FI107881B - Menetelmä Herpes simplex-rokotteen valmistamiseksi, joka sisältää HSV-glykoproteiinia GD ja 3-deasyloitua monofosforyylilipidi A:ta - Google Patents

Description

107881

Menetelmä Herpes simplex -rokotteen valmistamiseksi, joka sisältää HSV-glykoproteiinia 6D ja 3-deasyloitua monofos-foryylilipidi Asta 5 Tämä keksintö koskee menetelmää uusien rokoteformulaati-oiden valmistamiseksi. Erityisesti tällä keksinnöllä saadaan aikaan uusia formulaatioita Herpes simplex -virusinfektioiden, erityisemmin Herpes simplex virus 2(HSV-2) -infektioiden hoitamiseksi.

10 HSV-2 on sukuelinten herpeksen pääasiallinen aiheuttava aine ja yhdessä HSV-l:n kanssa (huuliherpeksen aiheuttava aine) niille on tunnusomaista niiden kyky aiheuttaa sekä akuutteja sairauksia että perustaa latentin infektion, pääasiassa hermosoluissa.

15 Sukuelinten herpestä arvioidaan olevan pelkästään USArssa noin 5 miljoonalla henkilöllä, jolloin vuosittain rekisteröidään 500 000 kliinistä tapausta (primääri- ja toistuvaa infektiota). Primäärinen infektio tapahtuu tyypil-.:. lisesti puberteetin jälkeen, ja sille on tunnusomaista 20 kivuliaiden ihovaurioiden paikallinen esiintyminen, jotka • · pysyvät ajan välillä 2-3 viikkoa. Seuraavien 6 kuukau- • · . den aikana primäärisen infektion jälkeen 50 %:lla poti- • · · laista esiintyy sairauden uudelleen esiintymistä. Noin • · · • ·* 25 % potilaista voi kokea vuosittain välillä 10 - 15 tau- V : 25 din uudelleen puhkeamista. Immuniteetiltaan heikoilla po tilailla suurella taajuudella uusiutumisen esiintymistä- *:**: heys on tilastollisesti korkeampi kuin normaalissa poti- ·“*: laspopulaatiossa.

• · · * ·.:.* Sekä HSV-l- että HSV-2-viruksen pinnalla sijaitsee joukko • · · 30 glykoproteiinikomponentteja. Nämä tunnetaan nimillä gA, gB, gC, gD ja gE ja niin edelleen.

• · · · ··· ·...· Glykoproteiini D sijaitsee virusmembraanilla, ja se esiintyy myös infektoitujen solujen solulimassa (Eisen-berg R.J. et ai: J of Virol 35 (1980) 428-435) . Se käsit- 2 107881 tää 393 aminohappoa, mukaan lukien signaalipeptidin,- ja sen molekyylimassa on noin 60 kD. Kaikista HSV-kuorigly-koproteiineista tämä on luultavasti parhaiten karakterisoitu (Cohen et ai J. Virology jjO. 157-166) . In vivo sillä 5 tiedetään olevan keskeinen merkitys viruksen tarttumisessa solumembraaneihin. Lisäksi glykoproteiini D:n on osoitettu kykenevän synnyttämään neutraloivia vasta-aineita in vivo (Eing et ai J. Med Virology 127 59-65). Piilevä HSV-2-virus voi kuitenkin aktivoitua uudelleen ja indu-10 soida sairauden uudelleen puhkeamisen huolimatta neutraloivien vasta-aineiden korkeasta tiitteristä potilaiden seerumeissa.

Yksistään kyky indusoida neutraloivaa vasta-ainetta ei ole riittävä sairauden kontrolliin. Sairauden uusiutumi-15 sen estämiseksi minkä hyvänsä rokotteen on stimuloidava ei ainoastaan neutraloivaa vasta-ainetta, vaan myös T-solujen välittämää soluimmuunisuutta. Tämä keksintö saavuttaa nämä tavoitteet.

Tämän keksinnön menetelmä antaa käyttöön rokotteen, joka . 20 käsittää HSV-glykoproteiini D:tä tai sen immunologista ··« ···; fragmenttia yhdessä 3-o-deasyloidun monofosforyylilipidi • · - ·* A:n (3D-MPL) ollen monofosforyylilipidi A:n deasyloitu **’ * johdannainen, ja sopivan väliaineen kanssa. Tyypillisesti glykoproteiini D on HSV-2:sta. Väliaine voi olla öljyve- • · · | 25 dessä -emulsiota tai alunaa, 3D-MPL:ää on läsnä alueella :T: 10 - 100 pg, edullisesti 25 - 50 pg/annos, jolloin anti geeniä on tyypillisesti läsnä alueella 2-50 pg/annos.

····· ... Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa • · ·;·’ patenttivaatimuksissa.

• · · • · · .1”. 30 3D-MPL voidaan saada menetelmillä, jotka kuvataan GB-pa- *!* tenttijulkaisussa 2220211 (RIBI) .

»·· • · · · .···. Keksinnön eräs suoritusmuoto on katkaistu HSV-2-glykopro teiini D, jossa on 308 aminohappoa ja joka käsittää aminohapot 1 - 306 luonnollisesti esiintyvästä glykoproteii- 3 107881 nista, joissa on lisäksi asparagiini ja glutamiini C-ter-minaalisessa päässä katkaistussa proteiinissa, josta puuttuu membraaniinankkuroitumisalue. Tämä proteiinimuoto sisältää signaalipeptidin, joka katkaistaan tuottamaan 5 kypsä proteiini, jossa on 238 aminohappoa. Tällaisen proteiinin tuottaminen kiinalaisen hamsterin munasarjaso-luissa on kuvattu yhtiön Genentech EP-patenttijulkaisussa B-139 417.

Kypsää katkaistua peptidiä käytetään edullisesti rokote-10 formulaatioissa, ja sitä kutsutaan nimellä rgÖ2t.

HSV-antigeeni voi olla kemiallisesti tai muuten erityiseen kantajaan konjugoitua. Eräs erityisen edullinen lähestymistapa on konjugoida kemiallisesti erillisten partikkelien muodossa olevaa hepatiitti B -pinta-antigeeniä 15 hepatiitti B -pinta-antigeenin pinnalla sijaitsevien vapaiden sulfhydryyliryhmien kautta. Katso yhdessä haettua GB-patenttihakemusta 9027623.9.

Tässä esitetyt formulaatiot ovat hyvin tehokkaita suojäävän immuniteetin indusoinnissa, myös hyvin alhaisilla an-20 tigeeniannoksilla (esimerkiksi niin alhaisilla kuin 5 pg I V rgÖ21) .

* · · · · • ·

Ne aikaansaavat erinomaisen suojauksen primääristä infek- ΙΓ1 tiota vastaan ja stimuloivat, edullisesti sekä spesifistä • · · • · humoraalista (neutraloivat vasta-aineet) että myös efek- • · · 25 torisoluvälitteistä (DTH) immuunivastetta.

Ei-toksiset öljyvedessä -emulsiot sisältävät edullisesti .···. ei-toksista öljyä, esimerkiksi skualaania tai skualeenia, . ·# emulgoimisainetta, esimerkiksi Tween 80:tä, vesipohjai- • · · *···* sessa väliaineessa. Vesipohjainen väliaine voi olla 30 esimerkiksi fosfaattipuskuroitua suolaliuosta.

«·· *”* Edelleen eräässä näkökannassa tämä keksintö antaa käyt- • · *···* töön tässä kuvatun rokoteformulaation käytettäväksi lää ketieteellisessä terapiassa, erityisesti käyttöön Herpes 4 107881 simplex -virusinfektioiden hoidossa ja ennaltaehkäisyssä käytettäväksi.

Keksinnön mukaisesti saatu rokote sisältää immunosuojäävän määrän HSV-gD:tä tai sen immunologista fragmenttia, 5 ja tämä voidaan valmistaa tavanomaisilla tekniikoilla.

Rokotevalmiste kuvataan yleisesti teoksessa New Trends and Developments in Vaccines, toimittanut Voller et ai., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Kapselointi liposomien sisälle kuvataan esimerkiksi US-10 patenttijulkaisussa 4 235 877, Fullerton. Proteiinien konjugointi makromolekyyleihin kuvataan esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa 4 372 945, Likhite; ja 4 474 757, Armor et ai.

Proteiinin määrä kussakin rokoteannoksessa valitaan mää-15 räksi, joka indusoi immunosuojaavan vasteen ilman merkittäviä, rokotteilla tyypillisiä haitallisia sivuvaikutuksia. Tällainen määrä vaihtelee riippuen siitä, mitä erityistä immunogeeniä käytetään. Yleensä odotetaan, että kukin annos käsittää 1-1 000 pg proteiinia, edullisesti 20 2 - 100 pg, edullisimmin 4-40 pg. Optimaalinen määrä • erityistä rokotetta varten voidaan ottaa selville vakio- ·:·*: tutkimuksilla, joihin liittyy vasta-ainetiitterien ja ··· muiden vasteiden huomiointi kohteissa. AI kuroko tuksen ···· jälkeen kohteet voivat saada teho s tus annoksen noin 4 vii- • * 25 kon sisällä.

• · · * HSV-infektioille alttiiden henkilöiden rokotuksen lisäksi '·"· keksinnön mukaisia farmaseuttisia koostumuksia voidaan ·«· käyttää hoidettaessa, immunoterapeuttisesti, potilaita, . )·. jotka kärsivät HSV-infektioista.

* · * • · · • · · ·...· 30 Keksinnön eräässä näkökannassa aikaansaadaan tässä kuvat- tu valmistusmenetelmä, jossa menetelmässä HSV-2-glyko- ···· .···. proteiini D:tä tai sen immunologista fragmenttia sekoi- • · ··* 5 107881 tetaan väliaineen, esimerkiksi öljy-vedessä-emulsion tai alunan ja 3D-MPL:n kanssa.

Yhdistelmä-DNA-Herpes simplex-virus-glykoproteiini D-alayk-5 sikkörokotteen adjuvanttitehokkuuden vertailu Tässä tutkimuksessa arvioitiin useiden adjuvanttien kykyä parantaa Herpes simplex-virus (HSV) tyyppi 2 (rgD2t) s n yh-distelmä-DNA-glykoproteiini D:n suojaimmuunisuutta marsumal-lissa. Testatut adjuvantit olivat alumiinihydroksidi, alu-10 miinihydroksidi yhdistelmänä 3-deasyyli-monofosforyylilipidi A: n kanssa, ja 3-deasyyli-monofosf oryylilipidi A öljy-vedes-sä-emulsiona toimitettuna.

1. Antigeenin kuvaus 15 HSV rgD2t on katkaistua yhdistelmä-DNA-glykoproteiinia, joka on tuotettu kiinan hamsterin munasarja(CHO)-soluissa (EP-patenttijulkaisu 0139417).

2. Antigeeni/adjuvantti-valmisteet ja immunisointikaaviot 20 Suoritettiin kaksi erillistä koetta useiden rgD2t-formulaa- tioiden suojaavan immuunisuuden arvioimiseksi marsumallissa. Ensimmäisessä kokeessa marsuryhmiä immunisoitiin kolmesti * alhaisella antigeeniannoksella (5 pg rgD2t) 4 adjuvanttifor- Γ·*: mulaatiossa, jotka oli valmistettu alla kuvatulla tavalla.

·:··♦ 25 Kaksi viikkoa viimeisen immunisoinnin jälkeen ne altistet- tiin emättimensisäisesti HSV-tyyppi 2: lie, ja tarkkailtiin •V. päivittäin primäärisen ja uusiutuvan HSV-2-sairauden kehit- * · \.‘4 tyrnistä. Toisessa kokeessa näitä formulaatioita arvioitiin • · ♦ • edelleen suuremmilla eläinryhmillä. Testattiin myös tekijöi- 30 tä, jotka vaikuttavat näiden formulaatioiden tehokkuuteen, kuten antigeeniannos ja adjuvanttikoostumus.

·· · • V 2.1. Antigeeni/adjuvantti-valmisteet ··· • '· Ensimmäisessä kokeessa marsuja immunisoitiin seuraavilla .···* 35 adjuvanttivalmisteilla. Kukin annos (5 pg) annettiin tila- I · « 'I.. vuudessa 0,25 ml.

• t ·« · • · • · • · « · · • i» • · 6 107881 2.1.1. rgD2t/aluna (alumiinihydroksidi)

Aluna saatiin yhtiöstä Superfos (Alhydrogel, (Boehimte)

Superfos, Tanska). 5 μg puhdistettua rgD2t:tä adsorboitiin yön yli 4 °C:ssa alumiinihydroksidille (aluna), vastaten 5 0,25 mg-ekvivalenttia Al3+ 0,25 ml:ssa 150 mM NaCl, 10 mM

fosfaattipuskurissa, pH 6,8.

2.1.2. rgD2t/alumiinihydroksidi + 3D-MPL

3D-MPL saatiin yhtiöstä Ribi Immunochem Research, Inc. Kun 10 oli adsorboitu yön yli 5 μg gD2t:tä alunalle kohdassa 2.1.1. kuvatulla tavalla, adjuvanttivalmiste sentrifugoitiin ja sen supernatantti poistettiin. Sitten alunaan sidottuun rgD2t:hen lisättiin yhtä suuri tilavuus adsorptiopuskuria, joka sisälsi 100 μg 3D-MPL:ää.

15

Molemmilla rgD2t/aluna-valmisteillä yli 98 %:n rgD2t:stä keksittiin olevan liittyneenä alumiinihydroksidiadjuvant-tiin.

20 2.1.3. rgD2t/3D-MPL öljy-vedessä-emulsiossa (R) Ö1jy-vedessä-emulsio valmistettiin käyttämällä 12-% pai-no/tilavuus lesitiiniä lisättynä skualeeniöljyyn ja 0,08 %:iin Tween 80:tä. 3D-MPL:ää lisättiin 100-kertaisesti suu- ·· · jrempi konsentraatio kuin lopullinen haluttu konsentraatio.

····· 25 Sitten 1 % tätä valmistetta sekoitettiin tilavuudessa 0,25 ··· ml 5 μg:aan rgD2t:tä vesifaasissa, jolloin tulokseksi saa- • · * « tiin 1—% öljy-vedessä-emulsiota, joka sisälsi 100 μ9 3D- • · .·{·, MPLsää.

• · « 30 Toisessa kokeessa käytettiin samanlaisia adjuvanttiformulaa- tioita, jotka oli valmistettu edellä kuvatulla tavalla mutta sisälsivät eri määriä rgD2t:tä ja/tai immunostimulaattoria.

• · · : .* Ne annettiin kokonaistilavuudessa 0,5 ml. Nämä formulaatiot »*· * kuvataan alla.

.·*:·* 35 4 · « ,···. rgD2t/aluna: 5 tai 20 μg rgD2t? 0,5 mg-ekvivalenttia Al3+/0,5 > * *1*. ml annosta.

• * • ♦ • · · • · *· • · 7 107881 rgD2t/aluna plus 3D-MPL: 5 tai 20 pg rgD2t; 0,5 mg-ekviva-lenttia Al3+; 50 μg 3D-MPL/0,5 ml annosta.

rgD2t/3D-MPL öljy/vedess'-emulsiossa (R): 5 tai 20 pg 5 rgD2t:tä formuloitiin edellä (2.1.3.) kuvattuun 1-% o/w- emulsioon. 0,5-ml annos sisälsi 5 tai 20 pg rgD2t, 50 pg 3D-MPL:ää 1-% o/w-emulsiossa.

rgD2t/3D-MPL o/w-emulsiossa (S): Väliaine valmistettiin 10 seuraavasti: Fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), joka sisältää 0,4 % (tilavuus/tilavuus) Tween 80:tä, lisätään 5 % (tilavuus/tilavuus) Pluronic L121:tä ja 10 % skua-laania, ja tulokseksi saatu seos mikrofluidisoidaan 10 kertaa mikrofluidisoijan (malli M/110 Microfluidics Corp.) läpi 15 niin, että tulokseksi saatu emulsio käsittää vain alle 1 μπι:η kokoisia hiukkasia. Sitten emulsioon lisättiin 50 pg 3D-MPL$ää. Yksi tilavuus tätä emulsiota, joka sisälsi 3D-MPLrää, sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa kahdesti konsentroitua antigeeniä ja sekoitettiin lyhyesti komponent-20 tien täydellisen sekoituksen varmistamiseksi. Lopullisessa valmisteessa oli 0,2 % Tween 80:tä, 2,5 Pluronic Ll21:tä, 5 % skualaania, 50 pg 3D-MPL ja 5 tai 20 pg rgD2t:tä 0,5-ml e *’ annoksessa.

• · · * • a a » · * • * • » »···· 25 2.2. Immunisointikaavio

Naaraspuolisten Hartley-marsujen ryhmiä (200 - 250 g) im-··,·. munisoitiin kolmesti päivinä 0, 28 ja 95 5 ^g:lla rgD2t:tä c i formuloituna 4 erilaiseen adjuvanttiformulaatioon.

• ♦ » 30 Immunisoinnit tehtiin ihonalaisesti 0,25-ml injektiotilavuu-della. KOntrollieläimet injisoitiin saunan ohjeen mukaan pelkästään adjuvantilla, tai ne olivat käsittelemättömiä.

• » · a « · • · • ·

Eri ryhmät immunisoitiin seuraavasti: • · ··# • * • · * « • *· » • · 9 m · • # • 9 4 • ·· a · 8 107881

Ryhmä 1 (n = 4) s 5 μg rgD2t/3D-MPL (100 μg) o/w-emulsiossa (R)

Ryhmä 2 (n = 4): 5 μg rgD2t/aluna + 3D-MPL (100 μg)

Ryhmä 3 (n = 4): 5 μg rgD2t 5 Ryhmä 4 (n = 5): pelkästään aluna

Ryhmä 5 (n « 5): pelkästään 3D-MPL (100 μg)

Ryhmä 6 (n = 8): käsittelemätön

Eläimistä otettiin verta joka toinen päivä vasta-ainemääri-10 tyksiin ELISA:11a ja neutralointimäärityksiin, kuten alla kuvataan.

Testattiin myös eri formulaatioiden kyky indusoida T-soluvä-litteistä immuunisuutta, mitattuna viivästyneen tyyppisten 15 liikaherkkyysvasteiden aiheuttamisella. Alla kuvataan eri rgD2t-formulaatioilla indusoitujen humoraalisten - ja solun immuunivasteiden arviointiin käytetyt testit.

Kaikki marsut altistettiin 2 viikkoa viimeisen immunisoinnin 20 jälkeen emättimensisäisesti 105 täplän muodostavalla yksiköllä (pfu) HSV2:ta, kantaa MS rgD2t-formulaatioilla indusoidun suojaavan immuniteetin vertaamiseksi. Niistä tutkittiin päivittäin akuutin infektion kliiniset merkit, samoin kuin todisteet uusiutuvista herpes sairauksista. 5. päivänä ·*·*: 25 virusaltistuksen jälkeen kerättiin emättimestä vanutuppo- näyte ja titrattiin infektoiva virus.

• # · j’."t Alla esitetään yksityiskohtainen kuvaus marsun emättimen- • · sisäisestä mallista.

:·' * 30

Toisessa kokeessa arvioitiin seuraavien rgD2t-formulaatioi-den immunogeenisyys suuremmilla eläinryhmillä. Verrattiin kahta antigeeniannosta (5 ja 20 μg) ja testattiin eri adju-: vanttikoostumuksia. Käytettiin annosta 50 μg 3-DMPL:ää, ja 35 sen vaikutusta verrattiin aikaisemmin käytettyyn 100-pg annokseen.

• « « • · · » » · • · • « · • · « · • · • « « « ·« » · 9 107881

Naaraspuolisten Hartley-marsujen ryhmiä immunisoitiin kolmesti päivinä 1, 28 ja 84 seuraavasti:

Ryhmä I (n = 8) s 20 pg rgD2t/3DMPL (50 pg) o/w-emulsio (R) 5 Ryhmä II (n = 8) : 5 pg rgD2t/3DMPL (50 pg) o/w-emulsio (R)

Ryhmä III (n * 10): 20 pg rgDat/3DMPL (50 pg) o/w-emulsio(S) Ryhmä IV (n » 10): 5 μg rgD2t/3DMPL (50 pg) o/w-emulsio (S) Ryhmä V (n = 10): 20 pg rgD2t/aluna + 3DMPL (50 pg)

Ryhmä VI (n = 10): 5 pg rgD2t/aluna + 3DMPL (50 pg) 10 Ryhmä VII (n = 4) : aluna + 3DMPL (50 pg) pelkästään

Ryhmä VIII (n = 4) : 3DMPL (50 pg) o/w-emulsio (R) pelkästään

Ryhmä IX (n = 8) : käsittelemätön 15 Immunisoinnit annettiin 0,5-ml annoksessa. Kontrolliryhmät immunisoitiin saunalla ohjeella pelkästään adjuvantilla (ryhmät VII ja VIII) tai oli käsittelemätön (ryhmä IX).

Viimeinen ryhmä (ryhmä X) immunisoitiin gD2t/aluna + 3D-MPL-20 formulaatiolla, joka sisälsi 100 pg 3D-MPL:ää 0,25-ml annoksessa ohjeen mukaan, joka kuvataan ensimmäisessä ennaltaes-tokokeessa:

Ryhmä X (n = 10): 5 pg rgD2t/aluna + 3DMPL (100 mg).

\\: 25

Eläimistä otettiin verta joka toinen viikko yksittäisiä vasta-ainemäärityksiä varten ELISA: 11a ja neutralointimääri-tyksiä varten, kuten alla kuvataan. Emätinpesut kerättiin • · toisen immunisoinnin jälkeen ja määritettiin gD2t:lle spesi- • · · 30 fisten systeemisten vasta-aineiden (IgG-luokan gD2t-vasta-aineiden) läsnäolo. Marsut altistettiin emättimensisäisesti 105 pfu:lla HSV2:ta (kanta MS) 2 viikkoa viimeisen immunisoinnin jälkeen. Altistuksen jälkeen niistä tarkastettiin : '/· päivittäin akuutin infektion kliiniset merkit (päivät 4-12 35 altistuksen jälkeen), samoin kuin todisteet uusiutuvasta .1.* herpes sairaudesta (päivät 13 - 39 altistuksen jälkeen).

• · · • · · • · • · • · · • · « · • · « · ♦ • · 10 107881 3. Testit Järjestettiin useita testejä arvioimaan spesifisiä vasta-aine- ja soluvälitteisiä vasteita, jotka indusoitiin rgD2t-formulaatioilla rokottamalla. Häiden formulaatioiden suojaa-5 va arvo määritettiin marsujen emättimensisäisellä mallilla.

3.1. ELISA

ELISA suunniteltiin osoittamaan ja kvantisoimaan gD-spesifi-set vasta-aineet marsun seerumeissa ja emätinpesuissa käyt-10 täen rgD2t:tä paällysantigeeninä.

3.1.1. rgD2t:lle spesifisten vasta-aineiden osoittaminen seerumeissa

Antigeeni- ja vasta-aineliuoksia käytettiin tasolla 50 μΐ/-15 kaivo. Antigeeni laimennettiin lopulliseen konsentraatioon 1 pg/ml PBS:ään ja adsorboitiin yön yli 4 °C:ssa 96-kaivoisen mikrotiitterilevyn (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Tanska). Sitten kaivot pestiin viidestä PBS Tween 0,1-%:11a (pesupus-kuri) ja inkuboitiin 1 tunti 37 °C:ssa PBS:n kanssa, joka 20 sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia, 4 % vastasyntyneen vasikan seerumia ja 0,1 % Tweenia (kyllästyspuskuri). Seerumien kolminkertaisia laimennoksia (lähtien laimennoksesta 1/100) kyllästyspyskurissa lisättiin rgD2t:llä päällystet-•Ϊ* tyihin kaivoihin ja inkuboitiin 2 tunnin ajan huoneenlämpö- ·*·*: 25 tilassa. Levyt pestiin kuten edellä, ja kuhunkin kaivoon • · ...•j lisättiin biotiinikonjugoitua lampaan anti-marsu-IgG:tä (IgGl- ja IgG2-spesifistä, Serotec, Sopar Biochem., Belgia) laimennettuna 1/3000 kullästyspuskuriin, ja inkuboitiin 1 • · tunti 30 min 37 °C:ssa. Pesuvaiheen jälkeen lisättiin strep- • 30 tavidiini/biotinyloitu peroksidaasi-kompleksia (Amersham, UK) laimennettuna 1/1000 kyllästyspusuriin, ja inkuboitiin 30 min ajan 37 °C:ssa. Levyt pestiin kuten edellä, ja inkuboitiin liuoksen kanssa, jossa oli 0,04 % o-fenyleenidiamii- o · · • nia (Sigma), 0,03 % H202 0,1 M sitraattipuskurissa, pH 4,5.

* · · _ : : : 35

.1.* Värireaktio pysäytettiin 15 min kuluttua lisäämällä 2M

• · · H2S04, ja absorbanssi luetttiin 492 nm:llä.

• · * · • · · • · • · • · • · · • ·· • · 11 107881 ELISA-tiitteri määritettiin käänteisarvona seerumilaimennok-sesta, joka tuotti absorbanssin (optinen tiheys, joka mitattuna 492 nm:llä on 50 % maksimaalisesta absorbanssiarvosta (keskipisteen tiitteri).

5 ELISA-tiitterit laskettiin 4 parametrin lineaarisella regressioanalyysillä tietokoneohjelmaa käyttäen.

3.1.2. rgD2t:lle spesifisten IgG-vasta-aineiden osoitus 10 emätinhuuhteluista

Emätinhuuhtelut kalibroitiin niiden kokonais-IgG-pitoisuuden suhteen ELISA'11a seuraavasti. Maxisorp Immunio-levyjä päällystettiin yön yli 4 °C:ssa määrällä 1 pg/ml (50 pl/kaivo) puhdistettua vuohen anti-marsu-IgGitä (Sigma, Belgia) lai-15 mennettuna PBS:ään. Levyt pestiin ja niitä inkuboitiin kyl-lästyspuskurin kanssa kuten edellä. Emätinpesuista tehtiin sarjalaimennokset kaksinkertaisin laimennoksin (lähtien laimennoksesta 1/100) kyllästyspuskuriin ja lisättiin levyille. Kullekin levylle lisättiin (kaksinkertainen laimen-20 nos alkaen konsentraatiosta 100 ng/ml) standardikäyrä puhdistettua marsu-IgG:tä (Sigma, Belgia).

Kun oli inkuboitu 2 tuntia huoneenlämpötilassa, levyt pes-*:1 tiin kuten edellä, ja kuhunkin levyyn lisättiin biotiinikon- 25 jugoituja lampaan vasta-aineita, jotka olivat spesifisiä • » marsu-IgG 1 :lle ja -IgG2:lle (Serotec, Sopar Biochem, Belgia) laimennettuna 1/1000 kyllästyspuskuriin, ja inkuboitiin 1 I"! tunti 30 min 37 °C:ssa. Seuraavat vaiheet (streptavidii- ni/biotinyloitu peroksidaasi-kompleksin lisäys ja värin • · · ‘ 30 paljastaminen) olivat edellä kuvatunlaiset (3.1.1.).

Emätinpesuissa läsnä olevan IgG:n kokonaiskonsentraatio määritettiin IgG-standardikäyrästä, 4 parametrin epälineaa- • · · * · V risella regressioanalyysillä tietokoneohjelmaa käyttäen.

35 • J.’ Kun emätinpesut oli kalibroitu kokonais-IgG-pitoisuutensa • « « suhteen, niistä testattiin rgD2t-spesifisten IgG-vasta-ai- • · » · · • · · • · ♦ « · · • · 12 107881 neiden läsnäolo samalla ELISA'11a, joka kuvattiin anti-gD-vasta-aineseerumien kvantisoinneille. Tulokset ilmaistaan optisina tiheyksinä mitattuna 492 nmsllä IgG:n kokonaiskon-sentraatiota 0,5 pg/ml kohden.

5 3.2. Neutralointimääritys

Formaatiltaan 96-kaivoinen neutralointimääritys järjestettiin seuraavasti.

10 Testattavien näytteiden kaksinkertaiset sarjalaimennokset valmistettiin suoraan 96-kaivoisille levyille (25 μΐ/kaivo kutakin seerumilaimennosta, rinnakkaisin). Jokaiseen kaivoon lisättiin 50 μΐ seosta, joka sisälsi 4000 pfu virus HG52:ta ja komplementtia (1/100 lopullinen kaimennos kaivossa).

15 Levyjä inkuboitiin 1 tunti 37 °C:ssa. Sitten jokaiseen kaivoon lisättiin 100 μΐ BHK21-solususpensiota tasolla 4·105 solua/ml (4104 solua/kaivo). Levyjä sentrifugoitiin 5 min nopeudella 1000 r/min ja inkuboitiin 5 päivää 37 °C:ssa kun läsnä oli 7 % C02.

20 Tämän ajanjakson jälkeen kasvatusväliaine poistettiin varovasti, ja kuhunkin kaivoon lisättiin 100 μΐ kideviolettili-uosta (10 % metanolia, 90 % H20, 0,3 % kideviolettia), ja *:* inkuboitiin 20 min ajan huoneenlämpötilassa. Sitten levyt ·*·*: 25 pestiin runsaalla vesijohtovedellä. Täplien läsnäoloa voi- • · ....: daan tarkkailla helposti mikroskooppitutkimuksella.

!!*! Neutraloiva tiitteri määritettiin käänteisarvona korkeimmas- • · « • · ta seerumilaimennoksesta, jolla ei havaittu virustäplää 30 (100-% suoja sytopatogeeniseltä vaikutukselta). On tärkeää huomata, että tällä kertaa täydellinen sytopatogeeninen vaikutus (100-% soluyksikerroksen liukeneminen) havaittiin kontrollikaivoissa.

·· · • · • · :*:** 35 3.3. Viivästyneen tyyppinen liikaherkkyys (DTH) .!.* Eri rgD2t-formulaatioilla testattiin myös niiden kyky indu- ( t > soida T-soluspesifistä immuunivastetta mitattuna viivästy- • · • * ··· • · • · • · • · « • ·· • · 13 107881 neen tyyppisten liikaherkkyysvasteiden induktiolla.

Tässä tutkimuksessa käytettiin adjuvanttiformulaatioita, jotka valmistettiin ensimmäistä koetta varten. Nämä valmis-5 teet sisälsivät 5 μg rgD2t 0,25 ml:n annoksessa. Immunisoin-tikaavio oli seuraavanlainen: primäärinen immunisointi: 0,25 ml rokotevalmistetta annettuna lihaksensisäisesti; tehos-tusimmunisointi: 0,25 ml rokoteformulaatiota annettuna lihaksensisäisesti 21 päivää myöhemmin; ihotesti: 5 10 rgD2t:tä annettuna ihonalaisesti (suolaliuoksessa) 8 päivää myöhemmin. Kaikille marsuille tehtiin kontrollina testi suolaliuoksella.

Lisäksi kontrollimarsuilla (immunisoimattomat eläimet) suo-15 ritettiin ihotesti rgD2t:llä. Ihon punotus ja kovettuminen ihonalaisen injektion kohdassa tarkastettiin 24 ja 48 tuntia myöhemmin.

3.4. Marsun intravaginaalinen malli 20 Marsumallin HSV-genitaali-infektiolle on kuvannut LR Stan-berry et ai. (J. of Infectious Diseases 146 (1982) 397-403; Intervirology 24 (1985) 226-231).

·;· Lyhyesti, kaksi viikkoa viimeisen immunisoinnin jälkeen *··♦ ** ;*·*· 25 marsut altistettiin 10s pfu:lla HSV2-kantaa MS emättimen- • · sisäisellä nesteen kaatamisella. Primäärisen infektion klii- • « nistä etenemistä seurattiin tarkastamalla päivittäin ulkoi- V'\ set sukupuolielinten ihon vammojen esiintymisen ja vakavuu- • * den 12 päivän aikana altistuksen jälkeen.

• · * • ♦ ♦ _ _ • 30

Vaginaaliset pumpulitupot kerättiin 5. päivänä virusaltis-tuksen jälkeen ja titrattiin infektoiva HSV2 täplämäärityk-sellä alla kuvatulla tavalla. Sitten eläimistä tutkittiin j * ‘ päivittäin todisteet herpeksen aiheuttamien vaurioiden uu- :*·*: 35 siutumisesta päivinä 13 - 60. Herpeksen aiheuttamat ulkosyn-.j.* nyttimien ihon vauriot kvantisoitiin käyttämällä vaurionpis- ‘f.. teytysasteikkoa alueella 0-4 (0 = ei vammaa tai punotusta; • · • · ··· • · ♦ · • * • * * • ·« • · 14 107881 0,5 * punotusta; 1 = rakkula; 1,5 s 4 pientä rakkulaa; 2 * suurempia rakkuloita; 2,5 » useita suuria rakkuloita, jotka ovat tulosta pistemäärän 2 rakkuloiden yhteensulautumisesta; 3 = rakkuloiden koko ja lukumäärä kasvavat; 3,5 = vauriot 5 peittävät koko synnyttimien ihon; 4 = haavautuneita vaurioita pehmenemisellä).

Eri rgD2t-rokotteilla aikaansaatu suoja-aste arvioitiin alla määriteltyjen kriteerioiden mukaan.

10

Suoja primääristä sairautta vastaan (päivät 0-12) Katsottiin, että eläimiä ei oltu suojattu, jos havaittiin seuraavia vammoja: - useampia kuin yksi punainen alue millä hyvänsä ajanhetkel-15 lä, - yksi punainen alue, joka pysyy samalla alueella ainakin 3 peräkkäisen päivän ajan (0,5 vauriopisteytys), - yksi tai useita rakkuloita a 1 vauriopisteytys).

20 Suoja uusiutuvaa sairausta vastaan (päivät 13 - 60)

Eläimet pisteytettiin uusiutuvan sairauden suhteen positiivisiksi joko jos vauriopistemäärä 0,5 havaittiin 2 peräkkäisenä päivänä, tai jos vauriopistemäärä a 1 havaittiin '** minä hyvänsä päivänä. Uusiutuvan sairauden tapausta edelsi ···« 25 ja seurasi päivä ilman mitään vaurioita tai punotusta.

• · « %

Vaurion vakavuus eläimellä laskettiin primäärisen infektion ΙΓ! aikana (päivät 1-12) mitattujen pisteiden summana. Vaurion • * *,.* esiintymistiheys edustaa lukumäärää eläimiä, joilla saatiin « · ? *·* 30 vauriopistemäärä a 1 tarkasteluajanjakson aikana (päivät 1 - 12 [primäärinen sairaus] tai päivät 13 - 60 [uusiutuvat sairaudet]).

:***: 3.5. Viruksen titraus vaginaalisista tupoista :*;* 35 Vaginaaliset tupot kerättiin 5. päivänä virukselle altistuk- sen jälkeen. Emätinholvi pyyhittiin kalsiumalginaattikäsi-tellyllä tupolla, joka oli esikostutettu "Basal Eagle's"- «·· • · a * • · I · · • ·♦ • · 15 107881 väliaineessa, joka oli täydennetty 2 %:lla naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 100 U/ml penisilliiniä, 100 μς/ιηΐ streptomysiiniä, 100 μg/ml gentamysiiniä ja 1 pg/ml amfoterisiini B:tä (tuppoväliaine).

5

Kaikki tupot rikottiin ja lisättiin steriiliin 12 x 75-mm 5-ml polyallomeeriputkeen, joka sisälsi 1 ml tuppoväliainetta. Sitten putkia sekoitettiin viruksen ottamiseksi ulos, ja pakastettiin käyttöön asti. Itse titrausta varten inkuboi-10 tiin yön yli 37 °C:ssa 6-kaivoisia kasvatuslevyjä, jotka sisälsivät 5·105 solua/kaivo. Putket sulatettiin, ja valmistettiin näytteiden sarjalaimennokset tuppoväliaineeseen. Kasvatusväliaineen poistamisen jälkeen 6 kaivolta 200 μΐ kutakin näytelaimennosta lisättiin rinnakkaisnäyttein solu-15 yksikerroksille ja pidettiin 1 tunti 37 °C:ssa. Kuhunkin kaivoon lisättiin 4 ml kasvatusväliainetta, joka sisälsi 1,5 % karboksimetyyliselluloosaa. Tämän inkubointiajanjakson jälkeen väliaine poistettiin varovasti, ja kuhunkin kaivoon lisättiin 15 min ajaksi 1 ml kideviolettiliuosta (10 % me-20 tanolia, 90 % H20, 0,3 % kideviolettia). Sitten levyt huuhdottiin läpikotaisin, ja täplät laskettiin. HSV2-tiitteri ilmaistiin yksikössä pfu/ml.

*j1 4. Tulokset • t» · 25 Ensimmäisessä kokeiden sarjassa marsujen ryhmiä immunisoi- • 1 tiin alhaisella antigeeniannoksella (5 μg rgD2t) formuloitu- ,·. na 4 eri formulaatioon. Tämä suboptimaalinen antigeeniannos valittiin tehokkaamman rgD2t/adjuvantti-yhdistelmän valitse- *,,1 miseksi, joka voisi aikaansaada suojan primääristä tai uu- • · 1 *·1 ' 30 siutuvaa HSV-sairautta vastaan annettaessa marsuille ennen emättimensisäistä HSV2-siirrostusta (ennaltaestokokeet).

4.1. Humoraalisen immuunisuuden indusointi » : ·1ϊ Kuten taulukossa 1 esitetään, ryhmillä, jotka oli rokotettu ;1·1 35 rgD2t-formulaatioilla, jotka sisälsivät 3D-MPL:ää immunosti- 0 ,l,‘ mulanttina, nähtiin seerumeissa korkeammat ELISA- ja neutra- i · •e, loivat tiitterit kuin ryhmällä, joka oli immunisoitu rgD2t/- »·· I ♦ • f···-» • s · * · · • ·' « · 16 107881 aluna-rokotteella. Hyviä neutraloivia keskiarvotiittereitä indusoitui kolmen rgD2t/3D-MPL o/w (R) :llä tai rgD2t/alu-na/3D-MPL;llä immunisoinnin jälkeen.

5 4.2. Efektori-T-soluvasteen (DTH) induktio

Ihotestitulokset (taulukko 2) osoitti, että 3D-MPL o/w-emul-sioon formuloitu rgD2t indusoi voimakkaimman DTH-vasteen. Erityinen DTH-vaste indusoitui myös rgD2t/aluna/3D-MPL:llä. Samanlaiset kokeet, jotka suoritettiin hiirillä, antoivat 10 myös tulokseksi, että alunan plus 3D-MPL:n kanssa yhdistetty rgD2t oli hyvin voimakas efektori-T-soluvasteen indusoinnis-sa in vivo, vastakohtana rgD2t/aluna-formulaatiolle.

4.3. Rokotuksen vaikutus primääriseen HSV-sairauteen 15 Kaksi viikkoa kolmannen immunisoinnin jälkeen marsut altistettiin emättimensisäisesti HSV2:lla. Rokotuksen vaikutus primäärisen HSV2-infektion kliiniseen ja virologiseen etenemiseen kuvataan kuviossa 1 ja esitetään yhteenvetona taulukossa 3. Verrattuna kontrolliryhmiin (ryhmät 4-6), jotka 20 infektoituivat ja sairastivat akuutin primäärisen sairauden, yhdelläkään eläimistä, jotka oli rokotettu rgD2t/3D-MPL o/w-formulaatiolla, ei nähty herpeksen oireita, tarkkailtuna ihovaurion esiintymistaajuutena ja vakavuutena. Lisäksi ·;· näillä eläimillä ei nähty mitään merkkejä virusreplikaatios- » · * · 1 ta emättimen alueella määritettynä emättimen virustitrauk- • · ....: sella 5. päivänä altistuksen jälkeen. Hyvin samanlaiset tulokset saatiin ryhmässä, joka rokotettiin rgD2t/aluna//3D-j.’“ MPLillä. Tässä ryhmässä ei milloinkaan kehittynyt tarkkai- lua jän jakson aikana herpesrakkuloita (vauriopistemäärä < 1).

* · · '·" 30 Lisäksi kerätyissä emätintupoissa voitiin havaita hyvin vähän viraalista replikaatiota. Vastakohtana eläimet, jotka oli käsitelty alunalle adsorboidulla rgD2t:llä, olivat hyvin huonosti suojattuja (ihovaurion esiintymistaajuus 75 %).

• · · • · • * :T: 35 4.4. Rokotuksen vaikutus uudistuvaan HSV-sairauteen .1." Tulokset esitetään kuviossa 1 ja esitetään yhteenvetona *·* taulukossa 4.

• · · • · • · • · · • · • · • · • · ♦ • M • · 17 107881

Rokotus rgDjt-formulaatioilla, jotka sisälsivät 3D-MPL:ää (ryhmät 1 ja 2), muutti uusiutuvien herpessairausten kehittymistä merkittävästi. Kahdella ryhmällä oli merkittävästi vähemmän uusiutuvia tapauksia ja uusitutumispäiviä kuin 5 kontrolli- tai rgD2t/alunalla käsitellyissä ryhmissä.

3D-MPL:ää sisältävien, ennaltaestävien rgD2t-rokotteiden tehokkuuteen vaikuttavien tekijöiden edelleen arvioimiseksi aloitettiin toinen kokeiden sarja useammilla marsuilla.

10

Verrattiin kahta antigeeniannosta (5 ja 20 pg), ja testattiin eri adjuvanttikoostumuksia. Annettiin kolme immunisointia päivinä 0, 28 ja 84. Eläimistä otettiin verta joka 2. viikko yksilöllistä vasta-ainemääritystä varten ELISA'11a ja 15 neutralointimäärityksiin. Kerättiin emätinhuuhtelut toisen immunisoinnin jälkeen ja etstattiin rgD2t:lle spesifisten systeemisten vasta-aineiden läsnäolo.

Humoraalisen immuunisuuden indusointi 20 Tulokset (taulukko 5) osoittavat, että kaikki rgD2t-formu-laatiot, jotka sisältävät 3D-MPL:ää, pystyivät stimuloimaan marsuseerumeissa korkeat ELISA- ja neutralointitiitterit.

··· Kolmen immunisoinnin jälkeen indusoidut keskimääräiset ELI- • · · * 25 SA- ja neutralointitiitterit olivat hyvin samanlaiset seeru- • · meissä ryhmillä, jotka oli rokotettu rgD2t-formulaatiolla, • * . joka sisälsi joko 5 tai 20 pg gD2t:tä. Humoraalisessa vas- teessä, joka mitattiin ryhmillä, jotka oli immunisoitu • · · ·..** rgD2t/aluna-rokotteella, joka sisälsi joko 50 pg 3D-MPL:ää *·* 30 (ryhmä VI) tai 100 mg 3D-MPLiää (ryhmä X), ei ollut merkit tävää eroa.

On kiinnostavaa havaita, että systeemisiä anti-rgD2t-vasta-aineita (IgG-luokka) voitiin havaita kaikkien rokotettujen • · 35 ryhmien emätinpesuissa. Tällä limakalvossa sijaitsevalla anti-rgD2t-vasteella voi olla tärkeä suojaustehtävä infek- • · · toivan viruksen panoksen vähentämisessä sukuelimissä primää- • · • · • · · • · m 0 0 • * • · · • · · * · 18 107881 risen infektion aikana.

Rokotuksen vaikutus primääriseen HSV-sairauteen Kaksi viikkoa kolmannen immunisoinnin jälkeen marsut altis-5 tettiin emättimensisäisesti HSV2:lla. Taulukossa 6 esitetään rokotuksen vaikutus primäärisen HSV2-infektion kliiniseen ja virologiseen etenemiseen. Kontrolleihin verrattuna eläimillä, jotka oli rokotettu 5 /ig:lla rgD2t/aluna/3D-MPL-formu-laatiota, joka sisälsi joko 50 tai 100 pg 3D-MPL:ää (ryhmät 10 VI ja X), nähtiin merkittävästi (p < 0,05) vähentynyt ihovaurion vakavuus, samoin kuin ihovaurioiden esiintymistaa-juuden aleneminen.

Hyvin samanlaiset tulokset saatiin ryhmässä, joka rokotet-15 tiin 5 μg:lla rgD2t:tä 3D-MPL o/w-emulsiossa (ryhmä III) . Kolmessa rokotetussa ryhmässä hyvin vähäinen viraalinen replikaatio voitiin havaita emätintupoissa, jotka kerättiin 5 päivää altistuksen jälkeen.

20 Rokotuksen vaikutus uusiutuvaan HSV-tautiin

Tulokset esitetään taulukossa 6. Kontrolliryhmiin verrattuna ihovaurioiden esiintymistaajuus ja uusiutumispäivien lukumäärä olivat merkittävästi (p > 0,05) alentunut kolmessa rokotetussa ryhmässä. Näillä ryhmillä oli myös vähemmän ··.·. 25 uusiutumistapauksia.

• · » * » • « . 5. Johtopäätökset • *i *··· Marsuilla saadut tulokset osoittavat selvästi, että rokotus • · · • · · : ·* rgD2t-formulaatiolla, joka sisältää 3D-MPL:ää toimitettuna • ·· : 30 öljy/vedessä-emulsiossa tai yhdistettynä alumiinihydroksidin kanssa, on hyvin tehokas aikaansaamaan suojan primääristä ja sekundääristä HSV2-sairautta vastaan annettaessa marsuille ennen HSV2-siirrostusta. Tällaiset rgD2t/3D-MPL-formulaatiot voivat parantaa spesifisiä humoraalisia (neutraloivat vasta- • · 35 aineet) ja efektorisoluvälitteisiä (DTH) immuunivasteita.

• · · *· . Nämä tulokset saadaan hyvin alhaista rgD2t-annosta (5 ug) ··· *.* * käyttämällä.

··· « · • ♦ • · · • ♦ • · • * • · · • ·· • ♦ 19 107881 6. gD2t-formulaatioiden immunogeenisyys primaateissa 6.1. rgD2t/aluna- ja rgD2t/aluna/3D-MPL-muodon immunogeeni-syyden vertailu rgD2t/aluna- ja rgD2t/aluna/3D-MPL-rokotteiden immunogeeni-5 syys arvioitiin cercopithecusa aethiops'issa (African Green Monkeys, AGM). Annettiin kolme immunisointia ajankohdilla 0, 1 ja 3 kuukautta. Mitattiin spesifiset humoraaliset (ELISA-ja neutralointitiitterit) ja efektorisoluvälitteiset (DTH) immuunivasteet.

10 6.1.1. Koemenettely

Kukin formulaatio sisälsi 20 mg rgD2t:tä ja 0,5 mg-ekviva-lenttia Al3+/annos. Käytettiin annosta, jossa oli 50 pg 3D-MPL:ää. AGM-ryhmiä immunisoitiin kolmesti päivinä 0, 28 ja 15 84. Immunisoinnit annettiin lihaksensisäisesti 0,5-ml annok sessa (20 rgD2t) . Eläimistä otettiin verta joka ±2. viikko ELISA- ja neutralointimäärityksillä suoritettavaa vasta-ainemääritystä varten. Näillä kahdella formulaatioilla testattiin myös niiden kyky indusoida T-soluvälitteistä immuu-20 nisuutta, mitattuna viivästyneen tyyppisillä liikaherk- kyys(DTH)-vasteilla. Apinoille annettiin ihonalaisesti vatsaan eri rgD2t-annoksia (20, 5 ja 1 pg) suolaliuoksessa 13 päivää toisen immunisoinnin jälkeen.

• · · 25 Niille suoritettiin myös ihotestit, jolloin kontrollina oli « 4 * *. pelkkä suolaliuos. Ihon punotus ja kovettumat ihonalaisen injektion kohdassa tarkastettiin 24 ja 48 tuntia myöhemmin.

« · ♦ • · · ♦ • · · : 6.1.2. Tulokset • · · : 30 a) Humoraalisen immuunisuuden induktio

Ennen rokotusta yhdessäkään apinaseerumissa ei nähty lainkaan anti-HSV2-vasta-aineaktiivisuutta (tietoja ei esitetä). Kuten taulukossa 7 esitetään, molemmat rokotteet indusoivat hyvät ELISA- ja neutraloivat tiitterit toisen immunisoinnin 35 jälkeen. Tätä vasta-ainevastetta ei tehostettu kolmannella • · · *· . immunisoinnilla rgD2t/aluna-rokotetuissa apinoissa. Vasta- • ·♦ *,· · kohtana apinat, jotka saivat kolmannen immunisoinnin rgD2t/- • · · • · • · ·· · • · • # • · * · · • · * • · 20 107881 aluna/3D-MPL:llä, tuottivat kasvaneet ELISA- ja neutraloivan vasta-aineen vasteet (keskimääräinen ELlSA-tiitteri: 10056; keskimääräinen neutraloiva tiitteri: 950).

5 b) Efektori-T-soluvasteen (DTH) indusointi

Ihotestitulokset (taulukko 8) osoittavat, että rgD2t yhdistettynä aluna plus 3D-MPL:n kanssa oli hyvin voimakas in vivo efektori-T-soluvasteen indusoinnissa vastakohtana rgD2t/aluna-formulaatiolle. Voimakas DTH-vaste havaittiin 10 kaikissa rgD2t/aluna/3D-MPL:llä rokotetuissa eläimissä, joilla suoritettiin ihotesti 20 mg:11a rgD2t:tä. Spesifiset DTH-vasteet mitattiin myös alhaisemmilla gD2t-konsentraati-oilla (5 ja 1 μ%) pääosassa apinoita (3/4:11a 5-pg annoksella ja 2/4:11a l-pg annoksella). rgD2t-annokset indusoivat 15 heikommat ihotestivasteet kuin rgD2t-konsentraatio 20 mg.

6.2. rgD2t/aluna/3D-MPL-formulaatioiden immunogeenisyys re-susapinoissa

Eri rgD2t-annokset (100 μg, 10 pg tai 5 pg) sisältävien 20 rgD2t/aluna/3D-MPL-rokotteiden ixnmunogeenisyyttä verrattiin resusapinoissa.

6.2.1. Koemenettely

Jokainen formulaatio sisälsi 0,5 ^g-ekvivalenttia Al3+:aa ja 25 50 μg 3D-MPL:ää annosta kohden. Kolme resusapinoiden ryhmää ’ \ (4 apinaa/ryhmä) immunisoitiin kolmesti päivinä 0, 28 ja 77, seuraavasti: t • ·«·· ·« # ; Ryhmä 1 : 100 μg rgD2t/aluna plus 3D-MPL (50 μ<%) '».! · 30 Ryhmä 2 : 20 μ% rgD2t/aluna plus 3D-MPL (50 μg)

Ryhmä 3 : 5 pg rgD2t/aluna plus 3D-MPL (50 μg)

Immunisoinnit annettiin lihaksensisäisesti 1-ml annoksessa. »V. Eläimistä otettiin verta joka ±2. viikko vasta-ainemäärityk- ψ · *..! 35 seen ELISA- ja neutralointimäärityksillä.

* ♦ * » M» V 6.2.2. Humoraalisen immuunisuuden indusointi • j· m · * ···

• I

• ♦ • · t · v • ♦« « · 21 107881

Ennen rokotusta missään apinaseerumeista ei nähty anti-HSV2-vasta-aineaktiivisuutta. Hyvät ELISA- ja neutralointitiitte-rit havaittiin kolmessa rokotetussa ryhmässä, jotka saivat joko 100, 20 tai 5 mg gD2t:tä aluna + 3D-MPL:ssä. (Tietoja 5 ei näytetä).

6.3. Johtopäätökset AGM-apinoilla saadut tulokset osoittavat selvästi, että rgD2t-rokote, joka sisälsi alunan yhdistelmää 3D-MPLsn kansio sa, paransi humoraalisia (neutraloivat vasta-aineet) ja efektorisoluvälitteisiä (DTH) spesifisiä immuunivasteita merkittävisti. Tähän rokotteeseen verrattuna egD2t/aluna-formulaatio on vähemmän tehokas neutraloivien vasta-aineiden indusoinnissa eikä voi indusoida in vivo-DTH-vastetta.

15

Resusapinoilla saadut tulokset osoittavat myös, että rgD2t/-aluna + 3D-MPL-formulaatio on hyvin tehokas spesifisen humo-raalisen vasteen indusoinnissa, myös alhaisilla antigeenin annoksilla (5 tai 20 μq rgD2t).

20 7. Yleiset johtopäätökset

Marsuilla saadut tulokset osoittavat, että adjuvanttiformu- laatiot, jotka sisältävät joko 3D-MPL:ää annettuna öljy- ··· vedessä-emulsiona tai yhdistettynä alumiinihydroksidin kans- • · « » :1 ·. 25 sa ovat hyvin tehokkaita aiheuttamaan suojaavan immuunivas- ____: teen yhdistelmä-DNA-HSV-glykoproteiinirokotteella intrava- • · ginaalisella marsunaltistuseläinmallilla, jopa hyvin alhai-!!’! silla antigeeniannoksilla (5 pg rgD2t) . Suojaustiedot osoit- tavat myös, että nämä rgD2t/3D-MPL-formulaatiot ovat tehok-*·’ 30 kaampia suojan annossa. Tällaiset 3D-MPL-formulaatiot voivat parantaa spesifisiä humoraalisia (neutraloivat vasta-aineet) ja efektorisoluvälitteisiä (DTH) immuunivasteita.

:1·1: Lisäksi rgD2t/aluna/3D-MPL-formulaation osoitettiin myös :1·1: 35 parantavan immunogeenisyyttä vasta-ainetasolla ja indusoivan .1.1 efektori-T-soluvasteen primaateissa, viitaten siihen, että » · · adj uvantti vaikutu s ei ole rajoittunut pieniin eläinlajeihin.

« · • 1 • 1 · • 1 ♦ · • » « • «1 • · 3 107881

-------- M

m i G _

2 P C

'2 <-> G in in i-i o

E -H vou>vo roi-i P

3 δΟ-ΗΓ'Ρ'^ιη-π^τ p g d 8 rH M CO rH m Ai

m S (0 (D -H +1 -H -H rH

m 3 M -P -H-H ti :3 S d -P -p O o n m 5·π

CO r® 3 ·η o o ro o» r» o» -H

πΦ1Ηη>«θίθΗ·ίΜ.-ι p

β c 5S 4-» CM r“1 i-H rH «-V ·—I rH H

3 Φ------- 3 ·ρ

•ro 2 S

3 »51 co co tj1 © «

M 3 P H» σι cm z -H

r: P -h «οοοοί·^· 2 O

2 ® -h ^ ro h· r»· •ί· cr. m <2 ·Ρ -P pj h rv co oj rH ·..

E P 1 ή 1h ή un μ rj rtj O CM -H -H -H ov g

β < W ·Η CM CM CM P

JJ, H H r- cg vo r~ σ\ tn _< E

JJi G <D oo c~ 00 m in es ™ E

π H p 10 CM (M C- CM cm P --------00 e

g . " S

» P _1 § Q1

β £ .5 o o g W

3 - O -h «o o :3 F ..

e <d h h h· (-< Ή +· B P nj Φ -h .3 0 3 ® MP -h Γ ^ :3 •H a+i+joo 000 > e P 3 -h o o o m m m -H ,3 3 m φ -h 10 o o :3 :JS d H -HZPr-ICMVOVV V Qi:P ®

” P t> M

•H 3 -H -H ®

0 1 01 in 1· jj 15 +J

•h m Λ -H

I) φ Ή CO rH Ή ti c "H o o ro 2^·· Ή

2 Π P CV CO CM « rH G P

3 M I -H +1 -H r—I 3

fM I—I < r-r c- VO 0 II Sl .M

CN r-ι 0).ιΗσ\σ\Ί·οοο II O) :3 <N g h H cm 00 ro o o o — ,A< 3

F P)0)rHO\OrHr-lt-l rH -H

M W P co ro cm V V V g 3.¾ ra

O -H p -ro M

• m W -3

λ .¾ P G M

^ o HJ 3 :<0 Q r» 5 ra ra :3

tr» 3 .2 -H Ai E

IH ~ G d . p 3 -H

3 G 'd·^! § jj « B ffl

Ϊ ! 15 “S ! “ α ί S

3 Ai 3 G v. G

> ^ £ £ g g g §3 P fc g 1 3

:· 2 £L - -F» 13331 ®wS„ S

.... GO 2. Tl QHrHrHQ g ® P ^ ... ·Η Φ»3 co <β <β <fl ro 1 .2 3 O ® : · : «op p_______·3 ,h -1 -h • 3 W ·1 „ n i .p| il ·:1·: 4J S m 3 -g -h « m 3 05 „ . £ :3 > 3

·:· g | β» λ o1 w B

”1! I p ^ 11 « >v -H

ϊ··>ρ> 6 ^ ° P >, M

: .1 w ra ή ® 1 «H p p 3 ...WP g d e !<ö p>

::: 1 +» g Ä §gm:3P

• -HW O»poji) P 'HGd«0 P 1H -H K, 1i -p m S 3 3 p fi -P P Q Q Q m q g Λί Ai 4-> rtJrH C0»0»0» .M1. S3 3

3 ^ MPPII-Oi S G P P P

.. ra - 5 :o -H -H -H

Ή 3 I >1 E 6 o M i E P 3 g

O -H « MM rH

.. . Ai > i Q333-H

I ‘ ! Ai p »h cm m ^ in 10 tr» O ai 3

• · 3 P >1 MJliWWP

... rH 3 « Ai O

: : : 3 p — -h — — >

• 3 G iH 1H CN CO M

eh 3 _1 I I I I I I < * « · · • · · • · • « t • 1 1 2 • · 107881 I · «9 :(0 O) G to :<0 •H > :(Ö *H to :(0 -------------M Oi » G ·

O θ\ to CM

. X

(0 *0 (0 rH M Λ « r-l 2 _ _ Λ P » •ri S e a a 1-1 ® rj ,¾ g — to » 3 ~ o H Hf-ifO rH τ* Γ0 O OO O O oTJph flj r* r 13

g β------------Qj-J

C G rH

to e G m S3 £o H oo 3 β G 10

p P

O) 0 :<0

+J g Ή P

0« P ··

,¾ ·~ «J P

7? ·» o in o <n <n (rt n

y Mi-HiH t—I i-H i-H i-H OO O O °_jQ

M_____________d en « a* d o g •H V · •h P 10 i rt Β Λ Q-H · co 5 § g C- WP :«J g cm « 2 M m · to § 3 3 ^ in o r- cm m «2 2 .5 «rt S 1-1 11] ι-l i—| rH CO rl Oi O O O O O (0 öl -H -O id) g - ______________H-H+Jii to W .5------- H (0 G-H 01 O c ·· H 3 to :0

V c 01 <0 P X X

* 3 a. G >t*r| P, p O eo to q oä o> m ·η tn >i )_! rH (0 t0 ^ cn ·Η -r-ι G (0 ^ g p Ti to ® s (0 10 »* Λ to H o in o o in ή n J N S ^ ,:. Q pt] CN 1—t CM i-H i-H i—I o O O O O _ " _ ^

. ·— O *rl (0 -C

.... ----------- rH rH G 0 : ·, ·. Jj :ιβ H H O X · • *(D G ·ιΗ (0 ·Η <0 . n s H ΡιΌ P G to S « S s,^3 >4 o to ·:. -g U «* nts ro n cm ro -h cm ro n « 5 C O ffl-H « . rH a :«d p x *1_‘p Ό ·:· s ft G G >Si Λ ···· Jj G rt -H Q) o ·· · -H_________ G ·Η ·π I ·γ\Χ

: : +j--------- H -rl (t) Q G -H

• · m -H P H -r| p <d Z p p G i w : : · 4j 2. j Htu-Htoo®

• o S O G -H G H P

,0 9 > S tocppo H ^ I Ή id P O li Ä

13 0 S g s „ g s §-H

·· «j o & 3®3S3 CMrHpi nf ? 6 rl H ftp 0 3 S C ' grHp-rl

OG Λ 5 8 H-rl-rl fi 0)rH

y 3 o P ™ -H P 0 > O

:·.·. x £ 3 pa tn.c o o : : g * ^ S o ©-h*.*

• · JL CM CM 3 tD · P

:T: 2 & §» * eh _ I l Is p h w h a • · · • · * I « · « · · • · • * • « « • « • · ♦ · • · · « · · • · 107881 E3 0) « Sei •H 8 O Λ e 3 S :1 •H -H -¾ ° •H 1H ,5L r< 5 ^ fi 0) «N « 2

§ i c <d P

.j «a n> o in in ov .jö -P

Γ; 3 «. «π σι t-- <-i d Ή to Ή M m o oi 2 3 m ·Η i i ,¾ -H 't <-i vo to 1>· 1r -P2 Γ! d) > ~ +1 s Σ,

U_l O -H -H -H -H -H m ,X I—I

e e +) S M «d « Φ-Η ininvocorj· +r u ' S M <n r- ή en -n to -4 q 'rrt

I -H <D «. in tN (N «N -rl ”? ” jjS

OJ -P-P vo ro in ro tN jJ ·Ρ OT.JP

> ä 5 H _ „ 5 s 13 ® S " 1 03 ö p „> tn 0 Du C ——------- z ’H > g e p m ._J Ό ro ro r~- VO VO r-~ in ·Η -H >,

U n ^ N « m Λ S :(ΰ -P

m 0 o » cn cn ro ή· _ tfljj 5<β -H W O im Zh :(0 P 3 Ή -H -H -H -H <t> ' g ·{“ e 3 3 -h

.5 (ö ^ rl <9 (N rrt (V) rrt (U

Π t> nS ^ih e M

h o ϋ o ^ vo tn r- ® . m

Di A m ^ e ö

tO ________ «. AI -H O

3 ° :<β -P «J

d ~ .m M <D M

5 - 1 s i s SS > δ S ·"

Nf > 3 .Jj +j M - e - ‘Ja ’q. to id td .5 SS ί· 1· 1· tn m co ” -h to g ·η n ooroin^r- G g1 —

.5 2 e J 1r| CN O

0 t & £ g - g.

to 2 ti -rl g | 3

1-13 · > - -S

1 3 H · g £ 41 £ .5 iH - S :<β :<U g

H -H Λ § Ό > <D

(β 2 , 05 P -H 5 id _j CO ·Η ^ Ai ·<ϋ ·ίϋ -—1-

• H Li -P g .. C Qj rH

···:" 3 ! ΐ -ΐ ό g g g g·1 “-5 « g a g S 1 « s 2 £ 3 i u ·:··· ! S . 3 ? .3 ύ > .° 1 a H 2 i Q <β W ^ m .

·:· I g .2 nv 33 v en .... S <u o------- a (rt :(Ö 0) 0)

:·.·. Οβ·« C

• · UI di O Q |(V _J S MP

7 -P « s 10 7 -H ttö -H

.1:1. Λ <D e ^ Il 3 :tö -H

*.1 1 w 3) 4_) .p .p § UjrHg43 QD .»H [0 Oi ® <1)1 OIO) O' O Q D 1 <m S 01 4J>

PtD ^MPP p SvntltJ »W

tn 4J SoP-MW

·· -H <J tJ (rt r-ι :io Di l η θ' ^ | o a O S Λ G e -rl Dl 0 rH Tn ·Η B P Oi

M O -------- Q g rX D H

:·.·. ·1Ρ_ tngsfljtea :.· S-r|:g P<UP1C>W· ..: h > I JC <Ö e

:;: G f, ^ :o — M _ (U

• (Ö <Ö (¾ rHtNOOrtrmvO rrt >1 N -rl n vf (1)

• · EH 1n _ I l g (ö -rt w X

• ·· • · · · « • ♦ 2 • · 3 • · • 1 • 1 • ♦♦ • · 107881

g "ie H

m c > <o Q

d :(Ö I S Q w

g .................£ S § S w +J

.3 t; +j ie +i o ® > - ^ .¾ rt O :rt S ie έ s ί » s .-s . .a g 3

| -11 1 " " « ’ 2 1 " HttS S

ö S3 2 ^ «Γ a § “Si ö -3 .h ° ^ .^ärtASajd) rt § fi in « ^ 1 2 .2 3D® c - -h rt £

ä------- rt rt rt β -P

m .2, τη +J .p rt © ® . . rt 0 tn rt

h .rl m β Ή ^ Ή S

rt <0 P ιηηΓΗΜίΝ'^^^ϋ'Η «< n C oo3»1- -H S3 ^ +2 ·Η

Jr ·η es 1 ih n i—i γί _ rt rt O rt M

2 -p -h o 2_1>©© β rt» -h -h ή ή -h O "D ^ n es

p > ® ή -h ij C M

Ö 3-f-i n oo ve in :rt H % +2 1 P 4-> c r-i .·.·. v r< rt rt :rt ·Ρ tn rn 3 Φ P rt-n<NM .J -P g P P β 2 'ä 1 S s h :rt rt rt

§13-3 -P ^ :rt -P

,n 0 14 s ’[S ai :rt rt rt O

R . :rt -H tn +> « 2 Π m :rt -h tn © ι> i m :rt Οι Oi ·Ρ Oi

Π3 C rt g :rt — rt M

d <g «! g g rt g rt

5 -O +J E g rt rt rH A

m > -H n rt'xrminineo H P lj_i.j rj o -h o i; 2[j H m ΕΝβ -H E ^ rH (N ro -<j· in in ^ ® S1»!,» 2? .3 P Pi o» ^ -P rt rt -P > 2 2 p - β Oi tn tn ω β 5 5 5 . .5 o Aäe+> .S § ί “ .d -h ;rt β rVj β

d ϋ » a Γ} P -P -p o -P

2 H Φ -n .ti β ·Ρ O H tn .2 g rt tn β β β I . > rt Ei61 3 I 2- § « £ 2n β ~ ~ s J.

3 «. g ,, :rt :<e o <-π o o σ> H Ö S cm Ό :rt Ä AI «J ro rt -h » ä -H > £ iJ ... , JS ,

Ji v 3 i ?λ :<d H :<o I Η i

3 +joq jj g c Φ :<ö H »H

·;· 3 S j i? j m " T3 :rt :rt n -P n O gg^rtrtg S rt JS ® 5 :I ^ ^ ·· ·. .3 rtScccS .3 j H ·ΡΒ τη : : n rr -f» I S 5 5 I .d □ -h w :rt © -p -p *· t; rl-OQr-irH^iQ ”3 „ ·ρ s ft +) :rt v :rt ....: 2 ^»irortrtrtm ωβΟ rt «>:rt> : · J3 ®-------w 2 -n +j -p -p -p -p -p a o . a X»Oi:rtg:rt ··· g -¾ —.“v OriniOOl-POl ···· n ot ^ a 1,1 «sö ^ id ·Η ίΠί ... y “ 5 "1 O -P M P ·· rP ..

P. S^^ig+JrtOrtO

*· V 5 'Ρββίβ»ω

.···. . Β h β :rt β -P > M :rt M

::: 1i, -j .ΡΗβΛί'-'βρπι o § «rai^-yS-'PlS'? tjl m 4J O 6 β β rt β .rt β p criijjjjj +> 3©!rt -P -P h rt E « •H es1 rl ci -H 3 Λ P 01 rt H τη tn -n p O o Q » 5 :0 :rt β ·Ρ rt -P rt ·1<· SuuuiiS | >1 :rt βίβΟβιββ

rt «PMMII1 ^gg +» H H e H

o .H ------ « β ·—. ·Ρ tn β -P o ·ρ

Qrt^ooi-p^rt^rt :·.·. Λί·ρ εηΟβνο^β^ί^ΟΛ : : β β « ΡΑίιΡ >4grt^!«Ai

·· H to S rH O) M Tf m VD M I OPP P

,·;·. β p ·§, —.m^rt — rt

·.·· rt rt S ·Ρ <n m n β rt+J^+J

EH g I I I I I I I I ^>^r-.^CrH — — — « · · • · * · · · · • · 2 • · 3 • · • · • · • · · • · · • · 107881

• O

—. ·Η

G G G X

Q) -H d) ti 0) g d) > p g m >1 O) H (ti

-H -H .3 iti G

« g _ S ;0 -n _g

•H -g ro p >1 -P

Ö B^H^OSOCNCOO CP S G 4·^ fli -H -w -M os r. ® o r- r-ι r- mrJ (rt

t: G W p OS 00 ω in N ιΛ so LJ T

Q) S® H IN (S (N N H rt fl3 · G <P

B P ** irt 4« -H -H -H H -H -H O fiC 1H

n -3 h «1 «j ΛΪ <D -P £ s ·Η ' <0 O rs| O O O O O 173 Α»Λ ” G GPUO^mvO-OOOOS©,^ ΦΟ g rs 4> ® p ^rtoincsvoinininm __ i> m r·1 3 g 4 n p n ^ 9 <i n (N V V V rs ^ hn VJ irt 3 > ω « ·Η rH -H 0) λ jj e > :fd G Ό •H ® ® I -m G Ä _, n s «n _ i o

G S - .5 G g .X

·· S 5 “ G -H -H

P .5 “ ·Η G rt (N 5 5 Ή G G 6 Q Λ rt rt P -H 0) ^

P P P H © l© rt SO N Jj O C CP

, . «rt « P <N N N Ν' >β Ift 1T. X G X

H ti a p h h h in ce m ^ Q; OT C ϊα.

> p o o ** «1 r- m os n ,-ΙλΙ

Il rt h v <n « s© «H 2 Φ M C P -H -H -H -H -H -H -H J® 5 ^ -P ffl » I -H G H ** «I® ti! « » r·** es m ® n .» es λ λ ♦hjc ω ιηοοΦβοΗοοοοοβο -H S w w

rt) p r—j h ©s«©voo©1roooin _j IS V

X ti») H ChrtS©ins©©rtrtrtl© H rt\ (0 <11 H rtcnnflrtCNVVVrt (0 ·Η P !ti · p___:ιβ m :<a a

G d) G :ti M CO

P J, S di > +i :ti 3 w « r- <n o in m ti CD ·Η 1ti +1 M " ~ S 5 5 S S £ S S . ·Η :ti :ti g

-H ~ -H O O O O O O rt O &1 G I O

S § I H SH -H -H rt SH p -H ^ U

> rt G ® O O O 0) U> U

O -Hp OOOOOOCSCSCSr-l rt !flf r-f U M Iti . a ρλ »©of-esesooof1 'u Pi -V . .

G “H ti g h o h n « in » s » « »r"> !(g Q) | ·Η 0) g S & OfHoooovvvo ^ Il -P W ^ 'e Ό 1 oo -H w +j .h a tN -p a -H CM :(d -H rt 0) O e£ Λ(β·ΗβΛί

•H # $ 1· +J -P Q

4-» -S ? O <> 01 O >ί C

ti M 4J w 1 u H m H r-. fH 3 > O d) osieinr^^o i) Lj Γ2 »O ® -H M tN Γ' in M rt 12 _ li LJ ^ .

H PH “ d C Q) (Q ·Η a ® ppppppooort π Π _j _j _ ,t

7 ti ti m in in p ·Η Ή »ι-i 4P

e> M o <n o o o o v V V s, «rl 1) JIÖ JJ

« p m rt 00 rs n P1 .^Τ'ΙΙ .ΤΓ.

H c s cd 1 tn o h 1 u> -H 1p rl (0 rl d)

O « I rt:(d+J(0d)rldJ

•W i S -h Λ :ti ^ ·· g

•H a “ ® M C S -P

«P a ®p r~ in ri in vo os rt 1H 0) 0) h “P

1 \ > SP ® n s1 05 r1 h m ij r< rf ti TT lp H o n ie CO Ί (N OS M 1T _2

G > 5 -H OS ^ rs os ^ ^ rt CQ G-PCNG

, β m 9 1i pppppp p (U 4^(UWCT> «·« S icPtil rsmorscs^ ei rrt .-j »p ·„, J 2 -H ti W vortrsosnr-ooofN B 1r . ^ _7

MM G 1» ® h 2S!^22i222S H r—I :(t -P

___ ti® H HinmS'dOrtrlrllO /« lit aj-d I I M> • · · m iti^ pq rtrtrtrtHrtvvvti· O Ψ·(\3"Ρ w

: · : T3___M 4J > 0) :<Ö W

• · ti P -H d) P di .·«·· , rt jjjjssss 5 3 s -p ti • -H w — aaa~» -H P &ι P >1 Ä M ® ϊϊϊϊοοοϊ ·Η Xl ·Η (0 >1 • fll 0 'ν'1'i'vininm-v.o jj n r1 Li rl il ·;1 w m οοοο—_«^ο o 1r j h 2 j ^

o c rt ·γ| ·Η -H ti Ή 1H

,. . 3 0.-Ρ·Η PM

. . -H +1 οοοοηοηοφ1 "M , \ E P Iti ti !ti ... ti t + + C „ d) :ti :ti P g

• 1 ' "H > ►qjijhqciiijcii^i'e 3 CN ^ ^ ^ JL

• M 3 SSSScBBe,rtC g rt, ti 0) d) -P

ΦΊ1 XXZX993XB3 gr |+ . x , t rn o DaoortrtHö»irt g ro ~ Ä +J -|J Ui < (imnnBMBnjiie >r_j .-J p, l—i 33 p p « O P1 ·· p ti 'd d) w m , d) 3 g g ti 1 ti +15 oiocoioicnoi g _j P 3 P tip

Ocn goaaaaaa w -M„MMOpCN

^C0 ffSS^S^S1"'1'3· :« H dl 0) > m Q

... M ·Η h«<ncn<n „ H 2 m O M ti tn 33 w q. w w g; > 1

* · <—I to =g H ^ -H

··· G M ·« H H H m -—Ί ·—«. rt-1. Aj ίί ti ti ti hh5h>^>>hX rrt o cm ro Tj< m c ', . En g ----- --- rt '— ^1-1 --- <0 ··» • · • · ' «·« • ♦ «M • · « » r 1 1 • · · • « 107881 i I I h I ^ ^ - I i.

H iN ρ e O ^ y) H 00 o> CN Φ-Η Al H I oo ' vo r> Ό ' IHa, O s s -H ^ a-a H 3 > -h -h „ -h w«i > O+J ^vor' '<λ g-g-g OS ati — ' t~- Is ' c ή (β HEX cs«oo ,_,rH «gg, •f—J a S H H rH -v o “1.°

O >1 I rH t» C M

ö « « h -I 3.83 ►H H-H > ]r e c

d) « 30 1H

m . M1H

W Oi C ad P

-H 3 ® g:gp a o ® § I«

H o 1 0» t- 00 S dt!S

H S' +,^ °Μ° e go» +3¾ -Η -Η -H S51m5 n S at -H 9 ► ö Q> £ K1 1 M VOVÖ w P id > ad 0σ> ro « o 1. ·. ·» —» β —ft ._| W-?n1 ^ »HO ρ e 1ad jj _ 2 Ώ _ Ä AI 0 H AI 9 O Φ 4-J 0> O 6 o O > β λ c ^ h H _| «H sd m sd h esd I 3 Ä Γ1 Γ1 n 1 ad μ -h o > fl) r1H >i S. ad -H ad ad <d 1r% >, vh “» < “i o n |-g£ ISo·0 ___________ ©ead φΦΜΛά p m p, p α o c .—I «a tT ·γη1η V Λ -ΗβίΛΉβΒ I C ft Φ D|Λ-Η «VI V> o C G 0 « « £N 3 1H 1H 1H -"H P JM 0 ίΐ _ _ C9PP®9fi«

CO o _ Op ^ C d O-P t « 3-H-H

a « ^ 0 ' ' atsjsa A ® «> m h p o ad 2h 1ri _ O0 CN 01 ° ad ad -H ^ 1r>ad «+> «

(0 J _| T-»MHH3-HrH

Ö. JH ^ jj o jj jj adalid G ad 9 β H

4-> PM ·« o n n c1 M ® ad 0 ad jj oj £ ei1.p«i-ta<> XÄi_i r2· VO VO 09^0 XdH Ή S Q a H 1 w JdJiwn 9 Pd O C ad _C O' 00 > Λ· 39rt P 9 « 0.

Ä ÄtLi^ O »H O P rH 1 »Had S

.-I <D H J? «η α I cd -H hpo

2 J_j ίο W 1H C m P CHGH

(u +: O' C E O O P0«»e H φ-j 9rl ^ > 0 asi Γ1 r1 βίβο "^3 “ 2

CN 9s£ pH >1 ^ -HH a ffiPad CP

«4 niA<d!B t—I CS NÄH9

C U UI «! MH 1-1 V1 H HP p rH fl> Ό M

•Fl Hd I p -rl c (d ad c CMP nCΉ MM Ω C # 1 . '•si “ .□ « p > S P >«H (0 Al er1 rH CN p Mdd MdO t 0 w N n 't ~ -hIF t 03 — ^ > ado3a ad0->0 m mmj I) ·1 O CQOdtt^OiadBOsd

X,1»LJ +4 CM β 00 9 0 d ·Η P Λ H

C CN ? H BP CP «p > s ej *5 Q "V. H ° +1 0 XH C Qi J<PHPJ< tt H Fn λ u (N +1 H d OP '11’ d OM d ®

s p1 O M rsi -f ·γ-<ρΡ Μ τηγΗ ft 9 C -X

S U f ·1β93ΰ4ίβ9β·Η S j äo «—I r-l ·. a rd JZ» 1h o pm ad pc 19 R »-λ Λ β Ο H4 t-.Pi 1 M -r-1A1 M C d — Φ o' Ö § Oi ddoe ddM-HC^d m a a Ä σ\ σ\ pmpp 9 μοήήρή

fö rt sL ΙΛ H-VOP HSBPId '-'P

l-H A S ί O -H C Ή ·Η Ρ C Β ιΡ cdP

*; lf> ro « »H CN pH id O ft-pf β βΡ β CH ® . »H ÄH OP Ji H β P P 9 5 __1 1 1 1 «— c S 9-H e ä d e «ήä i •V ••a o HPCH9 hä o opäp ,,,ί O 0) cd PC 9 H «JMAiS'HO-pl

···· , ^ .pipajOPpidoCirOMH

·» · 1H pH «Ö JH vMAidM^d :1: -p «a^-e «—h®1 1 · (rt (rt ö dP \ O »Ö o ^ • fö 03 ^ • · ^ »1 _im 1oo MH 1n fi a e

• 4 ^5 <β CUtfaoS^S

. 3 ‘d Λ ^ Λ Li M, 1'3 ,;. E 9 O o+j +>W3o«- "2 o 2 ’-p +> -3 0 9 1 Tl 13 - 1 ~

····: v S · «S. SiR|S:Sls s S

·· IB VH IM-P +> Ai -P 3 -P » 3 3 » +> C CC M+>(DC^I« “‘ο'λ «1 i ·»» CN Ch ·Η ·Η·Η 3·ΗΉ·Η 3 β β ·· « .Μ 5

- Q 0) I I ·Η 5 -H C ·Η C <β Η·Η Ojj ; „ £» S

mm «N CMC 5+j.hm Φ +> ΐΙί-ΗΗΟΗΪ p1 ® > >Φ ΛΜΙΦ-ΗΛ -H-S S I H ° i 3 a n® w «o Ai 3 «n >0 2t 1^-5 SB’s ®

•H SO BC CM>C -d-1 ^ ieSi «bh S

••E ® >-h«ö® « SS P P2P "SP- 2 VO S s g Ή „ ► »Ή a g !° ci«?i -5»g 5

o S S S 2 2 S S 2 et ^ Seis ^-5 M

y'1; ·Η ·Η ·Η ·ΗΦ Ρ·Η <1)> φ > Ή to «ad

Ρί+> H H H ME 3 n 33 ^ S1 S

M ® iS «2 P 2 Tl ti 3 ti ΰ S § o o e « o-H ® ·»· rH 3ΰ 2d Q (σ·Ρ O <ϋ SO -H ffl -H -H -H ® > -H B > * 1 «PH 6 SS S 4-> -H > -H -H >9UkMfi9M9 9 'h S -h 1P g o rt « o «g Siä S3 sl s3i t • I 2S M HX! XJE3X3 22 -SP las±! p fep p .. (d® 1 fcHHSDHDD SiJ -g||| «1« .

, , H W III m < p.|h h s o h d o • ·· * · • · • ·1 * • · # Λ 1 · 2 • 1 • · · • » 1 • 1 107881 h -s H -H Ν'

(Ö +> CN

'm ----- P _ jj Φ id

ίο C.-H

X _ O CH

o JJ O' X (d-H

σ> S a Ai ό

g I I I I I H H H -H II φ JS

•H Dl° ® HO

S WCN Ä H M

2 W -H Π P -H Id _ a -π (ö id H (d ^

§ P O' -H-H

P5 A g1 I III I H H H I '·φ+> 0 5 onn Φ +> H 1-1 ro d) « S *3 ^ e - »

P S -H -H

CN S ro +> Q n P O' Cro O' ^cNaQQOOD.MM, ,, ® ® " “§ΉΖΖΖΒ!5 Η" 11 5¾ C ^ id ä

•rl ÄH

•h _ d .

±1 * P id ro 0 ero jj co g Φ TS m i i i i i i i i i ι ι +S £ y ^ +> Ai p 3 3

W C-H

«i —- " '" ——m' (Q f-] id ''Λ

Ή <N fr, n· o vo Id O

p P ? 'e'e'e p 3 O cN^iiiiiMRixgxrgHii oro

•o O o O B g -H

θ'” H H H P Id

C» «-H

™ C - to Ö o

ii *< PC

OePOi *?? S g ί Sq·3-! i i i i wining ι ι i «hi 5 % s» „ „ * is

fl) " CN Q

* fi_ g*

Se bp 2 3 P OI 77 H® ;:· S » S* g g g g g - 1 i I > · 5,3 .

λ S WH » « *« S

i * : p o +j m • · -rl _ CN Id TJ id • Q. > Ä m ...· tr oo o ro * O cn-h Ai id • u co P -¾

·; h pq tiili ι ι t ι ι ι ' “ S -S

„ · O) cl o φ O O

·*· n ro -HAi

w ad-rl P

: : w e e Ai e • · ______-rl H φ o ... :id > id wh : : : m ·η e e p * ÖJ idooo'mN'coooo'inin oo S 7 •H q_ ininicvcvo n> n t'- h cn h “±5 Λ.3, ·. h; ro ro co m m rommin co «h a azooooooooo o » .5 e ro -5 g < 1 :15.3 « ?

2 Pg+JPQ

^ .rl -H g C ro H

*2 o Φ 3 3 P rH ro Ä P P id 0 1—1 -H « O Id >1 .. . r*- m ·· .e >ico e s p « · · AiiJ P 3 S ** 3 3 Ä : .· n n S -H E Q,-μ Φ g o ö Hgadid+Jp .·:*. -¾ s H -h rt ·η G Φ ... Ai G I ® P o > o >-h * 3PQ p Id Id0i H +J-H<dÄO© • · Jj | £ 0 PC PCS P id rt-H-H Ai •«· 5 1:1 x cn 3 cn 3 1 e e q»p 11 1 · * 5 5® OOH OHO O ·Η β ·· ·· . <dEH(d a O' id O' < n a q,co 3 o ...^ EH O C < H +J ω H 55 MM» • · 107881

§ Η ύ o o 0 o o O g o g g o ®3J

0) D 2 o o g o o to S o g g o SS

O £ 3 β EH

H K G

Ö c -H « (d a) rt ·γ—i

ϋ ® Λ O

•H ^ H G

im 2 rt<w o öin n cn ® “) SS r> m t4 h> n t< m ή o (n o »g g g ον σ> g» < h H o h cn to to JJ® 9 g r> n· 22 <**

— PH N N H 1C N «2 ^ 2 VO VO 22 I

W H 44 ^ o

:id ^ O

to <-h ®-----, #· ·Η

Sm 0 O S +1

^ EH S O O O O ® JJ O O O O JJJ t S

D 11 o o g o o 22 O o o o 5!« <e G ^ HS <N rH ^ U· rs ” 7J CN CO 00 H ^ 2 _ H * 2u * ^ « I s -8 +J »J ·ΓΊ n o< Q) h *· ** 10 < M in VO o o o ®g o rH CO o 2 M +1 CJ U H ro io o m 2 S <n «o in 10 g g *0 m H EH rH a» ro r~ in g 2 N- ro e» io 22 Q) 'K PH rH rH rH ro CN 2 N· H CN CO ^ ” »

V H H * * S

£ o

m----G

B s 3 a I

S S ä äl s s ; ; s ss s s ? » §! -a

? S 1 Hh Ϊ S S 5 3Ϊ S S ^ 53 JS

σν § ä «c o N , o ^ ° 5 ^ *5 *

G i? 2 h E

E G

g----P

H Φ | gl § g g § g §3 § § § § §5 3 "

3 « ° ° ° '‘ΐ ^ ^ ^ JS

0 W> t4 CN 0) •H > H Q (Ö

p 'd Cn S

(Ö n. ·Η E G

.:. rö m O' P -H td ...: iH o· i g ^ a.o)Mtö :·.·; g H 5 S IS S s g* « 5 S S 5· o ίί g le ’. o -P PH 2 S h in £ ^2 r- 2 ^ 40 <*2 ^ lp m > VS B 3«S« .:. μι -p —-----p p p -p • cu to h to td to

···· g td · · :rd*H to CJ

:\\ I > e « to QrH -P

• Q ^ co m co N· vo u co ov in m ^ -H Ή Φ G

ro jj S ininvovovo,*aN,'3lr~<H'*a

.·;. ^ φ g m CN to CO to CO , to to CO ro in .g tDÖ-H

*·’’ g to Si^oooooS-hooooS-*4 “ g :2 !5 G ·Η ^ oooooi O O *0 O 2 2 ^ :S ** G O' Li ϋ C hv ,

rH 0 ^ G II tttJ

«H flJ II P

o Φ-H tO

p M 4-> M ·>Η ·<Η

cn O O O) M G

Q to I M P Φ Φ ... 00 O' M 0 P P Φ ’ · · .. S S m -h +j o·

• t O <d rr H Η ·Η ·Η O

.·· Λί ·Γ0 to H |H e +) ·γΗ +J

::: a* >, w « λ p ·η i p «d οιφ δ > T?S μ< I α

·* rH p AS 2 £ Jni GW&hO

.·ί·· G CN G g Q QQ *3»+? ·.·* UQ 0 06 O* O' to MW?i

Eh 0'S L_]__ * W g to • · ··» • · • · • · « · » • · · • *

Claims (4)

107881

1. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi, joka rokote käsittää HSV-glykoproteiini gD:n tai sen immunologisen fragmentin, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää ensimmäisen 5 vaiheen, jossa adsorboidaan 3-de-0-asyloitu monofosforyyli-lipidi A alunalle tai sisällytetään 3-de-0-asyloitu monofos-foryylilipidi A öljy/vedessä-emulsioon, ja toisen vaiheen, jossa sekoitetaan HSV gD tai sen immunologinen fragmentti ensimmäisen vaiheen tuotteeseen. 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että glykoproteiini gD on HSV-2-glykoproteiini gD tai sen immunologinen johdannainen.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että glykoproteiini gD:ssä ei ole C-terminaalista ankkurialuetta.

4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen mene-20 telmä, tunnettu siitä, että 3D-MPL:ää on läsnä välillä 10 g ja 100 g annoksessa. * « • 1 » 1 k IfM * » » · · r * 1 4 1 t» k * 1 r · * · »1 · » 1 ♦ ♦ » * • · « » t 1 ·« « · · % 1 1 * · · » · « · · • · »· i « · • · ' · · · · * · • · · • * k 1· · 9 · 107881