JPH06505727A - ＨＳＶ糖蛋白質ｇＤおよび３脱アシル化モノホスホリルリピッドＡからなる単純ヘルペスワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｈ８Ｖ８Ｖ糖蛋白質および３脱アシル化モノホスホリルリビツドＡからなる単純 ヘルペスワクチン 本発明は新規ワクチン製剤、その調製法および治療におけるその使用に関する。

特に、本発明は、単純ヘルペスウィルス感染症、より詳細には、単純ヘルペス２ 型ウイルス（ＨＳＶ−２）感染症の治療のための新規処方物に関する。

ＨＳＶ−２は、陰部庖疹の主な病因物質であり、ＨＳＶ−１（口唇ヘルペスの原 因物質）と共にその両方の急性疾患を誘発し、主に神経節細胞において潜伏感染 を確立する能力を特徴とする。

陰部ヘルペスはアメリカ合衆国だけでも約５００万人がかかっていると推定され ており、毎年５０万の臨床例が記録されている（−次および再感染）。−次感染 は典型的には思春期以降に起こり、痛みを伴う皮膚病巣が局所的に見られること を特徴とし、これは２から３週間続く。−次感染の後６カ月以内で５０％の患者 で病気が再発するであろう。患者の約２５％で毎年１０から１５回再発するかも しれない。免疫抵抗性減弱の患者においては、通常の患者におけるより統計的に 高頻度の再発の発生率が高い。

ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の両方のウィルスはウィルス表面に位置する多くの 糖蛋白質成分を有する。これらはｇＡ、ｇＢ、ｇＣ，ｇＤおよびｇＥなどである 。

糖蛋白質りはウィルス膜上に位置し、さらに感染細胞の細胞質にも見られる（ア イゼンバーブ・アール・ジエイ（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ　Ｒ，Ｊ、　）ら、ジャー ナル・オブ・ウイロロジーＯｏｆ　Ｖｉｒｏｌ）　１９８０３５　４２８−４３ ５）、これはシグナルペプチドを含む３９３個のアミノ酸からなり、分子量が約 ６０ｋＤである。全Ｈ３■エンベロープ糖蛋白質のうち、これはおそら（最もよ く形質化されているものである（コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、ジャーナル・オブ ・ウイロロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６０　１５７−１６６）。ｉｎ　ｖ ｉｖｏではウィルスの細胞膜への付着において中心的役割を果たすことが知られ ている。さらには、糖蛋白質りはｉｎ　ｖｉｖｏで中和抗体を惹起しつると示さ れている（アイング（Ｅｉｎｇ）ら、ジャーナル・オブ・メディカル・ウイロロ ジー〇、Ｍｅｄ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　１２７　：　５９　６５）、しかし、患 者血清中において中和抗体価が高くても、潜在的Ｈ８Ｖ−２ウィルスはなお再活 性化され得、病気の再発を誘発しうる。中和抗体のみを誘起する能力ではこの病 気を適切に制御するには不十分である。病気の再発を予防するためには中和抗体 だけでなくＴ細胞により媒介される細胞性免疫もまた刺激するためのワクチンが 必要である。本発明はこれらの目的を達成するものである。

本発明は３−〇−説アシル化モノホスホリルリビッドＡ　（３Ｄ−ＭＰＬ）（モ ノホスホリルリピッドＡの脱アシル化誘導体）と結合したＨＳＶ糖蛋白質りまた はその免疫学的成分、および適切な担体を含むワクチンを提供する。典型的には 、糖蛋白質りはＨＳＶ−２由来のものである。担体は水中油型エマルジョン、ま たはミョウバン（＾ｌｕｍ）であってもよく、３Ｄ−ＭＰＬが用量当たり１０マ イクログラムから１００マイクログラム、好ましくは２５から５０マイクログラ ムの範囲で存在し、抗原は単位用量中典型的には２から５０マイクログラムの範 囲で存在する。

３Ｄ−ＭＰＬはイギリス特許第２２２０２１１号（ＲＩＢＩ）に記載された方法 にしたがって得ることができる。

本発明の具体例は１〜３０６個の天然の糖蛋白質に膜アンカー領域を欠く截形蛋 白質のＣ末端にアスパラギンおよびグルタミンを添加したアミノ酸を含む３０８ 個のアミノ酸の截形Ｈ５Ｉ２糖蛋白質りである。蛋白質のこの形態はシグナルペ プチドを含み、これは開裂して２８３個の成熟アミノ酸蛋白質が得られる。

チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるこのような蛋白質の産生はジエネンテ イック（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）のヨーロッパ特許ＥＰ−Ｂ−１３９４１７号に記載 されている。

成熟截形蛋白質は、好ましくは、本発明のワクチン製剤において用いられ、ｒｇ Ｄ２ｔで示される。

Ｈ８Ｖ抗原は化学的に、あるいは別の方法で粒状担体に結合していてもよい。

特に好ましい方法はＢ型肝炎表面抗原の表面に位置する遊離スルフィドリル基を 介して粒状Ｂ型肝炎表面抗原に化学的に結合するものである。係属しているイギ リス特許出願第９０２７６２３．９号参照。

本発明の処方物は抗原量が非常に低くても（例えば、ｒｇＤ２ｔ　５マイクログ ラムのように低（でも）、防御免疫を誘起するのに非常に有効である。

該処方物は一次感染に対して優れた防御を提供し、特異的体液性（中和抗体）お よびエフェクター細胞性（ＤＴＨ）免疫応答の両方が有利に刺激される。

非毒性水中油型エマルジョンは、好ましくは、水性担体中、例えばスクアランま たはスクアレンなどの非毒仕始、ツイーン８０　（Ｔｗｅｅｎ　３Ｑ）などの乳 化剤を含有する。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であってもよい。

本発明は、さらなる態様において、本明細書中に記載するような医学的治療、特 に単純ヘルペスウィルス感染症の治療または予防に用いるワクチン製剤を提供す る。

本発明のワクチンは、免疫防御量のＨＳＶｇＤまたはその免疫学的フラグメント を含有し、これは常套手段により調製される。

ワクチン調製物は、一般に、「ワクチンの新傾向と開発（Ｎｅｗ　Ｔｒｅｎｄｓ 　ａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）　Ｊ　、ボラ− （Ｖｏｌｌｅｒ）ら編、ユニバージティー０バーク・プレス（Ｌｌｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ）　、ボルチモア、メリーランド州、　Ｕ、Ｓ、 Ａ。

１９７８に記載されている。リポソーム中への封入は、例えば、フラートン（Ｆ ｕｌｌｅｒｔｏｎ）　、アメリカ合衆国特許第４，２３５，８７７号に記載され ている。

蛋白質の巨大分子との結合は、例えば、リックハイド（Ｌｉｋｈｉｔｅ）　、ア メリカ合衆国特許第４．３７２．９４５号およびアーマ−（＾ｒｍｏｒ）ら、ア メリカ合衆国特許第４．４７４．７５７号に記載されている。

各ワクチン用量中の蛋白質の量は、典型的ワクチンにおいて著しい副作用を起こ すことなく免疫防御応答を誘起する量として選択される。このような量は、用い る特異免疫原に依存する。一般に、各用量は、１〜１０００マイクログラム、好 ましくは２〜１００マイクログラム、最も好ましくは４〜４０マイクログラムの 蛋白賀を含むと考えられる。特定のワクチンに対する最適量は抗体価および対象 における他の応答の観察を含めた標準的研究により確かめることができる。初回 接種の後、約４週間内に対象は追加免疫を受けてもよい。

Ｈ５Ｖ感染症にかかりやすい個人の予防接種に加え、本発明の医薬組成物はＨ８ ｖ感染症にかかっている患者の免疫療法に用いることができる。

本発明のさらなる態様において、本明細書に述べるような製造法が提供され、こ の方法は、Ｈ８Ｉ２糖蛋白質りまたは免疫学的フラグメントを担体、例えば水中 油型エマルジョンまたはミョウバン、および３Ｄ−ＭＰＬと混合することかこの 研究において、単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）２型由来の組み換え糖蛋白質Ｄ 　（ｒｇＤ２ｔ）の防御免疫を向上させる数種のアジュバントの能力をモルモッ トモデルにおいて評価した。試験したアジュバントは水酸化アルミニウム、３デ アシルーモノホスホリルリピツドＡと結合した水酸化アルミニウム、および水中 油型エマルジョン中にプリバーされた３デアシルーモノホスホリルリビツドＡで ある。

１、抗原の記載 Ｈ８ＶｒｇＤ２ｔは、トランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣（ ＣＨＯ）細胞中で産生じた遺伝子操作した組み換え体裁形糖蛋白質である（ヨー ロッパ特許第０１３９４１７号）。

２　抗原−アジュバント調製物および免疫化スケジュールモルモットモデルにお いて数種のｒｇＤ２を処方物の防御免疫を評価するために２種の別の実験を行っ た。第一の実験において、モルモットの群を以下に記載するようにして調製した ４種のアジュバント処方物中少量の抗原（ｒｇＤ＝ｔ　５マイクログラム）で３ 回免疫化した。最後の免疫化の２週間後、ＨＳＶ２型を用いて膣内に抗原投与し て一次および再発性ＨＳＶ２症の発生をモニターした。第二の実験においては、 これらの処方物をもっと大きな動物群においてさらに評価した。

抗原量およびアジュバント組成物などのこれらの処方物の効力に影響する因子も 試験した。

２．１．抗原−アジュバント調製物 第一の実験において、以下のアジュバント調製物を用いてモルモットを免疫化し た。各投与量（５マイクログラム）を０．２５１１の容量で投与した。

２、１．１．　ｒｇＤ２ｔ／ミョウバン（水酸化アルミニウム）ミョウバンは５ ｕｐｅｒｆｏｓ　（＾ｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、（Ｂｏｅｈｉｍｔｅ）　Ｓｕｐｅｒ ｆｏｓＳＤｅｎｍａｒｋ）から入手した。５マイクログラムの精製ｒｇＤ２ｔを ４℃にて０．２５■１の１５０ｍＭＮａＣ１１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８ ）中０．２５ｍｇ当量のＡｌｌ＋に対応する水酸化アルミニウム（ミョウバン） 上に一夜吸着させた。

２、１．２．　ｒｇＤ２ｔ／水酸化アルミニウム＋３Ｄ−ＭＰＬ３Ｄ−ＭＰＬは Ｒｉｂｉ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、から入手した 。２．１．１に記載したように５マイクログラムのｇＤ、ｔをミョウバン上に一 夜吸着させた後、アジュバント調製物を遠心分離して、その上清を除去した。つ いで１００マイクログラムの３Ｄ−ＭＰＬを含有する等容量の吸着緩衝液をミョ ウバン結合のｒｇＤ、ｔに添加した。

両方のｒｇＤ２ｔ／Ａｌｕｍ調製物に関して、９８％以上のｒｇＤ２ｔが水酸化 アルミニウムアジュバント中に取り込まれているのが判明した。

２、１．３．　ｒｇＤ２ｔ／水中油型エマルジョン（Ｒ）中の３Ｄ−ＭＰＬスク アレン油および０．０８％Ｔｗｅｅｎ　８０に添加した１２％Ｗ／Ｖレシチンを 用いて水中油型エマルジョンを調製した。３Ｄ−ＭＰＬを最終の望ましい濃度よ り１００倍高い濃度で添加した。ついで、１％のこの調製物を、水性相中、５マ イクログラムのｒｇＤ２ｔと０．２５＋ａｌ容量中で混合して１００マイクログ ラムの３Ｄ−ＭＰＬを含有する１％水中油型エマルジョンを得た。

上記のようにして調製した同様のアジュバント調製物で異なる量のｒｇＤ、ｔお よび／または免疫促進物質を含有するものを第二の実験において用いた。これを 合計量０．５ｍｌ投与した。これらの処方物を以下に記載する。

ｒｇＤｔｔ／Ａｌｕ１１：投与量領５＋１あたり５または２０マイクログラムの ｒｇＤｌｔ；０．５ｍｇ当量のＡＩ” ｒｇＤ２ｔ／Ａ１ｕｍ＋　３　Ｄ−ＭＰ　Ｌ　：投与量Ｑ、５ｍｌ当たり５また は２０マイクログラムのｒｇＤ２ｔ　；　０．５ｍｇ当量のＡｌ”；　５０フイ クログラムの３Ｄ−ＭＰＬｒｇＤｔｔ１０／ｗ型エマルジョン（Ｒ）中の３Ｄ− ＭＰＬ：５または２０マイクログラムのｒｇＤ２ｔを前記（２，１，３）のよう にして１％Ｏ／　Ｗ型エマルジョン中で配合する。投与量Ｑ、５ｍｌは１％Ｏ／ Ｗ型乳剤中、５マイクログラムまたは２０マイクログラムのｒｇＤ２ｔ、　５０ マイクログラムの３Ｄ−ＭＰＬを含有する。

ｒｇＤｚｔ１０／ｗ型エマルジョン（Ｓ）中の３Ｄ−ＭＰＬ・以下のようにして ビヒクルを調製する２０．４％（ｖ　／　ｖ　）　Ｔｖｅｅｎ８０を含有するリ ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に５％（ｖ　／　ｖ　）　Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｌ １２１および１０％スクアランを添加し、得られた混合物をマイクロフルイダイ ザ−（Ｍ／１１０型、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ　Ｃａｒｐ、　）で１０回流 動化して、得られた混合物がミクロン以下の粒子のみを含むようにする。５０マ イクログラムの３Ｄ−ＭＰＬを次にエマルジョンに添加する。３Ｄ−ＭＰＬを含 有する１容量のこのエマルジョンを当容積の２倍に濃縮した抗原と混合し、簡単 に撹拌して成分が完全に混合されるようにする。最終調製物は投与量０゜５ｍｌ 当たり領２％　Ｔｗｅｅｎ８０．２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｌ１２１．５％ス クアラン、５０マイクログラムの３Ｄ−ＭＰＬおよび５マイクログラムまたは２ ０マイクログラムのｒｇＤ２ｔを含有する。

２．２．免疫スケジュール 雌のハートレーモルモット群（２００〜２５０グラム）を４種の異なるアジュバ ント処方物中に配合した５マイクログラムのｒｇＤ２ｔを用いて０．２８および ９５日目の３回免疫化した。

免疫化は０．２５ｆｆｉｌの用量を皮下注射することにより行った。対照動物は 同様の方法でアジュバントのみを用いて注射するかまたは処理しなかった。

種々の群を以下のようにして免疫化した：第１群（４匹）：５マイクログラムの ｒｇＤ＊ｔ１０／ｗ型エマルジョン（Ｒ）中の３Ｄ−ＭＰＬ　（１００マイクロ グラム）第２群（４匹）：５マイクログラムのｒｇＤ　Ｉｔ／Ａ１ｕｍ＋　３　 Ｄ−Ｍ　Ｐ　Ｌ　（１００マイクログラム） 第３群（４匹）＝５マイクログラムのｒｇＤ　Ｉｔ／Ａｌｕｍ第４群（５匹）： Ａｌｕｍのみ 第５群（５匹）：　３Ｄ−ＭＰＬ　（１００マイクログラム）のみ第６群（８匹 ）：処理せず 以下に記載するようなＥＬＩＳＡおよび中和検定による抗体決定のために被験動 物を２週間ごとに採血した。

異なる処方物も遅延型過敏性応答の誘起により測定されるＴ細胞性免疫を誘起す る能力に関して試験した。異なるｒｇＤｌを処方物により誘起される体液性およ び細胞性免疫応答の評価に用いたリードアウトを以下に記載する。

ｒｇＤｌを処方物により誘起される防御免疫を比較するために、全てのモルモッ トを１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＨＳＶ２、ＭＳ株を最終免疫化の２週 間後に膣内投与した。被験動物を毎日急性感染症の徴候および再発性ヘルペスの 形跡に関して観察した。膣スワブサンプルをウィルス投与の５日後に回収し、感 染性ウィルスに関して滴定した。

モルモットの膣内モデルの詳細を以下に記載する。

第二の実験において、以下のｒｇＤ２を処方物の免疫原性を、もつと大きな動物 群で評価した。２種の抗原量を比較しく５および２０マクロダラム）、異なった アジュバント組成物を試験した。５０マイクログラムの３ＤＭＰＬを用いて、そ の効果を予め用いた１００マイクログラムの用量と比較した。

雌のハートレーモルモットの群を以下のように、１．２８および８４日目で３回 免疫化した： 第１群（８匹）・２０マイクログラムのｒｇＤ２ｔ／３Ｄ−ＭＰＬ　（５０フイ クログラム）０／Ｗ型エマルジヨン（Ｒ） 第１Ｉ群（８匹）＝５マイクログラムのｒｇＤｚｔ／３Ｄ−ＭＰＬ　（５０フイ クログラム）ｏ／ｗ型エマルジョン（Ｒ） 第１ＩＩ群（１０匹）：２０フイクログラムのｒｇＤｘｔ／３Ｄ−ＭＰＬ　（５ ０マイクログラム）Ｏ／Ｗ型エマルジョン（Ｓ）第１Ｖ群（１０匹）：５マイク ログラムのｒｇＤｚｔ／３Ｄ−ＭＰＬ　（５０マイクログラム）ｏ／ｗ型エマル ジョン（Ｓ） 第Ｖ群（１０匹）：２０ｖイクログラムのｒｇＤ２ｔ／Ａ１ｕｍ＋３ＤＭＰＬ　 （５０マイクログラム） 第ＶＩ群（１０匹）：５マイクログラムのｒｇＤｚｔ／＾１ｕ１１＋３　ＤＭＰ 　Ｌ　（５０マイクログラム） 第ＶＩＩ群（４匹）：＾ｌｕｍ＋　３　Ｄ−ＭＰ　Ｌ（５０マイクログラム）の み第ＶＩＩＩ群（４匹）：　３Ｄ−ＭＰＬ（５０フイクログラム）０／Ｗ型エマ ルジヨン（Ｒ）のみ 第１Ｘ群（８匹）：処理せず Ｑ、５＋ｎｌの用量で免疫化した。対照群は同様の方法で、アジュバントのみを 用いて免疫化するか（第ＶＩＩ群および第ＶＩＩＩ群）または処理しなかった（ 第１Ｘ群）。

最終群（第Ｘ群）を０．２５ｍ１の用量中１００マイクログラムの３Ｄ−ＭＰＬ を含有するｒｇＤ、ｔ　＾１ｕｗ＋　３　Ｄ−Ｍ　Ｐ　Ｌ処方物を用いて最初の 予防実験において記載した方法にしたがって免疫化した。

第Ｘ群（１０匹）＝５マイクログラムのｒｇＤ２ｔ／＾ｌｕｍ＋　３　ＤＭＰ　 Ｌ　（１００ｍｇ）以下に記載するようなＥＬＩＳＡおよび中和検定による抗体 決定のために被験動物を２週間ごとに採血した。２回目の免疫化の後、膣内洗浄 物を集め、ｇＤ２を特異性全体的抗体（ＩｇＧクラスの抗ｇＤ　２を抗体）の存 在に関して検定した。モルモットに１０５ｐｆｕのＨ３Ｖ２（ＭＳ株）を最終免 疫化の２週間後に膣内投与した。抗原投与後、被験動物を毎日急性感染症の徴候 （抗原投与の４〜１２日後）および再発性ヘルペス症の形跡（抗原投与の１３〜 ３９日後）に関してモニターした。

ｒｇＤ、を処方物の接種により誘起される特異抗体および細胞性応答を評価する ために数種のリードアウトを設定した。これらの処方物の防御値をモルモット膣 内モデルにおいて評価した。

３、　ｌ、　ＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡは、モルモット血清および膣洗浄物においてコーティング抗体として ｒｇＤ２ｔを用いてｇＤ−特異性抗体を検出し、定量することを目的とする。

３、１．１．血清中のｒｇＤ２を特異性ＩｇＧ抗体の検出抗原および抗体溶液を 各ウェルにつき５０マイクロリツトル用いた。抗原をＰＢＳ中最中漬終濃度１マ イクログラム／ａ＋１釈し、９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓ ｏｒｐ　Ｉｍｍｕｎｏ−Ｐｌａｔｅ、　Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルに ４℃にて一夜吸着させた。ウェルを次にＰＢＳ　Ｔｗｅｅｎ　０．１％（洗浄緩 衝液）を用いて５回洗浄し、１％牛血清アルブミン、４％新生仔ウシ血清および ０．１％Ｔｖｅｅｎ　（飽和緩衝液）を含有するＰＢＳを用いて３７℃にて１時 間培養した。飽和緩衝液中３倍希釈の血清（１／１００希釈から始める）をｒｇ Ｄ２ｔをコートしたウェルに添加し、室温にて２時間培養した。プレートを前記 のようにして洗浄し、飽和緩衝液中１／３０００に希釈したビオチン複合ヒツジ 抗モルモットＩｇＧ　（ＩｇＧ１およびＩｇＧ　２特異性、５ｅｒｏｔｅｃ、　 ５ｏｐａｒ　ＢｉｏｃｈｅｍＳＢｅｌｇｉｕｇｌ）を各ウェルに添加し、１時間 ３０分３７°Ｃにて培養した。洗浄段階の後、飽和緩衝液中１／１０００に希釈 したストレプタビンンービオチニル化ペルオキシダーゼ複合体（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ、イギリス）を添加し、３７℃にて３０分間培養した。プレートを前記のよう にして洗浄し、Ｏ−フェニｌ／ンジアミン（Ｓｉｇｍａ）　０．０４％Ｈ２Ｏ２ ０，０３％の１１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４，５）中溶液とともに培養した。

Ｈ，ＳＯ４２Ｍを添加することにより１５分後に着色反応を停止させ、吸光度は ４９２ｎｍで読み取る。

Ｅｌ、ＩＳＡ価を吸光度（最大吸光度の５０％に等しい４９２ｎｍで測定した光 学密度（中点力価））を与える血清希釈度の逆数と定義する。

ＥＬＩＳＡ価をコンピュータープログラムを用いた４変数直線回帰分析により計 算する。

３．１．２、膣洗浄物におけるｒｇＤ２を特異性ＩｇＧ抗体の検出膜洗浄物を以 下のようにしてＥＬＩＳＡによりまずその総ＩｇＧ含量に関して校正する。Ｍａ ｘｉｓｏｒｐ　Ｉｍｍｕｎｏプレートを一夜４℃にて１マイクログラム／ｍ１（ ５０マイクロリツトル／ウエル）のＰＢＳ中に希釈した精製ヤギ抗モルモットＩ ｇＧ　（Ｓｉｇｍａ。

Ｂｅ１ｇ１＋ｍ）でコートする。プレートを洗浄し、前記のように飽和緩衝液と 共に培養する。膣洗浄液を飽和緩衝液中２倍希釈液（１／１００希釈度で始める ）で連続希釈し、プレートに添加する。精製モルモットＩｇＧの標準曲線は各プ レート中に包含される（２倍希釈１１００ｎ／ｍｌ濃度から始める）。

室温で２時間インキ、ベーションした後、プレートを前記のようにして洗浄し、 飽和緩衝液中１／１０００に希釈したモルモットＩｇＧ　１およびＩｇＧ　２　 （Ｓｅｒｏｔｅｃ。

５ｏｐａｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　Ｂｅｌｇｉｕｍ）に関して特異的なビオチン 複合ヒツジ抗体を各ウェルに添加し、３７℃にて１時間３０分インキュベーショ ンする。次の工程（ストレプタビジンービオチニル化ベルオキソダーゼ複合体の 添加および発色）は前記（３，１，１，）のとおりである。

膣洗浄物中に存在する総ＩｇＧ濃度をＩｇＧ標準曲線から、コンピュータープロ グラムを用いた４変数単一直線回帰分析によりめる。

総ＩｇＧ含量の校正の後、抗ｇＤ抗体血清定量に関して記載したのと同じＥＬＩ ＳＡを用いてｒｇＤ２ｔに関して特異的なＩｇＧ抗体の存在に関して膣洗浄物を 試験する。結果を、０．５マイクログラム／ｍｌ総ＩｇＧ当たりの４９２ｎｍで 測定した光学密度９６ウエル型中和検定は以下のようにして行う。

試験するサンプルの連続２倍希釈物を９６ウエルプレート（各ウェルにつき２５ ｕｌの各血清希釈物、二重反復試験）中にて直接調製する。４０００ｐｆｕのウ ィルスＨＧ５２および補体（ウェル中最終希釈度１／１００）を含有する混合物 ５０マイクロリツトルを各ウェルに添加する。プレートを３７℃にて１時間イン キュベーションする。４Ｘ１０５細胞／ｍｌの１００マイクロリツトルのＢＫＨ ２１細胞懸濁液を次に各ウェルに添加する（４Ｘ１０４細胞／畦）。プレートを １００Ｑ　ｒｐｍで５分間遠心分離し、７％ＣＯ２の存在下で３７℃にて５日間 インキュベーションする。

この後、培養物を静かに除去し、１００マイクロリツトルのクリスタルバイオレ ット溶液（１０％メタノール、９０％Ｈ，Ｏ１０，３％クリスタルバイオレッｌ −）を各ウェルに添加し、室温にて２０分間インキュベーションする。次にプレ ートを水道水でよく洗浄する。プラークの存在は、顕微鏡により容易に観察でき る。

中和価はウィルスプラークが観察されないような（１００％細胞変性効果の防止 ）最高血清希釈度で測定する。この時点で完全な細胞変性効果（１００％の細胞 単層溶解）が対照ウェルで観察されることに留意することが重要である。

３．３．遅延型過敏性（ＤＴＨ） 異なるｒｇＤ２を処方物もその遅延型過敏性応答の誘起として測定されるＴ細胞 特異性免疫応答を誘起する能力について試験した。

第一の実験用に処方したアジュバント処方物をこの研究において用いた。この調 製物は０．２５ｍ１あたり５マイクログラムのｒｇＤ２ｔを含有する。免疫化ス ケジュールは以下のとおりである。−次免疫化：０．２５ｍ１のワクチン製剤を 筋肉的投与、追加免疫＋０．２５ｍ１のワクチン製剤を２１日後に筋肉的投与： 皮膚試験：５マイクログラムのｒｇＤ２ｔを８日後に陵内投与（食塩水中）。モ ルモットはすべて対照として食塩水で皮膚試験した。

加えて、対照モルモット（非免疫化動物）をｒｇＤ２ｔで皮膚試験した。皮肉注 射した部位の紅斑および硬結を２４および４８時間後にモニターした。

３．４６モモルモット膣内モデ ル３Ｖ生殖器感染症に関するモルモットモデルはエル・アール・スタンバリーる 。

簡単には、最終免疫化の２週間後、モルモットに１０５ｐｆｕ（７）ＨＳ　Ｖ　 ２　ＭＳ株を膣内点滴注入して投与する。−次感染の臨床的過程を抗原投与後１ ２日間外生殖器皮膚病巣の発生率および程度を毎日観察することによりモニター する。

膣スワブをウィルス投与の５日後に回収し、以下に記載するようにプラーク検定 により感染性ＨＳＶ２を滴定する。ついで、動物を１３から６０日まで毎日再発 性ヘルペス病巣の形跡について調べる。外生殖器皮膚のヘルペス病巣を、０から ４までの病巣評点スケールを用いて定量化する（０＝病巣または赤みがない：０ ．５＝赤くなっている；１＝水庖；１．５＝４個以上の水痘；２＝大きな水痘： ２．５＝２の水痘の癒合によって出来た数個の大きな水痘；３＝水庖の大きさお よび数が増加；３．５＝生殖器皮膚の表面が全部病巣で覆われる；４＝浸軟を伴 う潰瘍化病巣）。

異なるｒｇＤ２ｔワクチンにより得られる防御の程度を以下に定義する基準にし たがって評価する。

原発病に対する防御（０〜１２日） 次のような病巣が見られたら動物は防御されなかったと見做すニーあらゆる時点 で１以上の赤い部分がある場合ニー少なくとも連続して３日間同じ部分に１個の 赤い部分が存続する場合（病巣評点０．５）； 一１個又は数個の水＠（病巣評点≧１）。

再発病に対する防御（１３〜６０日） 連続して少なくとも２日間病巣評点が０．５点を記録するかまたは１日でも病巣 評点が≧１の場合、動物は再発病に関して陽性と評価した。再発病のエピソード の前後は病巣又は赤みはない。

動物に関して病巣の程度を一次感染の期間（１〜１２日）巾測定された評点の合 計として計算する。病巣の発生は、観察期間（１〜１２日（原発病）または１３ 〜６０日（再発病））中、１以上の病巣を示す動物の数を示す。

膣スワブをウィルス投与の５日後に回収する。膣円蓋を予め２％牛脂仔血清、２ ｍＭＬグルタミン、１００　Ｕ／ｍｌペニシリン、１００マイクログラム／閣１ ストレプトマイシン、１００マイクログラム／ｍｌゲンタマイシンおよび１マイ クログラム／ｗ＋１アムホテリシンＢを追加したＢａ５ａｌ　Ｅａｇｌｅ培地（ スワブ培地）で予め湿らせたアルギン酸カルシウムを付けたスワブでふく。

各スワブをほぐし、１ａｌのスワブ培地を含む滅菌１２Ｘ７５關　５■１ポリア ロマ−試験管中にいれる。試験管を次に撹拌してウィルスを取りだし、使用前ま で凍結させる。滴定の為に、５Ｘ１０’細胞／ウエルを入れた６ウエルの培養プ レートを一夜３７℃にてインキュベーションする。試験管を解凍してスワブ培地 中連続希釈のサンプルを調製する。６ウエル中の培地を除去した後、各サンプル 希釈液２００マイクロリツトルを細胞単層上二重反復試験物に移し、１時間３７ ℃に保つ。１．５％カルボキシメチルセルロースを含有する培地４ｍｌを各ウェ ルに添加する。次にプレートを３７℃にて２日間インキュベーションする。この インキュベーション期間の後、培地を静かに除去し、クリスタルバイオレットの 溶液（１０％メタノール、９０％ＨｔＯ１０，３％クリスタルバイオレット）１ ａｌを各ウェルに１５分間で添加する。プレートを次によくすすぎ、プラークを 計測する。

Ｈ３Ｖ２価をｐｆｕ／ｍｌで表わす。

４、結果 最初の実験においては、モルモットのグループを４種類の異なる処方物中に配合 した低用量の抗原（５マイクログラムのｒｇＤｚｔ）で免疫化した。この準最適 抗原量を選択して、膣内Ｈ３Ｖ２接種（予防試験）の前にモルモットに投与した 場合、原発および再発性）（ＳＶ病に対して防御を与えるより有効なｒｇＤ２ｔ アジュバントの組み合わせを選択する。

４．１１体液性免疫の誘起 第１表に示すように、ｒｇＤ２ｔ／＾ｌｕｍワクチンで免疫化した群に比べて免 疫促進物質として３Ｄ−ＭＰＬを含有するｒｇＤ２を処方物で予防接種した群は 血清中でより高いＥＬＩＳＡおよび中和価を示した。良好な平均中和価は、ｒｇ Ｄ　２ｔ　３　Ｄ−Ｍ　Ｐ　Ｌｏ／ｗ（Ｒ）またはｒｇＤｚｔ　Ａｌｕｍ　３Ｄ −ＭＰＬで３回免疫化した後に誘発される。

４．２．エフェクターＴ細胞応答（ＤＴＨ）誘起皮膚試験の結果（第２表）から 、３Ｄ−ＭＰＬ　ｏ／ｗ型エマルジョン中に配合したｒｇＤｚｔが最も強いＤＴ Ｈ応答を誘起することがわかる。特異的ＤＴＨ応答もｒｇＤｚｔ　Ａｌｕｍ　３ 　Ｄ−ＭＰ　Ｌにより誘起される。マウスにおいて行った同様の実験からも、Ａ １ｕｍ＋３　Ｄ−ＭＰ　Ｌと組み合わせたｒｇＤｚｔが、ｒｇＤ　２ｔ　Ａｌｕ ｍ処方物と対照的に、１ｎＶｉＶＯエフエクターＴ細胞応答を誘起するのに非常 に有効であることが判明した。

４．３．Ｈ８Ｖ原発病に関する予防接種の効果三回目の免疫化の２週間後、モル モットにＨ３Ｖ２を膣内投与する。−次Ｈ３Ｖ２感染症の臨床的およびウィルス 学的経路に関する予防接種の効果を第１図に示し、第３表に要約する。感染し、 急性原発病にかかった対照群（第４〜６群）に比べて、ｒｇＤｚｔ　３Ｄ−ＭＰ Ｌ　ｏ／ｗ処方物で予防接種した動物はすべ皮膚病巣の発生および程度によりモ ニターされるヘルペス病を示さなかった。さらには、これらの動物は抗原投与の ５日後での膣のウィルス力価により測定される原管中でウィルスの複製を示さな かった。ｒｇＤ２ｔ／Ａｌｕｍ　３Ｄ−ＭＰＬで予防接種した群において非常に よく似た結果が得られた。この群は観察期間中ヘルペス水庖が見られなかった（ 病巣評点く１）。さらには、採集した膣スワブ中でウィルスの複製はほとんど検 出されなかった。対照的にａｌｕｍ上に吸着されたｒｇＤ２を動物は余り防御さ れなかった（皮膚病巣発生率７５％）。

４．４．Ｈ５Ｖ再発症に関する予防接種の効果結果を第１図に示し、第４表に要 約する。

３Ｄ−ＭＰＬを含有するｒｇＤ２を処方物を用いた予防接種（第１および２群） により再発性ヘルペス病の発生は明らかに変化した。２つの群の再発エピソード および再発日数は対照またはｒｇＤｚｔ　Ａｌｕｍ処理群処理へて著しく少ない 。

３Ｄ−ＭＰＬを含有する予防的ｒｇＤ２ｔワクチンの効力に影響するファクター をさらに評価するために、さらに多数のモルモットについて第２の実験を行った 。

２種の抗原量（５および２０マイクログラム）を比較し、異なるアジュバント組 成物を試験した。３種の免疫化を０．２８および８４日に行った。動物は、ＥＬ ＩＳＡおよび中和検定による各抗体測定のために２週間毎に採血した。膣洗浄物 を二回目の免疫化の後に採集し、ｒｇＤ、ｔに関して特異的な全身性抗体の存在 について試験した。

体液性免疫の誘起 結果（第５表）から３Ｄ−ＭＰＬを含有するｒｇＤｌを処方物はすべてモルモッ トの血清において高いＥＬＩＳＡおよび中和価を刺激できることが判明した。

３回の免疫化の後に誘起されるＥＬＩＳＡおよび中和価の平均は、５マイクログ ラムまたは２０マイクログラムのｇＤ、ｔを含有するｒｇＤ、を処方物で予防接 種した群の血清におけるものと非常に似ている。５０マイクログラムの３Ｄ−Ｍ ＰＬ（第ＶＩ群）または１００ｍｇの３Ｄ−ＭＰＬ（第Ｘ群）を含有するｒｇＤ ｚｔ　Ａｌｕｍで免疫化した群（第Ｘ群）において測定される体液性応答におい て著しい差はなかった。

全身性抗ｒｇＤ２を抗体（ＩｇＧ　クラス）がすべての予防接種した群の膣洗浄 物中において検出できたことに留意することは重要である。この粘膜に存在する 抗ｒｇＤ２を抗体応答は、−次感染中、生殖路における感性ウィルスの負荷を減 少させることにより重要な防御の働きをする。

Ｈ５Ｖ原発病に関する予防接種の効果 三回目の免疫化の２週間後、モルモットにＨ３Ｖ２を膣内投与する。Ｈ８Ｖ２感 染症の臨床およびウィルス学的経路に関するワクチン投与の効果を第６表に要約 する。対照群に比べて、５０マイクログラムまたは１００マイクログラムのいず れかの３Ｄ−ＭＰＬを含有する５マイクログラムのｒｇＤｚｔ　Ａｌｕｍ　３　 Ｄ−ＭＰ　Ｌ処方物で予防接種した動物（第ｖＩおよびＸ群）は皮膚病巣の程度 および発生率が著しく低かった（ｐ＜０．０５）。

５マイクログラムの３Ｄ−ＭＰＬ　ｏ／ｗ型エマルジョン中のｒｇＤｚｔで予防 接種した群において非常によく似た結果が得られた（第１ＩＩ群）。予防接種し た３つの群において抗原投与の５日後に採集した膣のスワブ中でウィルスの複製 はほとんど検出されなかった。

Ｈ３Ｖ再発症に関するワクチン投与の効果結果を第６表に示す。対照群に比べて ３つの予防接種群において皮膚病の発生率および再発日数は著しく減少した（ｐ ＞０．０５）。これらの群は対照群よりも再発エピソードも少なかった。

５、結論 モルモットにおいて得られた結果から明らかに水中油型エマルジョン中に添加さ れた３Ｄ−ＭＰＬを含有するかまたは水酸化アルミニウムと結合したｒｇＤｌを 処方物を用いた予防接種はＨ３Ｖ２接種の前にモルモットに投与した場合、原発 および再発性ＨＳＶ２病に対しての防御を得るのに非常に有効であることがわか る。

このようなｒｇＤｚｔ３Ｄ−ＭＰＬ処方物は特異的体液性（中和抗体）およびエ フェクター細胞性（ＤＴＨ）免疫応答を向上させることができる。これらの結果 は少量（５マイクログラム）のｒｇＤ２ｔを用いて得られる。

ｒｇＤ２ｔ／＾ｌｕｍおよびｒｇＤ２ｔ／＾１ｕ１１３　Ｄ−Ｍ　Ｐ　Ｌワクチ ンの免疫原性をオナガザル（アフリカミドリザル、ＡＧＭ）において評価した。

３回の免疫化を０．１および３力月目に行った。特異的体液性（ＥＬＩＳＡおよ び中和力価）およびエフェクター細胞性（ＤＴＨ）免疫応答を測定した。

６、１．１．実験法 各処方物は用量当たり２０ωｇのｒｇＤ２ｔおよび０．５ｍｇ当量のＡＬ”を含 有する。

５０マイクログラムの３Ｄ−ＭＰＬを用いた。オナガザル（ＡＧＭ）の群を３回 ０．２８および８４日目に免疫化した。免疫化はり５ｍｌ　（２０ｔｇＤ２ｔ） を筋肉内投与して行った。ＥＬＩＳＡおよび中和検定による抗体測定のために動 物は±２週間ごとに採血した。２種の処方物も遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答の誘 起により測定されるそのＴ細胞性免疫を誘起する能力について試験した。サルの 腹に異なる量のｒｇＤ２ｔ（２０，５および１マイクログラム）の生理食塩水中 溶液を２回目の免疫化の１３日後に陵内投与した。動物は対照として生理食塩水 のみでも皮膚試験した。陵内注射部位の紅斑および硬結を２４時間後および４８ 時間後にモニタ予防接種以前は、サル血清はいずれも抗Ｈ３Ｖ２抗体活性を示さ なかった（データは示さない）。第７表に示すように、２回目の免疫化の後、両 方のワクチンにより良好なＥＬＩＳＡおよび中和価が誘起された。この抗体応答 後、ｒｇＤ２ｔ／＾ｌｕｍで予防接種したサルにおいて３回目の追加免疫はしな かった。対照的に、ｒｇＤ、ｔ／＾１＋ｍ３Ｄ−ＭＰＬで３回目の免疫化を行っ たサルではＥＬＩＳＡおよび中和抗体応答が増加した（平均ＥＬＩＳＡ価：１０ ０５６　、平均中和価：９５０）。

ｂ）　エフェクターＴ細胞応答（ＤＴＨ）の誘起皮膚試験の結果（第８表）から ｒｇＤ２ｔ＾ｌｕｍ処方物と異なり＾１ｕｍ＋　３　Ｄ−ＭＰ　Ｌと結合したｒ ｇＤ２ｔはｉｎ　ｖｉｖｏにてエフェクターＴ細胞応答の誘起において非常に有 効であることが判明した。２０ｍｇのｒｇＤ２ｔで皮膚試験した全てのｒｇＤ２ ｔ　Ａ１＋ｍ３Ｄ−ＭＰＬで予防接種した動物において強いＤＴＨ応答が観察さ れた。特異的ＤＴＨ応答も低濃度のｇＤ２ｔ（５および１マイクログラム）でサ ルの大部分において測定された（５マイクログラムでは３／４．１マイクログラ ムでは２／４）。

これらのｒｇＤｘｔ量は２０ｍｇのｒｇＤ２を濃度よりも弱い皮膚試験応答を誘 起した。

異なる量のｒｇＩｈｔ　（１００マイクログラム、１０マイクログラム、または ５マイクログラム）を含有するｒｇＤ２ｔ／＾ｌｕｍ　３Ｄ−ＭＰＬワクチンの 免疫原性をリーサスサルにおいて比較した。

６、２．１　衷−迭 各処方物は各用量中東５マイクログラム当量の＾１３４および５０マイクログラ ムの３Ｄ−ＭＰＬを含有する。３つのリーサスサルの群（１群につきサル４匹） を以下のようにして３回、０．２８および７７日目に免疫化した：第１群：１０ ０マイクログラムのｒｇＤ１ｔＡ１ｕｍ＋３Ｄ−ＭＰＬ　（５０マイクログラム ） 第２群＝２０マイクログラムのｒｇＩｈｔ　Ａｌｕｍ＋３　Ｄ−ＭＰ　Ｌ’　（ ５０マイクログラム） 第３群：５マイクログラムのｒｇＤ　２ｔ　Ａ１ｕｏ＋＋３　Ｄ−Ｍ　Ｐ　Ｌ　 （５０マイクログラム）免疫化は１ｍｌの用量を筋肉内投与した。ＥＬＩＳＡお よび中和検定による抗体測定のために動物は±２週間ごとに採血した。

６、２．２．体液性免疫の誘起 予防接種以前は、サル血清はいずれも抗Ｈ８Ｖ２抗体活性を示さなかった。１０ ０．２０および５ｍｇのｇＤ、ｔＡ１ｕｍ＋３Ｄ−ＭＰＬを接種した３つの予防 接種群において良好なＥＬＩＳＡおよび中和価が観察された（データは示さない ）。

６．３．精障 オナガザルにおいて得られた結果から明らかにＡｌｕｍおよび３Ｄ−ＭＰＬの組 み合わせを含有するｒｇＤ２ｔワクチンにより体液性（中和抗体）およびエフェ クター細胞性（ＤＴＨ）免疫応答が向上することがわかる。このワクチンと比べ て、ｒｇＤ、ｔ＾ｌｕｍ処方物は中和抗体を誘起するのに有効でな（、ｉｎ　ｖ ｉｖｏでのＤＴＨ応答を誘起することが出来ない。

リーサスサルにおいて得られた結果からも、ｒｇＤ　２ｔ　Ａ１ｕｍ＋　３　Ｄ −Ｍ　Ｐ　Ｌ処方物は少量の抗原量（ｒｇＤ２ｔ　５０マイクログラムまたは２ ０マイクログラム）であっても特異的体液性免疫を誘起するのに非常に有効であ ることがわかる。

７　総結論 モルモットにおいて得られた結果から明らかに水中油乳剤中に添加されたかまた は水酸化アルミニウムと結合した３Ｄ−ＭＰＬを含有するアジュバント処方物は 膣内モルモット抗原投与動物モデルにおいて少量の抗原量（ｒｇＤ２ｔ　５マイ クログラム）であっても組み換えＨ８Ｖ糖蛋白質ワクチンに関する防御免疫応答 を誘起するのに非常に有効であることがわかる。防御値からも、これらのｒｇＤ ２ｔ３Ｄ−ＭＰＬ処方物は防御を得るのにより有効であることがわかる。このよ うな３Ｄ−ＭＰＬ処方物は特異的体液性（中和抗体）およびエフェクター細胞性 （ＤＴＨ）免疫応答を向上させることができる。

さらには、ｒｇＤｘｔ　Ａｌｕｍ　３　Ｄ−ＭＰ　Ｌ処方物は抗体レベルで霊長 類において免疫原性を向上させ、エフェクターＴ細胞応答を誘起し、このことか ら、このアジュバント効果は小動物に限定されるのではないことがわかる。

抗原投与後の日数 □処理せず 一争一−ｒＧＤ２ｔ　３０ＭＰＬ　Ｏ／Ｗ国際調査報告 ＦｅｔｍＰＣＴｎＳｋｔ２＋Ｏ１ｓｕｎ−ｍｌ’ｍ１ｍ１・Ｐ＠４實１ｓｏａ− 糎１１国際調査報告 ＥＰ　９２００５９２ Ｓ＾　５７２２６ フロントページの続き （７２）発明者　スラウィ、モンセフ ベルギー国、べ−−１３３０リクセンザルト、リュ・ドユ・ランスティチュー８ ８９番（７２）発明者　ギヤルコンージョンソン、ナタリー・マリーージョセフ ・クロード ベルギー国、ベーー１３３０リクセンザルト、リュ・ドユ・ランスティテユート ８９番

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．３脱アシル化モノホスホルリピッドＡと結合したＨＳＶ糖蛋白質Ｄまたはそ の免疫フラグメントおよび適切な単体を含有するワクチン製剤。
2. ２．担体がミョウバンである請求項１記載のワクチン製剤。
3. ３．担体が水中油型エマルジョンである請求項２記載のワクチン製剤。
4. ４．糖蛋白質ＤがＨＳＶ−２糖蛋白質Ｄまたはその免疫フラグメントである請求 項１〜３記載のいずれか１つのワクチン製剤。
5. ５．糖蛋白質Ｄが截形蛋白質である請求項１〜４記載のいずれか１つのワクチン 製剤。
6. ６．截形蛋白質がＨＳＶｇＤ２であって、Ｃ末端アンカー領域を欠く請求項５記 載のワクチン製剤。
7. ７．糖蛋白質Ｄが粒状担体と結合している前記請求項のいずれか１つに記載のワ クチン製剤。
8. ８．３脱アシル化モノホスホルリピッドＡが用量あたり１０マイクログラム〜１ ００マイクログラムの範囲で存在する前記請求項のいずれか１つに記載のワクチ ン製剤。
9. ９．医薬に用いる前記請求項のいずれか１つに記載のワクチン製剤。
10. １０．ＨＨＳＶ感染症の予防または治療用医薬の製造における３脱アシル化モノ ホスホルリピッドＡと結合した糖蛋白質ｇＤまたはその免疫フラグメントの使用 。
11. １１．有効量の請求項１〜８のいずれか１つに記載のワクチンを投与することか らなる単純ヘルペス感染症にかかりやすいヒト患者の治療法。
12. １２．ＨＳＶ糖蛋白質Ｄまたはその免疫フラグメントを担体および３脱アシル化 モノホスホルリピッドＡと混合することからなる請求項１〜８に記載のワクチン の製造法。