CZ280505B6 - Vakcína proti herpes simplex, obsahující HSV glykoprotein D a 3-deacylovaný monofosforyllipid A - Google Patents
Vakcína proti herpes simplex, obsahující HSV glykoprotein D a 3-deacylovaný monofosforyllipid A Download PDFInfo
- Publication number
- CZ280505B6 CZ280505B6 CS931958A CS195893A CZ280505B6 CZ 280505 B6 CZ280505 B6 CZ 280505B6 CS 931958 A CS931958 A CS 931958A CS 195893 A CS195893 A CS 195893A CZ 280505 B6 CZ280505 B6 CZ 280505B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- rgd
- mpl
- alum
- micrograms
- vaccine
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Řešení se týká nové vakcíny proti herpex simplex, která obsahuje HSV glykoprotein D tohoto viru nebo jeho imunologicky fragment a jeko pomocný prostředek obsahuje 3-deacylovaný monofosforyllipid A. Vakcína je účinná jak při vyvolání humorální, tak i buněčně zprostředkované imunity a je možno ji použít k zábraně akutní i opakované infenkcí herpas simplex.ŕ
Description
Vakcína proti herpes simplex
Oblast techniky
Vynález se týká nové vakcíny proti viru herpes simplex, jakož i způsobu výroby této vakcíny, jde zejména o vakcínu proti infekci virem HSV-2.
Dosavadní stav techniky
HSV-2 je primární etiologický původce herpes genitalis a společně s HSV-1 (původce herpes labialis) je charakterizován schopností vyvolat akutní onemocnění a mimoto latentní infekci, primárně v neuronech ganglií.
Herpes genitalis se vyskytuje u přibližně 5 000 000 obyvatel USA, každý rok je zaznamenáno přibližně 500 000 případů ve formě primární i rekurentní infekce. K primární infekci typicky dochází po pubertě a je charakterizována místním bolestivým poškozením kůže, které trvá 2 až 3 týdny. V období 6 měsíců po primární infekci dojde u 50 % nemocných k opakování choroby. Přibližně u 25 % nemocných se může onemocnění opakovat 10 až 15x každý rok. U nemocných s malou reaktivitou imunologického systému je tato incidence statisticky významně vyšší než u normální populace.
Virus HSV-1 a HSV-2 má na povrchu řadu glykoproteinových složek. Tyto složky jsou označovány jako gA, gB, gC, gD, gE a podobně .
Glykoprotein D je uložen na virové membráně a nachází se také v cytoplasmě infikovaných buněk, jak bylo popsáno v Eisenberg R. J. a další, J. of Virol., 1980, 35, 428 až 435. Obsahuje 393 zbytků aminokyselin včetně signálního peptidu a má molekulovou hmotnost přibližně 60 000. Ze všech obalových glykoproteinů HSV je patrně nejlépe charakterizovanou sloučeninou, jak bylo popsáno v publikaci Cohen a další, J. Virology, 60, 157 až 166. Je známo, že in vivo hraje hlavní úlohu při spojení viru s buněčnou membránou. Bylo však prokázáno, že tato látka je in vivo schopna vyvolat tvorbu neutralizačních protilátek podle publikace Eing a další, J. Med. Virology, 127; 59 až 65. Latentní virus HSV-2 však může ještě být reaktivován a dochází tak k opakovanému onemocnění přes vysoký titr neutralizačních protilátek v krevním séru nemocného.
Schopnost vyvolat tvorbu neutralizačních protilátek není sama o sobě dostatečná k potlačení onemocnění. Aby bylo možno zabránit opakovanému onemocnění, musela by vakcína nejen stimulovat tvorbu neutralizačních protilátek, ale také vznik buněčné imunity, zprostředkované T-buňkami. Vynález si klade za úkol takovou vakcínu navrhnout.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří vakcína proti herpes simplex, obsahující HSV glykoprotein D nebo jeho imunologický fragment ve spojeni s 3-o-deacylovaným monofosforyllipidem A (3D-MPL) a vhodným nosičem. Glykoprotein D bude v typických případech pocházet z HSV
-1CZ 280505 B6
-2. Nosičem může být emulze typu olej ve vodě nebo alum, 3D-MPL se bude ve vakcíně nacházet v rozmezí 10 až 100, s výhodou 25 až 50 mikrogramů na jednu dávku, typické množství antigenu v jedné dávce bude v rozmezí 2 až 50 mikrogramů.
Imunologický fragment je část molekuly, která je zkrácena od jednoho z obou konců, od obou konců nebo může chybět střední část molekuly, avšak imunologická účinnost původní molekuly zůstává zachována.
3D-MPL je možno získat způsobem podle britského patentového spisu č. 2 220 211 (RIBI).
V jednom z provedení vynálezu se vynález týká zkráceného HSV-2 glykoproteinu D s obsahem 308 aminokyselin, který obsahuje přírodní glykoprotein v rozmezí aminokyselin 1 až 306 s aminokyselinami asparaginem a glutaminem na C terminálním konci zkrácené bílkoviny, zbavené oblasti pro zakotvení v buněčné membráně. Tato forma bílkoviny zahrnuje signální peptid, po jeho odštěpení se získá bílkovina, obsahující 283 zbytků aminokyselin. Výroba této bílkoviny ve vaječníkových buňkách čínského křečka byla popsána v Evropském patentovém spisu č. 139 417 (Genentech).
Tato bílkovina je potom výhodným materiálem pro použití ve vakcíně podle vynálezu a je označována rgD2t.
Antigen HSV je možno konjugovat s částicovým nosičem chemicky nebo jiným způsobem. Zvláště výhodná je chemická vazba na částicový povrchový antigen viru hepatitidy B přes volné sulfhydrylové skupiny, uložené na povrchu antigenu hepatitidy B. Postup byl popsán v britské patentové přihlášce č. 9027623.9.
Vakcína podle vynálezu je velmi účinná pro vyvolání imunity, a to i při použití velmi nízkých dávek antigenu, například pouze 5 mikrogramů rgD2t.
Je možno dosáhnout velmi dobré ochrany proti primární infekci, podporována je jak specifická humorální odpověď za tvorby neutralizačních protilátek, tak také imunologická odpověď, zprostředkovaná efektorovými buňkami (DTH).
Netoxická emulze oleje ve vodě s výhodou obsahuje netoxický olej, například squalan nebo squalen a emulgátor, například Tween 80 ve vodném nosiči. Vodným nosičem může být například roztok chloridu sodného s obsahem fosfátového pufru.
Vakcína podle vynálezu je tedy určena k prevenci i léčení infekcí, které byly způsobeny virem herpes simplex.
Vakcína podle vynálezu obsahuje imunoprotektivní množství HSV gD nebo jeho imunologického fragmentu a je možno ji připravit běžnými postupy.
Obecná příprava vakcín byla popsána v publikaci New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Zapouzdření do liposomů bylo popsáno například v US patentovém spisu č. 4 235 877 (Fullerton). Konjugace bílkovin na makromolekuly byla popsána napří
-2CZ 280505 B6 klad v US patentových spisech č. 4 372 945 (Likhite) a 4 474 757 (Armor a další).
Množství bílkoviny v každé dávce vakcíny se volí jako to množství, které je schopné vyvolat imunoprotektivní odpověd’ bez významných nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství se bude měnit v závislosti na specifické použité imunogenní látce. Obvykle se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1 000, s výhodou 2 až 100 a zvláště 4 až 40 mikrogramů. Optimální množství pro určitou vakcínu je možno ověřit běžnými pokusy, které zahrnují sledování titru protilátek a dalších odpovědí. Po počáteční vakcinaci je možno další vakcinaci opakovat po čtyřech týdnech.
Kromě vakcinace osob, vystavených infekci HSV je možno farmaceutické prostředky podle vynálezu použít také k imunotherapeutickému léčení nemocných, kteří trpí infekcí HSV.
Vynález se také týká způsobu výroby vakcíny, který spočívá ve smísení HSV-2 glykoproteinu D nebo jeho imunologického fragmentu s nosičem, například emulzí typu olej ve vodě nebo prostředkem alum a 3D-MPL. Srovnání účinnosti pomocných prostředků ve vakcíně s obsahem rgD viru herpes simplex.
Při těchto pokusech byla na morčeti sledována schopnost různých pomocných prostředků zlepšit ochranný účinek vakcíny, obsahující rekombinantní glykoprotein D z viru herpes simplex (HSV) typ 2 (rgD2t). Zkoušenými pomocnými prostředky byly hydroxid hlinitý, hydroxid hlinitý v kombinaci s 3-deacylmonofosforyllipidem A a 3-deacylmonofosforyllipid A v emulzi typu olej ve vodě.
1. Popis antigenu
HSV rgD2t je geneticky zkonstruovaný rekombinantní omezený glykoprotein, který je produkován vaječníkovými buňkami čínského křečka CHO po transfekci způsobem podle Evropského patentového spisu č. 139 417.
2. Prostředky s obsahem antigenu a pomocného prostředku a způsob imunizace.
Byly provedeny dva oddělené pokusy k vyhodnocení ochranného účinku několika prostředků s obsahem rgD2t na morčeti. Při prvním pokusu byly skupiny morčat třikrát imunizovány při použití nízké dávky antigenu 5 mikrogramů rgD2t ve 4 prostředcích s obsahem pomocných prostředků, připravených dále popsaným způsobem. Dva týdny po poslední imunizaci byla zvířata intravaginálně infikována virem HSV typ 2 a potom denně sledována na vývoj primárního a opakovaného onemocnění HSV2. V průběhu druhého pokusu byly tytéž prostředky znovu vyhodnoceny na větších skupinách zvířat. Byly zkoumány také faktory, které mohou ovlivnit účinnost těchto prostředků, jako dávka antigenu a složení pomocného prostředku.
-3CZ 280505 B6
2.1. Prostředky s obsahem antigenu a pomocného prostředku
V prvním pokusu byla morčata imunizována následujícími prostředky s obsahem pomocných prostředků. Každá dávka 5 mikrogramů byla podána v objemu 0,25 ml.
2.1.1. rgD2t/alum (hydroxid hlinitý)
Alum byl získán od firmy Superfos (Alhydrogel, Boehimte Superfos, Dánsko). Množství 5 mikrogramů čištěného rgD2t bylo adsorbováno přes noc při teplotě 4 °C na hydroxid hlinitý (alum) v množství, odpovídajícím 0,25 mg Al3+ v 0,25 ml 150 mM NaCl v 10 mM fosfátovém pufru o pH 6,8.
2.1.2. rgD2t/hydroxid hlinitý + 3D-MPL
3D-MPL byl získán od Ribi Immunochem Research lne. Po adsorpci 5 mikrogramů gD2t přes noc na alum způsobem podle předchozího odstavce byl prostředek odstředěn a supernatant byl odstraněn. Potom bylo k rgD2t na prostředku alum přidáno stejné množství adsorpčního pufru s obsahem 100 mikrogramů 3D-MPL.
V případě obou prostředků, obsahujících rgD2t/alum bylo prokázáno, že více než 98 % antigenu bylo vázáno na hydroxid hlinitý.
2.1.3. rgD2t/3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě (R)
Emulze olej ve vodě byla připravena při použití 12 g lecithinu na 100 ml oleje squalenu a 0,08 % Tween 80. 3D-MPL byl přidán ve lOOx vyšší koncentraci než byla výsledná požadovaná koncentrace. Potom bylo 1 % tohoto materiálu smíseno v objemu 0,25 ml s 5 mikgrogramy rgD2t ve vodné fázi, čímž vznikla jednoprocentní emulze oleje ve vodě, obsahující 100 mikrogramů 3D-MPL.
Ve druhém pokusu byly použity podobné prostředky s obsahem pomocných prostředků, tyto prostředky obsahovaly různá množství rgD2t a/nebo pomocného imunostimulačního prostředku. Tyto prostředky, které budou dále popsány, byly podány v celkovém objemu 0,5 ml.
rgD2t/alum: Prostředek obsahoval 5 nebo 20 mikrogramů rgD2t a 0,5 mg ekvivalentu AI v objemu 0,5 ml.
rgD2t/alum + 3D-MPL: 5 nebo 20 mikrogramů rgD2t, 0,5 mg ekvivalentu Al+3 a 50 mikrogramů 3D-MPL v objemu 0,5 ml.
rgD2t/3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě (R): 5 nebo 20 mikrogramů rgD2t bylo smíseno na 1% emulzi typu olej ve vodě, způsobem, podle odstavce 2.1.3. Dávka 0,5 ml obsahovala 5 nebo 20 mikrogramů rgD2t, 50 mikrogramů 3D-MPL v 1% emulzi typu olej ve vodě.
-4CZ 280505 B6 rgD2t/3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě (S): Nosné prostředí bylo připraveno následujícím způsobem:
Roztok chloridu sodného s fosfátovým pufrem (PBS) s obsahem 0,4 % objemového Tween 80 se smísí s roztokem Pluronic LI21 s koncentrací 5 % objemových a s 10 % squalanu a výsledná směs se nechá lOx projít mikrofluidisačním zařízením (Model M/110, Microfluidics Corp.), takže výsledná emulze obsahuje pouze částice menší než 1 mikrometr. Potom se k emulzi přidá 50 mikrogramů 3D-MPL. Jeden objem této emulze s obsahem 3D-MPL se smísí se stejným objemem 2x koncentrovaného antigenu a směs se krátce promíchá k dosažení úplného smísení složek. Výsledný prostředek je tvořen 0,2 % Tween 80, 2,5 % Pluronic L121, 5 % squalanu a obsahuje 50 mikrogramů 3D-MPL a 5 nebo 20 mikrogramů rgD2t v dávce 0,5 ml.
2.2. Způsob imunizace
Skupiny morčecích samic Hartley s hmotností 200 až 250 g byly třikrát imunizovány ve dnech 0, 28 a 95 dávkou 5 mikrogramů rgD2t, zpracovanou do čtyř od sebe odlišných prostředků s obsahem pomocných prostředků.
Imunizace byla provedena podkožně při použití injekčního objemu 0,25 ml. Kontrolní zvířata obdržela pouze pomocný prostředek nebo nebyla vůbec ošetřena.
Jednotlivé skupiny živočichů byly imunizovány následujícím
| způsobem: |
| skupina 1 (n = 4): 5 mikrogramů rgD2t/3D-MPL (100 mikrogramů) |
| v emulzi typu olej ve vodě (R) |
| skupina 2 (n = 4): 5 mikrogramů rgD2t/alum + 100 mikrogramů |
| 3D-MPL |
| skupina 3 (n = 4): 5 mikrogramů rgD2t/alum |
| skupina 4 (n = 5): pouze alum |
| skupina 5 (n = 5): pouze 100 mikrogramů 3D-MPL |
| skupina 6 (n = 8): neošetřená zvířata. |
Zvířatům byla odebrána krev každé dva týdny ke stanovení protilátek zkouškou ELISA a zkouškou na neutralizační protilátky tak, jak bude dále popsáno.
Různé prostředky byly také zkoušeny na svou schopnost vyvolat imunitu, zprostředkovanou T-buňkami, jak je možno vyhodnotit indukcí hypersensitivní odpovědi zpožděného typu. Dále budou popsány způsoby vyhodnocení humorální a buněčné imunologické odpovědi, vyvolané prostředky, obsahujícími antigen rgD2t.
-5CZ 280505 B6
Aby bylo možno srovnat ochranný účinek, vyvolaný různými prostředky s obsahem uvedeného antigenu, byla všechna morčata intravaginálně infikována 105 jednotek, vytvářejících plaky (pfu) viru HSV2, kmene MS, dva týdny po poslední imunizaci. Potom byla zvířata denně sledována na klinické příznaky akutní infekce i na opakované onemocnění. Vzorky byly odebírány pomocí tamponu ve dni 5 po infekci a titrovány na přítomnost infekčního viru.
Podrobný popis provedení těchto pokusů bude dále uveden.
Ve druhém pokusu byla vyhodnocena imunogenita dále uvedených prostředků s obsahem téhož antigenu na větších skupinách zvířat. Byly srovnávány dvě dávky antigenu 5 a 20 mikrogramů spolu s různými pomocnými prostředky. Byla užita dávka 50 mikrogramů 3D-MPL a její účinky byly srovnány s dávkou 100 mikrogramů téže látky z předchozích pokusů.
Skupiny morčecích samic Hartley byly třikrát imunizovány ve dnech 1, 28 a 84 při použití následujících prostředků:
skupina I (n = 8): 20 mikrogramů rgD2t/3D-MPL (50 mikrogramů v emulzi typu olej ve vodě (R) skupina II (n = 8): 5 mikrogramů rgD2t/3D-MPL (50 mikrogramů v emulzi typu olej ve vodě (R) skupina III (n = 10): 20 mikrogramů rgD2t/3D-MPL (50 mikrogramů) v emulzi typu olej ve vodě (S) skupina IV (n = 10): 5 mikrogramů rgD2t/3D-MPL (50 mikrogramů) v emulzi typu olej ve vodě (S) skupina V (n = 10): 20 mikrogramů rgD2t/alum + 3D-MPL (50 mikrogramů) skupina VI (n = 10): 5 mikrogramů rgD2t/alum + 3D-MPL (50 mikrogramů) skupina VII (n = 4): pouze alum + 3D-MPL (50 mikrogramů) skupina VIII (n = 4): pouze 3D-MPL (50 mikrogramů) v emulzi typu olej ve vodě (R) skupina IX (n = 8): bez ošetřeni.
Imunizace byla prováděna při použití objemu 0,5 ml. Zvířatům z kontrolní skupiny byl podán pouze pomocný prostředek (skupiny VII a VIII), u negativních kontrol nebyla zvířata vůbec ošetřena (skupina IX).
Poslední skupina (skupina X) byla imunizována při použití prostředku s obsahem gD2t/alum + 3D-MPL s obsahem 100 mikrogramů 3D-MPL v objemu 0,25 ml podle protokolu, popsaného při prvním pokusu.
-6CZ 280505 B6
Skupina X (n = 10): 5 mikrogramů rgD2t/Alum + 3D-MPL (100 mikrogramů ).
Zvířatům byla odebrána krev každé dva týdny pro stanovení protilátek zkouškou ELISA a pro stanovení neutralizačních protilátek dále popsaným způsobem. Vaginální výplachy byly provedeny po druhé imunizaci a zkoumány na přítomnost systemických protilátek, specifických proti gD2t (protilátky gD2t ze skupiny IgG). Potom byla morčata dva týdny po poslední imunizaci vystavena intravaginálně působení 105 pfu HSV2 (kmen MS). Potom byla morčata denně sledována, aby bylo možno rozeznat okamžitě případné klinické příznaky akutní infekce ve dnech 4 až 12 po pokusné infekci nebo opakovaného onemocnění ve dnech 13 až 39 po infekci.
3. Stanovení výsledků
Výsledky byly vyhodnocovány několika způsoby tak, aby bylo možno vyhodnotit tvorbu specifických protilátek a buněčně zprostředkovanou odpověď, vyvolanou vakcinací podáním prostředku s obsahem rgD2t. Ochranná hodnota těchto prostředků byla stanovena při intravaginální infekci morčat.
3.1. ELISA
Zkouškou ELISA byly sledovány a kvantitativně stanoveny specifické protilátky proti gD v morčecím séru a v materiálu z vaginálních výplachů při použití rgD2t jako antigenu v povlakovém materiálu.
3.1.1. Detekce protilátek typu IgG, specifických pro rgD2t v krevním séru
Roztoky antigenu a protilátky byly užity v množství 50 mikrolitrů na jedno vyhloubení. Antigen byl zředěn na konečnou koncentraci 1 mikrogram/ml v PBS a byl adsorbován přes noc při teplotě 4 °C do vyhloubení mikrotitrační plotny, obsahující 96 vyhloubení (Maxisorp Immuno-plate, Nunc, Dánsko). Potom byla vyhloubení pětkrát promyta 0,1% prostředkem Tween v PBS (promývací pufr) a inkubována jednu hodinu při teplotě 37 °C v PBS, obsahujícím 1 % sérového albuminu skotu, 4 % séra novorozených telat a 0,1 % prostředku Tween (saturační pufr). Potom se přidá vždy trojnásobné ředění séra (od výchozího ředění 1/100) v saturačním pufru do každého vyhloubení, opatřeného povlakem rgD2t a plotna se inkubuje 2 hodiny při teplotě místnosti. Potom se plotny omyjí stejně jako shora a přidá se kozí IgG proti morčecím tkáním (specifické IgGl a IgG2, Serotec, Sopar Biochem, Belgie) v ředění 1 : 3 000 v saturačním pufru do každého vyhloubení a plotna se inkubuje 1 hodinu a 30 minut při teplotě 37 °C. Po dalším omytí se přidá komplex streptavidinu a biotinylované peroxidázy (Amersham, UK) v ředění 1/1 000 v saturačním pufru a směs se inkubuje 30 minut při teplotě 37 °C. Potom se plotny omyjí stejné jako shora a inkubují s roztokem 0,04 % o-fenylendiaminu (Sigma) a 0,03 % H2O2 v 0,1 M citrátovém pufru o pH 4,5.
Barevná reakce se zastaví po 15 minutách přidáním 2 M kyseliny sírové a absorbance se odečítá při 492 nm.
-7CZ 280505 B6
Titr ELISA se definuje jako převrácená hodnota toho ředění séra, které vyvolá absorbanci (optickou hustotu, měřenou při 492 nm) rovnou 50 % maximální hodnoty absorbance (střední titr).
Titr ELISA byl vypočítán z analýzy lineárních regresí na základě čtyř parametrů při použití počítačového programu.
3.1.2. Detekce protilátek typu IgG, specifických pro rgD2t v materiálu vaginálních výplachů
Vaginální výplachy byly nejprve kalibrovány na celkový obsah IgG zkouškou ELISA následujícím způsobem. Imunologické plotny Maxisorp byly přes noc povlečeny při teplotě 4 °C povlakem čištěného kozího IgG proti morčecím tkáním v koncentraci 1 mikrogram/ml a v množství 50 mikrolitrů na vyhloubení, protilátka byla ředěna PBS (Sigma, Belgie). Potom byly plotny omyty a inkubovány se saturačním pufrem stejně jako shora. Výplachy byly sériově ředěny vždy dvakrát od výchozího ředění 1/100 saturačním pufrem a potom byly přidávány do jednotlivých vyhloubení ploten. Obdobným způsobem byl přidán také čištěný IgG morčete (Sigma, Belgie) ve vždy dvojnásobném ředění, počínaje od ředění 100 ng/ml.
Po 2 hodinách inkubace při teplotě místnosti se plotny promyjí a do každého vyhloubení se přidá s biotinem konjugovaná ovčí protilátka, specifická proti morčecímu IgGl a IgG2 (Setotec, Sopar Biochem, Belgie), v ředění 1/1 000 v saturačním pufru a směs se inkubuje 1 hodinu a 30 minut při teplotě 37 °C. Následující stupně, to znamená přidáním komplexu streptavidinu a biotinylované peroxidázy a barevná reakce se provádějí stejně jako v odstavci 3.1.1.
Koncentrace celkového IgG ve vaginálním výplachů se stanoví na základě standardní křivky pro IgG pomocí počítačového programu na základě nelineární analýzy regresí na podkladě čtyř parametrů.
Po stanovení celkového obsahu IgG se vaginální výplachy zkoumají na přítomnost IgG protilátek, specifických pro rgD2t při použití téže zkoušky ELISA, která byla popsána pro kvantitativní stanovení protilátky proti gD v krevním séru. Výsledky jsou vyjádřeny jako optická hustota, měřená při 492 nm při koncentraci 0,5 mikrogramů/ml celkového IgG.
3.2. Zkouška na neutralizační protilátky
Tato zkouška byla prováděna na plotnách s 96 vyhloubeními následujícím způsobem:
Série vždy dvojnásobného ředění se připraví přímo v plotnách s 96 vyhloubeními (25 mikrolitrů každého ředění séra v jednom vyhloubení ve dvojím opakování). Potom se do každého vyhloubení přidá 50 mikrolitrů směsi, obsahující 4 000 pfu viru HG52 a komplement v konečném ředění 1/100. Potom se plotny inkubují 1 hodinu při teplotě 37 °C. Potom se do každého vyhloubení přidá 100 . 5 mikrolitrů buněčné suspenze buněk BHK s množstvím 4 x 10 buněk/ml, to znamená celkem 4 χ 104 buněk na jedno vyhloubení.
-8CZ 280505 B6
Potom se plotny odstředí 5 minut při 1 000 ot/min a inkubují 5 dnů při teplotě 37 °C v přítomnosti 7 % CO2.
Po této době se živné prostředí opatrně odstraní a do každého vyhloubení se přidá 100 mikrolitrů roztoku krystalové violeti, obsahující 10 % methanolu, 90 % vody a 0,3 % krystalové violeti a směs se inkubuje 20 minut při teplotě místnosti. Potom se plotny důkladně promyjí vodou z vodovodu. Přítomnost plaků je možno snadno sledovat mikroskopickým pozorováním.
Titr neutralizačních protilátek je definován jako převrácená hodnota největšího zředění séra, při němž ještě není možno pozorovat žádné plaky viru (100% ochrana proti cytopathogennímu účinku). Je důležité uvést, že v této době je možno v kontrolních vyhloubeních již pozorovat úplný cytopathogenní účinek, to znamená 100% rozrušení souvislé vrstvy buněk.
3.3. Hypersensitivita zpožděného typu (DTH)
Různé prostředky s obsahem rgD2t byly také zkoušeny na svou schopnost vyvolat specifickou imunologickou odpověď T-buněk, měřenou vyvoláním hypersensitivní odpovědí zpožděného typu.
K pokusům byly užity prostředky s obsahem pomocných prostředků tak, jak byly připraveny pro první pokus. Tyto prostředky obsahovaly 5 mikrogramů rgD2t v 0,25 ml. Imunizace byla provedena tak, že při první imunizaci bylo podáno nitrosvalově 0,25 ml vakcíny a při následující imunizaci bylo po 21 dnech podáno dalších 0,25 ml vakcíny, opět nitrosvalově. Při kožní zkoušce bylo po dalších 8 dnech intradermálné podáno 5 mikrogramů rgD2t ve fyziologickém roztoku chloridu sodného. Všem morčatům byl v kontrolním pokusu nitrokožně podán roztok chloridu sodného.
Mimoto byl proveden kožní test s rgD2t také u kontrolních, neimunizovaných zvířat. Zčervenání a zatvrdnutí v místě nitrokožní injekce bylo odečítáno po 24 a 48 hodinách.
3.4. Intravaginální model infekce u morčete
Morčecí model pro genitální infekci virem HSV byl popsán v publikaci L. R. Stanberry a další, J. of Infectious Diseases 1982, 146:397-403, Intervirology 1985, 24:226-231.
Postupuje se tak, že se morčatům dva týdny po poslední imunizaci podá intravaginálné 105 pfu viru HSV2, kmene MS. Klinický průběh primární infekce se denně sleduje a zaznamenává se výskyt a závažnost zevního poškození kůže genitální oblasti v průběhu 12 dnů po nanesení viru.
Vaginální výplachy se shromažďují od 5 dne po nanesení viru a titrují se na přítomnost infekčního HSV2 na základě tvorby plaků, jak bude dále popsáno. Zvířata se denně sledují ke zjištění opakované infekce mezi dnem 13 až 60. Herpetické poškození kůže zevního genitálu se hodnotí kvantitativně při použití škály 0 až 4 (0 = bez poškození, nebo pouze zarudnutí, 0,5 = zarudnutí,
-9CZ 280505 B6 = jeden puchýřek, 1,5 = až 4 malé puchýřky, 2 = větší puchýřky, 2,5 = několik větších puchýřků, vzniklých spojením puchýřků ze stupně 2, 3 = zvýšený počet i rozměr puchýřků, 3,5 = puchýřky, pokrývající celý povrch kůže genitálu a 4 = zvředovatělé puchýřky s mokváním).
Stupeň ochrany, kterou je možno zajistit různými očkovacími látkami s obsahem rgD2t byl vyhodnocen podle následujících kriterií .
Ochrana proti primárnímu onemocnění, dny 0 až 12
Na nedostatek ochrany bylo usuzováno při přítomnosti následujícího poškození kůže:
- více než jedna oblast zčervenání v kterémkoliv období,
- jedna oblast zčervenání, přetrvávající v tomtéž místě po dobu alespoň tří následujících dnů (hodnocení 0,5),
- jeden nebo několik puchýřků (hodnocení 1 nebo vyšší).
Ochrana proti opakovanému onemocnění, dny 13 až 60
Positivní opakované onemocnění bylo uváděno v případě, že bylo nutno zaznamenat hodnoceni 0,5 alespoň ve dvou po sobě následujících dnech nebo v případě, že bylo kterýkoliv den pozorováno hodnocení 1 nebo vyšší. Toto opakované onemocnění musí být předcházeno alespoň jedním dnem bez jakéhokoliv poškození nebo zarudnutí a takovým dnem také následován.
Závažnost poškození se vypočítá jako součet hodnocení v průběhu primární infekce ve dnech 1 až 12. Incidence poškození představuje počet zvířat s poškozením 1 nebo vyšší v průběhu primárního onemocnění ve dnech 1 až 12 nebo opakovaného onemocnění ve dnech 13 až 60.
3.5. Tritace viru ve vaginálním výplachu
Vaginální výplachy byly shromažďovány pátého dne po nanesení viru. Poševní klenba byla otřena tamponem, opatřeným povlakem alginátu vápenatého a předem zvlhčením Eaglovým základním prostředím, doplněným dvěma procenty fetálního telecího séra, 2 mM L-glutaminu, 100 jednotek penicilinu/ml, 100 mikrogramů streptomycinu/ml, 100 mikrogramů gentamycinu/ml a 1 mikrogram amphotericinu B/ml (prostředí pro vaginální výplach.
Každý tampon byl rozrušen a uložen do sterilní zkumavky s rozměrem 12 x 75 mm a s obsahem 5 ml, zkumavka obsahovala 1 ml prostředí pro vaginální výplach. Potom byly zkumavky promíchány, aby se virus dostal do kapalného prostředí a zmrazený až do použití. Při titraci byly plotny se šesti vyhloubeními s obsahem x 105 buněk/vyhloubení inkubovány přes noc při teplotě 37 ’C. Potom byly zkumavky rozmraženy a bylo připraveno sériové ředění vzorků v pufru pro vaginální výplachy. Po odstranění živného prostředí ze šesti vyhloubení bylo přeneseno na souvislé vrstvy buněk ve dvojím provedení vždy 200 mikrolitrů každého ředění a plotny byly inkubovány ještě 1 hodinu při teplotě 37 °C. Potom byly do každého vyhloubení přidány 4 ml živného prostředí s obsahem 1,5 % karboxymethylcelulosy. Potom byly plotny inkubovány dva
-10CZ 280505 B6 dny při teplotě 37 °C. Po této době inkubace bylo prostředí opatrně odstraněno a do každého vyhloubení byl na 15 minut přidán 1 ml roztoku krystalové violety s obsahem 10 % methanolu, 90 % vody a 0,3 % krystalové violety. Potom byly plotny důkladně opláchnuty a byly spočítány plaky. Titr HSV2 byl vyjádřen ve formě pfu/ml.
4. Výsledky
V první skupině pokusů byly skupiny morčat imunizovány nízkou dávkou antigenu 5 mikrogramů rgD2t ve formě čtyř od sebe odlišných prostředků. Tato suboptimální dávka antigenu byla zvolena z toho důvodu, aby bylo možno vybrat účinnější kombinaci rgD2t a pomocného prostředku, kterou by bylo možno dosáhnout u morčat ochrany proti primární i opakované infekci HSV v případě, že očkovací látka se podá před naočkováním HSV2 intravaginálně (profylaktický účinek).
4.1. Vyvolání humorální imunity
Jak je zřejmé z tabulky 1, měly skupiny zvířat, očkované prostředky s obsahem rgD2t a 3D-MPL jako imunostimulačního pomocného prostředku vyšší titry ELISA i neutralizačních protilátek v krevním séru než skupiny, imunizované kombinací rgD2t/alum. Dobré střední neutralizační titry byly vyvolány po třech imunizacích při použití rgD2t/3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě (R) nebo při použití kombinace rgD2t/Alum s přídavkem 3D-MPL.
4.2. Vyvolání odpovědi efektorových T-buněk (DTH)
Výsledky kožních testů, shrnuté v tabulce 2 prokazují, že nej silnější odpověd’ typu DTH je možno vyvolat při použití rgD2t a 3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě. Specifickou odpověď DTH je možno vyvolat také při použití rgD2t/Alum v přítomnosti 3D-MPL. Obdobné pokusy, které byly provedeny na myších také potvrdily, že rgD2t v kombinaci s pomocnými prostředky Alum a 3D-MPL je velmi účinný při vyvolání odpovědi efektorových T-buněk in vivo na rozdíl od očkovací látky typu rgD2t/Alum, která není dostatečně účinná .
4.3. Účinek očkování na primární onemocnění HSV
Dva týdny po třetí imunizaci byl do pochvy morčat vnesen virus HSV2. Účinek očkování na klinický a virologický průběh primární infekce HSV2 je znázorněn na obr. 1 a shrnut v tabulce 3. Kontrolní skupiny 4 až 6 byly infikovány a došlo u nich k akutnímu primárnímu onemocnění, zatímco u 100 % zvířat, očkovaných kombinací rgD2t/3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě nedošlo k žádné tvorbě oparu, jak je možno potvrdit sledováním výskytu kožního poškození a jeho závažnosti. Mimoto nedošlo u těchto zvířat ani k replikaci viru v pochvě, jak bylo stanoveno titrací viru v poševním výplachu pátého dne po infekci. Velmi podobné výsledky byly získány také u skupiny, která byla očkována pomocí rgD2t/Alum
-11CZ 280505 B6 s přidáním 3D-MPL. Ani u této skupiny se nevyvinuly oparové puchýřky v průběhu pozorování. Došlo však k malé replikaci viru ve vaginálním výplachu, přestože celkové hodnocení poškození kůže bylo nižší než 1. U zvířat, očkovaných pomocí rgD2t/Alum bylo možno v 75 % pozorovat výskyt kožního poškození.
4.4. Vliv očkování na opakované onemocnění HSV
Výsledky tohoto očkování jsou znázorněny na obr. 1 a shrnuty v tabulce 4.
Očkování pomocí rgD2t/3D-MPL (skupiny 1 a 2) podstatně mění častost výskytu opakovaného onemocnění. U obou skupin bylo možno pozorovat statisticky významné snížení množství opakovaných infekcí a kratší dobu jejich trvání než u kontrolních skupin nebo u skupin, které byly očkovány prostředkem, obsahujícím rgD2t/Alum.
Aby bylo možno dále vyhodnotit faktory, které mají vliv na účinnost profylaktického použití vakcín s obsahem rgD2t a 3D-MPL jako pomocného prostředku, byla provedena druhá řada pokusů při použití většího počtu morčat.
Byly srovnávány dvě dávky antigenu 5 a 20 mikrogramů a různé pomocné prostředky. Byly provedeny tři imunizace ve dnech 0, 28 a 84. Zvířatům byla každé dva týdny odebrána krev pro stanoveni protilátek zkouškou ELISA a stanovení neutralizačních protilátek. Po druhé imunizaci byly provedeny také vaginální výplachy, které byly sledovány na přítomnost systemických protilátek, specifických pro rgD2t.
Vyvolání humorální imunity
Výsledky, které jsou uvedeny v tabulce 5 prokazují, že všechny prostředky, obsahující rgD2t v kombinaci s 3D-MPL jsou schopné vyvolat tvorbu vysoké odpovědi při zkoušce ELISA i vysokou tvorbu neutralizačních protilátek v morčecím krevním séru.
Střední titry ELISA a titry neutralizačních protilátek po trojím očkování jsou velmi podobné titrům pro skupiny, které byly očkovány prostředkem s obsahem 5 nebo 20 mikrogramů gD2t. Není možno pozorovat žádný statisticky významný rozdíl v humorální odpovědi pro skupiny, imunizované vakcinou rgD2t/Alum s obsahem 50 mikrogramů 3D-MPL (skupina VI) nebo 100 mg 3D-MPL (skupina X).
Je zajímavé, že bylo možno prokázat systemické protilátky proti rgD2t ze skupiny IgG ve výplaších z pochvy u všech očkovacích skupin. Tato odpověď, spočívající ve tvorbě protilátek proti RgD2t ve sliznici může hrát důležitou ochrannou úlohu při snížení zátěže infikujícím virem v průběhu primární infekce genitálu.
Účinek vakcinace na primární onemocnění HSV
Dva týdny po třetí imunizaci byl intravaginálně nanesen u morčat virus HSV2. Účinek vakcinace na klinický a virologický
-12CZ 280505 B6 průběh primární infekce HSV2 je shrnut v tabulce 6. Ve srovnání s kontrolami bylo možno u zvířat, očkovaných prostředkem s obsahem 5 mikrogramů rgD2t/Alum a 3D-MPL s obsahem 50 nebo 100 mikrogramů 3D-MPL (skupiny VI a X) podstatné snížení (p menší než 0,05) závažnosti kožního poškození a také nižší výskyt kožních projevů onemocnění.
Velmi podobné výsledky bylo možno pozorovat také u skupiny, očkované 5 mikrogramy rgD2t v emulzi typu olej ve vodě s obsahem 3D-MPL (skupina III). U tří očkovaných skupin bylo možno pozorovat velmi nízkou replikaci viru ve výplachu z pochev 5 dnů po nanesení viru.
Účinek očkování na opakované onemocnění HSV
Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6. Ve srovnání s kontrolní skupinou byl výskyt kožního poškození a počet dnů trvání tohoto onemocnění statisticky významně (p > 0,05) u všech tří očkovaných skupin. Tyto skupiny měly také nižší výskyt opakovaných onemocnění než kontrolní skupiny.
5. Závěry
Výsledky, získané u morčat jasně prokazují, že očkování prostředky s obsahem rgD2t a 3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě nebo v kombinaci s hydroxidem hlinitým je velmi účinné pro dosažení ochrany proti primárnímu i opakovanému onemocnění HSV2 v případě, že se morčata očkují před naočkováním viru HSV2. Tyto prostředky mohou zvýšit tvorbu neutralizačních protilátek i imunologickou odpověd', zprostředkovanou efektorovými buňkami (DTH). Těchto výsledků je možno dosáhnout při použití nízké dávky 5 mikrogramů rgD2t.
6. Imunogenita prostředků s obsahem gD2t u primátů
6.1. Srovnání imunogenity prostředku s obsahem rgD2t/Alum a rgD2t/ Alum s obsahem 3D-MPL
Imunogenita rgD2t/Alum a rgD2t/Alum s obsahem 3D-MPL byla vyhodnocena na opicích Cercopithecus aethiops (africká zelená opice, AGM). Bylo provedeno trojí očkování v měsících 0, 1 a 3. Specifická humorální odpověď (ELISA a neutralizační titr) byla vyhodnocena spolu s imunologickou odpovědí, zprostředkovanou efektorovými buňkami (DTH).
6.1.1. Provedení pokusu
Každá očkovací látka obsahovala 20 mg rgD2t a ekvivalent 0,5 mg Al+3 v jedné dávce. Bylo užito vždy 50 mikrogramů 3D-MPL. Skupiny opic AGM byly imunizovány třikrát ve dnech 0, 28 a 84. Očkování bylo provedeno nitrosvalově v dávce 0,5 ml (20 mg rgD2t). Zvířatům byla odebrána krev každé dva týdny na stanovení protilátek zkouškou ELISA a na stanovení neutralizačních protilátek. Obě očkovací látky byly také zkoušeny na svou schopnost vyvolat imunitu, zprostředkovanou T-buňkami, při měření hypersensi
-13CZ 280505 B6 tivity opožděného typu (DTH). Opicím byly podány intradermálně do kůže břicha různé dávky rgD2t 20, 5 a 1 mikrogram) ve fyziologickém roztoku chloridu sodného 13 dnů po druhé imunizaci. Byly také provedeny kožní zkoušky pouze s fyziologickým roztokem. Zarudnutí a zatvrdnutí v tomto místě bylo sledováno po 24 a po 48 hodinách.
6.1.2. Výsledky
a) Vyvolání humorální imunity
Před očkováním nebylo možno prokázat v krevním séru opic žádné protilátky proti HSV2 (údaje nejsou uvedeny). Jak je možno pozorovat z tabulky 7, bylo možno vyvolat očkování po druhé imunizaci dobré titry při zkoušce ELISA i v případě neutralizačních protilátek. Tato tvorba protilátek již nebyla zvýšena třetím očkováním v případě opic, očkovaných kombinací rgD2t/Alum. Naproti tomu u opic, které byly potřetí očkovány kombinací rgD2t/Alum s 3D-MPL došlo ke zvýšení titru ELISA i titru neutralizačních protilátek, střední titr ELISA: 10056, střední titr neutralizačních protilátek byl 950.
b) Vyvolání odpovědi efektorových T-buněk (DTH)
Výsledky kožních zkoušek, které jsou uvedeny v tabulce 8 prokazují, že rgD2t v kombinaci s Alum a s 3D-MPL je velmi účinným prostředkem pro vyvoláni odpovědi efektorových T-buněk in vivo ve srovnání s očkovací látkou, která obsahuje rgD2T/Alum. U všech zvířat, očkovaných očkovací látkou s obsahem rgD2t/Alum a 3D-MPL bylo možno pozorovat silnou odpověd’ DTH u všech zvířat, jimž bylo při testu podáno 20 mg rgD,t. Specifické odpovědi DTH byly také měřeny při podání nižších koncentrací 5 a 1 mikrogram gD2t u většiny opic (3 ze 4 pro dávku 5 mikrogramů a 2 ze 4 pro dávku 1 mikrogram). Tyto dávky vyvolaly slabší kožní odpověď než dávka 20 mg rgD2t. (
6.2. Imunogenita kombinace rgD2t/Alum s 3D-MPL u opic Rhesus
Imunogenita uvedených vakcín, obsahujících různé dávky 100, 10 nebo 5 mikrogramů rgD2t byla srovnána.
6.2.1. Provedení pokusu
Každý očkovací materiál obsahoval v jedné dávce 0,5 mikrogramů ekvivalentu Al+3 a 50 mikrogramů 3D-MPL. Tři skupiny opic Rhesus po 4 opicích ve skupině byly třikrát imunizovány ve dnech 0, 28 a 77 následujícím způsobem:
skupina 1: 100 mikrogramů rgD2t/Alum plus 3D-MPL (50 μg) skupina 2: 20 mikrogramů rgD2t/Alum plus 3D-MPL (50 μg) skupina 3: 5 mikrogramů rgD2t/Alum plus 3D-MPL (50 μg).
-14CZ 280505 B6
Imunizace byla provedena nitrosvalově v dávce 1 ml. Zvířatům byla odebrána krev každé dva týdny pro stanovení protilátek zkouškou ELISA a pro stanovení neutralizačních protilátek.
6.2.2. Vyvolání humorální imunity
Před vakcinací nebylo možno prokázat v krevním séru žádné opice protilátky proti HSV2. Bylo možno pozorovat dobré titry ELISA a titry neutralizačních protilátek u všech tří očkovaných skupin, kterým bylo podáno 100, 20 a 5 mikrogramů rgD2t spolu s pomocným prostředkem Alum + 3D-MPL. Údaje nejsou uvedeny.
6.3. Závěry
Výsledky, které byly získány v případě Cercopithecus aethiops jasně ukazují, že očkovací látka s obsahem rgD2t a kombinací Alum + 3D-MPL podstatně zvyšuje jak humorální odpověď, spočívající ve tvorbě neutralizačních protilátek, tak specifickou odpověď, zprostředkovanou efektorovými buňkami (DTH). Ve srovnání s tímto očkovacím materiálem je vakcína, obsahující jako pomocný prostředek pouze Alum méně účinná při vyvolání tvorby neutralizačních protilátek a není vůbec schopna vyvolat in vivo odpověď typu DTH.
Výsledky, získané u opic Rhesus také prokazují, že vakcína, obsahující rgD2t/Alum + 3D-MPL je velmi účinná při vyvolání specifické humorální odpovědi i při nízkých dávkách 5 nebo 20 mikrogramů antigenu rgD2t.
7. Obecné závěry
Výsledky, získané na morčatech jasné prokazují, že očkovací látky, které obsahují jako pomocný prostředek 3D-MPL v emulzi typu olej ve vodě, popřípadě ještě v kombinaci s hydroxidem hlinitým jsou velmi účinné při vyvolání imunologické odpovědi v přítomnosti rekombinantního glykoproteinu HSV, jak je možno prokázat při intravaginální pokusné infekci morčat, a to i při použití nízkých dávek 5 mikrogramů antigenu. Je také možno prokázat, že očkovací látky, obsahující rgD2t spolu s 3D-MPL jsou účinnější při poskytování ochranného účinku. Jsou schopné zlepšit jak specifickou humorální odpověď, tvořenou neutralizačními protilátkami, tak odpověď, zprostředkovanou efektorovými buňkami (DTH).
Mimoto bylo prokázáno, že uvedené očkovací látky zlepšují tvorbu protilátek i imunitu, zprostředkovanou efektorovými T-buňkami u primátů, takže je zřejmé, že pomocný účinek není omezen pouze na malá zvířata.
-15CZ 280505 B6
Tabulka 1
Protilátky proti HSV v látkou s obsahem rgD2t krevním séru morčat imunizovaných očkovací před a po pokusné infekci virem
| skupina | vakcína | před pokusnou infekcí^ | po pokusné infekci3) | |||
| antigen | pomocný prostředek | titr ELISA | titr neutralizačních protilátek | titr ELISA | titr neutralizačních protilátek | |
| 1 | rgD2t | 3D-MPL o/w(R) | 81291+20822 | 1600 | 68720+24648 | 2200+765 |
| 2 | rgD2t | Alum 3D-MPL | 39897+30165 | 2000+800 | 27224+13093 | 1800+765 |
| 3 | rgD2t | Alum | 20346+23704 | 600+400 | 28622+24024 | 1333+461 |
| 4 | - | Alum | < 100 | < 50 | 737+878 | 142+85 |
| 5 | - | 3D-MPL | < 100 | < 50 | 250+244 | 1275+1304 |
| 6 | - | - | < 100 | < 50 | 225+194 | 119+141 |
*·) Dávka rgD2t = 5 mikrogramů. Zvířata byla imunizována třikrát ve dnech 0, 28 a 95, potom byla po dvou týdnech infikována 105 pfu HSV2.
2' Krevní sérum bylo odebráno den před infekcí, 14 dnú po třetí imunizaci.
3' Krevní sérum bylo odebráno dva týdny po pokusné infekci.
Hodnoty jsou uvedeny jako aritmetický průměr titru ± střední chyba .
o/w = emulze olej ve vodě.
-16CZ 280505 B6
Tabulka 2
Výsledky kožního testu DTH u očkovaných morčat s použitím rgD2t
| očkovací látka | morče č. | hodnocení za 24 h. | hodnocení za 48 h. | ||
| E(mm) | I (mm) | E(nun) | I (mm) | ||
| rgD2t 3D-MPL o/w(R) | 1 | 20 | 15 | 14 | 10(N) |
| 2 | 15 | 10 | 10 | 3 | |
| 3 | 20 | 17(N) | 15 | 12(N) | |
| rgD2t Alum 3D-MPL | 1 | 10 | 8 | 10 | 4 |
| 2 | 15 | 12 | 12 | '3 | |
| 3 | 11 | 9 | 12 | 0 | |
| Almu + 3D-MPL | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| neošetřeno | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Morčata byla imunizována ve dnech 0 až 21 vždy 5 μg rgD2t nitrosvalově, potom bylo podáno nitrokožně 5 μg rgD2t ve fyziologickém roztoku ve dni 29. Odečet po 24 a 48 hodinách.
E = zarudnutí v mm, I = zatvrdnutí v mm, N = nekrosa o/w = emulse olej ve vodě
-17CZ 280505 B6
Tabulka 3
Vliv imunizace pomocí rgD2t na klinický a virologický průběh primární infekce HSV2 u morčat
| skupina | vakcína^ | výskyt kožního poškození^ | závažnost kožního poškození3) | titr viru ve výplachu pochvy^ | |
| antigen | pomocný prostředek | ||||
| 1 | rgD2t | 3D-MPL o/w(R) | 0/4 | 0,1+0,3 | 0 |
| 2 | rgD2Í | Alum-3D-MPL | 0/4 | 1 + 0,4 | 6,25+12,4 |
| 3 | rgD2t | Alum | 3/4 | 4,4+2,7 | 3575+6010 |
| 4 | - | Alum | 5/5 | 6,2+2,6 | 5216+6295 |
| 5 | - | 3D-MPL | 4/5 | 5,1+3,6 | 3298+4475 |
| 6 | 0 | - | 7/8 | 7,3+4,7 | 2214+4519 |
-1 2 * 4·) Dávka rgD2t = 5 μg. Zvířata byla imunizována 3x ve dnech 0, a 95. Při pokusné infekci po dvou týdnech bylo užito 105 pfu HSV2.
2) Počet zvířat s hodnocením alespoň 1 v průběhu 12 dnů pozorování .
2) Součet hodnocení ve dnech 1 až 12, aritmetický průměr ± střední chyba.
4) Nejvyšší titr HSV v pfu/ml ve vaginálním výplachu 5 dnů po infekci .
o/w = emulze olej ve vodě.
-18CZ 280505 B6
Tabulka 4
Vliv imunizace pomocí rgD2t na opakovanou genitální infekci HSV2 u morčat.
období opakovaného onemocnění^ skupina
Vakcína^ antigen pomocný prostředek výskyt kožního poškození^ >
počet dnů opakování^
| 1 | rgD2t | 3D-MPL o/w(R) | 1/4 | 1 + 2 | 0,7+1,5 |
| 2 | rgD2t | Alum+3D-MPL | 2/4 | 1 + 0,8 | 1,7+3,5 |
| 3 | rgD2t | Alum | 3/3 | 4,3+1,5 | 8,3+5 |
| 4 | - | Alum | 4/5 | 3,8+3,3 | 7,6+6,5 |
| 5 | - | 3D-MPL | 5/5 | 2,6+1,1 | 6 + 4,4 |
| 6 | 0 | - | 6/8 | 3,5+2,2 | 9,9+ 6 |
Dávka rgD2t = 5 μς. Zvířata byla očkována 3x ve dnech 0, 28 a 95 a po dvou týdnech byla vystavena pokusné infekci 105 pfu HSV2.
) - - . .
' Počet zvířat s hodnocením alespoň 1 v prubehu dnu 13 až 60.
o \ ' Jedno období opakovaní je předchozeno i následováno dnem bez příznaků a charakterizováno alespoň dvěma dny se zarudnutím (hodnocení 0,5) nebo jedním dnem trvání puchýřků (hodnocení až 1). Výsledky jsou vyjádřeny jako aritmetický průměr ± střední chyba ve dnech 13 až 60.
Celkový počet dnů u zvířat s opakováním, aritmetický průměr ± střední chyba ve dnech 13 až 39.
o/w = emulze olej ve vodě.
-19CZ 280505 B6
Tabulka 5
Srovnání účinků různých pomocných prostředků na imunogenitu rgD2t u morčat
| vakcína^ | Protilátky proti HSV po dvou | titr protilátek po 3 imunizacích před infekcí v séru | |||||
| očkováních v séru | ve výplachu pochvy 5) | ||||||
| skup. | rgDjt | pomocný | titr | ||||
| dávka | prostředek | titr ELISA | neutr. | titr ELISA | titr. neutr. | ||
| I | 20 pg | 3DMPL (50pg) o/w (R) | 31462+9087 | 850+396 | 0.780+0.376 | 19958+10171 | 3400+1994 |
| II | 5 pg | 3DMPL (50pg) o/w (R) | 35015+14395 | 412+264 | 1.000+0.177 | 51688+40120 | 4342+2879 |
| III | 20 pg | 3DMPL (50pg) o/w (S) | 16720+12641 | 1380+756 | 0.700+0.232 | 36647+24126 | 4080+2883 |
| IV | s pg | 3DMPL (50pg) o/w (S) | 14992+9885 | 840+571 | 0.570+0.200 | 45082+24221 | 4560+2502 |
| V | 20 pg | Alum 3DMPL (50pg) | 14452+7476 | 740+499 | 0.620+0.175 | 16015+7846 | 3280+2276 |
| VI | 5 pg | Alum 3DMPL (50pg) | 10174+4219 | 420+301 | 0.520+0.175 | 20488+9562 | 2640+1510 |
| VII | - | Alum 3DMPL (50pg) | <100 | <50 | <0.020 | <100 | <50 |
| VIII | - | 3DHPL (50pg) o/w (R) | <100 | <50 | <0.020 | <100 | <50 |
| IX | - | - | <100 | <50 | <0.020 | <100 | <50 |
| X | 5 M | Alum 3DMPL (100 pg) | 40602+3953 | 163+151 | 0.671+1.187 | 16588+6945 | 2560+1678 |
*·) Zvířata byla imunizována ve dnech 0, 28 a 84, po dvou týdnech infikována 105 pfu HSV2.
O ) . - .
1 Sérum a vaginální výplach byly odebraný 14 dnu po druhé imunizaci .
3) Sérum bylo odebráno den před infekcí, 14 dnů po třetí imunizaci .
4) Hodnoty jsou uvedeny jako aritmetický průměr titru ± střední chyba.
5) Odpovídá optické hustotě při 492 nm pro 0,5 μg celkového IgG při zkoušce ELISA - aritmetický průměr ± střední chyba.
o/w = emulse olej ve vodě.
-20CZ 280505 B6
Tabulka 6
Účinek imunizace pomocí rgD2t na klinický a virologický průběh infekce HSV2 u morčat gg rgD2t 3DMPL o/w(S) skupina III gg rgD2t
Alum+50 gg3DMPL skupina VI gg rgD2t Alum+100 gg 3DMPL skupina X kontroly skupiny VII, VIII a IX
Primární infekce HSV2:
| incidence kožního poškození (í) | 1/9 11 1 | 1/10 10 i | 0/10 0 í | 12/14 86 i |
| závažnost kožního poškození | 1,2+1 | 0,7+0,7 | 0,9+1 | 8,6+5,1 1077+1682 |
| vaginální titr virů pfu/ml | 0 | 0 | 1,5+4,7 | |
| Opakovaná infekce BSV2: | ||||
| incidence kožního poškození (%) | 2/9 22 t | 2/10 20 i | 3/10 30 i | 11/14 79 t |
| počet dnů onemocnění | 1+2,3 | 1,6+2,1 | 1,6+2,7 | 7,3+6 |
| počet opakování onemocnění | 0,2+0,4 | 0,6+0,7 | 0,5+0,8 | 1,9+1,2 |
Provedení pokusu:
Provedení pokusu:
Očkování bylo provedeno třikrát ve dnech 0, 28 a 84. Dva týdny po poslední imunizaci byla provedena pokusná infekce při použití 105 pfu HSV2.
Primární infekce HSV2:
Zvířata byla pozorována 4 až 12 dnů po infekci. Uveden je výskyt kožního poškození v % a počet zvířat, u nichž se vyvinuly puchýřky, to znamená, hodnocení alespoň 1. Při závažnosti poškození je uveden součet hodnocení pro dny 4 až 12 jako aritmetický průměr ± střední chyba. Titry ve vaginálním výplachu jsou uvedeny v pfu/ml, výplachy byly odebrány 5 dnů po pokusné infekci.
Opakovaná infekce HSV2:
Zvířata byla pozorována 13 až 39 dnů po infekci. Uveden je výskyt kožního poškození v %, jde o počet zvířat, u nichž se vyvinuly puchýřky, to znamená hodnocení alespoň 1. V případě počtu dnů je uveden celkový počet dnů, v nichž se u zvířat projevovala opakovaní infekce, jde o aritmetický průměr ± střední chyba. Zvířata jsou uvedena v případě, že se alespoň na dva po sobě následující dny objevilo zarudnutí, tj. hodnocení 0,5 nebo se objevily kteréhokoliv dne puchýřky, tj. hodnocení alespoň 1. Jako počet opakování onemocnění je uveden počet opakovaných infekcí jako aritmetický průměr ± střední chyba.
-21CZ 280505 B6
Tabulka 7
DTH u afrických opic AGM po vakcinaci gD9t/Alum nebo gD9t/Alum + 3D MPL po 24 hodinách po 48 hodinách
| vakcína opice č. PBS gD2t | gD2t gDjt pg 20 pg | PBS 1 pg | gD2t 5 P9 | gD2t 20 pg | gD2t | |
| 1 pg 5 | ||||||
| gDnt/Alum J0358 | ND | - | ND | - | ||
| J0359 | ND | - | ND | - | ||
| J0363 | ND | - | ND | - | ||
| J0364 | ND | - | ND | - | ||
| J0366 | ND | - | ND | - | ||
| gD2t/Alum J0348 | - | E I 2-4 cm | - | I | I | |
| + 3D MPL J0349 | - E l-2mm | I 5-8mm E 7-9nun | E | I | I | |
| J0375 | - E l-2nm | I 3-4mm I 4-6irun | E | I | I | |
| J0515 | - | E | - | - | E (slabý) | |
| kontroly J0320 | - | - | - | |||
| JS110 | - | - | - | - | - |
Vysvětlivky k tabulce 7:
Opice byly imunizovány ve dnech 0 a 28 vždy dávkou 20 μg gD2t, podanou nitrosvalově. Potom byly nitrokožně do břišní stěny podány po 13 dnech různé dávky gD2t ve fyziologickém roztoku chloridu sodného. Výsledky kožních testů byly odečteny po 24 a po 48 hodinách.
E = zarudnutí v místě nitrokožní injekce
I = zatvrdnutí v místě nitrokožní injekce
ND = nebylo provedeno.
Vysvětlivky k tabulce 8:
Každá dávka vakcíny obsahovala 20 μg gD2t. Jako titr ELISA je uveden tzv. střední titr. Jako titr neutrálních protilátek je uvedena převrácená hodnota nejvyššího zředění séra, poskytujícího 100% ochranu proti cytopathogennímu účinku viru oparu.
-22CZ 280505 B6
Tabulka 8
Srovnání imunogenity gD2t/Alum a gD2t/Alum+3D MPL u afrických opic, serologická odpověď
| po II imunisaci | po III imun. | |||||||
| 14 dnů | 28 dnů | 56 dnů | 14 dnů | |||||
| vakcina | opice | titr | titr | titr | titr | titr | titr | titr |
| č. | ELISA | neut. | ELISA | ELISA | neut. | ELISA | neut. | |
| JO 358 | 1388 | 400 | 6572 | 1135 | 200 | 2050 | 400 | |
| JO 359 | 4731 | 400 | 3232 | 1866 | 100 | 2110 | 200 | |
| gD2tALUM | JO 363 | 1376 | 200 | 2316 | 1300 | 50 | 1205 | 50 |
| JO 364 | 5914 | 1600 | 5275 | 3740 | 400 | 6323 | 800 | |
| JO 366 | 21104 | 400 | 3696 | 2550 | 200 | 2302 | 200 | |
| arit. | průměr | 6902 | 600 | 4218 | 2118 | 190 | 2798 | 330 |
| + SD | + 8190 | + 565 | + 1697 | + 1062 | i 134 | + 2015 | ± 290 | |
| JO 348 | 7120 | 200 | 10175 | 4490 | 200 | 11082 | 400 | |
| gD2tAlUH | JO 349 | 14437 | 1600 | 15409 | 7361 | 800 | 15848 | 1600 |
| /3D MPL | JO 375 | 7990 | 800 | 5170 | 2953 | 800 | 6797 | 1600 |
| JO 515 | 6515 | 200 | 7246 | 3660 | 100 | 6497 | 200 | |
| arit. | průměr | 9015 | 700 | 9500 | 4616 | 475 | 10056 | 950 |
| + SD | + 3664 | + 663 | + 4442 | + 1934 | + 377 | + 4392 | ± 754 |
-23CZ 280505 B6
Claims (7)
- NÁROKY1. Vakcina proti herpes simplex, vyznačující se tím, že obsahuje HSV glykoprotein D nebo jeho imunologický fragment ve spojení s 3-deacylovaným monofosforyllipidem A a vhodným nosičem.
- 2. Vakcina podle nároku 1, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje hydroxid hlinitý.
- 3. Vakcina podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje nosič ve formě emulze typu olej ve vodě.
- 4. Vakcina podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že jako glykoprotein D obsahuje glykoprotein D z viru HSV-2 nebo jeho imunologický fragment.
- 5. Vakcina podle nároků 1,2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že obsahuje zkrácenou formu glykoproteinu D.
- 6. Vakcina podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje zkrácenou formu bílkoviny HSVgD2, prostou C-terminální zakotvující oblasti.
- 7. Vakcina podle nároků 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6, vyznačující se tím, že glykoprotein D je vázán na částicový nosič.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9105992A GB9105992D0 (en) | 1991-03-21 | 1991-03-21 | Vaccine |
| PCT/EP1992/000592 WO1992016231A1 (en) | 1991-03-21 | 1992-03-17 | HERPES SIMPLEX VACCINE COMPRISING HSV GLYCOPROTEIN gD AND 3 dEACYLATED MONOPHOSPHORYL LIPID A |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ195893A3 CZ195893A3 (en) | 1994-07-13 |
| CZ280505B6 true CZ280505B6 (cs) | 1996-02-14 |
Family
ID=10691946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS931958A CZ280505B6 (cs) | 1991-03-21 | 1992-03-17 | Vakcína proti herpes simplex, obsahující HSV glykoprotein D a 3-deacylovaný monofosforyllipid A |
Country Status (34)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6027730A (cs) |
| EP (1) | EP0576478B2 (cs) |
| JP (1) | JP3530526B2 (cs) |
| KR (1) | KR100224329B1 (cs) |
| CN (2) | CN1058191C (cs) |
| AP (1) | AP298A (cs) |
| AT (1) | ATE129160T1 (cs) |
| AU (1) | AU650521B2 (cs) |
| BR (1) | BR9205745A (cs) |
| CA (1) | CA2106492C (cs) |
| CY (1) | CY1936A (cs) |
| CZ (1) | CZ280505B6 (cs) |
| DE (1) | DE69205566T3 (cs) |
| DK (1) | DK0576478T4 (cs) |
| ES (1) | ES2081102T5 (cs) |
| FI (1) | FI107881B (cs) |
| GB (1) | GB9105992D0 (cs) |
| GR (1) | GR3017884T3 (cs) |
| HK (1) | HK1004525A1 (cs) |
| HU (1) | HU218025B (cs) |
| IE (1) | IE69560B1 (cs) |
| IL (1) | IL101290A (cs) |
| MA (1) | MA22471A1 (cs) |
| MX (1) | MX9201245A (cs) |
| MY (1) | MY110086A (cs) |
| NO (1) | NO307499B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ242057A (cs) |
| PL (1) | PL170059B1 (cs) |
| PT (1) | PT100262B (cs) |
| SA (1) | SA92120459B1 (cs) |
| SK (1) | SK279190B6 (cs) |
| WO (1) | WO1992016231A1 (cs) |
| YU (1) | YU28392A (cs) |
| ZA (1) | ZA922011B (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ302808B6 (cs) * | 1998-09-11 | 2011-11-23 | Smithkline Beecham Biologicals S. A. | Vakcína proti sexuálne prenosným nemocem |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9105992D0 (en) * | 1991-03-21 | 1991-05-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| US6197311B1 (en) | 1991-07-25 | 2001-03-06 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses |
| GB9202933D0 (en) * | 1992-02-12 | 1992-03-25 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| US6620414B2 (en) | 1992-03-27 | 2003-09-16 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Hepatitis vaccines containing 3-0-deacylated monophoshoryl lipid A |
| CA2156525A1 (en) * | 1993-02-19 | 1994-09-01 | Susan Dillon | Influenza vaccine compositions containing 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a |
| EP0812593B8 (en) * | 1993-03-23 | 2010-11-10 | SmithKline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid a |
| US5723130A (en) * | 1993-05-25 | 1998-03-03 | Hancock; Gerald E. | Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus |
| GB9326253D0 (en) * | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| CA2209360C (en) * | 1994-12-28 | 2010-07-06 | University Of Kentucky | Recombinant monoclonal anti-idiotype antibody 3h1 sequences relating to human carcinoembryonic antigen |
| US6949244B1 (en) | 1995-12-20 | 2005-09-27 | The Board Of Trustees Of The University Of Kentucky | Murine monoclonal anti-idiotype antibody 11D10 and methods of use thereof |
| US6235280B1 (en) | 1996-04-12 | 2001-05-22 | Malaya Chatterjee | Methods of delaying development of CEA-associated tumors using anti-idiotype antibody 3H1 |
| US20020041872A1 (en) | 1996-04-12 | 2002-04-11 | Malaya Chatterjee | Methods of delaying development of CEA-associated tumors using anti-idiotype antibody 3H1 |
| US6468782B1 (en) | 1996-12-05 | 2002-10-22 | Quadrant Healthcare (Uk) Limited | Methods of preserving prokaryotic cells and compositions obtained thereby |
| US6274143B1 (en) | 1997-06-13 | 2001-08-14 | Malaya Chatterjee | Methods of delaying development of HMFG-associated tumors using anti-idiotype antibody 11D10 |
| US6355244B1 (en) | 1997-11-17 | 2002-03-12 | University Of Kentucky Research Foundation | Methods and compositions for the treatment of psoriasis |
| US6692752B1 (en) * | 1999-09-08 | 2004-02-17 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Methods of treating human females susceptible to HSV infection |
| AU750587B2 (en) | 1998-10-16 | 2002-07-25 | Smithkline Beecham Biologicals (Sa) | Adjuvant systems and vaccines |
| US7026155B2 (en) | 1999-02-02 | 2006-04-11 | Regents Of The University Of California | Method of reducing bacterial proliferation |
| EP1104767A1 (en) † | 1999-11-30 | 2001-06-06 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Mono- and disaccharide derivatives containing both fatty acid ester and sulfate ester groups |
| US9273326B2 (en) | 2004-04-30 | 2016-03-01 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Tetracycline-regulated gene expression in HSV-1 vectors |
| EP1804833A2 (en) | 2004-09-22 | 2007-07-11 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Staphylococcal immunogenic compositions |
| NZ561823A (en) | 2005-03-23 | 2010-04-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Use of an influenza virus and an oil-in-water emulsion adjuvant to induce cd4 t-cell and/or improved b-memory cell response |
| GB0607088D0 (en) | 2006-04-07 | 2006-05-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| CN101378778B (zh) | 2005-12-22 | 2013-02-06 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 肺炎球菌多糖缀合物疫苗 |
| EP2476433A1 (en) | 2006-03-30 | 2012-07-18 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
| EP2043682B1 (en) | 2006-07-17 | 2014-04-02 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Influenza vaccine |
| US20090181078A1 (en) | 2006-09-26 | 2009-07-16 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| SI2068918T1 (sl) | 2006-09-26 | 2012-09-28 | Infectious Disease Res Inst | Si - ep sestavek za cepljenje, ki vsebuje sintetiäśna pomagala |
| TW200908994A (en) | 2007-04-20 | 2009-03-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| AU2008267208B2 (en) | 2007-06-26 | 2012-01-19 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates |
| WO2010135747A1 (en) | 2009-05-22 | 2010-11-25 | Genocea Biosciences Inc. | Vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response |
| PT2437753T (pt) | 2009-06-05 | 2016-11-23 | Infectious Disease Res Inst | Adjuvantes lipídicos de glucopiranosilo sintéticos e composições de vacina contendo os mesmos |
| GB0913681D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| GB0913680D0 (en) | 2009-08-05 | 2009-09-16 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic composition |
| SI2516629T1 (sl) | 2009-12-21 | 2016-10-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Cepiva proti virusu herpes simplex |
| EP2643014A4 (en) | 2010-11-24 | 2015-11-11 | Genocea Biosciences Inc | HERPES SIMPLEX TYPE 2 VIRUS VACCINES: COMPOSITIONS AND METHODS FOR STIMULATING AN IMMUNE RESPONSE |
| CA2829607A1 (en) * | 2011-03-11 | 2012-09-20 | Mcmaster University | A method of vaccination comprising a histone deacetylase inhibitor |
| MX350795B (es) | 2011-04-08 | 2017-09-19 | Inmune Design Corp | Composiciones inmunogenicas y metodos para utilizar las composiciones para inducir respuestas inmunes humorales y celulares. |
| US10206996B2 (en) | 2011-08-22 | 2019-02-19 | Nanobio Corporation | Herpes simplex virus nanoemulsion vaccine |
| CA2885693C (en) | 2011-11-23 | 2020-07-28 | Genocea Biosciences, Inc. | Nucleic acid vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response |
| PT2850431T (pt) | 2012-05-16 | 2018-07-23 | Immune Design Corp | Vacinas para hsv-2 |
| ES2847930T3 (es) | 2013-01-07 | 2021-08-04 | Mucosal Vaccine Tech Llc | Vacunas terapéuticas para el tratamiento de las infecciones por el virus del herpes simple de tipo 2 |
| JP6426706B2 (ja) | 2013-04-18 | 2018-11-21 | イミューン デザイン コーポレイション | がん処置で使用するためのｇｌａ単剤療法 |
| US9463198B2 (en) | 2013-06-04 | 2016-10-11 | Infectious Disease Research Institute | Compositions and methods for reducing or preventing metastasis |
| WO2018064232A1 (en) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | Genocea Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treating herpes |
| WO2019152821A1 (en) | 2018-02-05 | 2019-08-08 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Recombinant herpes simplex virus-2 expressing glycoprotein b and d antigens |
| CA3208643A1 (en) | 2021-01-18 | 2022-07-21 | Conserv Bioscience Limited | Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4372945A (en) * | 1979-11-13 | 1983-02-08 | Likhite Vilas V | Antigen compounds |
| IL61904A (en) * | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
| US5110587A (en) * | 1981-12-24 | 1992-05-05 | Health Research, Incorporated | Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus |
| US5149660A (en) * | 1982-02-18 | 1992-09-22 | University Patents, Inc. | Diagnostic reagents relating to herpes simplex virus |
| US4762708A (en) * | 1982-02-18 | 1988-08-09 | University Patents, Inc. | Materials and methods for herpes simplex virus vaccination |
| NZ209308A (en) * | 1983-08-30 | 1991-08-27 | Genentech Inc | Vaccine against hsv involving a truncated membrane-free derivative of a membrane-bound protein |
| US5244792A (en) * | 1984-04-06 | 1993-09-14 | Chiron Corporation | Expression of recombinant glyoprotein B from herpes simplex virus |
| US5171568A (en) * | 1984-04-06 | 1992-12-15 | Chiron Corporation | Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine |
| US4877611A (en) * | 1986-04-15 | 1989-10-31 | Ribi Immunochem Research Inc. | Vaccine containing tumor antigens and adjuvants |
| US5554372A (en) * | 1986-09-22 | 1996-09-10 | Emory University | Methods and vaccines comprising surface-active copolymers |
| DE3751772T2 (de) * | 1986-10-20 | 1996-12-05 | Chiron Corp | Impfstoff zur behandlung von hsv |
| US5149529A (en) * | 1988-04-08 | 1992-09-22 | Board Of Trustees Of Leland Chiron Corporation | Compositions and treatment for herpes simplex |
| US4912094B1 (en) * | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
| NZ230424A (en) * | 1988-08-25 | 1992-05-26 | Liposome Co Inc | Liposomal composition comprising an externally disposed antigen |
| WO1990004412A1 (en) * | 1988-10-27 | 1990-05-03 | Regents Of The University Of Minnesota | Liposome immunoadjuvants containing il-2 |
| US5597573A (en) * | 1989-05-04 | 1997-01-28 | Igen, Inc. | Lipid-A analogs: new monosaccharide and disaccharide intermediates for eliciting therapeutic antibodies and for antitumor and antiviral activities |
| US5158939A (en) * | 1989-07-21 | 1992-10-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method of stimulating the immune systems of animals and compositions useful therefor |
| CA2063271A1 (en) * | 1989-07-14 | 1991-01-15 | Subramonia Pillai | Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines |
| CA2088246A1 (en) * | 1990-08-01 | 1992-02-02 | Dennis J. O'callaghan | Gene encoding equine herpesvirus type i glycoprotein d, its gene product, antibodies and their uses |
| ATE179614T1 (de) * | 1990-08-02 | 1999-05-15 | Chiron Corp | Herpes simplex virus vp16 impfstoffe |
| GB9106048D0 (en) * | 1991-03-21 | 1991-05-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
| US5196452A (en) * | 1991-01-29 | 1993-03-23 | Genelabs Incorporated | Macrocyclic anti-viral compound and method |
| US5166173A (en) * | 1991-01-29 | 1992-11-24 | Genelabs Incorporated | Method of treating herpes simplex virus infection |
| GB9105992D0 (en) * | 1991-03-21 | 1991-05-08 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| MA22842A1 (fr) * | 1992-03-27 | 1993-10-01 | Smithkline Beecham Biolog | Procede de preparation de compositions de vaccin. |
| JP3755890B2 (ja) * | 1992-06-25 | 2006-03-15 | スミスクライン・ビーチャム・バイオロジカルス（ソシエテ・アノニム） | アジュバント含有ワクチン組成物 |
| CA2156525A1 (en) * | 1993-02-19 | 1994-09-01 | Susan Dillon | Influenza vaccine compositions containing 3-o-deacylated monophosphoryl lipid a |
| EP0812593B8 (en) * | 1993-03-23 | 2010-11-10 | SmithKline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine compositions containing 3-0 deacylated monophosphoryl lipid a |
| US5723130A (en) * | 1993-05-25 | 1998-03-03 | Hancock; Gerald E. | Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus |
-
1991
- 1991-03-21 GB GB9105992A patent/GB9105992D0/en active Pending
-
1992
- 1992-03-17 JP JP50598492A patent/JP3530526B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-17 KR KR1019930702835A patent/KR100224329B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-03-17 DK DK92906441T patent/DK0576478T4/da active
- 1992-03-17 CY CY193692A patent/CY1936A/xx unknown
- 1992-03-17 HU HU9302645A patent/HU218025B/hu unknown
- 1992-03-17 WO PCT/EP1992/000592 patent/WO1992016231A1/en active IP Right Grant
- 1992-03-17 PL PL92300617A patent/PL170059B1/pl unknown
- 1992-03-17 ES ES92906441T patent/ES2081102T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-17 SK SK946-93A patent/SK279190B6/sk unknown
- 1992-03-17 CA CA 2106492 patent/CA2106492C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-17 EP EP19920906441 patent/EP0576478B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-17 DE DE1992605566 patent/DE69205566T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-17 CZ CS931958A patent/CZ280505B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-03-17 AU AU13657/92A patent/AU650521B2/en not_active Expired
- 1992-03-17 BR BR9205745A patent/BR9205745A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-03-17 AT AT92906441T patent/ATE129160T1/de active
- 1992-03-18 MY MYPI92000448A patent/MY110086A/en unknown
- 1992-03-19 ZA ZA922011A patent/ZA922011B/xx unknown
- 1992-03-19 MA MA22760A patent/MA22471A1/fr unknown
- 1992-03-19 NZ NZ242057A patent/NZ242057A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-19 PT PT100262A patent/PT100262B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-03-19 IL IL10129092A patent/IL101290A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-19 CN CN92102950A patent/CN1058191C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-19 IE IE920881A patent/IE69560B1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-03-20 YU YU28392A patent/YU28392A/sh unknown
- 1992-03-20 MX MX9201245A patent/MX9201245A/es unknown
- 1992-03-20 AP APAP/P/1992/000368A patent/AP298A/en active
- 1992-04-21 SA SA92120459A patent/SA92120459B1/ar unknown
-
1993
- 1993-09-20 NO NO933343A patent/NO307499B1/no not_active IP Right Cessation
- 1993-09-21 FI FI934134A patent/FI107881B/fi not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-09 US US08/303,542 patent/US6027730A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-25 GR GR950402992T patent/GR3017884T3/el unknown
-
1998
- 1998-01-05 CN CN98103933A patent/CN1101226C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-28 HK HK98103623A patent/HK1004525A1/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ302808B6 (cs) * | 1998-09-11 | 2011-11-23 | Smithkline Beecham Biologicals S. A. | Vakcína proti sexuálne prenosným nemocem |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ280505B6 (cs) | Vakcína proti herpes simplex, obsahující HSV glykoprotein D a 3-deacylovaný monofosforyllipid A | |
| US10653771B2 (en) | Vaccines against herpes simplex virus type 2: compositions and methods for eliciting an immune response | |
| JP3901731B2 (ja) | サポニンおよびステロールを含有するワクチン | |
| KR100270134B1 (ko) | 3-0-탈아실화된 모노포스포릴 지질 a를 함유하는 간염 백신 | |
| CZ289476B6 (cs) | Očkovací přípravek a způsob jeho výroby | |
| JP2001501640A (ja) | ワクチン | |
| F Eng et al. | Polyphosphazenes enhance mucosal and systemic immune responses in mice immunized intranasally with influenza antigens | |
| Van Steenis et al. | Immunogenicity of dog kidney cell rabies vaccine (DKCV) | |
| Prinzie | Rubella Vaccines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20120317 |