KR100224329B1 - 단순포진비루스 당단백질 지디(gD) 및3D-MPL를 함유하는 단순포진백신 - Google Patents
단순포진비루스 당단백질 지디(gD) 및3D-MPL를 함유하는 단순포진백신 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100224329B1 KR100224329B1 KR1019930702835A KR930702835A KR100224329B1 KR 100224329 B1 KR100224329 B1 KR 100224329B1 KR 1019930702835 A KR1019930702835 A KR 1019930702835A KR 930702835 A KR930702835 A KR 930702835A KR 100224329 B1 KR100224329 B1 KR 100224329B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- rgd
- mpl
- vaccine
- alum
- days
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
새로운 단순 포진(HSV) 백신 배합물을 제공한다. 이들은 3 데실화 모노포스포릴 리피드 A와 함께 HSV 당단백질 gD 또는 면역학적 단편으로 구성된다.
Description
본 발명은 새로운 백신 배합물, 이의 제조 방법 및 치료요법에서 이의 사용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 단순 포진 비루스 감염, 보다 구체적으로 단순 포진 비루스 2(HSV-2) 감염 치료를 위한 새로운 배합물에 관한 것이다.
HSV-2는 음부포진의 1차 병인제이고 HSV-1(구순복행진의 원인제)와 함께 급성 질병을 유발하고 주로 뉴우런의 신경절 세포에서 잠복성 감염을 일으키는 두가지 능력을 특징으로 한다.
생식기 포진은 미합중국에서만 약 5백만명 발생한 것으로 추정되며 매년 500,000 임상 증례가 기록되었다(초기감염 및 재발감염). 전형적으로 초기감염은 사춘기 후에 발생하고 아픈 피부 병변의 국소적 출현을 특징으로 하며, 2 내지 3주의 기간동안 지속된다. 초기감염 후에 6개월 내에 환자의 50%가 질병의 재발을 경험할 것이다. 환자의 약 25%가 매년 10-15 사이의 재발 에피소드를 경험할 수 있다. 면역절충된 환자에게서 높은 빈도의 재발율을 보통 환자집단보다 통계적으로 높다.
HSV-1 및 HSV-2 비루스는 비루스의 표면상에 위치한 다수의 당단백질 성분을 갖는다. 이것들은 gA, gB, gC, gD 및 gE 등으로 공지되어 있다.
당단백질 D는 비루스 막 상에 위치하고, 또한 감염된 세포의 세포질에서 발견된다(Eisenberg R. J. 일행 ; J of Virol 1980 35 428-435). 그것은 시그날 펩티드를 포함하는 393개 아미노산으로 구성되고 대략 50 kD의 분자량을 갖는다. 모든 HSV 엔벨로프 당 단백질 중 이것이 아마도 가장 잘 특성화되어 있다(Cohen 일행 J. Virology 60 157-166). 생체내에서 그것이 세포막에 대한 비루스 부착에서 중심 역할을 한다고 공지되어 있다. 또한, 당단백질 D는 생체내에서 중화 항체를 유도할 수 있다고 밝혀졌다(Eing 일행 J. Med. Virology 127 : 59-65). 그러나, 잠복 HSV-2 비루스는 여전히 재활성화될 수 있고 환자 혈청내에 높은 중화 항체 역가가 존재할지라도 질병의 재발을 유발한다.
중화 항체만을 유발하는 능력은 질병을 적당히 억제하기에 불충분하다. 질병의 재발을 방지하기 위해서는, 중화 항체 뿐만 아니라 T-세포를 통해 매개된 세포 면역을 자극하는 임의 백신이 필요할것이다. 본 발명은 상기 목적을 성취한다.
본 발명은 3-o-데아실화 모노포스포릴 리피드 A(3D-MPL), 모노포스포릴 리피드 A의 데아실화 유도체, 및 적당한 부형제와 함께 HSV 당단백질 D 또는 그의 면역학적 단편으로 구성되는 백신을 제공한다. 전형적으로 당단백질 D는 HSV-2로부터 일 것이다. 부형제는 수중유 유탁액, 또는 명반일 수 있고, 3D-MPL은 투여량마다 10㎍-100㎍, 바람직하게 25-50㎍의 범위로 존재할 것이며 항원은 전형적으로 투여량 당 2-50㎍ 범위로 존재할 것이다.
3D-MPL은 영국 특허 번호 2220211(RIBI)에 서술된 방법에 따라 얻을 수 있다.
본 발명의 실시양태는 308 아미노산의 절단형 HSV-2 당단백질 D로서, 이는 자연적으로 발생하는 당단백질의 1번부터 306번까지의 아미노산과 막앵커영역이 없는 절단형 단백질의 C 말단에서 아스파라긴과 글루타민을 부가하여 구성된다. 상기 형태의 단백질은 시그널 펩티드를 함유하는데 이는 절단되어 성숙 283 아미노산 단백질을 생성한다. 차이니즈 햄스터 난소 세포에서의 상기 단백질의 생산이 제네테크의 유럽 특허 EP-B-139 417에 서술되었다.
본 발명의 백신 배합물에서 사용되는 바람직한 성숙 절단체는 rgD2t로 명명된다.
HSV 항원은 화학적으로 또는 다르게 특정 부형제에 접합될 수 있다. 특히 바람직한 접근법은 헤파티티스 B 표면 항원의 표면 상에 위치된 자유 설프히드릴기를 통하여 특정 헤파티티스 B 표면 항원에 화학적으로 접합시키는 것이다. 참고 동시계류중인 영국 특허 출원 번호 902763.9.
본 발명의 배합물은 심지어 항원의 매우 적은 투여량(예컨대, 5㎍ rgD2t 만큼 적은)에 의해서도 보호 면역을 유발하는데 매우 효과적이다.
그것들은 초기감염에 대해 탁월한 보호를 제공하고 이롭게 특이적 체액성(humoral, 중화 항체) 및 또한 효과기 세포 매개된(DTH)면역 반응 둘다를 자극한다.
바람직하게, 비독성 수중유 유탁액은 수성 부형체내에 비독성 오일, 예컨대 스쿠알란 또는 스쿠알렌, 유화제, 예컨대, 트윈 80을 함유한다. 수성 부형제는 예컨대 인삼염 완충 식염일 수 있다.
부가적인 측면에서 본 발명은 의료 치료요법에 사용하기 위해, 특히 단순포진 비루스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위해 여기서 서술된 바와 같이 백신 배합물을 제공한다.
본 발명의 백신은 면역보호량의 HSVgD 또는 그의 면역학적 단편을 함유할 것이고 이는 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다.
일반적으로 백신 제제는 1978년 미합중국 메릴렌드주 빌트모아시의 유니버시티 파크 프레스의 Voller 일행에 의해 편집된 백신에서의 새로운 경향 및 개발에 서술되어 있다. 리포좀내의 포위(Encapsulation)는 예컨대, Fullerton의 미합중국 특허 4,235,877에 서술되어 있다. 거대분자로의 단백질의 접합은 예컨대 Likhite의 미합중국 특허 4,372,945 및 Armor 일행의 미합중국 특허 4,474,757에 공개되어 있다.
각 백신 투여량내 단백질의 양은 전형적인 백신주사자에게서 유의한 역작용없이 면역보호 반응을 유발하는 양으로 선택된다. 상기 양은 특정 면역원이 사용되는가에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 각 투여량이 1-1000㎍의 단백질, 바람직하게 2-100㎍, 가장 바람직하게 4-40㎍을 함유할 것이라고 예측된다. 특정 백신에 대한 최적량은 항체 역가 및 피검자에서의 기타 반응에 대한 관찰을 수반하는 표준연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신주사에 이어, 피검자에게 약 4주후에 증강분을 준다.
HSV 감염에 민감한 사람의 백신주사외에, 본 발명의 제약학적 조성물을 HSV 감염으로 고통받는 환자들을 면역치료요법으로 치료하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명의 부가적인 측면에서, 여기서 서술되는 바와 같은 제조방법이 제공되는데, 상기 방법은 HSV-2 당단백질D 또는 면역학적 단편을 부형제, 예컨대 수중유 유탁액 또는 명반, 및 3D-MPL과 함께 혼합하는 것으로 구성된다.
재조합 단순 포진 비루스 당단백질 D 서브유니트 백신의 보조약 효력의 비교
상기 연구에서, 단순 포진 비루스(HSV) 유형 2(rgD2t)로부터의 재조합 당단백질 D의 보호면역을 개선하는 몇몇 보조약의 능력은 기니아 피그 모델에서 평가했다. 시험한 보조약은 수산화알루미늄, 3 데아실-모노포스포릴 리피드 A와 함께 수산화알루미늄, 및 수중유 유탁액내에 운반된 3 데아실-모노포스포릴 리피드 A였다.
1. 항원의 설명
HSV rgD2t는 트랜스펙션된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생산된 유전학적으로 조작된 재조합 절단형 당단백질이다(유럽 특허 번호 0 139 417)
2. 항원-보조약 제제 및 면역화 스케즐
기니아 피그 모델에서 몇몇 rgD2t 배합물의 보호 면역을 평가하기 위해 두개의 별개 실험을 수행했다. 첫 번째 실험에서, 기니아 피그의 군은 하기 서술된 바와 같이 제조된 4개 보조약 배합물내 낮은 항원 투여량(5㎍의 rgD2t)으로서 3번 면역화했다. 최종 면역화 후 2주에, 그들을 HSV 유형 2로써 질내로 공격했고 초기 및 재발 HSV2질병의 전개를 매일 검사했다. 두번째 실험에서는, 부가적으로 이들 배합물을 더 큰 동물군에 대해 평가했다. 또한 항원 투여량 및 보조약 조성물 같은, 이들 배합물의 효력에 영향을 미치는 요인들도 시험했다.
2. 1 항원-보조약 제제
첫번째 실험에서, 기니아 피그를 하기 보조약 제재로써 면역화했다. 각각의 투여량(5㎍)은 -0.25㎖부피로 투여했다.
2. 1. 1. rgD2t/명반(수산화알루미늄)
명반은 수퍼포스(알히드로겔,(보에히미트), 수퍼포스, 덴마크)로부터 얻었다. 정제 rgD2t 5㎍을 pH 6.8의 150 mM NaCl 10 mM 인삼염 완충액 0.25㎖내에서 0.25㎎ 당량 Al3+에 상응하는 수산화알루미늄(명반) 상에서 4℃에서 밤새도록 흡수시켰다.
2. 1. 1 rgD2t/수산화알루미늄과 3D-MPL
3D-MPL은 리비 이뮤노켐 리서어치, Inc로부터 얻었다. 2. 1. 1에 서술된 바와 같이 명반 상에서 gD2t 5㎍을 밤새도록 흡수한 후에, 보조약 제제를 원심분리하고 그의 상등액을 제거했다. 그 다음 3D-MPL 100㎍을 함유하는 흡수 완충액의 동일부피를 명반-결합 rgD2t에 첨가했다.
두 rgD2t/명반 제제에 대해, 98% 이상의 rgD2t가 수산화 알루미늄 보조약내에 혼입되었음을 발견했다.
2. 1. 3 수중유 유탁액(R)내 rgD2t/3D-MPL
스쿠알렌 오일에 첨가된 12% w/v 레시틴 및 0.08% 트윈 80을 사용하여 수중유 유탁액을 제조했다. 최종 원하는 농도보다 100배 높은 농도의 3D-MPL을 첨가했다. 그 다음 상기 제제의 1%를 수성 상내 rgD2t 5㎍이 되도록 0.25㎖ 부피로 혼합하여, 3D-MPL 100㎍을 함유하는 1% 수중유 유탁액을 생성했다.
상이한 양의 rgD2t 및/또는 면역자극체를 함유하는 것을 제외하고 상기한 같이 제조된 유사한 보조약 배합물을 두 번째 실험에서 사용했다. 0.5㎖의 층부피로 투여했다. 이들 배합물은 하기에 서술된다.
rgD2t/명반 : 0.5㎖ 투여량당 5 또는 20㎍ rgD2t : 0.5㎎ 당량 Al3+
rgD2t/명반과 3D-MPL : 0.5㎖ 투여량 당 5 또는 20㎍ rgD2t : 0.5㎎ 당량 Al3+: 50㎍ 3D-MPL
o/w 유탁액(R)내 rgD2t/3D-MPL : rgD2t 5 또는 20㎍를 상기(2. 1. 3) 서술된 바와같이 1% o/w 유탁액내에 배합했다. 0.5㎖ 투여량은 1% o/w 유탁액내에 5㎍ 또는 20㎍의 rgD2t, 50㎍의 3D-MPL을 함유했다.
o/w 유탁액(S)내 rgD2t/3D-MPL : 하기와 같이 부형액을 제조했다 : 0.4%(v/v) 트윈 80을 함유하는 인산염 완충 식염(PBS)에 5%(v/v)플루로닉 L121 및 10% 스쿠알란을 첨가하고 결과의 유탁액이 단지 서브미크론 입자로 구성되도록 결과의 혼합물을 마이크로유동화장치(모델 M/100 마이크로플로이딕스 Corp.)를 통해 10번 마이크로유동화했다. 그다음 50㎍의 3D-MPL을 유탁액에 첨가했다. 3D-MPL을 함유하는, 상기 유탁액중 1부피를 동일 부피의 두배 농축된 항원과 혼합하고 성분을 완전히 혼합시키기 위해 간단히 볼텍싱했다. 최종 제제는 0.5㎖ 투여량내에 트윈 80 0.2%, 플로리닉 L121 2.5%, 스쿠알란 5%, 3D-MPL 50㎍ 및 rgD2t 5㎍ 또는 20㎍로 구성되었다.
2. 2 면역화 스케쥴
암컷 하트레이 기니아 피그(200-250gr)의 군을 4개 상이한 보조약 배합물에 배합된 rgD2t 5㎍으로써 0, 28 및 95일에 3번 면역화했다.
0.25㎖의 주사부피로써 피하로 면역화를 수행했다. 대조표준 동물을 보조약으로써 동일 프로토콜에 따라 주사하거나 처리하지 않았다.
상이한 군들을 하기와 같이 면역화했다 :
1 군(n=4) : o/w 유탁액(R)내 5㎍ rgD2t/3D-MPL(100㎍)
2 군(n=4) : 5㎍ rgD2t/명반과 3D-MPL(100㎍)
3 군(n=4) : 5㎍ rgD2t/명반
4 군(n=5) : 명반 단독으로
5 군(n=5) : 3D-MPL(100㎍) 단독으로
6 군(n=8) : 처리안함
하기 서술된 바와 같이 ELISA 및 중화 검정법에 의한 항체 측정을 위해 매 2주마다 동물에게서 체혈했다.
지연형 과감작 반응의 유발을 측정하여 상이한 배합물들의 T 세포 매개된 면역 유발 능력을 시험했다. 상이한 rgD2t 배합물에 의해 유발된 체액성 및 세포 면역 반응의 평가를 사용된 정보 판독은 하기에 서술된다.
상기 rgD2t 배합물들에 의해 유발된 보호 면역을 비교하기 위해, 모든 기니아 피그를 최종 면역화 2주 후에 105플라그-형성 단위(pfu)의 HSV2, 균주 MS로써 질내로 공격했다. 그들의 급성 감염의 임상 신호 뿐만 아니라 재발 포진성 질병의 징후를 매일 조사했다. 비루스 공격후 5일후 질 면봉 표본을 수집하고 감염성 비루스에 대해 적정했다.
기니아 피그 질내 모델의 상세한 설명의 하기에 주어진다.
두 번째 실험에서, 하기 rgD2t 배합물의 면역원성을 더 큰 동물군으로 평가했다. 두개의 항원 투여량을 비교하고 (5 및 20㎍) 상이한 보조약 조성물을 시험했다. 50㎍ 3DMPL의 투여량을 사용했고 그의 효과를 앞서 사용된 100㎍ 투여와 비교했다.
암컷 하트레이 기니아 피그의 군을 하기와 같이 1, 28 및 84일에 세 번 면역화했다 :
Ⅰ 군(n=8) : 20㎍ rgD2t/3DMPL(50㎍) o/w 유탁액(R)
Ⅱ 군(n=8) : 5㎍ rgD2t/3DMPL(50㎍) o/w 유탁액(R)
Ⅲ 군(n=10) : 20㎍ rgD2t/3DMPL(50㎍) o/w 유탁액(S)
Ⅳ 군(n=10) : 5㎍ rgD2t/3DMPL(50㎍) o/w 유탁액(S)
Ⅴ 군(n=10) : 5㎍ rgD2t/Alum+3 DMPL(50㎍)
Ⅵ 군(n=10) : 5㎍ rgD2t/Alum+3 DMPL(50㎍)
Ⅶ 군(n=4) : 명반+3DMPL(50㎍) 단독으로
Ⅷ 군(n=4) : 3DMPL(50㎍) o/w 유탁액(R) 단독으로
Ⅸ 군(n=8) : 처리안함
0.5㎖ 투여량으로 면역화했다. 대조표준군은 동일한 프로토콜에 따라 보조약만으로 면역화하거나 (Ⅶ 및 Ⅷ군) 처리하지 않았다(Ⅸ군).
첫번째 예방 실험에 서술된 프로토콜에 따라 마지막 군(Ⅹ군)을 0.25㎖ 투여량내에 100㎍ 3D-MPL을 함유하는 gD2t 명반+3D-MPL 배합물로써 면역화했다 :
Ⅹ 군(n=10) : 5㎍ rgD2t/명반+3DMPL(100㎎)
하기에 서술된 바와 같이, ELISA 및 중화 검정에 의한 개별 항체 측정을 위해 동물에게 매 2주마다 채혈했다. 두 번째 면역화 후에 질 세척물을 수집했고 gD2t에 대해 특이적인 전신계(systematic) 항제(IgG 부류의 항-gD2t 항체)의 존재를 검정했다. 최종 면역화 후 2주에 기니아 피그를 105pfu HSV2(균주 MS)로써 질내로 공격했다. 공격 후에, 급성 감염의 임상 신호(공격 후 4 내지 12일)뿐만 아니라 제발포진성 질병의 징후(공격 후 13 내지 39일)를 매일 조사했다.
3. 정보판독
rgD2t 배합물로써 백신주사하여 유발된 특이적 항체 및 세포 매개된 반응을 평가하기 위해 몇몇개 정보판독을 했다. 이들 배합물의 보호값은 기니아 피그 질내모델에서 평가했다.
3. 1 ELISA
코우팅 항원으로 rgD2t를 사용하여 기니아 피그 혈청 및 질 세척물 내 gD-특이적 항체를 감지하고 정량하기 위한 ELISA를 고안했다.
3. 1. 1 혈청내 rgD2t에 대해 특이적인 IgG 항체의 감지
웰당 50㎕의 항원 및 항체 용액을 사용했다. 항원을 PBS 내 1㎍/㎖의 최종 농도로 희석하고 4℃에서 밤새도록 96웰 마이크로타이터 평판의 웰(Maxisorp Immune-plate, Nune, Denmark)에 흡착시켰다. 그 다음 웰을 PBS 트윈 0.1%(세척완충액)로써 5번 세척하고 37℃에서 1시간동안 1% 소혈청 알부민, 4% 신생 송아지 혈청 및 0.1% 트윈을 함유하는 PBS(포화 완충액)와 함께 항온처리했다. 포화 완충액내 혈청의 3-배 희석물(1/100 희석에서 출발)을 rgD2t-코우팅된 웰에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 항온처리했다. 평판을 상기와 같이 세척하고 포화 완충액내 1/3000 희석된 비오틴-접합된 양 항-기니아 피그 IgG(IgG1 및 IgG2 특이적, 세로테크, 소파르 바이오켐, 벨기에)를 각 웰에 첨가했고 37℃에서 1시간30분 동안 항온처리했다. 세척 단계 후에, 포화 완충액내 1/1000 희석된 스트렙타비딘-비오틴화 퍼옥시다제 복합체(아메르함, 영국)를 첨가했고 37℃에서 30분동안 항온처리했다. 평판을 상기와 같이 세척하고 pH 4.5의 0.1M 구연산 완충액내 o-페닐렌디아민(시그마) 0.04% H2O20.03%의 용액과 함께 항온처리했다. 15분 후에 H2SO42M을 첨가하여 색반응을 중지시키고 492nm에서 흡광도를 판독했다.
ELISA 역가를 흡광도를 생성한 혈청 희석액의 역으로 정의해다(492nm에서 측정된 광학 밀도는 최대 흡광도 값의 50%에 상응한다(중간점 역가)).
ELISA 역가는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 4 파라메타 선형 희귀분석에 의해 계산했다.
3. 1. 2 질 세척물내 rgD2t에 대해 특이적인 IgG 항체의 감지
먼저 질 세척물을 하기와 같이 ELISA에 의해 그들의 총 IgG 함량을 조정했다. 멕시소프 면역-평판을 4℃에서 밤새도록 PBS내 희석된 정제 염소 항-기니아 피그 IgG(시그마, 벨기에) 1㎍/㎖(웰당 50㎕)로써 코우팅했다. 평판을 세척하고 상기와 같이 포화 완충액과 함께 항온처리했다. 질 세척물을 포화 완충액내 두-배 희석물(1/100 희석물로 출발)로써 연속하여 희석했다. 정제 기니아 피그 IgG(시그마, 벨기에)의 표준 곡선이 각 평판에 포함되었다(100ng/㎖ 농도에서 출발하는 2배 희석물).
실온에서 2시간 항온처리한 후에, 평판을 상기와 같이 세척하고 포화 완충액내 1/1000 희석된 기니아 돼지 IgG1 및 IgG2(세로테크, 소파르 바이오켐, 벨기에)에 대해 특이적인 비오틴-접합된 양 항체를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 30분동안 항온처리했다. 다음 단계(스트렙타비딘-비오틴화 퍼옥시다제 복합체의 첨가 및 색 발현)는 상기(3. 1. 1) 서술된 바와 같았다.
질 세척물내 존재하는 총 IgG의 농도를 컴퓨터 프로그램을 사용하여 4 파라메타 단선 회귀 분석에 의해 IgG 표준 곡선으로부터 결정했다.
그들의 총 IgG 함량을 조정한 후에, 질 세척물을 항-gD 항체 혈청 정량화를 위해 서술된 바와 동일한 ELISA를 사용하여 rgD2t에 대해 특이적인 IgG 항체의 존재에 대해 시험했다. 결과는 0.5㎍/㎖ 총 IgG마다 492nm에서 측정된 광학 밀도로써 표현했다.
3. 2 중화 검정
96 웰 포맷 중화 검정을 하기와 같이 했다 :
시험될 표본의 일련의 두배 희석물을 96W 평판(각 혈청 희석물의 25㎕/웰, 복제물)에 직접 제조했다. 400 puf의 비루스 HG52 및 보체를 함유하는 혼합물의 50 마이크로리터(웰내 1/100 최종희석)를 각 웰에 첨가했다. 평판을 37℃에서 1시간동안 항온처리했다. 그 다음 4.105세포/㎖의 BHK 21 세포 현탁액 100 마이크로리터를 각 웰에 첨가했다(4.104세포/웰). 평판을 1000 rpm에서 5분동안 원심분리했고 7% CO2의 존재하에 37℃에서 5일동안 항온처리했다.
이 기간 후에, 배양 배지를 온화하게 제거하고 100㎕의 크리스탈 바이올렛 용액(10%, 메탄올, 90%, H2O, 0.3% 크리스탈 바이올렛)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 20분동안 항온처리했다. 그 다음 평판을 수도물로 충분히 세척했다. 플라크의 존재는 현미경 관찰에 의해 쉽게 감지할 수 있다.
중화 역가는 비루스 플라크가 관찰되지 않은 최종 혈청 희석액의 역수로 정의되었다(세포병원성 효과의 100% 보호). 동시에, 완전한 세포병원성 효과(세포 단층의 100% 용해)가 대조표준 웰에서 관찰되었음에 주의하는 것이 중요하다.
3. 3 지연형 과감작(DTH)
지연형 과감작 반응의 유발을 측정하여 상이한 rgD2t 배합물들의 T 세포 매개된 면역 유도 능력을 시험했다.
첫번재 실험을 위해 제조된 보조약 배합물을 상기 연구에서 사용했다. 상기 제제는 0.25㎖ 투여량당 5㎍의 rgD2t를 함유했다. 면역화 스케쥴은 하기와 같았다 : 1차 면역화 : 근육내로 주어진 백신 배합물 0.25㎖ ; 증강 면역화 : 21일 후에 근육내로 주어진 백신 배합물 0.25㎖ ; 피부시험 : 8일 후에 피부내로 주어진(식염내) rgD2t 5㎍. 모든 기니아 피그에 대해 대조표준으로서 식염으로 피부 시험을 했다.
게다가, 대조표준 기니아 피그(면역화안된 동물)를 rgD2t로써 피부시험을 했다. 피부내 주사 부위에서의 흥반 및 경화물 24 및 48시간 후에 조사했다.
3. 4 기니아-피그 질내 모델
HSV 생식기 감염에 대한 기니아 피그 모델은 LR Stanberry 일행에 의해 서술되었다(J. of Infectious Diseases 1982, 146 : 397-403 ; Intervirology 1985, 24 : 226-231).
간단히, 최종 면역화 후 2주에, 기니아 피그를 105pfu의 HSV2 균주 MS로써 질내 적하에 의해 공격했다. 초감염의 임상 경과를 공격 후 12일 동안에 외생식기 피부 병변의 빈도 및 엄중도를 매일 관찰하여 조사했다.
질 면봉을 비루스 공격후 5일에 수집하고 하기 서술된 바와 같이 플라크 검정에 의해 감염성 HSV2에 대해 적정했다. 그 다음 13에서 60일까지 재발 포진성 병변의 징후를 매일 관찰했다. 외생식기 피부상의 포진성 병변을 0 내지 4 범위의 병변 점수 규모를 사용하여 정량했다(0=병변 또는 발적(redness)이 없음 ; 0.5=발적 ; 1=소포 ; 1.5=≥4 작은 소포 ; 2=더 큰 소포 ; 2.5=점수 2 로서의 소포의 융합으로 초래된 몇몇의 큰 소포 ; 3=소포의 크기 및 수증가 ; 3.5=생식기 피부의 모든 표면을 덮은 병변 ; 4=이해(maceration)로써 부패된 병변).
상이한 rgD2t 백신에 의해 제공된 보호 정도를 하기 정의된 기준에 따라 평가했다.
초기 질병에 대한 보호(0-12일)
하기의 병변이 기록되었다면 동물이 보호되지 않았다고 간주했다 :
-임의 시간에 하나 이상의 붉은 영역,
-적어도 연속적인 3일 동안 동일한 영역에서 지속된 하나의 붉은 영역(0.5 병변 점수),
-하나 또는 몇 개의 소포(그 병변 점수).
재발 질병에 대한 보호(13-60일)
0.5 병변 점수가 적어도 2일 연속 기록된다면 또는 병변 점수 ≥1가 임의 날에 관찰되었다면 동물은 재발 질병에 양성으로 기록했다. 재발 질병의 에피소드가 선행하고 임의 병변 또는 발적없는 날이 이어졌다.
동물에 대한 병변 임중도를 초감염중에(1-12일) 측정된 점수의 합으로 계산한다. 병변 또는 관찰 기간동안(1-12일 [초기 질병] 또는 13-60일[재발 질병] ≥1의 병변을 보이는 동물의수를 나타낸다.
3. 5 질 면봉내 비루스 적정
질 면봉을 비루스 공격후 5일에 수집했다. 질 강공을 2% 태아송아지 혈청, 2mML 글루타민, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 100㎍/㎖ 젠타마이신 및 1㎍/㎖ 암포테리신 B로 보충된 기초 이글 배지(면보유 배지)내에 예비 분비된 칼슘 아르기네이트를 끝에 씌운 면봉으로써 훔쳐내었다.
각 면봉을 부러뜨리고 1㎖의 면봉 배지를 함유하는 무균 12×75㎜ 5㎖ 폴리알로머 튜브내에 놓는다. 그 다음 비루스를 제거하기 위해 튜브를 볼텍싱하고 사용할 때까지 동결시켰다. 적정을 위해, 5.105세포/웰을 함유하는 6개 웰 배향평판을 37℃에서 밤새도록 항온처리했다. 튜브를 해동시키고 면봉 배지내 일련의 표본 희석액을 제조했다. 6개 웰내 배양 배지를 제거한 후에, 각 표본 희석액의 200㎕를 세포 단층상의 복제물에 옮기고 37℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 1.5% 카르복시메틸셀룰로스를 함유하는 배양 배지 4㎖를 각 웰에 첨가했다. 그 다음 평판을 37℃에서 2일 동안 항온처리했다. 상기 항온처리기간 후에, 배지를 온화하게 제거하고 1㎖의 크리스탈 바이올렛 용액(10% 메탄올, 90% H2O, 0.3% 크리스탈 바이올렛)을 15분 동안 각 웰에 첨가했다. 그 다음 평판을 완전히 헹궈 내고 평판을 계수했다. HSV2 역가를 pfu/㎖로 표현했다.
4. 결과
첫 번째 실험 세트에서, 기니아 피그의 군을 4개 상이한 배합물내에 배합된 낮은 항원 투여량(rgD2t 5㎍)으로써 면역화했다. 질내 HSV2 접종(예방시도)에 앞서 기니아 피그에서 투여할 때 초기 및 재발 HSV 질병에 대항하여 보호할 수 있는 보다 효력있는 rgD2t 보조약 조합을 선택하기 위하여 상기 부최적 항원 투여를 선택했다.
4. 1 체액성 면역의 유발
[표 1]에 제시된 바와 같이, 면역자극제로서 3D-MPL을 함유하는 rgD2t 배합물로써 백신주사된 군은 rgD2t/명반 백신으로써 면역화된 군보다 그들의 혈청에서 더 높은 ELISA 및 중화역가를 나타냈다. rgD2t/3D-MPL o/w(R) 또는 rgD2t 명반 3D-MPL로써 3번 면역화 후에 우수한 평균 중화 역가를 유발했다.
4. 2 효과기 T 세포 반응의 유발(DTH)
피부 시험 결과[표 2]는 3D-MP Lo/w 유탁액내에 배합된 rgD2t가 가장 강한 DTH 반응을 유발했음을 보였다. 또한 rgD2t 명반 3D-MPL에 의해 특이적 DTH 반응을 유발했다. 또한 생쥐에서 수행된 유사한 시험은 명반과 3D-MPL과 혼합된 rgD2t는 rgD2t 명반 배합물에 반하여 생체내 효과기 T 세포 반응을 유발하는데 매우 효과가 있었다.
4. 3 HSV 초기 질병에 대한 백신주사의 효과
세 번째 면역화 후 2주에, 기니아 피그를 HSV2로써 질내로 공격했다. HSV2 초감염의 임상적 및 비루스학적 경과에 대한 백신주사의 효과는 제1도에 예시되고 제3도에 요약된다. 급성 초기 질병에 감염되고 경험하게 되는 대조표준군(4 내지 6 군)에 비교하여, rgD2t 3D-MPL o/w 배합물로써 백신주사된 동물의 100%는 피부 병변 빈도 및 엄중도에 의해 조사된 바대로 포진성 질병의 징후를 보이지 않았다. 또한, 이들 동물은 공격후 5일에 질 비루스 적정에 의해 측정된 바대로 임의 비루수 복제를 나타내지 않았다. rgD2t/명반 3D-MPL로써 백신 주사된 군에서 매우 유사한 결과가 얻어졌다. 이 군은 관찰 기간 중에 포진성 소포를 발병하지 않았다(병변 점수1). 또한, 수집된 질 면봉에서 매우 낮은 비루스 복제를 감지할 수 있었다. 반면에 명반 상에 흡수된 동물 rgD2t는 불량하게 보호했다(75% 피부 병변율).
4. 4. HSV 재발 질병에 대한 백신주사 효과
결과는 제1도에 예시되고 [표 4]에 요약된다.
3D-MPL을 함유하는 rgD2t 배합물에 의한 백신주사는(1 및 2 군) 재발 포진성 질병의 전개를 유의하게 변경시켰다. 두 군은 대조표준 또는 rgD2t 명반 처리군보다 유의하게 적은 재발 에피소드를 가졌다.
3D MPL을 함유하는 예방 rgD2t 백신의 효과에 영향을 주는 인자를 부가적으로 평가하기 위해, 두번째 실험 세트를 더 큰 기니아 피그 수에 대해 시작했다.
두 항원 투여량을 비교했고(5 및 20㎍)상이한 보조약 조성물을 시험했다. 0, 28 및 84일에 세 번의 면역법을 투여했다. ELISA 및 중화 검정에 의한 개별 항체 측정을 위해 매 2주마다 동물에게 채혈했다. 두번째 면역화 후에 질 세척물을 수집하고 rgD2t에 대해 특이적인 전신기 항체의 존재를 시험했다.
체액성 면역의 유발
결과[표 5]는 3D-MPL을 함유하는 모든 rgD2t 배합물이 기니아 피그 혈청에서 높은 ELISA 및 중성 역가를 자극할 수 있었음을 나타냈다.
세 번 면역화 후에 유발된 평균 ELISA 및 중화 역가는 5㎍ 또는 20㎍ rgD2t를 함유하는 rgD2t 배합물로써 백신 주사된 군의 혈청에서와 매우 유사했다. 50㎍ 3D-MPL(Ⅵ 군) 또는 100㎎ 3D-MPL(Ⅹ 군)을 함유하는 rgD2t 명반 백신으로써 면역화된 군에서 측정된 체액성 반응에서 유의한 차이가 없었다.
전신계 항-rgD2t항체(IgG 부류)가 모든 백신주사된 군의 질 세척물에서 감지될 수 있었음을 인지하는 것이 흥미롭다. 상기 점액으로 위치를 알게 되는 항-rgD2t 항체 반응은 초감염 중에 생식관내 감염성 비루스의 적하를 감소시켜 중요한 보호 역할을 할 수 있다.
HSV 초기 질병에 대한 백신주사의 효과
세 번째 면역화 후 2주에, 기니아 피그를 HSV2로써 질내로 공격했다. HSV2 초감염의 임상적 및 비루스학적 경과에 대한 백신주사의 효과는 [표 6]에 요약된다. 대조표본과 비교하면, 50㎍ 또는 100㎍ 3D-MPL(Ⅵ 및 Ⅹ 군)을 함유하는 5㎍ rgD2t 명반 3D-MPL로써 백신주사된 동물은 유의하게(p0.05) 감소된 피부 병변 엄중도 뿐만 아니라 피부 병변 빈도의 감소를 보였다.
3D-MPL o/w 유탁액내 5㎍ rgD2t로써 백신주사된 군(Ⅲ 군)에서 매우 유사한 결과가 관찰되었다. 세 개의 백신주사된 군에서, 공격후 5일 후에 수집된 질 면봉에서 매우 낮은 비루스 복제를 감지할 수 있었다.
HSV 재발 질병에 대한 백신주사의 효과
결과는 [표 6]에 제공된다. 대조표준과 군과 비교하면, 피부병변이 빈도 및 재발일수는 새 백신주사된 군에서 유의하게(p0.05) 감소되었다. 또한 이들 군은 대조표준 군보다 더 적은 재발 에피소드를 가졌다.
5. 결론
기니아 피그에서 얻어진 결과는 수산화알루미늄과 조합되거나 수중유 유탁액으로 운반되는, 3D-MPL을 함유하는 rgD2t 배합물에 의한 백신주사가 HSV2 접종전에 기니아 피그에 투여할 때 초기 및 재발 HSV2 질병에 대항하여 보호를 제공하는데 매우 효과적임을 명확히 보여준다. 상기 rgD2t 3D-MPL 배합물은 특이적 체액성(중화 항체) 및 효과기 세포 매개된(DTH) 면역 반응을 개선할 수 있다. 이들 결과는 rgD2t의 낮은 투여량(5㎍)을 사용하여 얻는다.
6. 영장류에서 gD2t 배합물의 면역원성
6. 1 rgD2t/명반 및 rgD2t/명반 3D-MPL 형태의 비교 면역원성
rgD2t/명반 및 rgD2t/명반 3D-MPL 백신의 면역원성을 남아프리카산 긴꼬리원숭이(아프리카 녹색 원숭이, AGM)에서 평가했다. 특이적 체액성(ELISA 및 중화역가) 및 효과기 세포 매개된(DTH)면역 반응을 측정했다.
6. 1. 1 실험 절차
각각의 배합물은 20㎎ rgD2t 및 0.5㎎ 당량 Al3+/투여를 함유했다. 50㎍ 3D-MPL의 투여량을 사용했다. 남아프리카산 긴꼬리 원숭이(AGM)를 0, 28 및 84일에 세 번 면역화했다. 0.5m 투여량(20 rgD2t)으로 근육내에 면역화했다. ELISA 및 중화 검정에 의한 항체 측정을 위해 매 ±2주에 동물에게 피를 뽑았다. 지연형 과감작(DTH) 반응의 유발을 측정하여 상이한 배합물들의 T 세포 매개된 면역 유발 능력을 시험했다. 원숭이를 두 번째 면역화 후 13일에 식염내 상이한 rgD2t 투여량(20, 5 및 1㎍)을 복부 상에 피부내로 주었다. 또한 대조표준으로서 그들을 식염단독으로 피부 시험을 했다. 피부내 주사 부위의 홍반 및 발적은 24시간 및 48시간 후에 주시했다.
6. 1. 2 결과
a) 체액성 면역의 유발
백신주사 전에, 어느 원숭이도 임의 항-HSV2 항체 활성을 나타내지 않았다(자료는 제시하지 않음). [표 7]에 제시된 바대로, 두 번째 면역화 후에 두 백신은 우수한 ELISA 및 중화 역가를 유발했다. 상기 항체 반응은 rgD2t/명반 백신주사된 원숭이에서 세 번째 면역화에 의해 증강되지 않았다. 반면에, rgD2t/명반 3D-MPL로써 세 번째 면역화를 받은 원숭이는 증가된 ELISA 및 중화 항체 반응을 생성한다(평균 ELISA 역가 : 10056 ; 평균 중화 역가 : 950).
b) 효과기 T 세포 반응(DTH)의 유발
피부 검사 결과[표 8]은 명반과 3D-MPL과 조합된 rgD2t가 rgD2t 명반 배합물에 반하여 생체내에서 효과기 T 세포 반응을 유발하는데 매우 효과적이었음을 보였다. 강한 DTH 반응이 20㎎ rgD2t로써 피부 시험된 모든 rgD2t 명반 3D-MPL 백신주사된 동물에서 관찰되었다. 또한 대부분의 원숭이에서(5㎍ 투여의 경우에 3/4 및 1㎍ 투여의 경우에 2/4) 낮은 gD2t 농도(5 및 1㎍)로써 특이적 DTH 반응을 측정했다. 상기 rgD2t 투여는 20㎎ rgD2t 농도보다 더 약한 피부 시험 반응을 유발한다.
6. 2 붉은털 원숭이에서 rgD2t/명반 3D-MPL 배합물의 면역원성
상이한 rgD2t 투여량(100㎍, 10㎍, 또는 5㎍)을 함유하는 rgD2t/명반 3D-MPL 백신의 면역원성을 붉은털 원숭이에서 비교했다.
6. 1. 2 실험 절차
각 배합물은 투여량당 0.5㎍ 당량 Al3+및 50㎍ 3D-MPL을 함유했다. 세군의 붉은털 원숭이(4마리 원숭이/군)를 하기와 같이 0, 28 및 77일에 세 번 면역화했다.
1 군 : 100㎍ rgD2t 명반과 3D-MPL(50㎍)
2 군 : 20㎍ rgD2t 명반과 3D-MPL(50㎍)
3 군 : 5㎍ rgD2t 명반과 3D-MPL(50㎍)
1㎖ 투여량으로 근육내로 면역화했다. ELISA 및 중화 검정에 의한 항체 측정을 위해 매 ±2주에 동물에게 채혈했다.
6. 2. 2 체액성 면역의 유발
백신주사전에는, 어느 원숭이 혈청도 임의 HSV2 항체 활성을 나타내지 않았다. 명반+3D-MPL 내 100, 20 및 5㎎ gD2t를 준 세 백신주사된 군에서 우수한 ELISA 및 중화 역가가 관찰되었다(자료는 제시되지 않음).
6. 3 결론
남아프리카산 긴꼬리원숭이에서 얻어진 결과는 명반과 3D-MPL의 조합물을 함유하는 rgD2t 백신이 유의하게 체액성(중화 항체) 및 효과기 세포 매개된(DTH)특이적 면역 반응을 개선함을 명백하게 나타낸다. 상기 백신에 비교하여, rgD2t 명반 배합물은 중화 항체 유발에 덜 효능있고 생체내에서 DTH 반응을 유발할 수 없다.
또한 붉은털 원숭이에서 얻어진 결과는 rgD2t 명반+3D-MPL 배합물은 심지어 항원의 낮은 투여량에서도(5㎍ 또는 20㎍ rgD2t) 특이적 체액성 반응을 유발하는데 특히 유용하다.
7. 총괄 결론
기니아 피그에서 얻어진 결과는 수산화알루미늄과 조합되거나 수중유 유탁액 내에 운반되는 3D-MPL을 함유하는 보조약 배합물이 심지어 낮은 투여량의 항원(5㎍ rgD2t)에서도 질내 기니아 피그 공격 동물 모델에서 재조합 HSV 당단백질 백신으로써 보호 면역 반응을 유발하는데 매우 효과적임을 명백하게 나타낸다. 또한 보호자료는 상기 rgD2t 3D-MPL 배합물이 보호를 제공하는데 보다 효능있음을 나타낸다. 상기 3D-MPL 배합물은 특이적 체액성(중화 항체) 및 효과기 세포 매개된 (DTH)면역 반응을 개선할 수 있다.
더욱이, 또한 rgD2t 명반 3D-MPL 배합물은 항체 수준에서의 면역원성을 개선하고 영장류에서 효과기 T 세포 반응을 유발함을 보여주었고, 이는 상기 보조약 효과가 작은 동물 종에 제한되지 않음을 시사한다.
비루스 공격 전 후에 rgD2t 배합물로써 면역화된 기니아 피그의 혈청에서의 항-HSV 항체 반응
(1) rgDt투여량 =5㎍. 동물을 0, 28 및 95일에 세 번 면역화했다. 그들을 10 pfu HSV2 로 2주 후에 공격했다.
(2) 혈청은 공격전날(=세번째 면역화 후 14일) 수집했다.
(3) 혈청은 공격 후 2주에 수집했다.
값은 산술평균역가 ±SD로 제시된다.
[표 2]
기니아 피그를 0 및 21일에 5℃ rgD2t 배합물로 면역화했다(근육내로 주사). 그들에게 29일째 식염내 5℃ rgD2t를 피하내로 제공했다. 피부 시험은 24시간 및 48시간에 판독했다.
E = 밀리미터 단위로 ID 주사부위의 홍반
I = 밀리미터 단위로 ID 주사부위의 강화
N = 피부 시험 부위의 회사(necrosis)
[표 3]
(1) rgD2t 투여량 =5㎍. 동물을 0, 28 및 95일에 세 번 면역화했다. 그들을 2주 후에 105puf HSV2로써 공격했다.
(2) 12일의 관찰기간 동안 병변점수≥1를 나타낸 동물수
(3) 병변 점수의 합(1-12일), 산술 평균±SD
(4) 공격 후 5일에 질 면봉으로 수집된 피이크 HSV 역가(pfu/㎖)
[표 4]
(1) rgD2t 투여량 =5㎍. 동물을 0, 28 및 95일에 세 번 면역화했다. 그들을 2주 후에 105puf HSV2로써 공격했다.
(2) 관찰기간 동안(13-60일) 병변점수≥1을 나타낸 동물수.
(3) 한 재발 에피소드가 선행되고 병변이 없는 날이 이어지고 홍반을 갖는 적어도 2일(점수=0.5) 또는 소포(들)이 있는 1일(병변 점수≥1)을 특징으로 한다.
(4) 재발성 포진성 에피소드를 경험한 동물 전체일, 산술 평균±SD(관찰기간 : 13-39일).
[표 5]
(1) 동물을 0, 28 및 84일에 세 번 면역화했다. 그들은 2주 후에 105puf HSV2로써 공격했다.
(2) 혈청 및 질 세척물을 두 번째 면역화 후 14일에 수집했다.
(3) 공격 전날 혈청을 수집했다(=세번째 면역화후 14일)
(4) 값은 산술 평균 역가±SD로써 주어진다.
(5) 표준 항 gD2t ELISA 검정에서 측정된 0.5㎍/㎖ 총 IgG 당 광학 밀도(492nm에서)상응한다. 산술평균±SD
기니아 피그에서 HSV2 감염의 임상적 및 비루스학적 경과에 대한 rgD2t 배합물에 의한 면역화 효과
[표 6]
실험 스케쥴 : 0, 28일 및 84일에 3번 면역화
105pfu HSV2로써 최종 면역화후 2주에 공격
HSV2 초기감염 : (공격후 4 내지 12일의 관찰기간)
피부 병변빈도(5) : 소포(들)이 있는 동물의 수(병변 점수≥1)
피부병변 엄중도 : 병변 점수의 합(4 내지 12일 동안), 산술평균±SD
질 비루스 역가 : 공격후 5일에 수집된 질 면봉에서의 비루스 역가(pfu/㎖)
HSV2 재발 감염 : (공격 후 13 내지 29일의 관찰 기간)
피부 병변 빈도(%) : 소포(들)이 있는 동물의 수(%) (병변 점수≥1)
재발 일수 : 재발 포진성 질병을 경험한 동물 전체 날짜, 산술 평균 ≥SD. 적어도 연속적인 2일 동안 0.5 병변 점수(홍반)가 기록됐다면 또는 어느 날에 병변 점수≥1(소포(들))가 관찰되었다면 동물에게 재발 질병에 대해 양성으로 기록했다.
재발 에피소드 수 : 산출 평균, ±SD
gD2t 명반 또는 gD2t 명반 3D MPL로써 백신주사된 아프리카 녹색 원숭이에서의 DTH 결과
[표 7]
원숭이를 0 및 28일에 20㎍ gD2t 배합물로써 면역화했다(근육내로 제공).
13일 후에 식염내 상이한 gD2t 투여량을 복부에 피부내로 제공했다.
피부 시험은 24 시간 및 48시간에 판독했다.
E = ID 주사부위의 홍반
I = ID 주사부위의 강화
ND = 수행하지 않음
아프리카 녹색 원숭이에서 GD2T 및 3D MPL 배합물의 비교 면역원성 : 혈청학적 반응
[표 8]
* 각 백신 투여량은 20㎍ gD2t를 함유한다.
ELISA 역가 = 주간점 역가
MEUT 역가 = 세포병원성 효과에 대항하여 100% 보호를 제공하는 최고 혈청 희석액의 역수
Claims (10)
- 3 데아실화 모노포스포릴 리피드 A 및 적합한 부형제와 함께 HSV 당단백질 D로 구성되는 백신 배합물.
- 제1항에 있어서, 부형제가 명반인 백신 배합물.
- 제2항에 있어서, 부형제가 수중유 유탁액인 백신 배합물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질 D가 HSV-2 당단백질 D인 백신 화합물
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 당단백질 D가 절단형 단백질인 백신 배합물.
- 제5항에 있어서, 절단형 단백질이 HSVgD2이고 C말단 액커 영역이 없는 백신 화합물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 당단백질 D가 특정 부형제에 접합된 백신 배합물.
- 제1항에 있어서, 3 데아실화 모노포스포릴 리피드 A는 투여량당 10㎍-100㎍ 범위로 존재하는 백신 화합물.
- 제1항에 따른 백신 유효량을 투여하는 것으로 구성되는 단순포진 감염으로 고통을 받거나 그에 민감한 사람을 제외한 동물 피검자를 치료 하는 방법.
- HSV 당단백질 D와 부형제 및 3 데아실화 모노포스포릴 리피드 A를 혼합시키는 것으로 구성되는, 제1항에 따른 백신을 생산하는 방법.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB9105992.3 | 1991-03-21 | ||
GB9105992A GB9105992D0 (en) | 1991-03-21 | 1991-03-21 | Vaccine |
PCT/EP1992/000592 WO1992016231A1 (en) | 1991-03-21 | 1992-03-17 | HERPES SIMPLEX VACCINE COMPRISING HSV GLYCOPROTEIN gD AND 3 dEACYLATED MONOPHOSPHORYL LIPID A |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR100224329B1 true KR100224329B1 (ko) | 1999-10-15 |
Family
ID=10691946
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1019930702835A KR100224329B1 (ko) | 1991-03-21 | 1992-03-17 | 단순포진비루스 당단백질 지디(gD) 및3D-MPL를 함유하는 단순포진백신 |
Country Status (34)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6027730A (ko) |
EP (1) | EP0576478B2 (ko) |
JP (1) | JP3530526B2 (ko) |
KR (1) | KR100224329B1 (ko) |
CN (2) | CN1058191C (ko) |
AP (1) | AP298A (ko) |
AT (1) | ATE129160T1 (ko) |
AU (1) | AU650521B2 (ko) |
BR (1) | BR9205745A (ko) |
CA (1) | CA2106492C (ko) |
CY (1) | CY1936A (ko) |
CZ (1) | CZ280505B6 (ko) |
DE (1) | DE69205566T3 (ko) |
DK (1) | DK0576478T4 (ko) |
ES (1) | ES2081102T5 (ko) |
FI (1) | FI107881B (ko) |
GB (1) | GB9105992D0 (ko) |
GR (1) | GR3017884T3 (ko) |
HK (1) | HK1004525A1 (ko) |
HU (1) | HU218025B (ko) |
IE (1) | IE69560B1 (ko) |
IL (1) | IL101290A (ko) |
MA (1) | MA22471A1 (ko) |
MX (1) | MX9201245A (ko) |
MY (1) | MY110086A (ko) |
NO (1) | NO307499B1 (ko) |
NZ (1) | NZ242057A (ko) |
PL (1) | PL170059B1 (ko) |
PT (1) | PT100262B (ko) |
SA (1) | SA92120459B1 (ko) |
SK (1) | SK279190B6 (ko) |
WO (1) | WO1992016231A1 (ko) |
YU (1) | YU28392A (ko) |
ZA (1) | ZA922011B (ko) |
Families Citing this family (48)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9105992D0 (en) * | 1991-03-21 | 1991-05-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
US6197311B1 (en) | 1991-07-25 | 2001-03-06 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses |
GB9202933D0 (en) * | 1992-02-12 | 1992-03-25 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
US6620414B2 (en) | 1992-03-27 | 2003-09-16 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A |
AU6141094A (en) * | 1993-02-19 | 1994-09-14 | Smithkline Beecham Biologicals (Sa) | Influenza vaccine compositions containing 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a |
DK0689454T4 (da) * | 1993-03-23 | 2005-05-30 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccinepræparater indeholdende 3-O-deacyleret monophosphoryl-lipid A |
DE69426077T3 (de) * | 1993-05-25 | 2004-09-02 | Wyeth Holdings Corp. | Adjuvantien für impfstoffe gegen das respiratorische synzitialvirus |
GB9326253D0 (en) * | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
DK0800578T3 (da) * | 1994-12-28 | 2003-08-11 | Univ Kentucky | Rekombinant monoklonalt anti-idiotype antistof 3H1 |
US6949244B1 (en) | 1995-12-20 | 2005-09-27 | The Board Of Trustees Of The University Of Kentucky | Murine monoclonal anti-idiotype antibody 11D10 and methods of use thereof |
US6235280B1 (en) | 1996-04-12 | 2001-05-22 | Malaya Chatterjee | Methods of delaying development of CEA-associated tumors using anti-idiotype antibody 3H1 |
US20020041872A1 (en) | 1996-04-12 | 2002-04-11 | Malaya Chatterjee | Methods of delaying development of CEA-associated tumors using anti-idiotype antibody 3H1 |
US6468782B1 (en) | 1996-12-05 | 2002-10-22 | Quadrant Healthcare (Uk) Limited | Methods of preserving prokaryotic cells and compositions obtained thereby |
US6274143B1 (en) | 1997-06-13 | 2001-08-14 | Malaya Chatterjee | Methods of delaying development of HMFG-associated tumors using anti-idiotype antibody 11D10 |
US6355244B1 (en) | 1997-11-17 | 2002-03-12 | University Of Kentucky Research Foundation | Methods and compositions for the treatment of psoriasis |
GB9819898D0 (en) * | 1998-09-11 | 1998-11-04 | Smithkline Beecham Plc | New vaccine and method of use |
US6692752B1 (en) | 1999-09-08 | 2004-02-17 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Methods of treating human females susceptible to HSV infection |
DE122007000087I1 (de) | 1998-10-16 | 2008-03-27 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Adjuvanzsysteme und impfstoffe |
US7026155B2 (en) | 1999-02-02 | 2006-04-11 | Regents Of The University Of California | Method of reducing bacterial proliferation |
EP1104767A1 (en) | 1999-11-30 | 2001-06-06 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Mono- and disaccharide derivatives containing both fatty acid ester and sulfate ester groups |
US9273326B2 (en) | 2004-04-30 | 2016-03-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Tetracycline-regulated gene expression in HSV-1 vectors |
CA2580103C (en) | 2004-09-22 | 2021-11-16 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
KR101916787B1 (ko) | 2005-03-23 | 2019-01-24 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | Cd4 t-세포 및/또는 개선된 b-메모리 세포 반응을 유도하는 인플루엔자 바이러스 및 수중유 에멀젼 애주번트의 용도 |
GB0607088D0 (en) | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
US20090010959A1 (en) | 2005-12-22 | 2009-01-08 | Ralph Leon Biemans | Pneumococcal Polysaccharide Conjugate Vaccine |
CN103169960A (zh) | 2006-03-30 | 2013-06-26 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 免疫原性组合物 |
EP2043682B1 (en) | 2006-07-17 | 2014-04-02 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Influenza vaccine |
US20090181078A1 (en) | 2006-09-26 | 2009-07-16 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
ES2387327T3 (es) | 2006-09-26 | 2012-09-20 | Infectious Disease Research Institute | Composición de vacuna que contiene un adyuvante sintético |
US9452209B2 (en) | 2007-04-20 | 2016-09-27 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Influenza vaccine |
BRPI0813307C1 (pt) | 2007-06-26 | 2021-05-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | composição imunogênica, vacina, e, processo para fabricar a vacina |
CN102458463B (zh) * | 2009-05-22 | 2017-01-18 | 健诺西生物科学公司 | 针对ⅱ型单纯疱疹病毒的疫苗:诱发免疫应答的组合物和方法 |
AU2010256461B2 (en) | 2009-06-05 | 2016-03-17 | Access To Advanced Health Institute | Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants |
GB0913680D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
GB0913681D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
CN102666843B (zh) | 2009-12-21 | 2014-10-22 | 布里格海姆妇女医院公司 | 单纯疱疹病毒疫苗 |
US9782474B2 (en) | 2010-11-24 | 2017-10-10 | Genocea Biosciences, Inc. | Vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response |
CN108126204A (zh) * | 2011-03-11 | 2018-06-08 | 特斯通有限责任合伙公司 | 包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的疫苗接种方法 |
CN103596586A (zh) | 2011-04-08 | 2014-02-19 | 免疫设计公司 | 免疫原性组合物及使用所述组合物诱导体液和细胞免疫反应的方法 |
WO2013028738A1 (en) | 2011-08-22 | 2013-02-28 | Nanobio Corporation | Herpes simplex virus nanoemulsion vaccine |
EP2782597B1 (en) | 2011-11-23 | 2022-04-13 | Genocea Biosciences, Inc. | Nucleic acid vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response |
DK2850431T3 (en) | 2012-05-16 | 2018-07-16 | Immune Design Corp | Vaccines against HSV-2 |
JP6469585B2 (ja) | 2013-01-07 | 2019-02-13 | バイオメディカル リサーチ モデルズ, インコーポレイテッド | 単純ヘルペスウイルス2型感染を処置するための治療用ワクチン |
EP3711768A1 (en) | 2013-04-18 | 2020-09-23 | Immune Design Corp. | Gla monotherapy for use in cancer treatment |
US9463198B2 (en) | 2013-06-04 | 2016-10-11 | Infectious Disease Research Institute | Compositions and methods for reducing or preventing metastasis |
EP3519427A4 (en) | 2016-09-28 | 2020-03-11 | Genocea Biosciences Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF HERPES |
WO2019152821A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Recombinant herpes simplex virus-2 expressing glycoprotein b and d antigens |
CA3208643A1 (en) | 2021-01-18 | 2022-07-21 | Conserv Bioscience Limited | Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof |
Family Cites Families (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4372945A (en) * | 1979-11-13 | 1983-02-08 | Likhite Vilas V | Antigen compounds |
IL61904A (en) * | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
US5110587A (en) * | 1981-12-24 | 1992-05-05 | Health Research, Incorporated | Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus |
US5149660A (en) * | 1982-02-18 | 1992-09-22 | University Patents, Inc. | Diagnostic reagents relating to herpes simplex virus |
US4762708A (en) * | 1982-02-18 | 1988-08-09 | University Patents, Inc. | Materials and methods for herpes simplex virus vaccination |
NZ209308A (en) * | 1983-08-30 | 1991-08-27 | Genentech Inc | Vaccine against hsv involving a truncated membrane-free derivative of a membrane-bound protein |
US5244792A (en) * | 1984-04-06 | 1993-09-14 | Chiron Corporation | Expression of recombinant glyoprotein B from herpes simplex virus |
US5171568A (en) * | 1984-04-06 | 1992-12-15 | Chiron Corporation | Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine |
US4877611A (en) * | 1986-04-15 | 1989-10-31 | Ribi Immunochem Research Inc. | Vaccine containing tumor antigens and adjuvants |
US5554372A (en) * | 1986-09-22 | 1996-09-10 | Emory University | Methods and vaccines comprising surface-active copolymers |
CA1337395C (en) * | 1986-10-20 | 1995-10-24 | Rae Lyn Burke | Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine |
US5149529A (en) * | 1988-04-08 | 1992-09-22 | Board Of Trustees Of Leland Chiron Corporation | Compositions and treatment for herpes simplex |
US4912094B1 (en) * | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
NZ230424A (en) * | 1988-08-25 | 1992-05-26 | Liposome Co Inc | Liposomal composition comprising an externally disposed antigen |
WO1990004412A1 (en) * | 1988-10-27 | 1990-05-03 | Regents Of The University Of Minnesota | Liposome immunoadjuvants containing il-2 |
US5597573A (en) * | 1989-05-04 | 1997-01-28 | Igen, Inc. | Lipid-A analogs: new monosaccharide and disaccharide intermediates for eliciting therapeutic antibodies and for antitumor and antiviral activities |
US5158939A (en) * | 1989-07-21 | 1992-10-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of stimulating the immune systems of animals and compositions useful therefor |
AU651949B2 (en) * | 1989-07-14 | 1994-08-11 | American Cyanamid Company | Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines |
ES2144400T3 (es) * | 1990-08-01 | 2000-06-16 | Res Corp Technologies Inc | Gen que codifica la gliproteina d del virus del herpes equino de tipo 1, su producto genico, anticuerpos y su utilizacion. |
JP3005292B2 (ja) * | 1990-08-02 | 2000-01-31 | カイロン コーポレイション | 単純ヘルペスウィルスのvp16のワクチン |
GB9106048D0 (en) * | 1991-03-21 | 1991-05-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
US5196452A (en) * | 1991-01-29 | 1993-03-23 | Genelabs Incorporated | Macrocyclic anti-viral compound and method |
US5166173A (en) * | 1991-01-29 | 1992-11-24 | Genelabs Incorporated | Method of treating herpes simplex virus infection |
GB9105992D0 (en) * | 1991-03-21 | 1991-05-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
MA22842A1 (fr) * | 1992-03-27 | 1993-10-01 | Smithkline Beecham Biolog | Procede de preparation de compositions de vaccin. |
EP0761231B1 (en) * | 1992-06-25 | 2000-01-12 | SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. | Vaccine composition containing adjuvants |
AU6141094A (en) * | 1993-02-19 | 1994-09-14 | Smithkline Beecham Biologicals (Sa) | Influenza vaccine compositions containing 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a |
DK0689454T4 (da) * | 1993-03-23 | 2005-05-30 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccinepræparater indeholdende 3-O-deacyleret monophosphoryl-lipid A |
DE69426077T3 (de) * | 1993-05-25 | 2004-09-02 | Wyeth Holdings Corp. | Adjuvantien für impfstoffe gegen das respiratorische synzitialvirus |
-
1991
- 1991-03-21 GB GB9105992A patent/GB9105992D0/en active Pending
-
1992
- 1992-03-17 ES ES92906441T patent/ES2081102T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-17 BR BR9205745A patent/BR9205745A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-03-17 KR KR1019930702835A patent/KR100224329B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-03-17 SK SK946-93A patent/SK279190B6/sk unknown
- 1992-03-17 EP EP19920906441 patent/EP0576478B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-17 WO PCT/EP1992/000592 patent/WO1992016231A1/en active IP Right Grant
- 1992-03-17 JP JP50598492A patent/JP3530526B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-17 CY CY193692A patent/CY1936A/xx unknown
- 1992-03-17 DK DK92906441T patent/DK0576478T4/da active
- 1992-03-17 AT AT92906441T patent/ATE129160T1/de active
- 1992-03-17 HU HU9302645A patent/HU218025B/hu unknown
- 1992-03-17 PL PL92300617A patent/PL170059B1/pl unknown
- 1992-03-17 AU AU13657/92A patent/AU650521B2/en not_active Expired
- 1992-03-17 CZ CS931958A patent/CZ280505B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-03-17 DE DE1992605566 patent/DE69205566T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-17 CA CA 2106492 patent/CA2106492C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-18 MY MYPI92000448A patent/MY110086A/en unknown
- 1992-03-19 IE IE920881A patent/IE69560B1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-19 ZA ZA922011A patent/ZA922011B/xx unknown
- 1992-03-19 CN CN92102950A patent/CN1058191C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-19 NZ NZ242057A patent/NZ242057A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-19 PT PT100262A patent/PT100262B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-03-19 MA MA22760A patent/MA22471A1/fr unknown
- 1992-03-19 IL IL10129092A patent/IL101290A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-20 YU YU28392A patent/YU28392A/sh unknown
- 1992-03-20 AP APAP/P/1992/000368A patent/AP298A/en active
- 1992-03-20 MX MX9201245A patent/MX9201245A/es unknown
- 1992-04-21 SA SA92120459A patent/SA92120459B1/ar unknown
-
1993
- 1993-09-20 NO NO933343A patent/NO307499B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-09-21 FI FI934134A patent/FI107881B/fi not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-09 US US08/303,542 patent/US6027730A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-25 GR GR950402992T patent/GR3017884T3/el unknown
-
1998
- 1998-01-05 CN CN98103933A patent/CN1101226C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-28 HK HK98103623A patent/HK1004525A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100224329B1 (ko) | 단순포진비루스 당단백질 지디(gD) 및3D-MPL를 함유하는 단순포진백신 | |
US10653771B2 (en) | Vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response | |
JP4510283B2 (ja) | 併合ワクチン組成物 | |
JP3901731B2 (ja) | サポニンおよびステロールを含有するワクチン | |
ES2109685T5 (es) | Composiciones para vacunas que contienen monofosforil-lipido a 3-o-desacilado. | |
KR100557665B1 (ko) | 혼합 백신 조성물 | |
KR20010075049A (ko) | 성인성질환에 대한 백신 | |
MXPA00008817A (en) | Combined vaccine compositions |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20110629 Year of fee payment: 13 |
|
EXPY | Expiration of term |