CN117653724A - 一种用于预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物及其应用，所述药物组合物包含i)乙型肝炎病毒表面抗原、其具有抗原活性的片段和/或其具有抗原活性的变体；和ii)免疫刺激组合物，其包含铝佐剂和CpG寡聚脱氧核苷酸，其中所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列包含两个或两个以上拷贝的5′‑TTCGTT‑3′基序或5′‑TCGTCGTCG‑3′基序。实验结果表明，所述免疫刺激组合物所包含的组分之间能够发生协同作用，从而对乙型肝炎病毒表面抗原的免疫效果达到强增效作用，仅免疫两次就可产生良好的免疫效果，且其较现有疫苗产生的抗体时间更早，能维持更长时间的高滴度抗体水平。

Description

一种用于预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种用于预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物及其应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围的严重公共卫生问题之一。HBV感染是导致慢性乙型肝炎、肝硬化和肝细胞癌的重要原因(Fattovich G.J.Hepatol.2008；48：335-352)。目前广泛应用的乙肝蛋白疫苗通过诱导体液免疫，产生保护性中和抗体，达到预防的目的。
日前市场上预防用乙型肝炎疫苗均采用氢氧化铝(Al(OH)3)作为佐剂，其能够增强Th2类免疫应答和体液免疫，诱导机体产生和分泌保护性抗体。但是，氢氧化铝主要刺激Th2相关抗体的产生(包括IgE)，不能诱导产生Thl细胞免疫反应，不能刺激Thl活性，也不能加强细胞免疫(CTL)，阻断CD8+CTL的激活。
研究发现，CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)佐剂具有免疫增强作用，可与细胞中的TLR9(Toll-like receptor 9)结合发挥作用，诱生依赖Thl途径的免疫应答，活化B细胞分化为分泌抗原特异性抗体的浆细胞，并刺激IFN-γ表达，从而促进细胞免疫应答，增加无免疫、低免疫应答及免疫抑制人群的免疫效应。因此，与氢氧化铝佐剂联合应用，可以起到更好的免疫效果，如专利CN105214083A中提到的CpG与氢氧化铝的组合方案。
但是，研究同时发现CpG佐剂具有结构多样性，不同类型的CpG佐剂在实际应用中效果差异大，成药效果的不确定性高。如何筛选出免疫增强效果更优的佐剂组合物，提高乙型肝炎疫苗的预防效果，仍是本领域亟待解决的问题。
发明内容
为了解决现有技术的不足之处，本发明的目的是提供一种预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物及其应用，其预防乙型肝炎病毒感染的起效时间短，免疫效果更好。
本发明用于实现上述目的的技术方案如下：
一种用于预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物，其包含：
i)乙型肝炎病毒表面抗原、其具有抗原活性的片段和/或其具有抗原活性的变体；和
ii)免疫刺激组合物，其包含铝佐剂和CpG寡聚脱氧核苷酸，其中所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列包含两个或两个以上拷贝的5′-TTCGTT-3′基序或5′-TCGTCGTCG-3′基序。
在本发明的一些实施方式中，所述CpG寡聚脱氧核苷酸可以选自如SEQ ID NO:2～4所示的CpG寡聚脱氧核苷酸中的一种或多种。
优选地，所述CpG寡聚脱氧核苷酸为如SEQ ID NO:2所示的CpG寡聚脱氧核苷酸。
在本发明的一些实施方式中，所述铝佐剂可以选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾或钾明矾中的一种或多种，优选为氢氧化铝。
在本发明的一些实施方式中，所述CpG寡聚脱氧核苷酸可以包含硫代磷酸酯键。
优选地，所述CpG寡聚脱氧核苷酸为全硫代CpG寡聚脱氧核苷酸。
在本发明的一些实施方式中，所述CpG寡聚脱氧核苷酸与铝佐剂的重量比为10～200：37.5，优选为60～200：37.5，进一步优选为200：37.5。
根据本发明，所述CpG寡聚脱氧核苷酸与铝佐剂的重量比选自10:37.5，20:37.5，30:37.5，40:37.5，50:37.5，60:37.5，70:37.5，80:37.5，90:37.5，100:37.5，110:37.5，120:37.5，130:37.5，140:37.5，150:37.5，160:37.5，170:37.5，180:37.5，190:37.5或200:37.5。
在本发明的一些实施方式中，所述乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物的组分i)和ii)之间的重量比为1：47.5～237.5，优选为1：97.5～237.5，进一步优选为1：237.5。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物为单位制剂，其中组分i)含量≥5μg/剂，组分ii)中的Al(OH)3含量≥187.5μg/剂，CpG含量≥300μg/剂。
优选地，CpG含量为300～1000μg/剂。
优选地，CpG含量为1000μg/剂。
根据本发明，所述CpG含量可以为300μg/剂、350μg/剂、400μg/剂、450μg/剂、500μg/剂、550μg/剂、600μg/剂、650μg/剂、700μg/剂、750μg/剂、800μg/剂、850μg/剂、900μg/剂、950μg/剂或1000μg/剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还可以包含：iii)药学上可接受的载体和/或辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述药学上可接受的载体和/或辅料可以选自水、缓冲水溶液、等渗盐溶液、润湿剂或乳化剂中的一种或多种。优选地，所述药学上可接受的载体和/或辅料选自磷酸盐缓冲液(PBS)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％v/v甘油水溶液、透明质酸、乙醇、聚亚烷基二醇(例如聚丙二醇)或甘油三酯中的一种或多种。
所用药物组合物的载体类型尤其依赖于根据本发明的药物组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的药物组合物、疫苗或者药物制剂可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物的剂型可以为冻干粉针剂或注射溶液。
本发明的另一目的是提供一种乙型肝炎预防性疫苗，其包含上述药物组合物。
本发明的另一目的是提供所述药物组合物在制备用于预防乙型肝炎病毒感染和/或乙型肝炎病毒介导的疾病的药物，例如疫苗中的用途。
在本发明的一些实施方式中，所述乙型肝炎病毒感染和/或乙型肝炎病毒介导的疾病选自乙型肝炎、肝硬化或肝癌中的一种或多种。
本发明的实验结果表明，所提供的药物组合物可诱导产生明显的体液免疫应答，相比单一佐剂系统可以更早、更快产生免疫应答效应：在一次免疫后(wk02)即可较早诱导产生较高水平的HBsAb阳转率，并在二次免疫后产生更高水平的HBsAb抗体。
本发明药物组合物中的CpG佐剂与铝佐剂具有良好的协同作用，两种佐剂联用能够提高乙型肝炎预防疫苗的保护效果。
此外，在食蟹猴实验中，与市售乙肝疫苗的3针免疫方案相比，本发明2针免疫方案即可达到相同的效果，而且免疫起效时间更短，表明在实际的应用过程中，本发明的药物组合物可以在较短时间内对人体起到预防保护作用。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1显示了小鼠血清中HBsAb抗体水平；
图2显示了食蟹猴血清中HBsAb抗体水平。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1药物组合物的制备
1.HBsAg蛋白的表达
HBsAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。由HBsAg基因重组酵母细胞制备，酵母细胞种类可选自汉逊酵母、酿酒酵母和毕赤酵母，优选为汉逊酵母。具体制备步骤参考中国专利申请CN108330145A的公开内容，HBsAg基因重组汉逊酵母细胞经发酵培养，收获菌体。经破菌处理和硅胶吸附、柱层析和TFF等步骤纯化。纯化的HBsAg蛋白用于药物组合物的制备。
2.CpG寡聚脱氧核苷酸的合成
CpG寡聚脱氧核苷酸是合成制备的寡聚脱氧核苷酸序列片段，序列中具有两个或两个以上拷贝的5′-TTCGTT-3′基序或5′-TCGTCGTCG-3′基序，本发明的CpG寡聚脱氧核苷酸如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中任一项所示，制备步骤参考中国专利CN104043120B，下述实施例以SEQ ID NO：2所示的CpG寡聚脱氧核苷酸为例说明本发明的免疫刺激组合物的效果。
实施例2乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb)阳转率检测方法
1.实验步骤：
使用40只雌性BALB/c小鼠，共分为A-E 5组(8只/组)；A组给予HBsAg 1μg/只；B组给予HBsAg 1μg/只、Al(OH)3 37.5μg/只；C组给予HBsAg 1μg/只、CpG 10μg/只；D组给予HBsAg 1μg/只、Al(OH)3 37.5μg、CpG 10μg/只；E组给予对照疫苗(大连汉信)，HBsAg 1μg/只、Al(OH)337.5μg/只。肌肉注射免疫，分别在wk(周)00和wk04免疫2次，给药后分别在wk02、wk04、wk06、wk08、wk12、wk16和wk20采血，其中对wk02和wk04血清进行HBsAb阳转率检测，对wk04、wk06、wk08、wk12、wk16和wk20血清进行HBsAb抗体水平检测。
采用乙型肝炎病毒表面抗体检测试剂盒(酶联免疫法，上海科华生物)，定性检测小鼠血清样本中乙型肝炎病毒表面抗体的HBsAb阳转率。
2.实验结果：
各组在不同检测时间小鼠血清中HBsAb阳转率，结果如表1所示，结果表明，在一免后两周(wk02)时，包含双佐剂成分的D组的HBsAb阳转率最高，抗体阳转率为50％，而其它各组的抗体阳转率均相对较低，对照疫苗组E组的抗体阳转率仅为12.5％；在一免后四周(wk04)时，各组血清的HBsAb阳转率均有升高，且其中B组、D组和E组抗体阳转率均达100％。
从实验结果证明，D组wk02 HBsAb阳转率％远高于B组和C组的阳转率％，也即本发明的CpG佐剂与铝佐剂具有良好的协同作用，两种佐剂联用能够更早地提高乙型肝炎预防疫苗的保护效果。
表1小鼠血清中HBsAb阳转率
实施例3小鼠血清中HBsAb抗体水平检测
1.实验步骤：
动物免疫和血清采集均参见实施例2。将小鼠血清样本用无菌PBS进行适量稀释(稀释倍数n)，选用ARCHITECT乙型肝炎病毒表面抗体测定试剂盒，运用化学发光微粒子免疫检测技术(CMIA)定量测定小鼠血清样本中HBsAb水平。
2.实验结果：
如图1所示，随着时间的延长，各组血清中HBsAb抗体水平逐渐升高，在wk16时HBsAb抗体达到相对较高水平并趋于稳定；诱导产生的HBsAb抗体水平在A-D组间的趋势为D组>B组>C组>A组，在wk16时A-E组HBsAb抗体水平分别为3.27、4.48、3.52、4.78和4.57Lg，显示出统计学差异：如图1所示，***指D组相对于A组在第20周数据，p＜0.001，**指D组相对于C组在第20周数据，p＜0.01，D组抗体水平最高，且对照疫苗组E组的HBsAb抗体水平始终低于D组，说明本发明提供的药物组合物的免疫应答水平和持续保护效果优于市售的乙肝疫苗。
实施例4食蟹猴血清中HBsAb抗体水平检测
1.实验步骤：
食蟹猴(广东春盛生物科技发展有限公司)，雄性12只、雌性12只，2-5岁，分为G1-G4共4组(6只/组，雌雄各半)。
表2实验动物分组
G1-G3组分别在wk00和wk04进行肌肉注射免疫，共免疫2次；G4组分别在wk00、wk04和wk10进行肌肉注射免疫，共免疫3次；采用肌肉注射方式，通过后肢四头肌肌群或臀肌肌群单个位点给药。给药后每两周进行采血，持续采血至wk24，其中对wk02-wk24血清进行HBsAb抗体水平检测，检测方法同实施例2。
2.实验结果：
如图2所示，G1-G3组分别在wk00和wk04以含有不同剂量CpG的药物组合物免疫，其诱导产生的HBsAb抗体水平均在wk06时达到较高水平，平均抗体水平分别为22763、10275和2055mIU/ml，此后呈现一定幅度的变化，并在wk18-wk24时抗体水平趋于稳定，在wk24时平均抗体水平分别为14047、10871和2641mIU/ml；在整个实验周期内，G1-G3组诱导产生的HBsAb抗体趋势为：G1>G2>G3，即抗体水平与CpG剂量间呈现正相关性。
G4组分别在wk00、wk04和wk10以对照疫苗免疫，其诱导产生的HBsAb抗体水平在wk12时达到峰值，平均抗体水平为27580mIU/ml，此后呈现一定的下降趋势，并在wk18-wk24时抗体水平趋于稳定，在wk24时平均抗体水平为11138mIU/ml。
在整个实验周期内，对比免疫双佐剂疫苗的G1-G3组和免疫对照疫苗的G4组诱导产生的HBsAb抗体水平，在二免后的wk06-wk10期间，各免疫组间呈现G1>G2>G4>G3的趋势；在wk10时，对G4组进行第三次免疫后，其抗体水平有明显升高，在wk12-wk14期间，各免疫组间呈现G4>G1>G2>G3的趋势；此后，G4组的抗体水平呈现一定的下降趋势，在wk16-wk24期间，各免疫组间呈现G1>G4>G2>G3的趋势，其中在wk24时G2组和G4组间的抗体水平相当，无明显差距。
与市售的乙肝疫苗相比，在2次免疫期间，免疫含较高CpG剂量(G1组)的双佐剂疫苗诱导产生的抗体水平高于对照疫苗(G4组)；在对照疫苗进行第3次加强免疫后，其诱导产生的抗体水平虽有明显升高，但在抗体水平达到相对稳定后，其抗体水平仍低于G1组的双佐剂疫苗。
综上所述，本发明提供的药物组合物具有显著的免疫作用，在小鼠上进行的实验效果优于现有技术，在食蟹猴上进行的实验效果优于现有3针次市售疫苗，基于此制备的乙肝疫苗具有显著的优势。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (13)

1.一种用于预防乙型肝炎病毒感染的药物组合物，其包含：
i)乙型肝炎病毒表面抗原、其具有抗原活性的片段和/或其具有抗原活性的变体；和
ii)免疫刺激组合物，其包含铝佐剂和CpG寡聚脱氧核苷酸，其中所述CpG寡聚脱氧核苷酸的序列包含两个或两个以上拷贝的5′-TTCGTT-3′基序或5′-TCGTCGTCG-3′基序。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述CpG寡聚脱氧核苷酸选自如SEQ ID NO:2～4所示的CpG寡聚脱氧核苷酸中的一种或多种；
优选地，所述CpG寡聚脱氧核苷酸为如SEQ ID NO:2所示的CpG寡聚脱氧核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾或钾明矾中的一种或多种，优选为氢氧化铝。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述CpG寡聚脱氧核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键；
优选地，所述CpG寡聚脱氧核苷酸为全硫代寡聚脱氧核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述CpG寡聚脱氧核苷酸与铝佐剂的重量比为10～200：37.5，优选为60～200：37.5，进一步优选为200：37.5。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物，其中所述乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的组分i)和ii)之间的重量比为1：47.5～237.5，优选为1：97.5～237.5，进一步优选为1：237.5。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物为单位制剂，其中组分i)含量≥5μg/剂，组分ii)中的Al(OH)3含量≥187.5μg/剂，CpG含量≥300μg/剂；
优选地，CpG含量为300～1000μg/剂；
优选地，CpG含量为1000μg/剂。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含：iii)药学上可接受的载体和/或辅料；
优选地，所述药学上可接受的载体和/或辅料选自水、缓冲液、等渗盐溶液、润湿剂或乳化剂中的一种或多种；
进一步优选地，所述药学上可接受的载体和/或辅料选自磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％v/v甘油水溶液、透明质酸、乙醇、聚亚烷基二醇(例如聚丙二醇)或甘油三酯中的一种或多种。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的剂型为冻干粉针剂或注射溶液。
11.一种乙型肝炎预防性疫苗，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物在制备用于预防乙型肝炎病毒感染和/或乙型肝炎病毒介导的疾病的药物，例如疫苗中的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述乙型肝炎病毒感染和/或乙型肝炎病毒介导的疾病选自乙型肝炎、肝硬化或肝癌中的一种或多种。
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