CZ289476B6 - Očkovací přípravek a způsob jeho výroby - Google Patents

Abstract

Je zde p°edkl d n nov² o kovac p° pravek, obsahuj c mal stice 3-O-deacylovan ho monofosforyllipidu A. Velikost stic je zejm na men ne 120 nm. Takov² o kovac p° pravek m vynikaj c imunologick vlastnosti.\

Description

Předkládaný vynález se týká nových očkovacích přípravků, způsobu jejich výroby a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

3-O-deacylovaný monofosforyllipid A (nebo 3-De-O-acylovaný monofosforyllipid A) byl dříve označován jako 3D-MPL nebo d3-MPL k vyznačení toho, že poloha 3 redukujícího konce glukosaminu je de-O-acylovaná. Výroba je popsána v GB 2 220 211 A. Chemicky se jedná o směs 3-deacylovaného monofosforyllipidu A se 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci. Zde je výraz 3D-MPL (či d3-MPL) zkrácen na MPL, neboť „MPL“ je zapsaná známka (^RTM) firmy Ribi Immunochem., Montana, která je firmou Ribi používána k jednoznačnému označení jejího výrobku, 3-O-deacylovaného monofosforyllipidu A.

GB 2 220 211 A udává, že endotoxicita dříve používaných enterobakteriálních lipopolysacharidů (LPS) je snížena, zatímco imunogenní vlastnosti se zachovávají. GB 2 220 211 A však tyto nálezy uvádí pouze ve spojitosti s bakteriálními (Gram negativními) systémy. Žádná zmínka nebyla věnována velikosti částic MPL. Ve skutečnosti je velikost částice známého 3-Odeacylovaného monofosforyllipidu A větší než 500 nm.

Ve WO 92/16 231 byl předložen očkovací přípravek, obsahující glykoprotein gD viru herpes simplex, nebo jeho imunologické fragmenty, ve spojení s 3-O-deacylovaným monofosforyllipidem A. Opět nebyla učiněna žádná zmínka o velikosti částic 3-deacylovaného monofosforyllipidu A.

Ve WO 92/06 113 byl předložen očkovací přípravek, obsahující HTV gp 160 či jeho deriváty jako gp 120, ve spojení s 3-deacylovaným monofosforyllipidem A. Žádná zmínka nebyla učiněna o velikosti částic MPL.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje očkovací přípravek, obsahující antigen ve spojení s 3-deacylovaným monofosforyllipidem A (zkracovaným zde jako MPL) a vhodným nosičem, kde velikost částic MPL je „malá“ a obecně při jeho přípravě nepřevyšuje 120 nm.

Takový přípravek se hodí pro široké rozmezí monovalentních i polyvalentních vakcín.

Překvapivě bylo zjištěno, že očkovací přípravky podle vynálezu mají zvláště výhodné vlastnosti, jak je popsáno dále. Konkrétně jsou takové přípravky silně imunogenní. Nádavkem může být zajištěna sterilita adjuvantního přípravku, neboť výrobek lze podrobit sterilní filtraci. Další výhoda „malého“ MPL se objeví, pokud je upravován s hydroxidem hlinitým, neboť MPL reaguje s hydroxidem hlinitým a antigenem tak, že vzniká jedna látka (entita).

Ve ztělesnění podle vynálezu je antigenem virový antigen, například antigen vůči infekční hepatitidě (hepatitis A, B, C, D nebo E) či oparu (HSV-I či HSV-2,), jak je zde popsáno dále. Přehled moderních vakcín vůči hepatitidě, včetně množství klíčových odkazů, lze najít v časopisu Lancet z 12. 5. 1990 na straně 1142 (prof. A.L.W.F. Eddleston). Viz také „Viral Hepatitis and Liver Disease“ (B.N. Vyas, J.L. Dienstag a J.H. Hoofnagle, editoři, Grune and Stratton, lne., 1984) a „Viral Hepatitis and Liver Disease“ (Proceedings of the 1990 Intemational Symposium, F.B. Hollinger, S.M. Lemon a H. Margolis, editoři, vyd. Williams and Wilkins). Odkazy na HSV-1 a HSV-2 lze nalézt ve WO 92/16 231.

Infekce virem hepatitidy A (HAV) je široce rozšířeným problémem, avšak vakcíny, použitelné k masové imunizaci, jsou dostupné, například výrobek „Havrix“ (SmithKline Beecham

-1 CZ 289476 B6

Biologicals), který je mrtvou oslabenou vakcínou, získanou z kmene HM-175 viru HAV (viz „Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A“ autorů F.E. Andreho, A. Hepbuma a E.D. Hondta v Prog. Med. Virol. sv. 37, str. 72-95 /1990/ a monografii výrobku „Havrix“, vydanou SmithKline Beecham Biologicals /1991/).

Flehmig se spoluautoiy (cit. tamtéž, str. 56-71) shrnuli klinické aspekty, virologii, imunologii a epidemiologii hepatitidy A a diskutovali přístupy k vývoji vakcíny vůči této běžné virové infekci.

Jak je zde použit, označuje výraz „antigen HAV“ jakýkoli antigen, schopný stimulovat neutralizující protilátky vůči HAV u lidí. Antigen HAV může zahrnovat živé, oslabené virové částice, nebo inaktivované oslabené virové částice, anebo může být například HAV kapsidem (virovou io obálkou) nebo virovou bílkovinou HAV, kterou lze vhodně získat postupem rekombinace DNA.

Infekce viru hepatitidy B je široce rozšířeným problémem, avšak nyní jsou k dispozici vakcíny, které lze použit k masové imunizaci, například výrobek „Energix-B“ (SmithKline Beecham plc), který se získává postupy genetického inženýrství.

Příprava povrchového antigenů hepatitidy B (HBsAg) je dobře doložena. Viz například Harford 15 se spoluautory v Develop. Biol. Standard 54. str. 125 (1983), Gregg se spol. v Biotechnology 5, str. 479 (1987), EP-A-0 226 846, EP-A-0 299 108 a v nich udané odkazy.

Jak je zde používán, výraz „povrchový antigen hepatitidy B“ či „HBsAg“ zahrnuje jakýkoli HBsAg antigen nebo jeho fragment, vykazující antigennost povrchového antigenů HBV. Bude zřejmé, že kromě 226 aminokyselinové sekvence antigenů HBsAg (viz Tiollais se spol., Nátuře 20 317, 489 /1985/ a uvedené odkazy) může HBsAg, jak je zde popsán, pokud je to žádoucí, obsahovat všechny části sekvence pre-S, jak je popsaná ve výše udaných odkazech a v EP-A278 940. HBsAg může zejména obsahovat polypeptid, mající aminokyselinovou sekvenci, která zahrnuje zbytky 12 až 52, následované zbytky 133 až 145 a poté zbytky 175 až 400 L-bílkoviny HBsAg, která je příbuzná otevřenému čtecímu rámci na viru hepatitidy B, sérotypu ad (tento 25 polypeptid je uváděn jako L*; viz EP 0 414 374). HBsAg v rozsahu vynálezu může rovněž zahrnovat polypeptid preSl-preS2-S, popsaný v EP 0 198 474 (Endotronics) nebo jeho analogy, jako jsou ty, popsané v EP 0 304 578 (Mc Cormick and Jones). HBsAg, jak je zde popsán, může také odpovídat mutantům, například „únikovému mutantu“ (escape mutant) popsanému ve WO 91/14 703 či EP 0 511 855 AI, zvláště HBsAg, kde došlo k náhradě (substituci) glycinu, 30 aminokyseliny v poloze 145, argininem.

HBsAg bude normálně ve formě částic. Částice mohou obsahovat například bílkovinu S samotnou, nebo mohou být složenými částicemi, například (L*,S), kde L* odpovídá předchozí definici a S označuje S-bílkovinu HBsAg. Uvedená částice je s výhodou ve formě, v níž se vyskytuje v kvasinkách.

Glykoprotein D viru herpes simplex je umístěn na virovém obalu a nachází se rovněž v cytoplazmě infikovaných buněk (R.J. Eisenberg se spoluautoiy, J. of Virol. 35, 428-435, 1980). Obsahuje 393 aminokyselin včetně signálního peptidů a má molekulovou hmotnost přibližně 60. Ze všech glykoproteinů obalu HSV je pravděpodobně nejlépe charakterizován (Cohen se spol., J. of Virology 60, 157-166). Je známo, že v podmínkách in vivo hraje ústřední roli v přichycení 40 viru na buněčné membrány. Nadto bylo prokázáno, že glykoprotein D je schopný in vivo vyvolat vznik neutralizujících protilátek (Eing se spol., J. Med. Virology 127, 59-65). Ovšem latentní virus HSV2 může být stále reaktivován a indukovat opětovný výskyt nemoci i přes přítomnost titru vysoce neutralizujících protilátek v sérech pacientů. Je proto zřejmé, že pouhá schopnost indukovat neutralizační protilátky je k patřičné kontrole nemoci nedostatečná.

Zralý rekombinantní zkrácený glykoprotein D (rgD₂t) nebo odpovídající bílkoviny, vylučované savčími buňkami, se přednostně užívají v očkovacích přípravcích podle tohoto vynálezu. Odpovídající bílkoviny zahrnují glykoprotein gD z HSV-1.

V upřednostňovaném aspektu je rgD₂t glykoproteinem D z HSV-2, majícím 308 aminokyselin, což zahrnuje aminokyseliny 1 až 306 přirozeně se vyskytujícího glykoproteinů s adicí asparaginu 50 a glutaminu na C konec zkrácené bílkoviny. Tato forma bílkoviny zahrnuje signální peptid, který je štěpen k získání zralé bílkoviny o 283 aminokyselinách. Tvorba takové bílkoviny v buňkách

-2CZ 289476 B6 vaječníků čínského křečka byla popsána v evropském patentu firmy Genentech EP-B-139 417, ve Science 222, str. 524 a v Biotechnology z června 1984, na str. 527. Pokud je taková vakcína vytvořena s malým MPL podle předkládaného vynálezu, má ve srovnání se známými přípravky rgD₂t vynikající léčebné možnosti.

Zatímco určité pokusné a komerčně dostupné vakcíny poskytují výborné výsledky, je uznávaným faktem, že optimální vakcína potřebuje stimulovat nejen neutralizující protilátky, ale také co nejúčinněji stimulovat buněčnou imunitu, zprostředkovanou T-buňkami.

Zvláštní výhodou je, že očkovací přípravky podle vynálezu jsou velmi účinné v indukování ochranné imunity i při velice nízkých dávkách antigenu.

Zajišťují vynikající ochranu vůči primární i opakované infekci a výhodně stimulují jak specifickou humorální (neutralizujícími protilátkami), tak i efektorovými buňkami zprostředkovanou (DTH) imunitní odpověď.

K přípravě 3-deacylovaného monofosforyllipidu A o malé velikosti částic, obecně nepřesahující 120 nm, je možné použít postup pro získání známého 3D-MPL, popsaný v GB 2 220 211, (nebo může být získán komerční MPL o větší velikosti částic od Ribi Immunochem.) a produkt pak lze sonikovat (dezintegrovat ultrazvukem) až do té doby, dokud suspenze není čirá. Velikost částic může být odhadnuta za použití dynamického rozptylu světla, jak bude popsáno níže. K udržení velikosti MPL i po úpravě s hydroxidem hlinitým v rozmezí do 100 nm lze přidat antigen a pufr, tween 80 či sorbitol. Za těchto podmínek bylo zjištěno, že se MPL v přítomnosti fosfátového pufru nemůže srážet (agregovat), k čemuž může dojít při úpravě v jeho nepřítomnosti. Tímto chováním je konečný přípravek dále definován a charakterizován. Rovněž bylo zjištěno, že za takových podmínek MPL stále reaguje s hydroxidem hlinitým a s antigenem za vzniku jednotné látky, entity.

Čirý roztok MPL vytváří jeden aspekt vynálezu. Tento roztok může být sterilizován zfiltrováním. Velikost částic je s výhodou v rozmezí od 60 do 120 nm.

Nej výhodněji je velikost částic menší než 100 nm.

MPL, jak byl výše definován, bude obvykle přítomen v rozmezí od 10 do 200 pg a lépe od 25 do 50 pg na dávku, zatímco antigen bude typicky přítomen v rozmezí od 2 do 50 pg na dávku či ve větším množství. Očkovací prostředek podle předkládaného vynálezu může nádavkem obsahovat další imunostimulační látky, v upřednostňovaném ztělesnění mohou vakcíny podle tohoto vynálezu obsahovat látku QS21 (někdy označovanou jako QA21). To je podíl saponinového extraktu, odvozeného z kůry stromu Quillaja Saponaria Molina, získaný pomocí HPLC a způsob jeho výroby je předložen v patentu US 5 057 540.

Nosičem může být volitelně emulze oleje ve vodě, lipidové vehikulum nebo hydroxid hlinitý (sůl hydroxidu hlinitého).

Netoxické emulze oleje ve vodě s výhodou obsahují netoxický olej, např. skvalen a emulgační činidlo, jako Tween 80, ve vodném nosiči. Vodným nosičem může být například fosfátem pufrovaný solný roztok.

Očkovací přípravky budou s výhodou obsahovat antigen nebo antigenní prostředek, schopný vyvolat imunitní odpověď vůči lidským nebo zvířecím patogenům, přičemž tento antigen nebo antigenní prostředek je odvozen od HTV-1 (jako je gp 120 či gp 160, viz WO 92/06 113 a tam uvedené odkazy), od viru Herpes (oparu) jako je gD nebo jeho deriváty, nebo od okamžité časné bílkoviny (Immediate Early protein) jako je ICP27 z HSV-1 či HSV-2, gB (nebo jeho derivátů) z lidského cytomegaloviru, či gpl, II nebo III z viru Varicella Zoster, nebo od virů hepatitidy, jako je virus hepatitidy B či od jiných virových patogenů, jako je respirační syncytiální virus, virus lidského papilomu, nebo virus chřipky, anebo vůči bakteriálním patogenům, jako je salmonela, neisserie, borelie (například OspA či OspB nebo jejich deriváty), anebo chlamydie nebo bordetella, například P.69, PT a FHA, nebo vůči parazitům, jako je plazmodium či toxoplazma. Očkovací přípravky podle tohoto vynálezu mohou obsahovat tumorový antigen a být tak použitelné jako protirakovinné vakcíny.

-3CZ 289476 B6

Jedním ztělesněním vynálezu je antigen HAV (například jako v přípravku Havrix) ve směsi s MPL a hydroxidem hlinitým, jak je popsáno níže.

Dalším ztělesněním vynálezu je povrchový antigen HB viru (HBsAg), například jako v přípravku Engerix-B, ve směsi s MPL a hydroxidem hlinitým, jak je popsáno níže.

Dalším specifickým ztělesněním vynálezu je HBsAg antigen jako (L*,S) částice, definovaná výše, ve směsi s MPL a hydroxidem hlinitým.

Podle vynálezu lze rovněž připravit kombinovanou vakcínu vůči hepatitidě A a hepatitidě B.

Dalším ztělesněním je přípravek podle vynálezu, obsahující zralý zkrácený glykoprotein D (rgD₂t), nebo rovnocenné bílkoviny, jak byly popsány výše. Ještě dalším ztělesněním je přípravek podle vynálezu, obsahující antigen OspA či jeho deriváty z Borelie burgdorferi. Použít lze například zejména antigeny OspA z kmenů ZS7 či B31. Ještě dalším ztělesněním je přípravek podle vynálezu, obsahující „flu“ antigen. Ten poskytuje zlepšenou vakcínu vůči chřipce, zvláště pokud byl použit virus „split“ (rozštěpený).

Přípravky mohou být vhodné také pro použití spolu s lehkými herpetickými částicemi, jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce WO 92/19 748 (PCT/GB 92/00 824) a v mezinárodní patentové přihlášce WO 92/13 943 (PCT/GB 92/00 179).

Očkovací přípravek podle vynálezu s výhodou obsahuje i další antigeny, takže je účinný v léčbě či profylaxi jedné nebo více jiných bakteriálních, virových nebo houbových infekcí.

Očkovací přípravky proti hepatitidě podle vynálezu například s výhodou obsahují nejméně jednu další složku, zvolenou z jiných než hepatitických antigenů, o nichž je v oboru známo, že poskytují ochranu vůči jednomu nebo více z následujících onemocnění: záškrtu, tetanu, černému kašli, Haemophilus influenzae b (Hib) a dětské obrně.

Vakcína podle vynálezu s výhodou obsahuje HBsAg, jak byl popsán výše. Zvláštní kombinované vakcíny v rozsahu vynálezu zahrnují kombinovaný očkovací přípravek vůči DTP (záškrt-tetanusčemý kašel)-hepatitidě B, očkovací přípravek vůči Hib-hepatitidě B, očkovací přípravek vůči DTP-Hib-hepatitidě B a očkovací přípravek vůči IPV (inaktivovaná vakcína vůči dětské obmě)DTP-Hib-hepatitidě B.

Výše uvedené kombinace mohou s výhodou obsahovat složku, která chrání vůči hepatitidě A, zvláště usmrcený oslabený kmen, odvozený od kmene HM-175 jaký je přítomný v přípravku Havrix.

Vhodné složky pro použití v takových vakcínách jsou již komerčně dostupné a podrobnosti lze získat od Světové zdravotnické organizace. Například IPV složkou může být Salkova inaktivovaná vakcína vůči dětské obrně. Vakcína vůči černému kašli může obsahovat celé buňky nebo bezbuněčný produkt.

Vakcína vůči hepatitidě nebo kombinovaná vakcína podle vynálezu je s výhodou pediatrickou vakcínou.

Vynález v dalším aspektu poskytuje očkovací prostředek podle vynálezu pro použití v léčebné terapii, zvláště pro použití v léčbě nebo profylaxi infekcí včetně virových a bakteriálních infekcí, nebo pro imunologickou léčbu rakoviny. V upřednostňovaném aspektu je vakcína podle vynálezu léčebnou vakcínou, vhodnou k léčbě pokračujících infekcí, například hepatitidy B nebo herpetických (oparových) infekcí u lidí, kteří jimi trpí.

Příprava vakcíny je obecně popsána v knize New Trends and Developments in Vaccines, editorů Voliéra a spolupracovníků, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Opouzdření (enkapsulace) do liposomů je popsána například Fullertonem v US patentu č. 4 474 757. Spojování bílkovin do makromolekul je předkládáno například Likhitem v US patentu č. 4 372 945 a Armorem se spoluautory v US patentu č. 4 474 757.

Množství antigenů v každé dávce vakcíny je zvoleno jako množství, které v typických vakcínách indukuje imunoprotektivní odpověď bez významných záporných vedlejších účinků. Takové

-4CZ 289476 B6 množství se bude měnit v závislosti na použitých specifických imunogenech. Obecně se předpokládá, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 pg celkového imunogenu, lépe 2 až 100 pg a nejlépe 4 až 40 pg. Optimální množství pro konkrétní vakcínu může být určeno standardními studiemi, zahrnujícími sledování titrů protilátek a jiných odpovědí subjektu. Po počáteční vakcinaci mohou subjekty obdržet zesilovací dávku přibližně ve čtyřech týdnech.

Jako další aspekt vynálezu je zde předložena metoda výroby vakcíny, účinné v předcházení či léčbě infekce, přičemž tato metoda obsahuje smísení antigenů s nosičem a MPL, jehož velikost částic nepřevyšuje 120 nm, normálně je rovna 60 až 120 nm a s výhodou je přibližně 100 nm nebo menší.

Následující příklady dokreslují vynález a jeho výhody.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava MPL o velikosti částic 60 až 120 nm

Voda pro injekce se za použití stříkačky injikuje do ampulek, obsahujících lyofilizovaný 3-deO-acylovaný monofosforyllipid A (MPL) od firmy Ribi Immunochem, Montana, k získání koncentrace 1 až 2 mg na ml. Přípravná suspenze se získá promícháním za použití míchadla. Poté se obsah ampulek převede do 25 ml zkumavek Corex s kulatými dny (10 ml suspenze na zkumavku) a suspenze se dezintegruje ultrazvukem za použití sonikátoru ve vodní lázni. Poté, kdy se suspenze vyjasní, se velikost částic stanoví za použití dynamického rozptylu světla (Malvem Zetasizer 3). V ultrazvukové dezintegraci se pokračuje dokud velikost částic MPL není v rozmezí od 60 do 120 nm.

Suspenze mohou být v některých případech skladovány při 4 °C bez významného srážení až po dobu 3 měsíců. Isotonický roztok NaCl (0,15 M) nebo isotonický roztok NaCl a 10 mM fosfátu indukuje rychlé srážení (velikost > 3 až 5 pm).

Příklad 2: Výroba široké škály sterilního rozpustného MPL o velikosti částic nižší než 100 nm

Lyofilizovaný 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A (MPL) byl získán od firmy Ribi Immunochem a rozpuštěn ve vodě pro injekce (VPI). Roztok byl nepřetržitě čerpán přes ultrazvukovou průtokovou celu. Průtoková cela je typicky vyrobena ze skla nebo z nerezové oceli s PTFE těsněním, aby byla přizpůsobena omezením GMP (správné výr. praxe). Ultrazvuk je vytvářen za použití ultrazvukového generátoru a titanové zvukové houkačky (sonotrody), získané od firmy Undatim Ultrasonics (Louvain-LaNeuve, Belgie). Do smyčky je zapojen tepelný výměník k vyloučení znehodnocení produktu teplem. Teplota MPL je mezi vstupem a výstupem průtokové cely udržována mezi +4 °C a 30 °C a teplotní rozdíl mezi vstupem a výstupem je udržován nižší než 20 °C. Je nutné připomenout, že teplo se rovněž odvádí při průchodu materiálu zařízením.

Zařízení je schematicky znázorněno na obrázku 1.

2.1. Dezintegrace ultrazvukem (sonikace)

MPL v práškové formě (50 až 500 mg) se rozpustí ve vodě pro injekce v koncentraci mezi 1 a 2 mg/ml.

Suspenze MPL se (za míchání) nepřetržitě čerpá přes sonikační smyčku (viz obrázek 1) při rychlosti toku mezi 50 a 100 ml za minutu k získání rovnovážné teploty systému mezi +4 a +15 °C.

Vlastní frekvenční spektrum zvukové houkačky v uspořádání systému (zdroj, průtoková cela, rychlost toku kapaliny, t °C) je zvoleno podle pokynů dodavatele zařízení. Předem dané meze jsou stanoveny mezi 19 000 Hz a 21 000 Hz pro 20 000 Hz měnič.

-5CZ 289476 B6

Generátor umožňuje kontrolu optimální účinnosti sonikace (větší přenos energie s menším ohříváním) v daném časovém intervalu.

Teplota je v průběhu procesu udržována pod 30 °C k vyloučení znehodnocení MPL.

Proces je dokončen, když je velikost částic snížena pod 100 nm a roztok je čirý při vizuálním posouzení. V průběhu sonikace jsou odebírány vzorky pro stanovení velikosti částic fotokorelační spektroskopií (dynamickým rozptylem světla) za použití přístroje Malvem Zetasizer typu 3 stejným způsobem jako v příkladu 1. Celková doba prodlevy tekutiny v sonikační průtokové cele je vypočítána tak, aby činila 2,5 až 3,5 minuty (viz tabulku 1) za použití průtokové cely o kapacitě 20 ml a rychlosti recirkulujícího toku 50 ml za minutu. Tato rychlost toku poskytuje průměrnou dobu prodlevy 25 sekund na 1 cyklus a normálně je potřeba méně než 10 cyklů k získání požadovaného účinku malých částic MPL.

2.2. Postup sterilizace

Výsledný MPL, který byl „učiněn rozpustným“, se sterilizuje filtrací se zaslepeným koncem na hydrofilní PVDF membráně 0,22 pm. Pozorovaný tlak je obvykle nižší než 10⁵ Pa. Nejméně 25 mg MPL, který byl „učiněn rozpustným“, je snadno zpracováno na 1 cm² s výtěžností nad 85 %.

2.3. Skladování/stabilita

Sterilní MPL, který byl „učiněn rozpustným“, se skladuje při +2 °C až 8 °C. Údaje o stabilitě (Malvem) neukázaly žádný významný rozdíl ve velikosti částic po 6 měsících skladování. (Viz tabulku 2).

Příklad 3: Očkovací přípravek vůči hepatitidě B

MPL (o velikosti částic menší než 100 nm) byl získán tak, jak bylo popsáno v příkladu 1. Hydroxid hlinitý byl získán od firmy Superfos (Alhydrogel).

MPL byl opět rozpouštěn ve vodě pro injekce v koncentraci, která se pohybovala od 0,2 do 1 mg/ml, sonikací ve vodné lázni, dokud částice nezískaly velikost mezi 80 a 500 nm, měřenou fotokorelačním rozptylem světla.

až 20 pg HBsAg (S-antigen jako v Engerix-B) v roztoku fosfátového pufru (1 mg/ml) se adsorbuje na 30 až 100 pg hydroxidu hlinitého (roztok 10,38 mg Al³⁺/ml) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti za protřepávání. Pak se k roztoku přidá 30 až 50 pg MPL (roztok 1 mg/ml). Objem a osmolarita jsou upraveny na 600 pl vodou pro injekce a 5 x koncentrovaným fosfátovým pufrem. Roztok se inkubuje při teplotě místnosti po 1 hodinu a až do použití se udržuje při 4 °C. K dozrání roztoku dochází během skladování. Roztok představuje 10 injekčních dávek pro testování na myších.

Příklad 4: Očkovací přípravek vůči hepatitidě A

MPL (o velikosti částic menší než 100 nm) byl získán tak, jak bylo popsáno v příkladu 1. Hydroxid hlinitý byl získán od firmy Superfos (Alhydrogel).

HAV (360 až 22 EU na dávku) se předem adsorbuje na hydroxid hlinitý (0,5 mg/ml) do 10% výsledné koncentrace. Poté se do roztoku přidá MPL (12,5 až 100 pg na dávku).

Zbývající hydroxid hlinitý se přidá k roztoku a ponechá 1 hodinu při teplotě místnosti. Objemy se upravují fosfátovým pufrem (10 mM fosfát, 150mM NaCl) a konečný přípravek se pak uchovává až do použití při teplotě 4 °C.

-6CZ 289476 B6

Příklad 5: Srovnání adjuvantní účinnosti rekombinantní vakcíny, tvořené podjednotkou glykoproteinu D, vůči Herpes simplex (oparu prostému)

5.1. V této studii byla zjišťována schopnost různých přípravků A1(OH)₃ MPL zlepšit obrannou imunitu vůči zkrácenému glykoproteinu D z viru Herpes simplex typu 2 (HSV2) (rgD₂t) na profylaktických i léčebných morčecích modelech. Studie imunogenity byly prováděny rovněž na primátech. Cílem těchto pokusů bylo zjistit vliv velikosti částic 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A (MPL) na imunogenitu a obrannou účinnost přípravků rgD₂t A1(OH)₃ MPL u hlodavců a u primátů. Testovány byly 3 odlišné přípravky A1(OH)₃ MPL o malé velikosti částic MPL:

A1(OH)₃ MPL 100 nm (jak byl popsán dříve),

A1(OH)₃ MPL 100 nm se sorbitolem,

A1(OH)₃ MPL 100 nm s činidlem Tween.

5.2. Schémata antigenně adjuvantní přípravy a imunizace

5.2.1. Antigenní přípravky

Hydroxid hlinitý, A1(OH)₃, byl získán od firmy Superfos (Alhydrogel Superfos, Dánsko). MPL byl získán od firmy Ribi Immunochem Research lne.

5.2.1.1. rgD₂t[Al(OH)₃]/MPL TEA

MPL byl rozpuštěn sonikací ve vodní lázni, tak, aby měl velikost částic mezi 200 a 600 nm. Přípravek byl vyroben podle patentové přihlášky WO 92/16 231 a až do použití uchováván při 4°C.

Dávka obsahovala 5 pg rgD₂t, 0,5 mg A1(OH)₃ a 50 pg MPL.

5.2.1.2. rgD₂t/Al(OH)3/MPL 100 nm

MPL (o velikosti částic menší než 100 nm) byl získán tak, jak bylo popsáno v příkladu 1. rgD₂t byl adsorbován na hydroxid hlinitý a inkubován 1 hodinu při teplotě místnosti. Pak byl k roztoku přidán MPL v požadované koncentraci a opět inkubován 1 hodinu při teplotě místnosti.

Přípravek byl doplněn PBS (fosfátem pufrovaným solným roztokem) k dosažení konečné koncentrace 10 mM PO₄ ³‘ a 150 mM NaCl. Výsledný přípravek byl dále inkubován 30 minut při teplotě místnosti a uchováván při 4 °C až do použití.

Dávka obsahovala 5 pg rgD₂t, 0,5 mg A1(OH)₃ a 50 pg MPL.

5.2.1.3. rgDYAlíOHjs/MPL 100 nm se sorbitolem

MPL byl připraven tak, jak bylo popsáno v příkladu 1. rgD₂t byl adsorbován na hydroxid hlinitý a inkubován 1 hodinu při teplotě místnosti. Pak byl přidán roztok 50% sorbitolu k dosažení konečné koncentrace 5%. Následoval přídavek lOmM roztoku Tris k získání konečného požadovaného objemu a roztok byl 1 hodinu inkubován za protřepávání při teplotě místnosti.

Přípravek byl až do použití uchováván při 4 °C. Dávka obsahovala 5 pg rgD₂t, 0,5 mg A1(OH)₃ a 50 pg MPL.

5.2.1.4. rgD₂t/Al(OH)₃/MPL 100 nm s činidlem Tween

MPL byl připraven tak, jak bylo popsáno v příkladu 1. K zachování velikosti částic MPL rovné 100 nm byl Tween 80 k roztoku přidáván v takové koncentraci, aby se rovnala koncentraci 0,01 % ve výsledném přípravku. Přípravek se pak připravuje způsobem, popsaným výše pro přípravek 5.2.1.3.

Dávka obsahovala 5 pg rgD₂t, 0,5 mg A1(OH)₃ a 50 pg MPL.

-7CZ 289476 B6

5.3. Profylaktický pokus na morčatech

V těchto pokusech byla morčata v den 0 primárně provokována 10⁵ pfu (plaky tvořícími jednotkami) HSV2 kmene MS. Po zotavení z primární infekce byla zvířata denně testována na opakované herpetické onemocnění (dny 13 až 21). Morčata byla očkována ve dnech 21 a 42 pomocí vakcíny rgD₂tAl(OH)₃ MPL. Vakcíny byly podávány podkožně v dávce 0,5 ml. Zvířata byla denně sledována s ohledem na výskyt herpetických lézí až do dne +60 či +84.

5.3.2. Studie imunogenity na primátech

Imunogenita vakcíny rgD₂tAl(OH)₃, spojené s MPL v sorbitolu, byla stanovena u afrických zelených opic (Afričan green monkeys). Skupina opic byla ve dnech 0 a 28 očkována 20 pg rgD₂t a 0,5 mg A1(OH)₃, spojenými s 50, 20 nebo 5 pg MPL v sorbitolu. Stanovovány byly specifická humorální (ELISA a neutralizační titry) a buňkami zprostředkovaná (odpověď opožděné přecitlivělosti, DTH) imunitní odpověď. Každá skupina opic zahrnovala 5 zvířat. Přípravky byly podávány nitrosvalově v dávce 1 ml a jejich příprava byla provedena tak, jak bylo popsáno výše. Zvířatům byla přibližně po každých dvou týdnech odebírána krev pro stanovení protilátek.

Odpověď na DTH byla testována 14 dní po druhé vakcinaci. Popis kožního testuje uveden níže.

5.4. Odečty

Stanovení byla prováděna k určení odpovědi specifických protilátek, indukovaných vakcinaci přípravky rgD₂tAl(OH)₃ MPL (určení titrů anti-rgD₂t ELISA a anti-HSV2 neutralizačních titrů). Obranný účinek těchto gD₂ přípravků byl stanoven na profylaktickém a léčebném morčecím modelu. Imunogenní studie byly prováděny rovněž na opicích. Měřena byla také specifická humorální a DTH odpověď.

5.4.1. ELISA a neutralizační titry

Titry protilátek anti-rgD₂ a anti-HSV2 neutralizační aktivita byly měřeny podle metod, popsaných v patentové přihlášce č. WO 92/16 231.

5.4.2. Přecitlivělost opožděného typu (DTH)

Přípravky rgD₂ byly také testovány vzhledem ke schopnosti indukovat specifickou imunitní odpověď T buněk u opic, a to měřením indukce odpovědi opožděné přecitlivělosti (DTH).

Africké zelené opice byly ve dnech 0 a 28 očkovány 20 pg očkovacího přípravku gD₂, podávaného nitrosvalově. 14 dní po druhé vakcinaci injikací 15 nebo 5 pg rgD₂t ve fyziologickém roztoku, aplikované do kůže na břiše, byly podrobeny kožním testům. Po aplikaci fyziologického roztoku byly rovněž provedeny kontrolní kožní testy. Místo injikace bylo sledováno po 24 a 48 hodinách s ohledem na vznik zarudnutí a zatvrdliny a měřen byl rozsah těchto místních reakcí.

5.4.3. Morčecí model intravaginální provokace

Morčecí model pro studium genitální infekce HSV byl popsán L. Stanberrym a spoluautory (J. of Infectious Diseases 146, 397-403, 1982; Intervirology 24, 226-231, 1985). Ve stručnosti, v profýlaktických pokusech byla morčata intravaginálně provokována 10⁵ pfú kmene HSV2, a to jeden měsíc po posledním očkování. Klinický průběh primárního onemocnění byl kontrolován denním sledováním výskytu a závažnosti genitálních kožních lézí během 4 až 12 dnů po době provokace. Poté byla zvířata od 13. do 39. dne denně testována na výskyt opakovaných herpetických lézí. V léčebných pokusech byla morčata v den 0 provokována 10⁵ pfu kmene HSV2. Po zotavení z primární infekce byla denně testována vzhledem k výskytu opakovaného herpetického onemocnění (ve dnech 13 až 21) a byla pak podle výsledků primární a opakované infekce rozdělena do skupin (zajišťujících rovnoměrné zastoupení zvířat se slabou až vážnou infekcí v každé skupině), které buď podstoupily vakcinaci, nebo nebyly léčeny. Vakcíny byly podávány ve dnech 20 a 41 po provokaci. Model opakujícího se onemocnění byl obecně pozorován do asi 70. dne po provokaci.

-8CZ 289476 B6

Herpetické léze byly kvantifikovány za použití škály projevů lézí, s rozsahem od 0 do 32. Systém hodnocení

Typ léze	hodnocení
žádná	0
vaginální léze:
- krvácení	0,5
- zarudnutí po 1 až 2 dny bez krvácení	0,5
- zarudnutí a krvácení po 1 den	1
- zarudnutí bez krvácení po nejméně 3 dny	1
vnější herpetické puchýřky:
- < 4 malé puchýřky	2
- > 4 malé puchýřky nebo jeden velký	4
- > 4 rozsáhlé léze	8
- spojující se rozsáhlé léze	16
- spojující se rozsáhlé léze na celé ploše
vnějších genitálií	32

Klinické odečty

Primární infekce

- Závažnost léze = souhrn denních hodnocení ve dnech 4 až 12 po infekci. Závažnost lézí se vyjadřuje jako aritmetický průměr ± SD (směrodatná odchylka), nebo jako střední hodnota (vhodnější u neparametrického testu).

- Výskyt primární infekce = % zvířat, která prodělala léze o maximálním ohodnocení 0; 0,5; 1; 2; 4; 8 či 16 (zřídka 32).

- Index primární infekce = Σϊ (max. hodnocení i) x (výskyt v %) s i = 0; 0,5; 2; 4; 8 nebo 16.

Opakované onemocnění

- Počet dnů opakování = počet dnů opakované infekce ve dnech 13 až 39 po infekci. Jedno opakování je předcházeno a následováno dnem bez výskytu léze a charakterizováno nejméně dvěma dny se zarudnutím nebo jedním dnem s puchýřem (puchýřky). Počty dnů opakování choroby jsou vyjádřeny jako aritmetické průměry ± SD a střední hodnoty.

5.5. Výsledky

Ochranná účinnost různých přípravků rgD₂t A1(OH)₃ MPL byla srovnávána v profylaktických a léčebných pokusech na morčatech.

Studie imunogenity byly uskutečněny rovněž na primátech. Cílem těchto pokusů bylo srovnat imunogennost a ochranný účinek vakcíny rgD₂t A1(OH)₃, spojené s MPL o různé velikosti částic.

5.5.1. Profylaktické pokusy

Ke stanovení schopnosti různých vakcín rgD₂t A1(OH)₃ MPL poskytnout ochranu vůči primárnímu a opakovanému onemocnění HSV2, pokud se podávají morčatům před intravaginálním zaočkováním viru, byly provedeny dva pokusy.

Pokus 1: Srovnání MPL 100 nm se sorbitolem a MPL TEA

Skupina samic morčat hartley (200 až 250 g) byla ve dnech 0 a 28 imunizována 5 pg rgD₂tAl(OH)₃ v kombinaci s částicemi MPL o malé velikosti (100 nm; MPL v sorbitolu), nebo s

-9CZ 289476 B6 částicemi MPL o vetší velikosti (MPL v TEA). Kontrolním zvířatům byla podle stejného schématu podávána pouze adjuvantní látka, nebo nebyla léčena nijak. Zvířatům byla 14 a 28 dní po druhé vakcinaci odebrána krev pro stanovení protilátek metodou ELISA a neutralizačními pokusy. Zvířata byla 29 dní po druhé vakcinaci intravaginálně provokována 10⁵ pfu kmene HSV2. Po provokaci byla zvířata denně sledována vzhledem ke klinickým známkám akutní infekce (dny 4 až 12 po provokaci) a vzhledem ke známkám opakovaného herpetického onemocnění (dny 13 až 39 po provokaci).

a) Indukce humorální imunity

Jak je ukázáno v Tabulce 3, vyšší neutralizační a ELISA titry byly indukovány v případech, kdy bylo v přípravcích rgD₂tAl(OH)₃ použito částic MPL o malé velikosti.

b) Účinek vakcinace na primární infekci HSV2 (Tabulka 3)

Ve srovnání s kontrolní skupinou, která byla infikována a prodělala akutní primární infekci, byla u obou očkovaných skupin významně snížena závažnost lézí (p < 0,00005). Významně nižší výskyt kožních lézí byl pozorován u skupiny, očkované rgD₂tAl(OH)₃ MPL 100 nm (p < 0,06).

c) Účinek vakcinace na opakované onemocnění HSV2

Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 4. Ve srovnání s kontrolami byly obě vakcíny schopné pozměnit vývoj opakovaného herpetického onemocnění, což bylo změřeno snížením počtu opakovaných příhod (p < 0,02 pro rgD₂tAl(OH)₃ MPL 100 nm).

d) Závěr

Oba přípravky byly schopné poskytnout významnou ochranu vůči primární infekci a oslabit opakující se onemocnění. Výsledky ukazují, že přípravek rgD₂tAI(OH)₃ s obsahem částic MPL o malé velikosti MPL má velmi silnou profylaktickou účinnost.

Pokus 2: Účinnost A1(OH)₃ MPL 100 nm

Morčata hartley (200 až 250 g) byla ve dnech 0 a 28 imunizována 5 pg gD₂, upraveného v A1(OH)₃ MPL 100 nm. Imunizace byla prováděna podkožně v dávce 0,5 ml. V přípravku A1(OH)₃ MPL byla použita dávka 50 pg MPL. Kontrolním zvířatům byla podle stejného schématu injikována pouze adjuvantní látka, nebo nebyla léčena nijak. Zvířatům byla odebrána ve dnech 14 a 28 po druhé vakcinaci krev pro stanovení protilátek pomocí testu ELISA a neutralizačních stanovení. Morčata byla 29 dní po poslední imunizaci intravaginálně provokována 10⁵ pfú HSV2 kmene MS.

a) Indukce humorální imunity

Jak je znázorněno v Tabulce 3, očkované skupiny vytvářely dobré neutralizační a ELISA titry. Kontrolní skupina nevytvářela žádnou zachytitelnou protilátkovou odpověď.

b) Účinek vakcinace na primární infekci HSV2 (Tabulka 3)

Ve srovnání s kontrolní skupinou, která byla infikována a prodělala akutní primární infekci, očkovaná skupina vykázala významné snížení závažnosti lézí (p < 0,00005) a jejich výskytu (p < 0,002). U žádného z očkovaných zvířat se neobjevily žádné příznaky vnějších kožních lézí.

c) Účinek vakcinace na opakované onemocnění HSV2 (Tabulka 4)

Ve srovnání s kontrolami byla vakcína rgD₂tAl(OH)₃ MPL schopna pozměnit vývoj opakovaného herpetického onemocnění, což bylo změřeno významným poklesem závažnosti opakovaných příhod (p < 0,00005) a výskytu opakovaných příhod (p < 0,01).

d) Závěr

Vakcína rgD₂tAl(OH)₃ ve spojení s MPL o malé velikosti částic je velmi účinná v poskytování ochrany vůči primární a opakované infekci HSV2 u morčat.

-10CZ 289476 B6

Z výše popsaných výsledků lze odvodit, že přípravky MPLA1(OH)₃ o malé velikosti částic, získané dvěma odlišnými přístupy, indukují nejméně tak silnou profýlaktickou odpověď, jako tomu je u přípravků MPL A1(OH)₃ o větší velikosti částic. Navíc má MPL o malé velikosti tu výhodu, že může být před použitím snadno sterilizován.

5.5.2. Léčebné pokusy

Cílem těchto pokusů bylo srovnat léčebné schopnosti odlišných přípravků rgD₂tAl(OH)₃ MPL v průběhu opakujícího se herpetického onemocnění u morčat s existující infekcí HSV2.

Morčata byla v den 0 intravaginálně naočkována 10⁵pfu HSV2 kmene MS. Poté byla denně sledována vzhledem ke klinickým známkám akutní infekce (dny 4 až 12) a vzhledem ke známkám opakovaného herpetického onemocnění (dny 13 až 20). Zvířata byla podle výsledků primární a opakované infekce rozdělena do skupin, zajišťujících rovnoměrné zastoupení zvířat se slabou až vážnou infekcí v každé skupině. Morčata bez známek klinických příznaků infekce nebyla zahrnuta do protokolu. Vakcíny byly podávány podkožně ve dnech 21 a 42 po provokaci.

Terapeutická účinnost přípravků rgD₂tAl(OH)₃ MPL byla testována ve třech odlišných pokusech.

Pokus 1: Účinnost rgD₂tAl(OH)₃ v kombinaci s MPL o větší velikosti částic (MPL v TEA)

Morčata, která prodělala opakující se onemocnění, byla rozdělena tak, aby dostala buď 20 pg rgD₂t A1(OH)₃ v kombinaci s MPL o větší velikosti částic (MPL TEA), nebo samotnou adjuvantní látku. Vakcíny byly podávány ve dnech 21 a 42 po provokaci. Obraz opakujícího se onemocnění byl pozorován až do dne 84.

Jak je ukázáno v Tabulce 3, přípravek rgD₂t A1(OH)₃ MPL TEA nebyl účinný pro omezení probíhajícího opakovaného onemocnění.

Pokus 2: Účinnost rgD₂t A1(OH)₃ MPL 100 nm

Dvě skupiny morčat byly buď očkovány 20 pg rgD₂t A1(OH)₃ v kombinaci s MPL o malé velikosti částic (MPL 100 nm), nebo nebyly ovlivňovány.

Očkování bylo prováděno ve dnech 20 a 41 po provokaci. Opakující se onemocnění bylo sledováno až do dne 69.

Jak je znázorněno v Tabulce 5, ve srovnání s údaji z pokusu 1, kde bylo použito MPL o větší velikosti částic, očkování vakcínou rgD₂t A1(OH)₃ MPL 100 nm pozměnilo opakování existujícího onemocnění HSV2 oproti kontrolní skupině významným snížením závažnosti opakování (-39 %, p < 0,05) a počtu dnů opakování (-28 %, p < 0,1).

Pokus 3: Poměrná účinnost A1(OH)₃ v kombinaci s MPL o malé velikosti částic

V tomto pokusu bylo k získání MPL o malé velikosti částic použito třetího přístupu: přídavku činidla Tween, např. Tween 80.

Pokusné skupiny byly následující:

skupina 1 (n = 15): 20 pg rgD₂t/Al(OH)₃ MPL 100 nm s činidlem Tween, skupina 2 (n = 15): 20 pg rgD₂t/Al(OH)₃ MPL 100 nm se sorbitolem, skupina 3 (n = 16): kontroly.

Kontroly buď nebyly ovlivňovány vůbec, nebo byly očkovány samotným A1(OH)₃ MPL. Vakcíny byly podávány ve dnech 21 a 42 po provokaci. Obraz opakujícího se onemocnění byl pozorován až do dne 60 po provokaci.

Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 5. Jasný významný léčebný účinek byl shledán u zvířat, očkovaných dvěma testovanými přípravky rgD₂t/Al(OH)₃ MPL. Oba přípravky významně snižovaly závažnost opakovaného onemocnění, počet dnů opakování a počet opakovaných příhod.

-11 CZ 289476 B6

Závěr:

Velmi silný léčebný účinek vůči existujícímu opakovanému genitálnímu onemocnění HSV2 byl pozorován u přípravků rgD₂t A1(OH)₃ MPL s obsahem částic MPL o malé velikosti (přibl. 100 nm). Naproti tomu nebyl tento léčebný účinek pozorován, pokud byly k vakcíně rgD₂t 5 A1(OH)₃ přidány částice MPL o větší velikosti (MPL v TEA).

Závěrem tedy výsledky, získané u morčat, jasně ukazují profylaktickou účinnost přípravků rgD₂t A1(OH)₃ MPL, připravovaných s částicemi MPL o malé velikosti. Tyto přípravky mají zlepšenou léčebnou schopnost ve srovnání s rgD₂t A1(OH)₃ v kombinaci s částicemi MPL o větší velikosti.

5.5.3. Studie imunogenity rgD₂tAl(OH)₃ v kombinaci s částicemi MPL o malé velikosti u 10 primátů

Imunogenita rgD₂tAl(OH)₃ v kombinaci s částicemi MPL o malé velikosti (MPL 100 nm v sorbitolu) byla měřena u primátů (Afrických zelených opic).

Dávky 50, 20 či 5 pg MPL 100 nm byly spojovány s 20 pg rgD₂t a s A1(OH)₃ (0,5 mg). Dvě vakcinace byly prováděny v čase 0 a po 1 měsíci. Měřena byla specifická humorální (ELISA a 15 neutralizační titry) a efektorovými buňkami zprostředkovaná (DTH) imunitní odpověď.

a) Postup pokusu

Tři skupiny o 5 opicích byly očkovány ve dnech 0 a 28 pomocí 20 pg přípravku gD₂t A1(OH)₃, zahrnujícího 50,20 či 5 pg MPL. Imunizace byla prováděna nitrosvalově v dávce 1 ml. Zvířatům byla odebírána krev každé 2 týdny pro stanovení pomocí ELISA (titry anti-gD₂) a pro neutrali20 začni stanovení. Tři očkovací přípravky byly rovněž srovnány vzhledem ke schopnosti indukovat

T-buňkami zprostředkovanou imunitu in vivo, která byla měřena indukcí odpovědi specifické opožděné přecitlivělosti (DTH). Tři opice z každé skupiny byly podrobeny kožním testům 14 dní po druhé vakcinaci pomocí 15 nebo 5 pg gD₂t, podávaného ve fyziologickém roztoku do břicha. Kožní testy jim byly rovněž provedeny po použití pouhého fyziologického roztoku jako kontroly. 25 Zarudnutí a zatvrdlina v místě zaočkování do kůže byly sledovány po 24 a 48 hodinách.

b) Výsledky

Sérologická a DTH odpověď je znázorněna v Tabulce 6. Skupiny opic, očkovaných přípravkem gD₂t A1(OH)₃ s obsahem buď 50, nebo 20 pg MPL, vytvářely významně více neutralizačních protilátek než skupina, která obdržela dávku 5 pg MPL (p < 0,003 a p < 0,008). Žádný významný 30 rozdíl se neprojevil v neutralizačních nebo ELISA titrech, měřených u skupin s 50 a s 20 pg

MPL. Pozorován byl však vztah mezi dávkou MPL a účinkem na imunitní odpověď, zprostředkovanou efektorovými buňkami. Silná odpověď DTH byla zaznamenána u většiny opic (3/4), očkovaných přípravkem s 50 či 20 pg MPL. Oproti tomu jen jedna opice ze skupiny, která dostala 5 mg MPL, poskytla odpověď v kožním testu.

c) Závěr

Výše uvedené údaje ukazují, že adjuvantní účinek A1(OH)₃ v kombinaci s částicemi MPL o malé velikosti je stejně účinný u primátů a není omezen na malé zvířecí druhy. Vztah mezi dávkou MPL a imunogenitou přípravku rgD₂t A1(OH)₃ MPL lze pozorovat u opic, přičemž dávky 50 a 20 pg poskytují nej lepší sérologické a DTH odpovědi.

Příklad 6: Klinické studie s vakcínami vůči lymské borelióze a hepatitidě B a malým MPL

6.1. Vakcína vůči lymské borelióze, obsahující rozpuštěnou bílkovinu NS1(1-81) z chřipkového viru a antigen OspA, odvozený z B. burgdorferi ZS7

- 12CZ 289476 B6

Příprava těchto přípravků

6.1.1. NSl-OspA/hydroxid hlinitý

NSl-OspA, připravený podle postupu, popsaného ve WO 93/04 175, byl adsorbován na hydroxid hlinitý a inkubován 1 hodinu při teplotě místnosti. Konečný objem byl upraven pomocí fosfátového pufru (10 mM PO₄ ³', 150 mM NaCl). Přípravek byl až do použití uchováván při 4 °C.

Dávka obsahuje 10 pgNSl-OspA/500 pg hydroxidu hlinitého.

6.1.2. NSl-OspA/hydroxid hlinitý/MPL

NSl-OspA byl adsorbován na hydroxid hlinitý a inkubován 1 hodinu při teplotě místnosti. Pak byl k přípravku přidán MPL připravený dříve popsaným způsobem a opět byl inkubován 1 hodinu při teplotě místnosti. Pak byl přípravek upraven na konečný objem pomocí fosfátového pufru (10 mM PO₄ ³’, 150 mM NaCl). Přípravek byl až do použití uchováván při 4 °C.

Dávka obsahuje 10 pgNSl-OspA/500 pg hydroxidu hlinitého/50 pg MPL.

6.1.3. Imunizační schéma

Dobrovolníkům byl třikrát nitrosvalově injikován 1 ml uvedeného přípravku ve dnech 0, 31 a 62. Séra byla odebírána 30 dní po injikaci I, II a III.

Poté u nich byly v inhibičním testu pomoci ELISA analyzovány celkové IgG anti OspA a protilátková odpověď podobná LA-2 (LA-2 Mab byla prokázána jako obranná protilátka vůči infekci u myší).

6.2. HBsAg/MPL přípravky u lidí

6.2.1. Příprava těchto přípravků

HBsAg 20 pg/hydroxid hlinitý 500 pg

HBsAg byl adsorbován na celé konečné množství hydroxidu hlinitého a konečný objem byl upraven pomocí fosfátového pufru (10 mM PO₄ ³', 150 mM NaCl) na 1 ml na dávku. Přípravek byl až do použití uchováván při 4 °C.

6.2.2. HBsAg 20 pg/hydroxid hlinitý 100 pg

HBsAg byl upraven tak, jak bylo dříve popsáno, ale adsorbován byl pouze na 100 pg A1(OH)₃. Konečný objem činil 1 ml na dávku.

6.2.3. HBsAg 20 pg/hydroxid hlinitý 100 pg/MPL 50 pg

HBsAg byl adsorbován na 100 pg hydroxidu hlinitého a inkubován 1 hodinu při teplotě místnosti. Poté byl přidán MPL v požadované koncentraci a inkubován 1 hodinu při teplotě místnosti. Přípravek byl následně upraven vhodným pufrem (viz výše) na konečný objem (1 ml na dávku) a do použití byl skladován při teplotě 4 °C.

6.2.4. Schéma imunizace

Dobrovolníkům (20 lidí ve skupině) byl nitrosvalově injikován 1 ml jednoho z daných přípravků. Séra byla shromažďována v měsíci 0, 1, 3 a 6. V nich byly analyzovány neutralizační protilátky komerčně dostupným testem Abbot.

-13CZ 289476 B6

6.3. Výsledky

Tabulka 8 ukazuje, že MPL, používaný v kombinaci s hydroxidem hlinitým a NSl OspA ve formě 100 nm částic, je účinnější v produkování vyšších protilátkových titrů inhibiční povahy než antigen na hydroxidu hlinitém a že kinetika sérokonverze je rychlejší.

To znamená, že v případě použití rozpustného antigenu, jako je NSl-OspA, u lidí, si MPL v podobě malých částic uchovává adjuvantní vlastnosti, které již vykázal u zvířat za použití jiných rozpustných antigenu.

Tabulka 7 ukazuje, že úbytek adjuvantního účinku, vyvolaný snížením množství přípravku hydroxidu hlinitého v přípravcích vůči hepatitidě B, může být obnoven přidáním MPL ve formě, popsané tímto patentem. MPL také zlepšuje rychlost sérokonverze.

Příklad 7: Kombinovaný očkovací přípravek - vůči hepatitidě B a hepatitidě A

HBsAg se adsorbuje na 90 % celkového množství hydroxidu hlinitého (0,5 mg/ml) a inkubuje přes noc při teplotě místnosti. Hodnota pH se upraví na 6,2 a přípravek se ponechá 14 dní dozrát při teplotě místnosti.

Antigen hepatitidy A v množství 360 až 22 EU (enzym, jednotek) na dávku, ve formě inaktivovaného derivátu kmene HM-175 (jako u přípr. Havrix) se předem adsorbuje na 10 % z konečné koncentrace hydroxidu hlinitého (0,5 mg/ml). Poté se do roztoku přidá zbývající hydroxid hlinitý a ponechá se 1 hodinu protřepávat při teplotě místnosti.

HAV adsorbovaný na hydroxid hlinitý se pak přidá k přípravku HBsAg.

K roztoku HAV/HBsAg o konečné koncentraci 12,5 až 100 μg na dávku 1 ml se přidá MPL (o velikosti částic menší než 100 nm), objem se upraví na výsledný dávkový objem a přípravek se až do použití uchovává při teplotě 4 °C.

Příklad 8: Kombinované vakcíny, obsahující přídavné antigeny

Kombinované vakcíny mohou být připraveny přidáním jednoho nebo více požadovaných antigenů k přípravkům, popsaným výše v příkladech 2, 3 nebo 4.

Příklad 9: Zvýšení humorální imunity a indukce buněčně zprostředkované imunity imunizací myší pomocí HBsAg, upraveného s A1(OH)₃ a MPL

9.1. Účinek A1(OH)₃ s MPL na indukci protilátek anti-HBs

Myši Balb/c byly imunizovány podkožně nebo do kůže rekombinantním HBsAg, adsorbovaným na A1(OH)₃ s MPL jako adjuvantní látkou. Myši byly přípravky HBsAg/Al/MPL imunizovány dvakrát a protilátková odpověď byla měřena po první i druhé dávce. Celkové Ig byly měřeny pomocí ELISA nebo souboru AUSAB (Abbott Lab., Illinois) a zvláštní pozornost byla věnována indukci protilátek isotypu IgG2, neboť tento isotyp je indukován hlavně sekrecí γ-interferonu. Indukce tohoto isotypu tedy nepřímo odráží aktivaci buněčně zprostředkované imunity, jmenovitě aktivaci Thl.

Stanovován byl poměr HBsAg/MPL, stejně jako velikost částic MPL.

9.1.1. Pokus I - Účinek dávky MPL (> 500 nm) na imunogenitu rek.HBsAg, adsorbovaného na AI(OH)₃

Skupinám 10 samic myší Balb/c bylo podkožně injikováno 2,5 μg rek.HBsAg, adsorbovaného na 50 pg Al⁺⁺⁺ (jako A1(OH)₃) a zvyšující se množství MPL (3,1 až 50 mg) o velikosti částic >500nm. Myším byl dvakrát injikován objem 100 μΐ v intervalu 2 týdnů. Krev jim byla odebrána dva týdny po první injikaci a poté opět 1 týden po zesilující injikaci. Celkové antiHBsIgG a specifické IgG2a byly měřeny pomocí ELISA za použití rek.HBsAg jako navázaného

-14CZ 289476 B6 antigenu. Tyto titry byly vyjádřeny jako převrácená hodnota zředění, odpovídajícího 50 % maximální hodnoty (poloviční zředění). Výsledky ukazují nárůst obou skupin specifických IgG a IgG2 s rostoucí dávkou MPL, zejména u dávek 12,5 až 50 pg. Účinek je patrný jak u primární, tak i u sekundární odpovědi a je zvláště zřetelný u IgG2a (až 20 násobný nárůst), což nepřímo ukazuje na sekreci γ-interferonu, indukovanou imunizací pomocí MPL.

9.1.2. Pokus II - Srovnání klinických sérií (šarží) adsorbovaných rek.HBsAg, obsahujících či neobsahujících MPL (> 500 nm)

Připraveny byly 3 klinické šarže rek.HBsAg, adsorbovaného na A1(OH)₃: šarže DSAH16 neobsahovala MPL a sloužila jako kontrola. Šarže DSAR501 a 502 byly připraveny podobným způsobem (20 pg rek.HBsAg, adsorbovaného na 0,5 mg Al⁺⁺⁺ jako A1(OH)₃, ale s obsahem 50 pg MPL (>500 nm).

šarže byly dvakrát podkožně injikovány skupinám 10 myší (200 pl s obsahem 2,5 pl HBsAg, 100 pg Al^^h a 6,25 pg MPL) v intervalu 2 týdnů. Myším byla odebrána krev v den 14 a 1 týden po zesilovací injikaci. Protilátky vůči HBs byly měřeny za použití soupravy AUSAB nebo vloženého testu ELISA pro buď IgG, nebo IgG2a. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2. Ukazují, že 2 týdny po první injikaci indukovaly 2 šarže s obsahem MPL velmi významnou odpověď antiHBs (12,4 a 41,9 mlU/ml). Počet odpovídajících zvířat je rovněž vyšší v přítomnosti MPL (9/10 a 9/10 proti 1/10 v nepřítomnosti MPL). Účinek MPL je potvrzen po zesilovací aplikaci, neboť titry, získané u šarží DSAR501 a 502, jsou přibližně 6 x vyšší než titry, pozorované bez MPL.

To ukazuje, že přinejmenším u myší může MPL (> 500 nm) zlepšit jak kinetiku odpovědi vůči HBs, tak i úroveň této odpovědi.

Tyto výsledky byly potvrzeny při měření specifických IgG a IgG2a po imunizaci šaržemi DSAH16 (bez MPL) a DSAR502 (s MPL): titr anti-HBs IgG je 5 x (primární odpověď) a 3 x (sekundární odpověď) vyšší v přítomnosti MPL.

Pro odpověď IgG2a je účinek MPL mnohem nápadnější, přinejmenším po druhé dávce, což ukazuje na přednostní indukci IgG2a. To nepřímo odráží aktivaci buněčně zprostředkované imunity (sekreci γ-interferonu) přípravkem, obsahujícím MPL.

9.1.3. Pokus III - Účinek dávky MPL (< 100 nm) na imunogenitu rekombinantního HBsAg, absorbovaného na A1(OH)₃

Skupinám 10 myší (Balb/c, samice, 7 týdnů staré) byl podkožně injikován 1 pg rekombinantního HBsAg, absorbovaného na 50 pg Al⁺⁺⁺ (jako A1(OH)₃), v přítomnosti zvyšujících se množství (3,1 až 25 pg) MPL (< 100 nm). Myši byly injikovány dvakrát s intervalem 2 týdnů. Krev jim byla odebrána 2 týdny po první injikaci a 1 týden po zesilovací injikaci. Odpověď vůči HBs byla měřena pomocí ELISA testu (celkové Ig, IgG, IgG2a) ve spojených sérech. Titry byly vyjádřeny jako poloviční zředění (převrácená hodnota zředění, poskytujícího 50 % nejvyšších hodnot). Výsledky ukazují, že i pouze 3,1 pg MPL indukuje silné zvýšení protilátkové odpovědi primární i sekundární odpovědi. Odpověď kulminuje při dávce 6,25 pg a poté se snižuje až na podobnou úroveň, jaká odpovídá nepřítomnosti MPL, pokud jsou použity vysoké dávky MPL (25 pg). Obraz protilátkové odpovědi je podobný pro IgG, IgG2a a pro celkové Ig. Oproti výsledkům, získaným s MPL o větší velikosti (> 500 nm) částic, se ukazuje, že částice MPL o malé velikosti (< 100 nm) jsou mnohem účinnější než větší částice (>500nm) (přinejmenším u humorální imunity), neboť k dosažení maximálního účinku je potřeba méně MPL. Vyšší aktivita MPL o malé velikosti částic byla potvrzena v několika pokusech.

Jak je ukázáno i u MPL o větší velikosti (> 500 nm), adjuvantní účinek MPL je vyšší pro IgG2a než pro celkové IgG či Ig. Při maximálním účinku sekundární odpovědi (6,25 pg MPL) dochází k 25 násobnému zvýšení IgG2a, zatímco zvýšení IgG či celkového Ig činí 7,6 a 4,3.

-15CZ 289476 B6

9.2. Indukce buněčně zprostředkované imunity pomocí rek.HBsAg, adsorbovaného na A1(OH)₃ účinek MPL

Pokud je humorální imunita dostatečná k ochraně vůči hepatitidě B, indukce buněčně zprostředkované imunity (CTL, Thl) by mohla být zvláště důležitá pro léčení onemocnění.

Ovšem pro léčebné vakcíny jsou vyžadovány nové přípravky, neboť A1(OH)₃ je schopný zvýšit humorální imunitu, ale ne buněčně zprostředkovanou imunitu.

Autoři zkoumali účinek MPL na indukci buněk Thl, schopných vylučovat IL-2 (interleukin 2) a γ-interferon u myší Balb/c, imunizovaných rek.HBsAg, adsorbovaným na A1(OH)₃.

9.2.1. Pokus I - Účinek MPL (> 500 nm) na indukci buněk Thl po imunizaci Balb/c myší HBsAg, adsorbovaným na AI(OH)₃

Skupina 10 myší Balb/c (samice, 5 týdnů staré) byla imunizována injikací 30 μ! o obsahu 10 pg HBsAg, 15 pg AT*⁺ (jako A1(OH)₃) a 15 pg MPL, do šlapky každé nohy. Kontrolní myši byly podobně injikovány stejným množstvím rek.HBsAg, smíšeného buď s FCA (Freudovo kompl. adjuvans, pozitivní kontrola), nebo adsorbovaným na A1(OH)₃ bez přítomnosti MPL (negativní kontrola).

dní po imunizaci byly myši zabity a byly od nich získány podkolení lymfatické žlázy. Lymfatické buňky (LNC 2.10⁵/ml) byly kultivovány po různé časové úseky (24 až 74 hodin) v médiu RPMI, doplněném 1 % negativního myšího séra a obsahujícím 5 pg/ml rek.HBsAg. Po ukončení kultivace byla měřena množství IL-2, γ-interferonu (IFN-γ) a IL-4, uvolněná do média. IL-2 byl stanovován pro svou schopnost stimulovat proliferaci (měřenou inkorporací ³H-thymidinu) buněčné linie CTL, závislé na IL-2 (buněk VDA2) a titr byl vyjádřen jako index stimulace (SI= množství ³H-thymidinu, inkorporovaného do stimulovaných buněk/množství ³H-thymidinu, inkorporovaného do nestimulovaných buněk). Množství IL-4 a IFN-γ bylo měřeno za pomoci komerčních souprav ELISA (Holland Biotechnology pro IFN-γ a Endogen pro IL-4). Titry byly vyjádřeny v pg IFN-γ na ml.

Výsledky ukazují, že buňky LNC myší, imunizovaných HBsAg adsorbovaným na A1(OH)₃, nevylučují žádné významné množství IL-2, IL-4 nebo IFN-γ. Oproti tomu jsou vysoké hladiny IL-2 (I.S. = 38 po 48 hodinách) a významné množství IFN-y vylučovány buňkami LNC myší, imunizovaných HBsAg, adsorbovaným na A1(OH)₃ s MPL. Tato sekrece je podobná (pro IFN-y) sekreci, pozorované u myší, imunizovaných HBsAg a FCA, nebo je vyšší (IL-2) a in vitro sekrece nastává dříve.

Žádný IL-4 nebyl zaznamenán po imunizací pomocí HBsAg, adsorbovaným na A1(OH)₃, a to ani v přítomnosti MPL.

Tento sekreční profil ukazuje, že specifické buňky Thl (IL-2, IFN-γ) byly indukovány imunizací adsorbovaným HBsAg v přítomnosti MPL, ale ne v nepřítomnosti MPL. Za takových podmínek imunizace však nebyly zaznamenány žádné Th2 (IL-4).

9.2.2. Pokus II - Účinek dávky MPL (< 100 nm) na indukci buněk Thl po imunizaci Balb/c myší rek.HBsAg, adsorbovaným na A1(OH)₃

Skupiny Balb/c myší byly imunizovány do šlapky každé ze dvou tlapek 30 pl s obsahem 10 pg rek.HBsAg, adsorbovaného na ΑΓ'⁺ (jako A1(OH)₃) a zvyšujícího se množství MPL (100 nm, 0 až 15 pg).

dní po imunizaci byly myši zabity a buňky podkoleních lymfatických žláz (LNC) byly v množství 2.10⁶/ml kultivovány v médiu RPMI, doplněném 1 % negativního myšího séra po různé časové úseky (24 hodin až 96/25) v přítomnosti 5 pg/ml rek.HBsAg.

-16CZ 289476 B6

Vylučování IL-2 bylo měřeno stimulací proliferace buněk VDA2 a koncentrace IL-2 je vyjádřena stimulačním indexem (S.I.); vylučování IFN-γ bylo měřeno za použití komerční soupravy a vyjádřeno v pg/ml.

Bylo zjištěno, že vylučování IL-2 dramaticky vzrostlo účinkem nižší dávky MPL (7,5 pg) a 5 maximální účinek se získá s 15 pg MPL.

Vylučování IL-2 je obecně důležitější po 24 hodinách než po 48 či 72 hodinách.

K vylučování IFN-γ nedochází, pokud je HBsAg adsorbován na A1(OH)₃ v nepřítomnosti MPL. Malá dávka (7,5 pg) MPL indukuje vylučování IFN-γ a opět, maximální účinek se získá s 15 pg MPL. Na rozdíl od toho, co bylo pozorováno pro IL-2, je sekrece IFN-γ v kultuře opožděna a io zvyšuje se s časem do 96 hodin.

Sumárně tyto údaje ukazují, že MPL (menší než 100 nm) je silným induktorem Thl, pokud je spojen s HBsAg, adsorbovaným na A1(OH)₃. Zkoumán byl účinek přípravku, obsahujícího HBsAg adsorbovaný na A1(OH)₃ a MPL, na indukci jak humorální, tak i buněčně zprostředkované imunity u myší Balb/c. Výsledky ukazují, že MPL jasně zlepšuje kinetiku odpovědi vůči 15 HBsAg, neboť jak po primární, tak i po sekundární imunizaci se tvoří mnohem více protilátek anti-HBsAg. Kvalita anti-HBsAg je rovněž pozměněna a pozorováno bylo zejména přednostní indukování IgG2a, odrážející nepřímo vylučování IFN-γ a tedy indukci buněčně zprostředkované imunity.

Přímé stanovení indukce buněk Thl přípravky, obsahujícími HBsAg, A1(OH)₃ a MPL, jasně 20 ukazuje, že MPL je silným induktorem buněk Thl, vylučujících IL-2 i IFN-γ. Druh přípravku je tedy ve vývoji léčebných vakcín důležitý.

Nejlepší výsledky byly získány za použití MPL o velikosti částic menší než 100 nm.

Tabulky, uvádějící výsledky výše popsaných pokusů, jsou uvedeny níže, viz Tabulky 9 až 14.

13. Závěr

Celkové údaje ukazují, že malý MPL je lepší imunostimulační látkou u primátů včetně člověka, než MPL o větší velikosti. To spolu se schopností vytvářet širokou škálu sterilních šarží činí malý MPL vhodným imunostimulátorem pro řadu lidských a veterinárních zdravotních vakcín.

Tabulka 1

Částice MPL a filtrační výtěžek za použití různých parametrů sonikace

č. pokusu	koncentrace (mg/ml)	celk. doba prodlevy v průtokové cele (min)	velikost částic před filtrací (nm)	výtěžek po filtraci (%)
16	1	2,5	92	104
17	1	3	79	78,5
18	1	3,5	95	86,4
19	2	2,8	77	neměř.
20	1	2,8	98	neměř.

-17CZ 289476 B6

Tabulka 2

Stabilita velikosti částice sterilního roztoku MPL, zjišťovaná fotonovou korelační spektroskopií (Malvem) v 1 mg/ml

č. pokusu	velikost částic po filtraci (nm)	velikost částice po stabilitě při 4 °C (nm)
8 dní	1 měsíc	3 měsíce	6 měsíců
9	94	81	74	88	82

Tabulka 3

Profylaktická účinnost přípravků rgD₂tAl(OH)₃MPL u morčat Humorální odpověď a účinek vakcinace na primární onemocnění HSV2

skupina	přípravek	Ab titry (GMT)		PRIMÁRNÍ INFEKCE
		28 dni po lil	závažnost	lézí*	Četnost hodnocení lézí %	PI index***
		ELISA	neutra	arit. prům. ±SD	střed, hod.	0	0,5	1	2	4	8	16
	POKUS 1
ln= 12	rgD2t5pgAI(OH),/MPL (sorbitol)	10 439	673	2,2 ±3,1	0,5	50	17	0	33	0	0	0	75
2n = 12	rgDjt5pgAl(OH)3/MPL TEA	5454	378	4,6 ± 6,3	1,5	42	8	8	25	17	0	0	130
3n=ll	kontroly	<100	<50	55,3 ±51,8	55	18	0	0	0	27	0	55	988
	POKUS 2
In = 10	rgD2t/Al(OH),/MPL 100 nm	21 039	696	0,5 ± 0,7	0	60	30	10	0	0	0	0	25
2n = 10	kontroly	<100	<50	28,5 ± 29,1	31,5	30	0	0	0	10	40	20	680

Suma hodnoceni lézí ve dnech 4 až 12 po infekci.

Hodnocení lézí: žádná leze (0), vaginální léze (0,5 éi 1), vnčjši kožní puchýřky (2,4,8 či 16). Primární infekční index = li (max. hodnocení i) x (četnost %); s i = 0; 0,5; 1; 2,4; 8 či 16.

io Tabulka 4

Profylaktická účinnost přípravků rgD₂tAl(OH)₃MPL u morčat Účinek vakcinace na opakované onemocnění HSV2

skupina	přípravek	OPAKOVANÉ ONEMOCNĚNÍ
závažnost opakováni*	počet dnů opakováni	četnost (%) počtu opak, příhod
arit. prům. ±SD	střed, hod.	arit. prům. ±SD	střed, hod.	0	1	2	3	4	5
In = 12	POKUS 1 rgDjtSpgAlřOHjj/MPL (sorbitol)	5,4 ± 6,2	3,5	4±5	2,5	33	42	8	8	8	0
2n= 12	rgD2t5pgAl(OH)VMPL TEA	6,5 ± 5,9	6,5	4,3 ±3,9	3	27	27	9	27	9	0
3n- 11	kontroly	8,0 ± 5,4	9	5.1 ±3,1	6	18	0	18	64	0	0
ln= 10	POKUS 2 rgD2t/Al(OH)ýMPL 100 nm	1,6 ± 3,9	0	0,5 ±1,1	0	80	20	0	0	0	0
2n-10	kontroly	6,1 ±6,0	6,75	4,3 ± 4,3	4,5	40	0	20	20	0	20

Suma hodnocení lézí ve dnech 13 až 39 po infekci.

Počet dnů opakováni mezi dny 13 a 39 po infekci.

Jedno opakováni následuje po dni bez léze, je takovým dnem také následováno a je charakterizováno nejménč 2 dny zarudnutí nebo 1 dnem s puchýřkem (puchýřky).

- 18CZ 289476 B6

Tabulka 5

Léčebná účinnost přípravků rgD₂t/Al(OH)₃/MPL

skupina	přípravek	LÉČEBNÝ ÚČINEK
závažnost opakováni*	počet dnů opakování **	počet opak, příhod***
arit. prům. ± SD	střed, hod.	arit. prům. ± SD	střed, hod.	arit. prům. ± SD	střed, hod. (% kontrol)
ln= 18	POKUS 1 rgD2t20pgAl(OH)3/MPL (sorbitol)	ND	ND	ND	11	ND	7
2n = 18	kontroly	ND	ND	ND		ND	5
ln = 14	POKUS 2 rgD2t20pgAl(OH)j/MPL 100 nm	11,1 ±8,7 (-39%)	10,25 (-41 %)	8,4 ± 6 (-28 %)	8,5 (-23 %)	3,3 ±2	4
2n=13	kontroly	p05<0 18,3 ±10,3	p <0,1 17,5	P < 0,1 11,7 ±6,8	p<0,31 11	4,4 ± 2,1	4
ln= 15	POKUS 3 rgDjtžOpgAXOHjj/MPL 100 nm,	10,3 ± 10,1	6(-54%)	6,3 ± 5,8	4 (-43 %)	2,7 ±2	3 (-25 %)
2n=15	tween rgD2t20ggAl(OH)j/MPL 100 nm,	8,3 ± 6,7	p < 0,07 6,5 (-50 %)	5,5 ± 4,4	p<0,l 4 (-43 %)	p < 0,1 2,7 ±1,5	P<0,l 3 (-25 %)
3n=16	sorbitol kontroly	12,5 ± 8,1	p < 0,03 13	8,5 ± 4,5	p<0,l 7	3,6 ±1,6	p<0,l 4

⁺ Suma hodnocení lézí ve dnech 21 až 60 po infekci.

Celkový počet dnů u zvířat, která prodělala opakované iéze ve dnech 21 až 60 po infekci.

^w Počet opakovaných příhod ve dnech 21 až 60 po infekci. Jedna příhoda následuje po dni bez léze a je jím také následována a charakterizují ji nejméně 2 dny zarudnuti (hodn. 0,5) nebo 1 den s puchýřem (puchýřky, hodn. 2).

Imunologická léčba: podkožní injikace ve dnech 21 a 42 po infekci.

Statistická analýza: Wilkoxonův řadový souhrnný test vůči adjuvantním kontrolám (není významný pro p < 0,1; NS). Střední hodnoty jsou v tabulce uváděny s údajem o % vzhledem ke kontrolám.

io Tabulka 6

Imunogenita gD₂t A1(OH)₃/MPL 100 nm (sorbitol) u primátů

Výsledky sérologie a DTH (reakce opožděné přecitlivělosti)

vakcína	opice č.	protilátková odpověď*	odpověď DTH** (zatvrdlina)
titr ELISA	titr NEUTRA	PBS	gD2: 5 pg	15 pg
	KQ 100	18630	800	-	+	++
20 pg gD2t	KQ 101	5554	1600	-	-	-
hydroxid hlinitý 50 μg MPL	KQ 102	14870	800	-	++	+++
KQ 103	5486	1600	-	++	+++
	KQ 104	16270	1600	ND	ND	ND
	GMT	10655	1213
	KQ 105	16170	800	-	+	++
20 pg gD2t	KQ 106	4389	800			-
hydroxid hlinitý	KQ 107	20440	1600	-	++	+++
20 pg MPL	KQ 108	5613	800	-	+	+
	KQ 109	6765	1600	ND	ND	ND
	GMT	8876	1056

-19CZ 289476 B6

Tabulka 6 - pokračování

vakcína	opice č.	protilátková odpověď*	odpověď DTH+ (zatvrdlina)
titr ELISA	titr NEUTRA	PBS	gD2:5 pg	15 pg
	KQ 110	2486	200	-	-	-
20 pg gD2t	KQ 111	9918	800	-	++	+++
hydroxid	KQ 112	2526	400	-	-	-
50 pg MPL	KQ113	7137	400	-	-	-
	KQ114	8396	400	ND	ND	ND
	GMT	5181	400

měřeno 14 dní po injikaci II/GMT = geometrický průměr titru, ELISA titr = střední titr,

NEUTRA titr = převrácená hodnota nej vyššího zředění séra, poskytujícího 100% ochranu vůči cytopatogennímu účinku, kožní test v den 14 po II, odečet zatvrdliny: + = 1 mm, ++ = 1 až 5 mm, +++ => 5 mm.

Tabulka 7

čas. rozvrh	N	sérokonverze	%	GMT	min. titr	max. titr
A1(OH)3 (500 pg) HBsAg před	20	0	0	0	0	0
PI (měsíc 1)	20	10	50	6	1	58
PII (měsíc 3)	20	19	95	80	7	565
A1(OH)3 (500 pg) HBs Ag před	20	0	0	0	0	0
PI (měsíc 1)	19	7	36,8	4	1	56
PII (měsíc 3)	19	18	94,7	24	2	320
A1(OH)3 (500 pg) HBs Ag před	20		0	0	0	0
PI (měsíc 1)	20		60	10	1	66
PII (měsíc 3)	20		100	73	6	605

io

-20CZ 289476 B6

Tabulka 8

Imunogenita klinických šarží OspA u lidí

Anti-OspA v inhibičním stanovení LA-2 (neg. ekviv. LA-2/ml) (GMT)

vakcína	před DO	po 130 D28	po II 30 D56	po III 30 D84
NSl-OspA v A1(OH)3	118	233	409	768
SC (%)	2,6	77,2	86,5	100
NSl-OspA + MPL v A1(OH)3	134	269	865	2424
SC (%)	2,6	88,6	97,2	100

N = 80, 10 pg/dávku, nitrosvalově.

Tabulka 9

Účinek rostoucích dávek MPL (> 500 nm) na imunogenitu rek.HBsAg, adsorbovaného na A1(OH)₃

množství MPL (pg/dávku)	odpověď anti-Hbs
celkové IgG	IgG2a
den 14	den 21	den 14	den 21
0 +	69	743	3,2	11
3,13	122	541	3,8	20
6,25	296	882	6,4	24
12,5	371	1359	10	48
25	456	1493	18	138
50	403	1776	33	242

⁺ HBsAgnaAl.

Tabulka 10

Srovnání 3 klinických šarží s obsahem MPL a bez něho Odpověď AUSAB

šarže	dávka HBsAg na A1(OH)3 (pg)	dávka MPL (pg)	GMT anti-HBs (mlU/ml)
DSAH16	2,5	0	0,75	15,1
DSAR501	2,5	6,25	12,4	96,7
DSAR502	2,5	6,25	41,9	89,2

-21 CZ 289476 B6

Tabulka 11

Srovnání 2 klinických šarží s obsahem MPL a bez něho (> 500 nm)

Odpověď anti-HBs IgG a IgG2a

šarže	dávka HBsAg na A1(OH)3 (pg)	dávka MPL (pg)	odpověď anti-HBs
IgG	IgG2a
D15	D21	D15	D21
DSAH16	2,5	0	20	178	<5	5
DSAR502	2,5	6,25	113	641	<5	28

Tabulka 12

Účinek dávky MPL (< 100 nm) na imunogenitu rek.HBsAg, adsorbovaného na A1(OH)₃

dávka HbsAg, ads. naAl(OH)3 (pg)	dávka MPL (< 100 nm) (pg)	odpověď anti-HBs
celkovéIG	IgG	IgG2a
D15	D21	D15	D21	D15	D21
1	0	30	637	67	516	15	99
1	3,12	312	2302	335	3532	167	1752
1	6,25	538	2719	856	3932	261	2521
1	12,5	396	2104	485	3625	125	1393
1	25,0	38	446	141	638	28	233

Tabulka 13

Účinek MPL (> 500 nm) na indukci buněk Thl, specifických vůči HBsAg, u myší Balb/c

dávka HbsAg (pg/myš)	přípravek	in vitro sekce
IL2 (SI)	IFN-γ (pg/ml)	IL-4 (pg/ml)
24 h	48 h	72 h	24 h	48 h	72 h	24 h	48 h	72 h
20	FCA	1,3	2,0	8,0	<125	< 125	385	NT	NT	NT
-	FCA	0,7	1,8	0,7	<125	< 125	< 125	NT	NT	NT
20	A1(OH)3	1,0	1,4	1,2	< 125	< 125	<125	<40	<40	<40
20	A1(OH)3 + MPL (30 pg)	2	38	10	< 125	280	280	<40	<40	<40

Po imunizaci popsané v textu byly lymfatické žlázy kultivovány s 5 pg rek.HBsAg/ml po udaná časová údobí a sekrece IL-2, IFN-γ a IL-4 byla měřena za použití T-buněčné linie VDA₂ a dvou 10 komerčních testů ELISA.

-22CZ 289476 B6

Tabulka 14

Účinek různých dávek MPL (< 100 nm) na indukci Thl buněk, specifických vůči HBsAg

dávka HbsAg (pg/myš)	dávka MPL	in vivo sekrece
IL2 (SI)	IFN-γ	pg/ml)
24 h	48 h	72 h	24 h	48 h	72 h	96 h
20 20 20 20	0 7,5 15 30	2,6 207 270 41	28 173 71 59	21,8 58 36 36	<67 <67 275 <67	<67 207 878 <67	<67 522 1249 <67	<67 698 1582 207

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (28)

1. Očkovací přípravek, obsahující antigen ve spojení s 3-O-deacylovaným monofosforyllipidem A a vhodný nosič, vyznačující se tím, že v kombinaci s antigenem a nosičem obsahuje 3-O-deacylovaný monofosforyllipid A s velikostí částic, nepřevyšující 120 nm.

2. Očkovací přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že velikost částic 3-Odeacylovaného monofosforyllipidu A je v rozmezí 60 až 120 nm.

3. Očkovací přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že velikost částic 3-O-deacylovaného monofosforyllipidu A je menší než 100 nm.

4. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků laž3, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje hydroxid hlinitý.

5. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků laž3, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje emulzi oleje ve vodě nebo jiné nosné prostředí na lipidové bázi.

6. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků laž5, vyznačující se tím, že antigenem je virový antigen.

7. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje antigen vůči hepatitidě A.

8. Očkovací přípravek podle nároku 7, vyznačující se tím, že jako antigen vůči hepatitidě A obsahuje inaktivovaný prostředek tvořený celými buňkami a odvozený od kmene HM-175.

9. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků laž6, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje antigen vůči hepatitidě B.

10. Očkovací přípravek podle nároku 9, vyznačující se tím, že jako antigen obsahuje povrchový antigen hepatitidy B, nebo jeho variantu.

11. Očkovací přípravek podle nároku 10, vyznačující se tím, že povrchový antigen hepatitidy B, obsahuje S-antigen povrchového antigenu hepatitidy B s obsahem 226 zbytků aminokyselin.

12. Očkovací přípravek podle nároku 11, vyznačující se tím, že povrchový antigen hepatitidy B, nádavkem obsahuje sekvenci pre-S.

-23CZ 289476 B6

13. Očkovací přípravek podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že povrchový antigen hepatitidy B, je složená částice o vzorci (L*,S), kde L* znamená modifikovanou bílkovinu L viru hepatitidy B se sekvencí aminokyselin, která zahrnuje zbytky 12 až 52, po nichž následují zbytky 133 až 145 a dále následují zbytky 175 až 400 bílkoviny L a S označuje

5 bílkovinný antigen S z povrchového antigenu hepatitidy B.

14. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků 9ažl3, vyznačující se tím, že navíc obsahuje antigen vůči hepatitidě A.

15. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden antigen vůči hepatitidě a alespoň jednu další složku, zvolenou z antigenu,

10 odlišného od antigenu vůči hepatitidě, která poskytuje ochranu vůči alespoň jedné z následujících chorob: záškrtu, tetanu, černému kašli, Haemophilus influenzae b, nebo dětské obrně.

16. Očkovací přípravek podle nároku 15, vyznačující se tím, že se jeho složky volí z kombinace antigenů vůči záškrtu-tetanu-čemému kašli a povrchového antigenu hepatitidy B, z kombinace antigenu vůči Haemophilus influenzae b a povrchového antigenu hepatitidy B, z

15 kombinace antigenů vůči záškrtu-tetanu-čemému kašli, antigenu vůči Haemophilus influenzae b a povrchového antigenu hepatitidy B, a z kombinace inaktivované vakcíny vůči dětské obrně, antigenů vůči záškrtu-tetanu-čemému kašli, antigenu vůči Haemophilus influenzae b a povrchového antigenu hepatitidy B.

17. Očkovací přípravek podle nároku 16, vyznačující se tím, že navíc obsahuje 20 antigen vůči hepatitidě A.

18. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků laž6, vyznačující se tím, že obsahuje glykoprotein D viru oparu herpes simplex, HSV, nebo jeho imunologický fragment.

19. Očkovací přípravek podle nároku 18, vyznačující se tím, že obsahuje bílkovinu HSVgD2 bez C koncové oblasti pro připoutání.

25

20. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků laž6, vyznačující se tím, že obsahuje antigen gp 160 viru HIV nebo jeho derivát.

21. Očkovací přípravek podle nároku 20, vyznačující se tím, že jako derivát antigenu gp 160 viru HIV obsahuje antigen gp 120 viru HIV.

22. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků laž21, vyznačující se tím, že 30 obsahuje 3-O-deacylovaný monofosforyllipid A v jednotkové dávce v rozmezí 10 až 100 pg.

23. Očkovací přípravek podle kteréhokoli z nároků laž22, vyznačující se tím, že navíc obsahuje polyoxyethylensorbitanmonooleát nebo sorbitol.

24. 3-O-deacylovaný monofosforyllipid A s velikostí částic menší než 120 nm.

25. 3-O-deacylovaný monofosforyllipid A podle nároku 24 ve formě čirého sterilního roztoku.

35

26. Způsob výroby čirého sterilního roztoku 3-O-deacylovaného monofosforyllipidu A podle nároku 25, vyznačující se tím, že se 3-O-deacylovaný monofosforyllipid A uvede do suspenze ve vodě a vzniklá suspenze se podrobí dezintegraci působením ultrazvuku.

27. Způsob výroby očkovacího přípravku podle některého z nároků laž23, vyznačující se tím, že se v prvním stupni k nosiči připoutá antigen a ve druhém stupni se pak ke směsi

40 přidá suspenze 3-O-deacylovaného monofosforyllipidu A podle nároku 25.

28. 3-O-deacylovaný monofosforyllipid A s velikostí částic menší než 120 nm, pro použití v medicíně.