案，含PTD的重组HPV16L2蛋白疫苗（融合蛋白疫苗或混合形式疫苗）均能诱导更高的血清中和抗体，可在免疫小鼠体内诱导滴度不小于1：100的抗HPV交叉中和抗体，免疫后的血清对于不同型别病毒的抑制效果最高可以提升到60%。

Claims

1.重组HPV16L2蛋白疫苗，其特征在于，该蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2 Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）。

2.根据权利要求1所述的重组HPV16L2蛋白疫苗，其特征在于，所述HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2Ne）是HPV16L2 1-88aa多肽片段、或HPV16L2 1-200aa多肽片段；编码所述的HPV16L2 1-88aa多肽片段的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：1；编码所述的HPV16L2 1-200aa多肽片段的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：2。

3.根据权利要求1所述的所述的重组HPV16L2蛋白疫苗，其特征在于，编码所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的核苷酸序列为序列表中的SEQ ID No：3；所述的具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No：4。

4.根据权利要求3所述的重组HPV16L2蛋白疫苗，其特征在于，该蛋白疫苗有两种形式：一种为HPV16L2Ne -PTD融合蛋白；一种为HPV16L2Ne和PTD按等比例的混合的混合物HPV16L2Ne+PTD。

5.重组HPV16L2蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，该蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2 Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）；制备方法包括如下步骤：步骤一、构建含PTD和HPV16L2Ne融合基因的重组蛋白表达载体，以及仅含HPV16L2Ne基因的重组蛋白表达载体；步骤二、用步骤一制备得到的两种重组蛋白表达载体分别转化相关蛋白表达细胞，诱导表达得到HPV16L2Ne-PTD融合蛋白和HPV16L2Ne蛋白；步骤三、将PTD蛋白与所述的HPV16L2Ne蛋白按等比例混合制成混合制剂，得到混合物HPV16L2Ne+PTD。

6.根据权利要求5所述的重组HPV16L2蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，用于制备所述重组蛋白表达载体的质粒是pET-30a或pET-22b。

7.根据权利要求5或6所述的重组HPV16L2蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述相关蛋白表达细胞是BL-21细胞。

8.重组HPV16L2蛋白疫苗的应用，其特征在于，蛋白疫苗含有HPV16L2的N端多肽片段（HPV16L2 Ne）和具有穿膜活性的转导域多肽（PTD）；所述重组HPV16L2蛋白疫苗应用于制备预防和治疗子宫颈癌的药物制剂中。