RU2815763C1 - Композиция для иммуностимуляции и ее применение - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композиции для иммуностимуляции. Раскрыты адъювантная фармацевтическая композиция и вакцина, содержащие указанную композицию для иммуностимуляции. Также раскрыты применение композиции для иммуностимуляции при изготовлении вакцины; способы профилактики или лечения вирусной инфекции с помощью указанной композиции. Изобретение позволяет эффективно проводить иммуностимуляцию. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 9 табл., 15 ил., 14 пр.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится к области биофармацевтики. В частности, настоящее изобретение относится к композиции для иммуностимуляции, содержащей сапонин и CpG-олигодезоксинуклеотид, или состоящей из адъюванта, содержащего сапонин и CpG-олигодезоксинуклеотид, при этом в последовательности CpG-олигодезоксинуклеотида присутствует две или более копии мотива 5'-TTCGTT-3' или мотива 5'-TCGTCGTCG-3'. Настоящее изобретение также относится к применению композиции для иммуностимуляции в производстве лекарственного средства.

Уровень техники

Олигодезоксинуклеотиды CpG представляют собой новый класс агентов для иммуностимуляции, открытый в последние годы, и по своей химической природе представляют собой олигодезоксинуклеотид, содержащий цитозин-гуаниновый динуклеотид, который вызывает иммунный ответ, похожий на естественный иммунный ответ паттерн-распознающих рецепторов, распознающих CpG, и может связывать Toll-подобные рецепторы на клеточной мембране, что вызывает эффективный запуск иммунного ответа у млекопитающих через сигнальный путь, активируемый TLR9. Иммунная реакция, вызванная CpG, относится, главным образом, к типу Th1, который может индуцировать преобразование иммунного ответа из типа Th2 в тип Th1, таким образом, стимулируя клеточный иммунитет. Активация иммунореактивных клеток, таких как Т-клетки, В-клетки и NK (natural killers, естественные киллеры) - клетки и т.д., может привести к образованию большого количества различных цитокинов, таким образом усиливая специфический и неспецифический иммунные эффекты в организме, что является важным связующим звеном между врожденным и приобретенным иммунитетом.

Сапонины представляют собой класс гликозидов, агликоны которых являются тритерпеновыми и спиростановыми соединениями, и относятся к адъювантам растительного происхождения. Среди них сапонины квилайи (quillaja saponin (QS)) представляют собой сапонины, выделенные из квилайи, и QS-21 представляет собой наиболее известный сапонин серии QS. Однако QS-21 может индуцировать клеточный гемолиз и имеет некоторые системные и местные токсические/побочные эффекты. В исследовании Alving et al. (ALVING CR, MATY AS G, BECK Z, et al. Revue Roumaine de Chimie, 2016, 61 (8): 631-635.) было обнаружено, что липосомы ALF совместно с MPLA и QS-21 в качестве адъюванта против белка gp140 ВИЧ (вируса иммунодефицита человека) могли эффективно повышать титр антител в сыворотке. Ng et al. (NG H, FERNANDO G J P, DEPELSENAIRE А С I, et al. Scientific Reports, 2016, 6 (1): 228-230.) применили технику подкожного введения, нанопластырь, чтобы сформировать адъювантный комплекс с QS-21. Результаты показали, что в сравнении с традиционными внутримышечными инъекциями нанопластырь может значительно снижать дозировки антигена и QS-21 и индуцировать более высокие титры IgG (иммуноглобулина G) (Ziyi Han, Zhongliang Zeng, Modern Agricultural Science and Technology, 2019 (14): 220-221.).

Композиции для иммуностимуляции, содержащие сапонин и CpG-олигодезоксинуклеотид, были описаны уровне техники (WO 2001051083 A3), где CpG-олигодезоксинуклеотид содержит CpG1826 и CpG7909. Однако эффекты адъювантов на основе CpG, имеющих разные последовательности, значительно различаются вследствие структурного разнообразия CpG-олигодезоксинуклеотидов.

Следовательно, в настоящее время имеется необходимость в адъювантах и лекарственных препаратах с более сильным иммунным эффектом.

Сущность изобретения

В связи с потребностями в данной области изобретатели, авторы настоящего изобретения в результате всесторонних исследований неожиданно обнаружили композицию для иммуностимуляции с более сильным иммунным эффектом. В указанной композиции сапонин и CpG-олигодезоксинуклеотид проявляют высокоэффективный синергический эффект, который опосредуют более сильный иммунный ответ. Композиция для иммуностимуляции имеет существенные преимущества, когда применяется по отношению к различным антигенам или антигенным композициям.

Следовательно, задачей настоящего изобретения является обеспечение композиции для иммуностимуляции, которая может быть применена для изготовления различных лекарственных средств, чтобы получить иммуностимулирующую иммуногенность с высокой эффективностью.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение адъюванта для вакцины, который может индуцировать сильный иммунный ответ у млекопитающего.

Задачи настоящего изобретения были достигнуты при помощи следующих технических решений.

Согласно одному аспекту, в рамках настоящего изобретения предложена композиция для иммуностимуляции, содержащая сапонин и CpG-олигодезоксинуклеотид, или состоящая из адъюванта, содержащего сапонин и CpG-олигодезоксинуклеотид, причем в последовательности CpG-олигодезоксинуклеотида присутствует две или более копий мотива 5'-TTCGTT-3' или мотива 5'-TCGTCGTCG-3'.

В композиции для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению последовательность CpG-олигодезоксинуклеотида представляет собой любую последовательность, выбранную из следующих: CpG T1: TCG ТТС GTT CGT TCG ТТС GTT (SEQ ID NO: 6); CpG Т2: TCG ТТС GTT CGT TCG ТТС GTT CGT T (SEQ ID NO: 7); и CpG T3: TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG (SEQ ID NO: 8).

Предпочтительно, последовательность CpG-олигодезоксинуклеотида представляет собой CpG T1: TCG ТТС GTT CGT TCG TTC GTT (SEQ ID NO: 6).

В композиции для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению сапонин представляет собой один или более сапонин, который выбран из группы, состоящей из сапонина квилайи, гинсенозида, платикодина, астрагалозида, нотогинсенозида, глицирризина, сапонина из коры альбиции, офиопогонина, сайкосапонина или сапонина японского женьшеня. Предпочтительно, сапонин представляет собой сапонин квилайи, гинсенозид, платикодин или астрагалин А. Более предпочтительно, сапонин квилайи представляет собой QS-7, QS-17, QS-18 или QS-21. Более предпочтительно, сапонин квилайи представляет собой QS-21. Гинсенозид может представлять собой гинсенозид Rg1, гинсенозид Rg3, гинсенозид Rb1 или гинсенозид Re. Платикодин может представлять собой платикодин D, платикодин D2 или их смесь. Астрагалозид может представлять собой астрагалин А (астрагалозид IV), астрагалозид I, астрагалозид II или смесь двух или более мономеров указанных сапонинов. Нотогинсенозид может представлять собой нотогинсенозид R1. Офиопогонин может представлять собой офиопогонин D. Сайкосапонин может представлять собойсайкосапонин а, сайкосапонин d или их смесь. Сапонин из коры альбиции может представлять собой общие сапонины из коры альбиции. Глицирризин может представлять собой общие глицирризины. Сапонин японского женьшеня может представлять собой общие сапонины японского женьшеня.

В композиции для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению, адъювант, содержащий сапонин, представляет собой адъювант в формате иммуностимулирующего комплекса (адъювант Iscom).

В композиции для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению, CpG-олигодезоксинуклеотид содержит тиофосфатную связь. В частности, CpG-олигодезоксинуклеотид представляет собой тиоолигодезоксинуклеотид, предпочтительно, пертиоолигодезоксинуклеотид.

В композиции для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению, соотношение массы CpG-олигодезоксинуклеотида к сапонину представляет собой 1~40:0,1~2, предпочтительно 2~40:0,1~2, и более предпочтительно 2:1.

В другом аспекте, в рамках настоящего изобретения также предложена фармацевтическая композиция, содержащая композицию для иммуностимуляции и антиген или антигенную композицию.

В фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, антиген или антигенная композиция выбран(а) из группы, состоящей из вируса иммунодефицита человека, вируса герпеса человека, вируса ветряной оспы, цитомегаловируса человека, вирусов гепатита А, В, С или Е, респираторно-синтициального вируса, вируса папилломы человека, вируса гриппа, микобактерии туберкулеза, сальмонеллы, нейссерии (Neisseria), такой как Neisseria meningitidis или Neisseria gonorrhoeae, боррелии (Borrelia), такой как Borrelia recurrentis или Borrelia duttonii, хламидии (Chlamydia), такой как Chlamydia trachomatis, бордетеллы (Bordetella), такой как Bordetella pertussis, плазмодиума (Plasmodium), такого как Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax или Plasmodium knowlesi, или токсоплазмы (Toxoplasma), такой как Toxoplasma gondii.

В фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению вирус герпеса человека представляет собой HSV1 (human herpes virus 1) или HSV2.

В фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению антиген представляет собой опухолевый антиген.

В еще одном аспекте в рамках настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая композицию для иммуностимуляции.

Согласно настоящему изобретению вакцина представляет собой вакцину для профилактики вирусной, бактериальной или паразитарной инфекции или вакцину для лечения вирусной, бактериальной или паразитарной инфекции посредством иммунотерапии.

В еще одном аспекте, в рамках настоящего изобретения предложено применение композиции для иммуностимуляции для изготовления лекарственного средства, индуцирующего ответ цитолитических Т-клеток.

В некоторых особых вариантах реализации в рамках настоящего изобретения предложено применение композиции для иммуностимуляции для изготовления лекарственного средства для индукции ответа посредством γ-интерферона у млекопитающего.

В некоторых особых вариантах реализации в рамках настоящего изобретения предложено применение композиции для иммуностимуляции для изготовления вакцины для профилактики вирусной, бактериальной и/или паразитарной инфекции.

В некоторых особых вариантах в рамках настоящего изобретения предложено применение композиции для иммуностимуляции для изготовления вакцины для лечения вирусной, бактериальной и/или паразитарной инфекции посредством иммунотерапии.

В некоторых особых вариантах реализации в рамках настоящего изобретения предложено применение композиции для иммуностимуляции для изготовления вакцины для лечения опухоли посредством иммунотерапии.

В рамках настоящего изобретения также предложен способ индукции ответа цитолитических Т-клеток, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению.

В рамках настоящего изобретения также предложен способ индукции ответа посредством γ-интерферона у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению.

В рамках настоящего изобретения также предложен способ профилактики вирусной, бактериальной и/или паразитарной инфекции, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту профилактически эффективного количества вакцины, содержащей композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению.

В рамках настоящего изобретения также предложен способ лечения вирусной, бактериальной и/или паразитарной инфекции посредством иммунотерапии, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества вакцины, содержащей композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению.

В рамках настоящего изобретения также предложен способ лечения опухоли, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению.

Композиция для иммуностимуляции, предложенная в рамках настоящего изобретения, обеспечивает достижение неожиданного технического результата, заключающегося в опосредовании более сильного иммунного ответа. Иммуностимулирующий эффект только CpG Т1~Т3 слабее, чем иммунный эффект CpG1018, CpG7909 или CpG1826 и т.д. Однако, когда они комбинированы с QS-21, композиции для иммуностимуляции проявляют неожиданный синергический эффект, и иммунный эффект значительно возрастает.

В результате исследования в рамках настоящего изобретения было обнаружено, что терапевтическая вакцина против гепатита В, содержащая композицию для иммуностимуляции, может преодолевать иммунотолерантность трансгенных мышей и обеспечивать продукцию высоких титров антител против HBsAg, антител против HBcAg и нейтрализующих антител. Результаты различных тестов показали, что многократные иммунизации указанной вакциной могут в значительной степени элиминировать из организма трансгенных мышей вирус гепатита В. По окончанию процесса иммунизации уровень HBsAb был близок к насыщению, что могло поддерживать долговременный стабильный иммунный эффект, и средний уровень понижения HBsAb поддерживался приблизительно на 92%. Одновременно вакцина против гепатита В, содержащая композицию для иммуностимуляции, могла индуцировать образование более стабильного уровня HBsAg- и HBcAg-специфического интерферона-γ (IFN-γ), и иммунный эффект был значительно лучше, чем эффект либо только адъюванта, либо комбинации существующих адъювантов CPG и QS-21.

Вакцина против опоясывающего герпеса (herpes zoster), содержащая композицию для иммуностимуляции, также демонстрирует, что композиция для иммуностимуляции имеет превосходный иммуностимулирующий эффект. Эксперимент по изучению клеточного иммунитета показал, что указанная вакцина могла индуцировать более высокий уровень интерферона-γ, специфичного к белку gE герпеса, и белковый иммунный эффект был значительно лучше, чем эффект только адъюванта. Эксперимент по изучению гуморального иммунитета также показал, что вакцина могла вызывать образование более высокого уровня антител класса IgG/IgG1/IgG2a, к белку gE герпеса, и ее эффект превосходил эффект только адъюванта и значительно превосходил эффект комбинаций существующих адъювантов CPG и QS-21.

В заключение, композиция для иммуностимуляции, предложенная в рамках настоящего изобретения, имеет превосходный иммуностимулирующий эффект. По сравнению с только адъювантом или комбинациями существующих адъювантов CPG и QS-21, CpG Т1-Т3 и QS-21 композиция для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению демонстрирует высокоэффективный синергический эффект и может опосредовать более сильные иммунные ответы. Настоящее изобретение обеспечивает значительные преимущества при применении к различным антигенам и антигенным композициям. Следовательно, как новый тип адъюванта, композиция для иммуностимуляции, предложенная в рамках настоящего изобретения, имеет высокую прикладную клиническую ценность и широкие перспективы на рынке.

Краткое описание чертежей

Варианты реализации настоящего изобретения будут детально описаны ниже в сочетании с сопроводительными чертежами, в которых:

Фигура 1 показывает эффект влияния различных CPG-олигодезоксинуклеотидов на уровень секреции интерферона-γ, специфического к антигену HBsAg.

Фигура 2 показывает эффект влияния различных CPG-олигодезоксинуклеотидов на уровень секреции интерферона-γ, специфического к антигену HBcAg.

Фигура 3 показывает эффекты влияния различных композиций для иммуностимуляции, в соответствии с настоящим изобретением, на уровень секреции интерферона-γ, специфического к антигену HBsAg.

Фигура 4 показывает эффекты влияния различных композиций для иммуностимуляции, в соответствии с настоящим изобретением, на уровень секреции интерферона-γ, специфического к антигену HBcAg.

Фигура 5 показывает эффект влияния различных дозировок композиции для иммуностимуляции в соответствии с настоящим изобретением на уровень секреции интерферона-γ, специфического к антигену HBsAg.

Фигура 6 показывает эффекты влияния различных дозировок композиции для иммуностимуляции в соответствии с настоящим изобретением на уровень секреции интерферона-γ, специфического к антигену HBcAg.

Фигура 7 показывает эффекты влияния вакцин против гепатита В, содержащих композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению, на уровень HBsAg в сыворотке.

Фигура 8 показывает эффекты влияния вакцин против гепатита В, содержащих композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению на уровень HBsAg в сыворотке.

Фигура 9 показывает эффекты влияния вакцин против гепатита В, содержащих композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению, на уровень секреции интерферона-γ, специфического к антигену HBsAg.

Фигура 10 показывает эффекты влияния вакцин против гепатита В, содержащих композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению на уровень секреции интерферона-γ, специфического к антигену HBcAg.

Фигура 11 показывает эффекты влияния вакцин против гепатита В, содержащих композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению на уровни антитела IgG и его подтипов к антигену HBsAg в сыворотке мыши, а именно, панель А: уровни IgG против HBsAb в сыворотке мыши во всех группах; панель В: уровни IgG1 против HBsAb в сыворотке мыши во всех группах; панель С: уровни IgG2a против HBsAb в сыворотке мыши во всех группах; панель D: соотношение IgG2a против HBsAb и IgG1 против HBsAb в сыворотке мыши во всех группах.

Фигура 12 показывает эффекты влияния вакцин против гепатита В, содержащих композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению, на уровни антител IgG и его подтипов, специфичных к антигену HBcAg в сыворотке мыши, а именно, панель А: уровни IgG против HBcAb в сыворотке мыши во всех группах; панель В: уровни IgG1 против HBcAb в сыворотке мыши во всех группах; панель С: уровни IgG2a против HBcAb в сыворотке мыши во всех группах; панель D: соотношение IgG2a против HBcAb и IgG1 против HBcAb в сыворотке мыши во всех группах.

Фигура 13 показывает эффект влияния вакцин против опоясывающего герпеса, содержащих композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению на уровень секреции интерферона-γ, специфического к антигену gE герпеса.

Фигура 14 показывает эффект вакцин против опоясывающего герпеса, содержащих композицию для иммуностимуляции согласно настоящему изобретению на уровни антиген-специфичных антител IgG и их подтипов в сыворотке мыши, а именно, панель А: уровни IgG в сыворотке мыши во всех группах; панель В: уровни IgG1 в сыворотке мыши во всех группах; панель С: уровни IgG2a в сыворотке мыши во всех группах; панель D: соотношение IgG2a и IgG1 в сыворотке мыши во всех группах.

Фигура 15 показывает эффекты влияния композиций для иммуностимуляции, содержащих различные сапонины, в соответствии с настоящим изобретением, на уровень секреции интерферона-γ, специфического к антигену gE герпеса.

Определения

Все научные и технические термины, используемые в настоящей заявке, имеют такое же значение, как и понимаемое специалистом в данной области техники, если не указано иначе. Относительно определений и терминов в данной области техники, специалист может обратиться к Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel). В качестве аббревиатур аминокислотных остатков используют стандартный трехбуквенный или однобуквенный код, используемый в данной области техники для обозначения одной из 20 общеизвестный L-аминокислот.

Хотя настоящее изобретение раскрывает численные интервалы и приближенные значения коэффициентов в широких рамках, численные значения, показанные в конкретных примерах, представлены настолько точно, насколько это возможно. Тем не менее все численные значения, по сути, содержат некоторую ошибку, неизбежно следующую из стандартных отклонений, встречающихся в соответствующих измерениях. Кроме того, устанавливается, что все интервалы, раскрытые в настоящем изобретении, заключают в себя все и каждый субинтервал, относящиеся к ним. Например, интервал, определенный как «от 2 до 40» должен рассматриваться как интервал, включающий в себя все и каждый субинтервал между (и включая) минимальным значением 2 и максимальным значением 40, то есть, все субинтервалы, начинающиеся с минимального значения 2 или больше, например, от 2 до 6,1, и заканчивающиеся максимальным значением 40 или меньше, например, от 5,5 до 40. Кроме того любая ссылка, упомянутая как «включенная в настоящую заявку», понимается как включенная в него полностью.

Кроме того, отмечаем, что, как используется в настоящей заявке, формы единственного числа включают формы множественного числа обозначаемых объектов, на которые они ссылаются, если только явно и недвусмысленно не ограничены одним обозначаемым объектом. Термин «или» может быть использован взаимозаменяемо с термином «и/или», за исключением тех случаев, когда контекст ясно диктует обратное.

Используемые в настоящей заявке термины «фармацевтическая композиция», «комбинированный лекарственный препарат» и «комбинация лекарственных препаратов» могут использоваться взаимозаменяемо и относиться к комбинации по меньшей мере одного лекарственного средства и, дополнительно, фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества или вспомогательного материала, которые объединены вместе для достижения определенной конкретной цели. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция содержит временно или пространственно разделенные компоненты, если они способны взаимодействовать для достижения задач настоящего изобретения. Например, ингредиенты (например, белок gE, QS-21 и CpG-олигодезоксинуклеотид), содержащиеся в фармацевтической композиции, могут быть введены субъекту вместе или отдельно. Когда ингредиенты, содержащиеся в фармацевтической композиции, вводят субъекту отдельно, ингредиенты можно вводить субъекту одновременно или последовательно.

Используемый в настоящей заявке термин «CpG-олигодезоксинуклеотид» или «CpG-ОДН» относится к короткой одноцепочечной синтетической молекуле ДНК, содержащей одну или более единиц(у) «CpG», где С обозначает цитозин, G обозначает гуанин, а р обозначает фосфодиэфирную связь. В частности, CpG-олигодезоксинуклеотид неметилирован. В некоторых вариантах реализации CpG-ОДН содержит тиофосфатную связь или тиофосфатный остов. То есть в некоторых вариантах реализации CpG-ОДН является тиофосфатным олигодезоксинуклеотидом (т.е. тиоолигодезоксинуклеотидом). Предпочтительно, чтобы все межнуклеотидные связи в CpG-ОДН являлись тиофосфатными связями, то есть CpG-ОДН являлся пертиоолигодезоксинуклеотидом. В других вариантах реализации CpG-ОДН содержит две или более копий мотива 5'-TTCGTT-3' или мотива 5'-TCGTCGTCG-3'. В частности, CpG-ОДН имеет последовательность, выбранную из: TCG ТТС GTT CGT TCG ТТС GTT (SEQ ID NO: 6), TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T (SEQ ID NO: 7) или TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG (SEQ ID NO: 8), предпочтительно, TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT (SEQ ID NO: 6).

Используемые в настоящей заявке «гинсенозид, платикодин, астрагалозид, нотогинсенозид, глицирризин, сапонин из коры альбиции, офиопогонин, сайкосапонин или сапонин японского женьшеня» относятся к активному ингредиенту, представленному в соответствующем растении. Например, гинсенозид является разновидностью стерольных соединений, которые в основном присутствуют в лекарственных материалах рода Panax (женьшень) и являются активными ингредиентами женьшеня. В некоторых вариантах реализации гинсенозид, предпочтительно, представляет собой мономер, такой как гинсенозид Rg1, гинсенозид Rg3, гинсенозид Rb1, гинсенозид Re или смесь двух или более мономеров этих сапонинов. Платикодин, предпочтительно, представляет собой платикодин D, платикодин D2 или их смесь. Астрагалозид, предпочтительно, представляет собой мономер, такой как астрагалин А (астрагалозид IV), астрагалозид I, астрагалозид II и т.п., или смесь двух или более из этих мономеров сапонина. Нотогинсенозид, предпочтительно, представляет собой нотогинсенозид R1 или тому подобное. Офиопогонин, предпочтительно, представляет собой офиопогонин D или тому подобное. Сайкосапонин, предпочтительно, представляет собой сайкосапонин а, сайкосапонин d или их смесь. Сапонин из коры альбиции, предпочтительно, представляет собой общий сапонин из коры альбиции или тому подобное. Глицирризин, предпочтительно, представляет собой общие глицирризины или тому подобное. Сапонин японского женьшеня, предпочтительно, представляет собой общий сапонин японского женьшеня или тому подобное.

Как используется в настоящей заявке, «адъювант в формате Iscom» представляет собой комплексный адъювант для иммуностимуляции, в частности, ISCOM MATRIX, который не содержит антиген, и который представляет собой адъювант, состоящий из фосфолипида, сапонина и холестерина со структурой наподобие клетки.

Как используется в настоящей заявке, «терапевтически и/или профилактически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к дозировке, достаточной, чтобы обеспечить ее полезное действие у субъекта, которому ее вводят. Фактическое количество для введения, а также скорость и время введения будут зависеть от собственного состояния и тяжести состояния субъекта, проходящего лечение. Назначение лечения (например, определение дозировки и т.д.) в конечном счете является ответственностью и определяется врачами общей практики и другими врачами, часто принимая во внимание заболевание, подлежащее лечению, состояние каждого пациента, место доставки, способ введения и другие факторы, известные врачам.

Используемый в настоящей заявке термин «млекопитающее» относится к человеку, а также может относиться к другим животным, таким как дикие животные (например, цапли, аисты, журавли и т.д.), домашние животные (например, утки, гуси и т.д.) или лабораторные животные (например, шимпанзе, обезьяны, крысы, мыши, кролики, морские свинки, сурки, суслики и т.д.).

В других вариантах реализации композиция согласно настоящему изобретению, может также содержать дополнительную добавку, такую как фармацевтически приемлемые носитель или добавка, в частности, когда она представлена в форме фармацевтической композиции (состава).

Предпочтительным фармацевтическим носителем является, главным образом, вода, буферные водные растворы, предпочтительно изотонические солевые растворы, такие как PBS (фосфатный буферный солевой раствор), глюкоза, маннитол, декстроза, лактоза, крахмал, стеарат магния, целлюлоза, карбонат магния, 0,3% глицерин, гиалуроновая кислота, этанол или полиалкиленгликоли, такие как полипропиленгликоль, триглицериды и т.д. Типы используемого фармацевтического носителя зависят, в частности, от того, составлена ли композиция согласно настоящему изобретению для перорального, назального, внутрикожного, подкожного, внутримышечного или внутривенного введения. Композиция, согласно настоящему изобретению, может содержать смачивающий агент, эмульгирующий агент или буферное вещество в качестве добавки.

Фармацевтическую композицию, вакцину или фармацевтический состав, согласно настоящему изобретению, можно вводить любым подходящим путем, например, пероральным, назальным, внутрикожным, подкожным, внутримышечным или внутривенным введением.

Дополнительно настоящее изобретение проиллюстрировано следующим описанием конкретных вариантов реализации в сочетании с сопроводительными чертежами, которые не должны толковаться как ограничение настоящего изобретения, и различные модификации или улучшения могут быть сделаны специалистами в данной области техники в рамках основных концепций настоящего изобретения, которые все входят в объем настоящего изобретения, до тех пор, пока они не отклоняются от основных принципов настоящего изобретения.

Лучшие варианты осуществления изобретения

Настоящее изобретение иллюстрировано ниже ссылкой на конкретные примеры. Специалисты в данной области техники примут во внимание, что эти примеры являются лишь иллюстрацией настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.

Экспериментальные способы в следующих примерах являются общепринятыми, если не указано иное. Сырьевые материалы, реагенты и т.п., используемые в следующих примерах, являются коммерчески доступными продуктами, если не указано иное.

Пример 1 Получение композиций для иммуностимуляции и вакцин против гепатита В в соответствии с настоящем изобретением

1. Стоковый раствор HBsAg: аминокислотная последовательность белка HBsAg показана в SEQ ID NO: 1.

Белок HBsAg был получен из рекомбинантных дрожжевых клеток, несущих ген HBsAg, типы дрожжевых клеток включают Hansenula, пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) и Pichia, предпочтительно, Hansenula. В отношении конкретных этапов подготовки настоящая заявка ссылается на китайскую патентную заявку CN 108330145 A. Рекомбинантные клетки Hansenula с геном HBsAg культивировали путем ферментации и собирали мицелий. Мицелий разрушали и очищали, что включало этапы адсорбции силикагелем, колоночной хроматографии, ТПФ (тангенциальная проточная фильтрация, tangential flow filtration, TFF) и др.

2. Стоковый раствор HBcAg: аминокислотная последовательность белка HBcAg показана в SEQ ID NO: 2.

Белок HBcAg был получен из рекомбинантных дрожжевых клеток, несущих ген HBcAg, типы дрожжевых клеток включают Hansenula, пекарские дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) и Pichia, предпочтительно, Hansenula. В отношении конкретных этапов подготовки настоящая заявка ссылается на китайскую патентную заявку CN 108047316 A. Рекомбинантные клетки Hansenula с геном HBcAg культивировали путем ферментации и собирали мицелий. Мицелий разрушали и очищали, что включало этапы обработки сульфатом аммония, колоночной хроматографии, ТПФ и др. для приготовления стокового раствора HBcAg.

3. QS-21 был приобретен у BRENNNTAG, CAS. NO. А010-023.

4. Способ приготовления CPG-олигодезоксинуклеотида из сырьевого материала: Олигодезоксинуклеотиды являются синтетически изготовленными фрагментами олигодезоксинуклеотидной последовательности, содержащими один или несколько мотивов CpG. Последовательности олигодезоксинуклеотидов, используемых в данном примере, показаны в Таблице 1:

Конкретный способ приготовления: для приготовления использовали общепринятый твердофазный фосфорамидит-фосфортриэфирный способ химического синтеза, начиная с 3' конца, т.е. 1) Депротекция: первоначальное удаление защитной группы DMT (диметокситритил) нуклеотида, соединенного с CpG, при помощи трихлоруксусной кислоты, для получения свободного 5' гидроксила для следующего этапа реакции конденсации; 2) Активация: смешивание фосфорамидит-защищенного мономера нуклеотида и тетразолового активатора в колонке для синтеза с целью образования фосфорамидитного тетразолового активного промежуточного продукта, который подвергается реакции конденсации с депротектированным CpG-нуклеотидом; 3) Соединение: когда фосфорамидитный тетразоловый активный промежуточный продукт контактирует с депротектированным CpG-нуклеотидом, он подвергается аффинной реакции с его 5' гидроксилом, конденсации и удалению тетразола, после чего олигонуклеотидная цепь удлиняется вперед на одно основание; 4) Окисление: во время реакции конденсации нуклеотидный мономер присоединяется к олигонуклеотиду, соединенному с CpG через фосфитную связь, в то время как фосфитная связь нестабильна и склонна к гидролизу под воздействием кислоты или основания, после чего фосфорамидит окисляется в фосфотриэфир с двойной связью сера-фосфор с использованием тиозамещающего реагента, тем самым получая стабильный олигонуклеотид; и 5) Блокировка: чтобы предотвратить реакцию элонгацию на не реагировавшем 5'-гидроксиле, связанным с CpG, в последующей круговой реакции после реакции конденсации этот концевой гидроксил обычно блокируют ацетилированием. После вышеуказанных пяти стадий один дезоксинуклеотид присоединяется к CpG-нуклеотиду. Вышеуказанные процессы депротекции, активации, соединения, окисления и блокирования повторяют для получения неочищенного фрагмента ДНК. Наконец, его подвергают пост-синтетическим обработкам, таким как расщепление, депротекция, очистка и количественная оценка и т.д.

5. Стоковый раствор HbsAg и стоковый раствор HbcAg разбавляли до концентрации 200 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно с использованием раствора PBS (приобретенного у Hyclone). Все сырьевые материалы для изготовления CPG растворяли и разбавляли отдельно до концентрации 100 мкг/мл с использованием раствора PBS для следующего этапа.

Пример 2 Скрининговый эксперимент с CPG-олигодезоксинуклеотидами

1. Экспериментальные животные: мыши C57BL/6(N), самцы, возраст: 4 недели, 135 мышей, Shanghai Lingchang Laboratory Animal Technology Co. Ltd.

2. Распределение по экспериментальным группам: см. Таблицу 2. Дозировка для каждой инъекции составляла 100 мкл/мышь, группа А была использована как отрицательный контроль (раствор PBS, 100 мкл/мышь).

3. Этапы эксперимента: на седьмой день после иммунизации мышей лимфоциты селезенки препарировали согласно общепринятой методике, детали которой приведены ниже: селезенки асептически удаляли путем разрезания стерильными щипцами и ножницами и помещали в 70-мкм клеточное сито, которое помещали в чашку Петри, содержащую 2 мл предварительно охлажденного 2% FBS (фетальная бычья сыворотка) (приобретенного у GIBCO)-PBS; селезенки измельчали с помощью стержня для измельчения, клетки селезенки просеивали для получения клеточной суспензии, затем суспензию фильтровали через 40-мкм клеточное сито (приобретенное у BD) и помещали в стерильную пробирку для центрифугирования объемом 50 мл с помощью пастеровской пипетки; пробирку с суспензией центрифугировали при 500×g при 4°С в течение 5 мин; надосадочную жидкость отбрасывали, а затем добавляли 2 мл из 1× агента для разрушения эритроцитов (приобретенного у BD) для повторного суспендирования клеток, полученную суспензию оставляли в течение 5 мин при 4°С, защищенную от света для разрушения красных кровяных клеток; 10 мл 2% FBS-PBS добавляли для прекращения реакции разрушения эритроцитов; полученную суспензию центрифугировали при 500×g при 4°С в течение 5 мин, надосадочную жидкость отбрасывали, затем добавляли 5 мл 2% FBS-PBS, чтобы ресуспендировать клетки повторно для последующего использования. Клетки селезенки стимулировали стимуляторами, HBsAg-специфической пептидной библиотекой PS4 и HBcAg-специфической пептидной библиотекой РСР соответственно. Набор ELISPOT (BD) был использован для определения уровня секреции интерферона-γ, специфического к антигенам HBsAg и HBcAg, в соответствии с инструкциями к набору. Количество пятен, измеренных набором ELISPOT, считывали с помощью анализатора ImmunoSPOT Series 3 (серия 3) Elispot (см. Пример 7 в китайском патенте CN 104043120 B в отношении конкретных операционных этапов).

Последовательности библиотеки пептидов, специфических для HBsAg, соответствуют последовательностям в Примере 7 китайского патента CN 104043120 B, и последовательности библиотеки пептидов, специфических для HBcAg, показаны в SEQ ID NO: 16~30.

4. Результаты эксперимента: результаты анализа пятен ELISPOT показаны на Фигурах 1 и 2. Результаты показывают, что адъюванты с CpG типа В с различными последовательностями имели разные иммунные эффекты. Среди них CpG Т1~Т3, CpG 1018, CpG 7909, CpG 1826 и CpG 684 в целом превосходили адъюванты с CpG типа А и адъюванты с CpG типа С, в то время как CpG 1618 и CPG D2 имели более слабые иммунные эффекты, а индуцированные уровни синтеза HBsAg- и HBcAg-специфического интерферона-γ были ниже, чем уровни, индуцированные адъювантами с CpG типа А и адъювантами с CpG типа С.

Пример 3 Эксперименты по скринингу композиций для иммуностимуляции

1. Экспериментальные животные: мыши C57BL/6(N), самцы, возраст: 4 недели, 81 мышь, Shanghai Lingchang Laboratory Animal Technology Co. Ltd.

2. Распределение по экспериментальным группам: см. Таблицу 3. Дозировка для каждой инъекции составляла 100 мкл/мышь, группа А была использована как отрицательный контроль (раствор PBS, 100 мкл/мышь).

3. Этапы эксперимента: см. Пример 2.

4. Результаты эксперимента: результаты анализа пятен ELISPOT показаны на Фигурах 3 и 4. Эти результаты показывают, что использование CpG Т1~Т3 в сочетании с QS21 привело к высокоэффективным синергическим эффектам, а индуцированные уровни синтеза HBsAg- и HBcAg-специфического интерферона-γ были значительно выше, чем уровни, индуцированные другими адъювантами с CpG, такими как CpG 1018, CpG 7909 и т.д., с неожиданными иммунными эффектами.

Пример 4 Влияние различных количеств адъюванта на иммунный эффект фармацевтической композиции

1. Экспериментальные животные: мыши C57BL/6(N), самцы, возраст: 4 недели, 60 мышей, Shanghai Lingchang Laboratory Animal Technology Co. Ltd.

2. Реагенты и материалы:

1) Белок HBsAg, белок HBcAg и CpG T1 были получены в Примере 1.

2) QS-21 (CAS. NO. АО 10-023, приобретенный у BRENNTAG).

3) Стоковый раствор HBsAg и стоковый раствор HBcAg разбавляли до концентрации 200 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно с использованием раствора PBS (приобретенного у Hyclone); QS21 разбавляли до концентрации 5 мкг/мл, 50 мкг/мл и 100 мкг/мл соответственно, используя раствор PBS; CpG T1 растворяли и разбавляли до 50 мкг/мл, 100 мкг/мл и 2 мг/мл соответственно, используя раствор PBS; и CPG 7909 растворяли и разбавляли до концентрации 100 мкг/мл с использованием раствора PBS для следующего этапа.

3. Распределение по экспериментальным группам: см. Таблицу 4. Дозировка для каждой инъекции составляла 100 мкл/мышь, группа А была использована как отрицательный контроль (раствор PBS, 100 мкл/мышь).

4. Этапы эксперимента: см. Пример 2.

5. Результаты эксперимента: результаты анализа пятен ELISPOT показаны на Фигурах 5 и 6. Результаты показывают, что изменения дозировки CpG T1 и QS21 оказывали значительное влияние на вакцинные композиции, а композиции для иммуностимуляции, имеющие дозировку выше дозировки 5, индуцировали уровни синтеза HBsAg- и HBcAg-специфического интерферона-γ, которые были значительно выше, чем у группы CPG 7909. Однако из-за видовых различий дальнейшее увеличение дозы адъюванта не вызывало значительного усиления эффекта, предположительно, потому что на модели мыши невозможно точно отразить иммунную интенсивность адъюванта.

Дозировки 1, 2 и 4 эквивалентны группе CPG 7909 с точки зрения иммуностимулирующего эффекта, но используемые дозы адъюванта были ниже, чем у эквивалентной группы CPG 7909, следовательно, они также имели определенное преимущество.

Пример 5 Организация экспериментальных групп и процесс иммунизации вакцинами против гепатита В

1. Экспериментальные животные и создание моделей:

Мыши C57BL/6(N), самцы, возраст: 4 недели, 81 мышь, Shanghai Lingchang Laboratory Animal Technology Co. Ltd. rAAV 8-HBV аденовирус, приобретенный у Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute Co. Ltd.

2. Реагенты и материалы:

1) Белок HBsAg: получен в Примере 1.

2) Белок HBcAg: получен в Примере 1.

3) Стоковый раствор HBsAg, стоковый раствор HBcAg и QS-21 разбавляли до концентрации 200 мкг/мл, 100 мкг/мл и 50 мкг/мл соответственно с использованием раствора PBS (приобретенного у Hyclone), CpG растворяли и разбавляли до концентрации 100 мкг/мл с использованием раствора PBS для следующего этапа.

3. Распределение по экспериментальным группам: см. Таблицу 5. Дозировка для каждой инъекции составляла 100 мкл/мышь, группа А была использована как отрицательный контроль, которой вводили раствор PBS, 100 мкл/мышь.

4. Иммунизация животных: препарат вводили всем группам животных путем внутримышечной инъекции один раз в 2 недели, место инокуляции находилось в правом заднем бедре, в общей сложности было проведено 6 введений на 4-й, 6-й, 8-й, 10-й, 12-й и 14-й неделе соответственно после внутривенной инъекции вируса rAAV 8-HBV в хвостовую вену. Кровь собирали один раз в 2 недели после первого введения, т.е. на 4-й, 6-й, 8-й, 10-й, 12-й, 14-й, 16-й, 18-й, 20-й и 22-й неделе соответственно. Все мыши были умерщвлены на 22-й неделе.

Пример 6 Влияние вакцин против гепатита В на уровень HBsAg в сыворотке крови

1. Выявление HBsAg в сыворотке: выявление было поручено больнице Nanjing Dram Tower.

С помощью двухэтапного иммуноанализа сначала выявляли связывание между исследуемым образцом и парамагнитными частицами, покрытыми антителами к поверхностному антигену вируса гепатита В; после промывки добавляли конъюгат антител к поверхностного антигену вируса гепатита В, меченый эфиром акридиниума; после повторной промывки в реакционную смесь добавляли раствор для предварительного возбуждения и раствор для возбуждения и определяли RLU (relative luminescence unit, относительная единица люминесценции) исследуемого образца; наблюдали положительную корреляция между содержанием HBsAg в образце и RLU, концентрацию HBsAg в образце сыворотки мыши определяли с помощью построения стандартной кривой HBsAg в программе ARCHTITECT; окончательно концентрация HBsAg в образце сыворотки мыши составляла от 50 до 200 раз больше определенного значения.

2. Анализ результатов (Фигура 7): вакцина группы Н, содержащая иммуностимулятор в соответствии с настоящем изобретением, показала значительную тенденцию к понижению соответствующего уровня HBsAg и сохраняла стабильный длительный иммунный эффект по окончанию процесса иммунизации (с 14-й недели), со значительным преимуществом по сравнению только с группой CpG (группа F) и только с группой QS-21 (группа G). Уровень HBsAg в группе Н снизился с >6350 МЕ/мл в начале до примерно 50 МЕ/мл. В этой группе уровень HBsAg снизился более чем на 30% после второй иммунизации (6-я неделя) и снизился более чем на 70% после третьей иммунизации (8-я неделя), а средний показатель снижения сохранялся на уровне приблизительно 92% после окончания иммунизации на 14-й неделе. Был обнаружен превосходный иммунный эффект. По сравнению с двойным адъювантным контролем (группа I) группа Н по-прежнему сохраняла стабильный иммунный эффект после окончания иммунизации на 14-й неделе, и уровень иммунитета был значительно лучше, чем у группы I.

Пример 7 Оценка гуморальных иммунных эффектов вакцин против гепатита В

1. Выявление HBsAb в сыворотке: выявление было поручено больнице Nanjing Dram Tower.

С помощью двухэтапного иммуноанализа исследуемый образец сначала смешивали с парамагнитными частицами, покрытыми рекомбинантным HBsAg (rHBsAg); после промывки добавляли конъюгат rHBsAg, меченый эфиром акридиниума; после повторной промывки в реакционную смесь добавляли раствор для предварительного возбуждения и раствор для возбуждения и определяли RLU (relative luminescence unit, относительная единица люминесценции) исследуемого образца; наблюдали положительную корреляция между содержанием HBsAb в образце и RLU, концентрацию HBsAg в образце сыворотки мыши определяли с помощью построения стандартной кривой HBsAb в программе ARCHTITECT; окончательно концентрация HBsAb в образце сыворотки мыши составляла от 50 до 200 раз больше определенного значения.

2. Анализ результатов (Фигура 8): Вакцина группы Н, содержащая иммуностимулятор, начала вызывать образование HBsAb (>10 мМЕ/мл) после второй иммунизации (неделя 6), уровень HBsAb показал тенденцию непрерывного увеличения по мере увеличения числа иммунизаций, тенденция увеличения значительно превосходила тенденцию только группы CpG (группа F) и только группы QS-21 (группа G). Через две недели после окончания иммунизации (16-я неделя) уровень HBsAb был близок к насыщению, достигнув уровня повышения HBsAb на 4 порядка, т.е. приблизительно 10000 мМЕ/мл. Уровень синтезированных антител также значительно превосходил уровень двойного адъювантного контроля (группа I).

Пример 8 Оценка влияния вакцин против гепатита В на клеточный иммунитет

1. Этапы выявления: см. Пример 2.

2. Оценочные показатели: если число пятен в контрольной лунке ≤5 SFC (spot forming unit, пятнообразующая единица), а число пятен в лунке с образцом ≥10 SFC, образец будет определен как положительный; если 5 SFC< число пятен в контрольной лунке ≤10 SFC, а число пятен в лунке с образцом / число пятен в контрольной лунке ≥2, образец будет определен как положительный; если число пятен в контрольной лунке >10 SFC, а число пятен в лунке с образцом / число пятен в контрольной лунке ≥3, образец будет определен как положительный.

3. Результаты эксперимента:

Результаты детекции уровня клеточного иммунитета: результаты анализа пятен ELISPOT показаны на Фигурах 9 и 10, результаты анализа показывают, что уровень положительной конверсии HBsAg-специфического интерферона-γ составлял 100%, а уровень положительной конверсии HBcAg-специфического интерферона-γ составлял 100% для групп F-I. Вакцина группы Н, содержащая иммуностимулятор, может индуцировать более высокий уровень синтеза HBsAg- и HBcAg-специфического интерферона-у, превышающий 2350 SFC/10⁶ клеток селезенки и более 1250 SFC/10⁶ клеток селезенки соответственно, что представляет значительное различие по сравнению с группой, содержащей только CpG (группа F) и группой, содержащей только QS-21 (группа G). Уровень синтеза HBsAg- и HBcAg-специфического интерферона-γ, индуцированный двойным адъювантным контролем (группа I), составлял приблизительно 1630 SFC/10⁶ клеток селезенки и 750 SFC/10⁶ клеток селезенки, что было значительно ниже, чем уровень, индуцированный группой Н.

Пример 9 Обнаружение HBsAg- и HBcAg-специфичных антител в сыворотке крови, индуцированных фармацевтическими композициями

1. Этапы обнаружения: 96-луночный планшет для ИФА (иммуноферментный анализ) был покрыт слоем очищенных HBsAg и HBcAg с получением твердофазных антигенов. После проведения блокирования исследуемую сыворотку последовательно разбавляли при определенном начальном разведении и устанавливали множественные разведения. Последовательно разбавленные образцы сыворотки вносили в 96-луночный планшет для ИФА, затем связывали с мечеными HRP анти-IgG/IgG 1/IgG 2а антителами с образованием меченых ферментом комплексов антител, содержащих антиген-антитело (из сыворотки). В заключение субстрат ТМВ добавляли для получения цветного окрашивания, абсорбцию (значение OD (optical density)) при 450 нм измеряли с помощью микропланшетного считывателя. Оттенок развившейся окраски положительно коррелировал с уровнями HBsAg- и HBcAg-специфичных антител IgG/IgG 1/IgG 2а в исследуемых образцах. Определение титров антител проводили путем установления взаимосвязи по кривой «величина ОД абсорбции - коэффициент разбавления образца сыворотки (Log)».

2. Анализ результатов:

1) Результаты детекции антител IgG к HBsAb и их подтипов в сыворотке крови.

Способ ИФА использовали для обнаружения уровня антител IgG к HBsAb и их подтипов в сыворотке мыши каждой группы в разное время. Как показано на Фигуре 11, вакцина группы Н, содержащая иммуностимулятор, вызывала образование более высокого титра анти-HBsAg-специфичных антител IgG/IgG 1/IgG 2а, с увеличением числа иммунизаций уровень антител продолжался увеличиваться, после шестой иммунизации (неделя 14) уровень антител приближался к насыщению, а титры специфичных антител могли достигать более чем 5,4 порядка. В группах A-D специфичных антител обнаружено не было. Хотя группы E-G вызывали образование определенного уровня HBsAg-специфичных антител IgG/IgG 1/IgG 2а, уровень антител был значительно ниже, чем в группе Н. Двойной адъювантный контроль (группа I) вызывал образования уровня анти-HBsAg-специфичных антител IgG и антител IgG 2а значительно ниже, чем в группе Н.

2) Результаты обнаружения антител HBcAb IgG и их подтипов в сыворотке крови.

Способ ИФА был использован для детекции уровня антител HBcAb IgG и их подтипов в сыворотке мыши каждой группы в разное время. Как показано на Фигуре 12, вакцина группы Н, содержащая иммуностимулятор, вызывала образование более высокого титра анти-HBcAg-специфичных антител IgG/IgG 1/IgG 2а, с увеличением числа иммунизаций уровень антител продолжал увеличиваться, после шестой иммунизации (14-я неделя) уровень антител приблизился к насыщению, а титр специфичных антител мог достигать более 4,8 порядков. Специфических антител в группах A-D обнаружено не было. Хотя группы E-G вызывали образование определенного уровня HBcAg-специфичных антител IgG/IgG 1/IgG 2а, уровень антител был значительно ниже, чем в группе Н. Группа Н более предрасположена к выбору пути Th1, у специфичных антител IgG 2а появилась значительная тенденция к росту, как показано на Фигуре D, отражающая, что вакцина группы Н могла способствовать конверсии подтипа антител против HBcAg, а эффективность конверсии была значительно выше, чем у двойного адъювантного контроля (группа I).

Пример 10 Организация экспериментальных групп для вакцин против опоясывающего герпеса

1. Экспериментальные животные и создание моделей:

Мыши C57BL/6(N), самки, возраст: 5 недель, 48 мышей, приобретенных у Shanghai SLRC Laboratory Animal Co., Ltd.

2. Реагенты и материалы:

1) Белок герпеса gE: аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 31.

В отношении подготовительных этапов настоящая заявка ссылается на отчет в источнике Thomsson Е., Persson L. et al. "Journal of Virological Methods", 2011, Vol. 175, No. 1, pp. 53-59, конкретные этапы были следующими: в соответствии с последовательностью белка-мишени последовательность нуклеиновой кислоты была оптимизирована таким образом, чтобы ее кодоны соответствовали системе экспрессии млекопитающих, и ген-мишень был синтезирован. Синтезированный ген-мишень лигировали с плазмидой pcDNA3.1(+) путем расщепления ферментами и лигирования и трансфецирован в компетентные клетки Тор 10. Положительные моноклоны отобирали и верифицировали путем секвенирования. Моноклональные бактерии были массово амплифицированы, и большое количество плазмид, подходящих для трансфекции клеток, были выделены с использованием набора для выделения плазмид без эндотоксинов. Суспендированные клетки СНО трансфецировали плазмидами способом транзитной трансфекции. Когда жизнеспособность клеток СНО составляла менее 70% или время ферментации составляло более 7 дней, надосадочную жидкость ферментационного бульона собирали центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С в течение 30 мин. Ферментационный бульон диализовали против раствора, содержащего 50 мМ Tris-HCl, 500 мМ NaCl и 20 мМ имидазола, с диализным соотношением 1:100 в хроматографическом шкафу при 4°С, один раз каждые 4 ч, в общей сложности 3 раза. Собранные образцы очищали на никелевой колонке, детекцию собранных образцов, соответствующих пику белка-мишени, проводили способом SDS-PAGE. Очищенные растворы высокой чистоты объединяли и диализовали против раствора, содержащего 20 мМ фосфата и 150 мМ NaCl, в хроматографическом шкафу при 4°С в течение 24 ч с коэффициентом диализа 1:100, диализный раствор меняли каждые 8 ч. Образцы фильтровали через стерильную фильтрующую мембрану 0,22 мкм и хранили в холодильнике при температуре 4°С для последующего использования.

Требовалось, чтобы приготовленный стоковый раствор белка герпеса gE имел чистоту более 95%, содержание белка не менее 200 мкг/мл и уровень эндотоксинов не выше 0,1 ЕЭ/мкг.

2) Стоковый раствор белка герпеса gE разбавляли до концентрации 50 мкг/мл и 10 мкг/мл с использованием раствора PBS (приобретенного у Hyclone) соответственно, QS-21 разбавляли до концентрации 50 мкг/мл и 10 мкг/мл с использованием раствора PBS соответственно; CpG разбавляли до концентрации 100 мкг/мл и 20 мкг/мл с использованием раствора PBS соответственно; и CpG7909 разбавляли до концентрации 100 мкг/мл и 20 мкг/мл с использованием раствора PBS соответственно.

3. Распределение по экспериментальным группам: см. Таблицу 7. Дозировка для каждой инъекции составляла 100 мкл/мышь, группа А была использована как отрицательный контроль, которой вводили раствор PBS, 100 мкл/мышь.

4. Иммунитет животных: введение животным, относящимся ко всем группам, осуществляли путем внутримышечной инъекции один раз в 2 недели, место инокуляции находилось в правом заднем бедре. Введение осуществляли дважды неизменно, то есть путем инъекций на неделях 0 и 2 соответственно. Все мыши были умерщвлены на 4-й неделе.

Пример 11 Проверка эффективности клеточного иммунитета вакцин против опоясывающего герпеса

1. Этапы обнаружения и показатели оценки были такими же, как и в Примере 2, последовательности gE-специфической пептидной библиотеки показаны в SEQ ID NO. 32-46.

2. Результаты эксперимента: уровень числа пятен Т-лимфоцитов, секретирующих gE-специфический интерферон-у в клетках селезенки мышей в каждой группе, показан на Фигуре 13, результаты положительного уровня конверсии gE-специфического интерферона-γ показаны в Таблице 8. Результаты показывают, что уровень числа пятен Т-лимфоцитов, секретирующих gE-специфический интерферон-γ в клетках селезенки, соответствующих группам Е и F с более высокой иммунной дозировкой (>4000 SFC/10⁶ клеток селезенки), был значительно выше, чем у групп G и Н с более низкой иммунной дозировкой. Среди них уровень числа пятен Т-лимфоцитов, секретирующих gE-специфический интерферон-γ в клетках селезенки, соответствующий группам Е и G (CpG T1+QS-21), был выше, чем у групп F и Н (CpG 7909+QS-21) с той же дозировкой. Уровень положительной конверсии интерферона-γ для групп Е-Н составил 100%.

Пример 12 Проверка эффективности гуморального иммунитета вакцин против опоясывающего герпеса

1. Этапы обнаружения: на 28-й день после иммунизации собирали кровь и отделяли сыворотку (цельную кровь помещали в инкубатор при постоянной температуре 37°С в течение 40 мин и центрифугировали при 12000 об/мин при 4°С в течение 10 мин; надосадочную жидкость отбирали и криоконсервировали при -20°С для последующего использования). Набор ИФА (Shanghai Kehua) использовали для определения уровня положительной конверсии антител, специфичных к белку gE герпеса, в соответствии с инструкциями набора. Для детекции устанавливали пустой контроль, отрицательный контроль и исследуемые образцы, две параллельные лунки для каждого из контролей или образцов; в качестве отрицательного контроля использовали негативную сыворотку мыши; за исключением пустого контроля, отрицательный контроль или исследуемые образцы вносили в каждую лунку, после чего вносили конъюгат с ферментом. После этого содержимое лунок перемешивали, планшеты запечатывали и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Каждую лунку промывали раствором для промывки и добавляли проявляющий раствор А и проявляющий раствор В. После этого содержимое лунок перемешивали, планшеты запечатывали и инкубировали при 37°С в течение 15 мин. В каждую лунку добавляли раствор для терминации и равномерно перемешивали. Значение OD в каждой лунке считывали с помощью считывателя микропланшетов при длине волны 450 нм.

2. Результаты эксперимента: уровень антиген-специфичных антител IgG и их подтипов в сыворотке мыши, обнаруженных с помощью ИФА, показан на Фигуре 14. Результаты показывают, что иммунный эффект группы Е, содержащей иммуностимулятор в соответствии с настоящим изобретением, значительно превосходил иммунный эффект только группы CpG (группа С), только группы QS-21 (группа D) и двойного адъювантного контроля (группа F). Более того, соответствующие уровни антител IgG и IgG 2а значительно отличались от уровней этих двух групп. Это означает, что добавление CpG к QS-21 может повысить соответствующий уровень гуморального иммунитета.

Пример 13 Влияние различных сапонинов на эффективность композиции рекомбинантной вакцины против опоясывающего герпеса

1. Экспериментальные животные и создание моделей:

Мыши C57BL/6(N), самки, возраст: 5 недель, 48 мышей, приобретенных у Shanghai SLRC Laboratory Animal Co. Ltd.

2. Реагенты и материалы:

1) Белок герпеса gE получали в Примере 10, CpG T1 и CpG 7909 получали в Примере 1.

2) QS-21 (CAS: NO. АО 10-023, приобретенный у BRENNTAG); гинсенозид Rg1 (CAS: 22427-39-0, приобретенный у Nanjing Spring & Autumn Biological Engineering Co. Ltd.); астрагалин A (CAS: 84687-43-4, приобретенный у Nanjing Spring & Autumn Biological Engineering Co. Ltd.); платикодин D (CAS: 58479-68-8, приобретенный у Hubei Yunmei Technology Co. Ltd.); адъювант Iscom (приобретенный у Shanghai Xiyuan Biotechnology Co. Ltd.).

3) Стоковый раствор gE герпеса разбавляли до концентрации 50 мкг/мл с помощью раствора PBS (приобретенного у Hyclone). Все сапонины раздельно разбавляли до концентрации 50 мкг/мл с использованием раствора PBS. CpG T1 и CpG 7909 растворяли и разбавляли до концентрации 100 мкг/мл соответственно с использованием раствора PBS для использования на следующем этапе.

3. Распределение по экспериментальным группам:

См. Таблицу 9. Дозировка для каждой инъекции составляла 100 мкл/мышь, контрольной группе вводили раствор PBS, 100 мкл/мышь.

4. Этапы эксперимента: см. Пример 2.

5. Результаты экспериментов:

Результаты анализа пятен ELISPOT показаны на Фигуре 15. Результаты показывают, что использование CpG T1 в сочетании с различными сапонинами приводило к высокоэффективному синергическому эффекту и индуцировало значительно более высокий уровень синтеза gE-специфического интерферона-γ, чем композиции других CpG и сапонинов, причем QS21 имел наилучший эффект.

В заключение, иммунная композиция, предложенная в рамках настоящего изобретения, обладает превосходным иммуностимулирующим эффектом. По сравнению с одиночным адъювантом и комбинациями других CPG-адъювантов и QS21, CpG Т1~Т3 и QS-21 проявляют высокоэффективный синергический эффект и могут опосредовать более сильный иммунный ответ. Они имеют значительные преимущества при применении с различными антигенами или антигенными композициями. Следовательно, как новый тип адъюванта, указанная иммунная композиция имеет высокую ценность при применении в клинике и широкую перспективу на рынке.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано выше, специалисты в данной области техники примут во внимание, что различные модификации и вариации могут быть внесены в настоящее изобретение, не отходя от сущности и объема настоящего изобретения. Соответствующий объем настоящего изобретения не должен ограничиваться предшествующим подробным описанием, модификации и вариации предназначены для того, чтобы соответствовать объему формулы изобретения. Хотя выше были описаны только примеры конкретных вариантов реализации настоящего изобретения, специалистам в данной области техники будет понятно, что вышеизложенное является только иллюстративным примером, и что объем охраны настоящего изобретения должен быть определен прилагаемой формулой изобретения. Различные вариации и модификации вариантов реализации могут быть сделаны специалистами в данной области техники, не отступая от принципа и сущности настоящего изобретения, но такие вариации или модификации должны подпадать под объем охраны настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> GRAND THERAVAC LIFE SCIENCE（NANJING）CO.,LTD.

<120> КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ИММУНОСТИМУЛЯЦИИ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> EIC20310034P

<150> 2019112795360

<151> 2019-12-13

<160> 46

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 226

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 1

Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1 5 10 15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys

35 40 45

Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

50 55 60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65 70 75 80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

85 90 95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly

100 105 110

Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala

115 120 125

Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp

130 135 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys

145 150 155 160

Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

165 170 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

180 185 190

Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile

195 200 205

Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

210 215 220

Tyr Ile

225

<210> 2

<211> 183

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 2

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala

65 70 75 80

Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

85 90 95

Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr

145 150 155 160

Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser

165 170 175

Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys

180

<210> 3

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 3

tgactgtgaa cgttcgagat ga

22

<210> 4

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 4

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt

24

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 5

tccatgacgt tcctgacgtt

20

<210> 6

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 6

tcgttcgttc gttcgttcgt t

21

<210> 7

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 7

tcgttcgttc gttcgttcgt tcgtt

25

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 8

tcgtcgtcgt cgtcgtcgtc g

21

<210> 9

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 9

tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc

23

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 10

tccatgacgt tcctgatgct

20

<210> 11

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 11

tgtcgtcgtc gtttgtcgtt tgtcgtt

27

<210> 12

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 12

gggggacgat cgtcgggggg

20

<210> 13

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 13

ggggacgacg tcgtgggggg g

21

<210> 14

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 14

tcgtcgtttc gcgcgcgccg

20

<210> 15

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 15

tcgtcgttcg ttcgtcgaac gacgtttgat

30

<210> 16

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 16

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 17

Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 18

Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp

1 5 10 15

<210> 19

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 19

Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn

1 5 10 15

<210> 20

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 20

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro

1 5 10 15

<210> 21

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 21

Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu

1 5 10 15

<210> 22

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 22

Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser

1 5 10 15

<210> 23

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 23

Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val

1 5 10 15

<210> 24

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 24

Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu

1 5 10 15

<210> 25

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 25

Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln

1 5 10 15

<210> 26

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 26

Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe

1 5 10 15

<210> 27

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 27

Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys

1 5 10 15

<210> 28

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 28

Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly

1 5 10 15

<210> 29

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 29

Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val

1 5 10 15

<210> 30

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 30

Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu

1 5 10 15

<210> 31

<211> 518

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 31

Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp

1 5 10 15

Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser

20 25 30

Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn

35 40 45

Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn

50 55 60

Ala His Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser

65 70 75 80

Gly Glu Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu

85 90 95

Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp

100 105 110

Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe

115 120 125

Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val

130 135 140

Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg

145 150 155 160

Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu

165 170 175

Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys

180 185 190

His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu

195 200 205

Asn Thr Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly

210 215 220

Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu

225 230 235 240

Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu

245 250 255

Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn

260 265 270

Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr

275 280 285

Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro

290 295 300

Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val

305 310 315 320

Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys

325 330 335

Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro

340 345 350

Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr

355 360 365

His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr

370 375 380

Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln

385 390 395 400

Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser

405 410 415

His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr

420 425 430

Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe

435 440 445

Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val

450 455 460

Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro

465 470 475 480

Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr

485 490 495

Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser

500 505 510

His His His His His His

515

<210> 32

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 32

Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu

1 5 10 15

<210> 33

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 33

Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser

1 5 10 15

<210> 34

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 34

His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro

1 5 10 15

<210> 35

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 35

Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser

1 5 10 15

<210> 36

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 36

Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu

1 5 10 15

<210> 37

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 37

Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp Val

1 5 10 15

<210> 38

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 38

Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu

1 5 10 15

<210> 39

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 39

His Ala Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys

1 5 10 15

<210> 40

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 40

Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His

1 5 10 15

<210> 41

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 41

Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr

1 5 10 15

<210> 42

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 42

Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg

1 5 10 15

<210> 43

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 43

Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp

1 5 10 15

<210> 44

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 44

Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu

1 5 10 15

<210> 45

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 45

Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His Glu

1 5 10 15

<210> 46

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искуственная Последовательность

<400> 46

Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His Glu His His Gly Val

1 5 10 15

<---

Claims (17)

1. Композиция для иммуностимуляции, содержащая сапонин и CpG-олигодезоксинуклеотид или состоящая из адъюванта, содержащего сапонин и CpG-олигодезоксинуклеотид, причем последовательность указанного CpG-олигодезоксинуклеотида имеет две или более копий мотива 5'-TTCGTT-3' или мотива 5'-TCGTCGTCG-3', и причём последовательность указанного CpG-олигодезоксинуклеотида представляет собой любую, выбранную из: CpG T1: TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT (SEQ ID NO: 6); CpG T2: TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T (SEQ ID NO: 7) и CpG T3: TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG (SEQ ID NO: 8); причем массовое отношение CpG-олигодезоксинуклеотида к сапонину составляет 1~40:0,1~2.

2. Композиция для иммуностимуляции по п. 1, отличающаяся тем, что последовательность CpG-олигодезоксинуклеотида представляет собой CpG T1: TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT (SEQ ID NO: 6).

3. Композиция для иммуностимуляции по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что указанный сапонин представляет собой один или более сапонин, выбранный из группы, состоящей из сапонина квилайи, гинсенозида, платикодина, астрагалозида, нотогинсенозида, глицирризина, сапонина из коры альбиции, офиопогонина, сайкосапонина или сапонина японского женьшеня.

4. Композиция для иммуностимуляции по п. 3, отличающаяся тем, что указанный сапонин квилайи представляет собой QS-7, QS-17, QS-18 или QS-21; указанный гинсенозид представляет собой гинсенозид Rg1, гинсенозид Rg3, гинсенозид Rb1 или гинсенозид Re; указанный платикодин представляет собой платикодин D, платикодин D2 или их смесь; указанный астрагалозид представляет собой астрагалин А, астрагалозид I, астрагалозид II или смесь двух или более мономеров указанных сапонинов; указанный нотогинсенозид представляет собой нотогинсенозид R1; указанный офиопогонин представляет собой офиопогонин D; указанный сайкосапонин представляет собой сайкосапонин а, сайкосапонин d или их смесь; указанный сапонин из коры альбиции представляет собой общий сапонин из коры альбиции; указанный глицирризин представляет собой общий глицирризин; и указанный сапонин японского женьшеня представляет собой общий сапонин японского женьшеня.

5. Композиция для иммуностимуляции по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что указанный адъювант, содержащий сапонин, представляет собой адъювант в формате Iscom.

6. Композиция для иммуностимуляции по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что указанный CpG-олигодезоксинуклеотид содержит тиофосфатную связь.

7. Композиция для иммуностимуляции по п. 6, отличающаяся тем, что указанный CpG-олигодезоксинуклеотид представляет собой пертио-олигодезоксинуклеотид.

8. Композиция для иммуностимуляции по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что массовое отношение CpG-олигодезоксинуклеотида к сапонину составляет 2~40:0,1~2.

9. Композиция для иммуностимуляции по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что массовое отношение CpG-олигодезоксинуклеотида к сапонину составляет 2:1.

10. Адъювантная фармацевтическая композиция, содержащая композицию для иммуностимуляции по любому из пп. 1-9 и антиген или композицию антигенов, причем указанный антиген или композиция представляют собой антиген вируса или композицию антигенов вируса.

11. Фармацевтическая композиция по п. 10, отличающаяся тем, что указанный антиген или композиция антигенов выбраны из группы, состоящей из антигена или композиции антигенов вируса герпеса человека, вируса ветряной оспы и вируса гепатита А, В, С или Е.

12. Фармацевтическая композиция по п. 11, отличающаяся тем, что указанный вирус герпеса человека представляет собой ВГЧ1 или ВГЧ2.

13. Вакцина, содержащая композицию для иммуностимуляции по любому из пп. 1-9 и антиген или композицию антигенов; причем указанная вакцина представляет собой вакцину для профилактики вирусной инфекции или указанная вакцина представляет собой вакцину для лечения вирусной инфекции посредством иммунотерапии.

14. Применение композиции для иммуностимуляции по любому из пп. 1-9 при изготовлении вакцины для профилактики вирусной инфекции.

15. Применение композиции для иммуностимуляции по любому из пп. 1-9 при изготовлении вакцины для лечения вирусной инфекции посредством иммунотерапии.

16. Способ профилактики вирусной инфекции, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту профилактически эффективного количества вакцины по п. 13.

17. Способ лечения вирусной инфекции посредством иммунотерапии, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества вакцины по п. 13.