FI110844B - Menetelmä 3-O-deasyloidun monofosforyylilipidin A valmistamiseksi - Google Patents

Description

110844

Menetelmä 3-O-deasyloidun roonofosforyylilipidin A valmistamiseksi - Förfarande för framställning av 3-O-deacylerad monofosfo-ryllipid A

5 Tämä keksintö liittyy menetelmään 3-O-deasyloidun monofosforyy-lilipidin A, jonka hiukkaskoko on alle 120 nm, valmistamiseksi. Voidaan muodostaa rokotekoostumus, jossa on antigeeni liitettynä tähän 3-0-deasyloituun monofosforyylilipidiin A sekä sopivaa 10 kantaja-ainetta.

3-O-deasyloitua monofosforyylilipidiä A (tai 3-de-O-asyloitua monofosforyylilipidiä A) on aiemmin nimitetty 3D-MPL:ksi tai d3-MPLrksi indikoimaan, että pelkistyvän pään glukosamiinin asema 3 15 on de-O-asyloitu. Valmistuksen puolesta katso GB-A-2220211. Kemiallisesti se on seos 3-deasyloitua monofosforyylilipidi A:ta ja 4,5,6-asyloituja ketjuja. Tässä termi 3D-MPL (tai d3-MPL) on lyhennetty MPL:ksi, koska 'MPL' on Ribi-yhtiön rekisteröity tavaramerkki (Ribi Immunochem, Montana), jota Ribi käyttää yksise-20 litteisesti 3-O-deasyloidusta monofosforyylilipidi A -tuottees-taan.

GB-A-2220211 mainitsee, että aiemmin käytettyjen enterobakteeri-: aalisten lipopolysakkaridien (LPS) endotoksisuus vähenee immuno- ,· · 25 geenisten ominaisuuksien pysyessä ennallaan. GB-A-2220211 mai nitsee näistä havainnoista kuitenkin vain bakteriaalisten (gram-negatiivisten) systeemien yhteydessä. MPL:n hiukkaskoosta ei ole mainintaa. Tunnetun 3-O-deasyloidun monofosforyylilipidin A hiukkaskoko on yli 500 nm.

30 :it WO-92/16231 on esittänyt rokotekoostumuksen, joka sisältää Her- .·· pes simplex -virusglykoproteiinia gD tai sen immunologisia frag- mentteja liitettynä 3-deasyloituun monof osf oryylilipidiin A.

. . Taaskaan 3-deasyloidun monofosforyylilipidin A koosta ei ole mi- 3 5 tään mainintaa.

2 110844 WO-92/06113 on esittänyt rokotekoostumuksen, jossa on HIV-gpl60:tä tai sen johdannaista kuten gpl20:tä liitettynä 3-deasy-loituun monofosforyylilipidiin A. MPL:n koosta ei ole mainintaa.

5 Tämän keksinnön kohteena on menetelmä 3-O-deasyloidun monofosfo-ryylilipidin A, jonka hiukkaskoko on alle 120 nm, valmistamiseksi, jossa menetelmässä 3-O-deasyloitu monofosforyylilipidi A (tässä lyhennetty MPL:ksi) suspensoidaan veteen ja saatu suspensio altistetaan sonikaatiolle.

10

Keksinnön mukaisesti voidaan valmistaa rokotekoostumus sekoittamalla antigeeni kantajan ja keksinnön mukaisesti valmistetun MPL:n kanssa, MPL:n hiukkaskoon ollessa alle 120 nm, normaalisti 60-120 nm, edullisesti noin 100 nm tai sitä pienempi.

15 Tällainen rokotekoostumus sopii erittäin moniin monovalentteihin tai polyvalentteihin rokotteisiin.

Yllättäen on havaittu, että tällaisella rokotekoostumuksella on 20 erityisen edullisia tässä kuvattuja ominaisuuksia. Erityisesti nämä koostumukset ovat huomattavan immunogeenisiä. Lisäksi saa-··' · daan taattua adjuvanttiformuloinnin steriliteetti, sillä tuote .sopii steriilisuodatukseen. Lisäetu 'pienestä' MPL:stä on, että :.· | aluminiumhydroksidin kanssa formuloituna MPL vaikuttaa alumini- : : 2 5 umhydroksidin ja antigeenin kanssa muodostaen yhden kokonaisuu den.

Keksinnön eräässä toteutusmuodossa antigeeni on virusantigeeni, . esimerkiksi hepatiitti-infektiota (hepatiitti A, B, C, D tai E) 30 tai herpes- (HSV-1 tai HSV-2) infektiota vastaan suunnattu anti-*; . geeni kuten jäljempänä kuvataan. Katsauksen nykyajan hepa- tiittirokotteista useiden avainviitteiden kera antaa Lancet (12.5.1990, alk. sivu 1142; prof. A.L.W.F. Eddleston) . Katso myös 'Viral Hepatitis and Liver Disease' (Vyas BN, Dienstag JL 35 and Hoofnagle JH, eds. Grune and Stratton, Inc, 1984) ja 'Viral Hepatitis and Liver Disease' (Proceedings of the 1990 Interna- 3 110844 tional Symposium, toim. FB Hollinger, SM Lemon and H Margolis, julkaissut Williams and Wilkins). Viitteitä HSV-l:stä ja HSV-2:sta antaa WO-92/16231.

5 Hepatiitti A-viruksen aiheuttama infektio (HAV) on laajalle levinnyt ongelma, mutta massaimmunisointiin käytettäväksi sopivia rokotteita on saatavilla, esimerkiksi tuote 'Havrix' (SmithKline Beecham Biologicals), joka on tapettua heikennettyä rokotetta, joka on saatu HAV-kannasta HM-175 (katso 'Inactivated Candidate 10 Vaccines for Hepatitis A, FE Andre, A Hepburn and ED Hondt, Prog Med Virol Vol 37:72-95, 1990) sekä 'Havrix'-tuotteen monografia (julkaisija SmithKline Beecham Biologicals, 1991).

Flehmig et ai (loc cit, sivut 56-71) ovat käsitelleet hepatiitti 15 A:n kliinisiä aspekteja, virologiaa, immunologiaa ja epidemiologiaa ja tuoneet esiin lähestymistapoja kehittää rokotteita tätä tavallista virusinfektiota vastaan.

Tässä ilmaisu 'HAV-antigeeni' tarkoittaa mitä tahansa antigee-—_ 20 niä, joka pystyy stimuloimaan HAV:tä neutraloivaa vasta-ainetta ihmisissä. HAV-antigeeni voi sisältää eläviä heikennettyjä vi-h: . ruspartikkeleita tai inaktivoituja heikennettyjä viruspartikke- leita tai se voi olla esimerkiksi HAV-kapsidi tai HAV-virus-j.| | proteiini, joka voidaan helposti saada yhdistelmä-DNA-teknii- : : 25 koin.

Hepatiitti B -virusinfektio (HBV) on laajalle levinnyt ongelma, mutta massaimmunisointiin käytettäväksi sopivia rokotteita on · saatavilla, esimerkiksi tuote ’Engerix-B’ (SmithKline Beecham 3 0 plc) , jota saadaan geenimanipulointitekniikoin.

Hepatiitti B -pinta-antigeenin (HBsAg) valmistus on hyvin doku-·;··.’ mentoitu. Katso esimerkiksi Harforf et ai, Develop Biol Standard 54:125, 1983, Gregg et ai, Biotechnology 5:479, 1987, EP-A-35 0226846, EP-A-0299108 sekä niissä mainitut viitteet.

4 110844 Tässä ilmaisu 'hepatiitti B -pinta-antigeeni' tai 'HBsAg' tarkoittaa mitä tahansa antigeeniä tai sen fragmenttia, joka pystyy osoittamaan HBV-pinta-antigeenin antigeenisyyttä. On selvää, että HBsAg:n S-antigeenin 226 aminohapon sekvenssin lisäksi (katso 5 Tiollais et ai, Nature 317:489, 1985 ja sen viitteet) tässä kuvattu HBsAg voi haluttaessa sisältää kokonaan tai osin pre-S-sekvenssin, kuten on kuvattu edellä mainituissa viitteissä ja EP-A-0278940:ssä. Erityisesti HBsAg voi sisältää polypeptidin, joka käsittää aminohapposekvenssin, jossa on tähteet 12-52, sen 10 jälkeen tähteet 133-145 ja sen jälkeen tähteet 175-400 HBsAg:n L-proteiinista liittyen avoimeen lukukehykseen hepatiitti B -viruksessa serotyyppiä ad (tämän polypeptidin nimitys on L*, katso EP-0414374). HBsAg voi tämän keksinnön puitteissa sisältää myös pre-Sl- tai pre-S-2-polypeptidejä, joita on kuvannut EP-15 0198474 (Endotronics) tai niiden analogeja, esimerkiksi sellai sia, joita kuvaa EP-0304578 (Mc Cormick and Jones). Tässä kuvauksessa HBsAg voi tarkoittaa myös mutantteja, esimerkiksi 'karannutta mutanttia', jota ovat kuvanneet WO-91/14703 tai EP-Al-0511855, erityisesti HBsAg, jossa aminohapposubstituutio asemas-20 sa 145 on glysiinistä arginiiniin.

:·’· · Normaalisti HBsAg on partikkelimuodossa. Hiukkaset voivat sisäl- tää esimerkiksi pelkkää S-proteiinia, tai ne voivat käsittää yh-·.: ’ distelmäpartikkeleita, esimerkiksi (L*,S), jossa L* on sama kuin 25 edellä määritettiin ja S on HBsAg:n S-proteiini. Edullisesti partikkeli saisi olla muodossa, jossa se ekspressoituu hiivassa.

Herpes simplex -viruksen glykoproteiini D sijaitsee virusvaipas-,·. sa, lisäksi sitä on löydetty infektoituneiden solujen sytoplas- 30 masta (Eisenberg RJ et ai, J of Virol 35:428-435, 1980). Se kä-'! . sittää 393 aminohappoa signaalipeptidi mukaanlukien, ja sen mo- lekyylipaino on noin 60 kD. Kaikista HSV-vaippaglykoproteiineis-ta se on todennäköisesti parhaiten karakterisoitu (Cohen et ai, ·· J Virology 60:157-166). In vivo sillä tiedetään olevaan erittäin 35 tärkeä osuus viruksen kiinnittymisessä solumembraaneihin. Lisäksi glykoproteiinin C on osoitettu pystyvän saamaaan esiin neut- 5 110844 raloivia vasta-aineita in vivo (Eing et ai, J Med Virology 127:59-65). Latentti HSV2-virus voi kuitenkin reaktivoitua ja aiheuttaa taudin uusiutumisen huolimatta korkeasta neutraloivan vasta-aineen tiitteristä potilaan seerumissa. Tämän vuoksi on 5 ilmeistä, että pelkkä neutraloivan vasta-aineen indusointi ei riitä taudin säätelyyn.

Tämän keksinnön mukaisesti aikaansaaduissa rokoteformuloinneissa on edullista käyttää kypsää rekombinanttia katkaistua glykopro-10 teiinia D (rgD2t) tai vastaavia proteiineja, jotka on eritetty nisäkässoluista. Esimerkiksi HSV-l:n glykoproteiini gD on eräs tällainen sopiva proteiini.

Eräässä edullisessa toteutusmuodossa rgD2t on 308 aminohapon 15 HSV-2-glykoproteiini D, joka käsittää luonnossa esiintyvän gly-koproteiinin aminohapot 1 - 306 katkaistun proteiinin C-termi-naalin asparagiinin ja glutamiinin lisäksi. Tämä proteiinin muoto sisältää signaalipeptidin, joka pilkkoutuu, jolloin saadaan kypsä 283 aminohapon proteiini. Tällaisen proteiinin tuottamista 20 kiinanhamsterin munasoluissa ovat kuvanneet EP-B-139417, Science 222:524, ja Biotechnology, sivu 527, kesäkuu 1984. Kun tällainen rokote formuloidaan tämän keksinnön mukaisesti pienen MPL:n kanssa, sen terapeuttinen vaikutus on suurempi verrattuna tun-·,· . nettuihin rgD2t-formulointeihin.

:Y 25

Vaikka joillain kokeilluilla ja kaupallisesti saatavilla olevilla rokotteilla päästään erinomaisiin tuloksiin, on tunnustettu tosiasia, että optimaalisen rokotteen tulee sekä stimuloida ,·, neutraloivaa vasta-ainetta että stimuloida mahdollisimman tehok- I · 30 kaasti T-soluvälitteistä soluimmuniteettia.

Eräs erityinen etu on, että keksinnön mukaisesti aikaansaadut ’rokoteformuloinnit ovat erittäin tehokkaita suojaavan immunitee-,···' tin indusoij ia, myös hyvin pieninä antigeeniannoksina.

35 6 110844

Niillä saadaan erinomainen suoja primaarista ja uusintainfektiota vastaa, ja ne stimuloivat edullisesti sekä spesifistä humo-raali- (neutraloivat vasta-aineet) että efektorisoluvälitteistä (DTH) immuunivastetta.

5

Valmistettaessa hiukkaskooltaan pientä 3-O-deasyloitua monofos-foryylilipidiä A, alle 120 nm, voidaan käyttää GB-2220211:n kuvaamaa menetelmää tunnetun 3D-MPL:n valmistamiseksi (tai hiukkaskooltaan suurempaa kaupallista MPL:ää voidaan hankkia Ribi 10 Immunochem. yhtiöltä), ja tuotetta sonikoidaan kunnes suspensio on kirkas. Hiukkaskokoa voidaan arvioida jäljempänä kuvattua dynaamista valosirontaa käyttäen. Jotta MPL:n koko pysyisi 100 nm:n alueella aluminiumhydroksidin kanssa formuloinnin jälkeen voidaan lisätä antigeeniä ja puskuriainetta, Tween 80:tä tai 15 sorbitolia. Näissä olosuhteissa vakiintuneen uskomuksen mukaan MPL ei aggregoidu fosfaattipuskurin läsnäollessa kuten saattaa tapahtua formuloinneissa ilman niitä. Näin menetellen lopullinen formulointi on edelleen määritetty ja karakterisoitu. On myös vakiintunut ajatus, että näissä olosuhteissa MPL vielä vaikuttaa 20 yhdessä aluminiumhydroksidin ja antigeenin kanssa muodostaen yhden kokonaisuuden.

. · Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä aikaansaadaan kirkas : MPL-liuos. Tämä liuos voidaan steriloida suodattamalla.

:V 25

Edullisesti hiukkaskoko saisi olla 60-120 nm.

Vielä edullisemmin hiukkaskoko saisi olla alle 100 nm.

i > I t ... 30 Edellä määritettyä MPL:ää ei normaalisti ole läsnä kuin 10- ’! . 200 μg, edullisesti 25-50 μg/annos/ jolloin antigeeniä on tyy- ·’,,, pillisesti läsnä 2-50 μg annoksessa tai enemmän. Tämän keksinnön mukaisesti aikaansaatu rokoteformulointi voi lisäksi sisältää ,···* immunostimulantteja, eräässä suositeltavassa toteutusmuodossa 35 rokotteet voivat sisältää QS21:ää (joskus siitä käytetään nimitystä QA21). Tämä on HPLC-fraktio saponiiniuutteesta, joka on 7 110844 johdettu puun kuoresta (Quillaja saponaria molina), ja menetelmä sen valmistamiseksi on esitetty US-patentissa 5057540.

Kantaja-aine voi valinnaisesti olla öljy vesiemulsiossa, lipidi-5 vehikkeli tai aluminiumhydroksidi (aluminiumhydroksidisuola).

Myrkytön öljy vesiemulsiossa saisi edullisesti sisältää myrkytöntä öljyä, esimerkiksi Squalenea, ja emulgointiainetta kuten Tween 80, vesiperustaisessa kantaja-aineessa. Vesiperustainen 10 kantaja voi olla esimerkiksi fosfaattipuskuroitu suolaliuos.

Edullisesti rokoteformuloinnit saisivat sisältää antigeeniä tai antigeenikoostumusta, joka pystyy aikaansaamaan immuunivasteen ihmisen tai eläimen patogeeniä vastaan tämän antigeenin tai an-15 tigeenikostumuksen ollessa johdettu HIV-l:stä (esimerkiksi gpl20 tai gpl60, katso WO-92/06113 ja siinä mainitut viitteet), herpesviruksesta kuten gD tai sen johdannaiset tai välittömästä aikaisesta proteiinista kuten ICP27 HSV-l:stä tai HSV-2:sta, gB

. (tai sen johdannaiset) ihmisen sytomegaloviruksesta, gpl, II tai » ‘ 20 III Varicella zoster -viruksesta tai hepatiittiviruksesta kuten hepatiitti B -virus tai muusta viraalisesta patogeenistä, joita • : ovat RS-virus, ihmisen papilloomavirus tai influessavirus, tai . d sellaisia bakteriaalisia patogeenejä vastaan kuin Salmonella, • · :,· ; Neisseria, Borrelia (esimerkiksi OspA, OspB tai niiden johdan- 25 naiset), Chlamydia tai Bordetella, esimerkiksi P.69, PT ja FHA, tai sellaisia parasiitteja vastaan kuin plasmodium tai tokso-plasma. Tämän keksinnön mukaisesti aikaansaadut rokotekoostumuk-set voivat sisältää tuumoriantigeeniä ja ne voivat olla käyttö-,kelpoisia syövän vastaisia rokotteita.

30 . Keksinnön mukaisesti voidaan muodostaa HAV-antigeeni (esimerkik- • t · ·,„ si Havrixissa) seoksena MPL:n ja aluminiumhydroksidin kanssa ku- *:* ten jäljempänä kuvataan.

• » \ % <

< I t I

8 110844

Keksinnön mukaisesti voidaan myös muodostaa HB-viruspinta-anti-geeni (HBsAg (esimerkiksi Engerix-B:ssä) seoksena MPL:n ja alu-miniumhydroksidin kanssa kuten jäljempänä kuvataan.

5 Keksinnön mukaisesti voidaan vielä muodostaa HBsAg-antigeeni (L*,S)-hiukkasina, joita jo kuvattiin edellä, seoksena MPL:n ja aluminiumhydroksidin kanssa.

Tämän keksinnön mukaan voidaan valmistaa myös hepatiitti A plus 10 hepatiitti B -yhdistelmärokotteita.

Voidaan lisäksi muodostaa formulointi, joka käsittää kypsän katkaistun glykoproteiinin D (rgD2t) tai vastaavia proteiineja kuten edellä kuvattiin. Eräs toteutusmuoto puolestaan on formu-15 lointi, joka käsittää OspP-antigeenin tai sen johdannainen Bor-relia burgdorferistä. Antigeeneistä voidaan erityisesti käyttää OSpA-antigeenejä kannoista ZS7 tai B31. Edelleen eräs toteutus-muoto on formulointi, joka käsittää influenssa-antigeenin. Tällä saadaan entistä parempi influenssarokote, erityisesti jos käyte-20 tään 'halkaistua' virusta.

: Formulointi voi sopia myös käytettäväksi herpeettisten kevyiden ·;· partikkeleiden kanssa, joita ovat kuvanneet PCT/GB92/00824 ja : .·. PCT/GB92/ 00179 .

!\\ 25

Edullisesti rokotekoostumus saisi sisältää muitakin antigeenejä, niin että sillä saadaan hoidettua tai ehkäistyä yksi tai useampi muu bakteeri-, virus- tai sieniperäinen infektio.

3 0 Esimerkkinä voidaan mainita, että hepatiittirokoteformuloinnit edullisesti sisältävät vähintään yhden muun komponentin, joka on ei-hepatiittiantigeeni, jonka alalla tiedetään suojaavaan yhdel- ____: tä tai useammalta seuraavista: difteria (kurkkumätä), tetanus • · (jäykkäkouristus), pertussis (hinkuyskä), Haemophilus influenzae ·...· 35 b (Hib) ja polio.

9 110844

Edullisesti rokote sisältää HBsAg:tä kuten edellä määriteltiin.

Erityisiä rokoteyhdistelmiä ovat DTP (difteria, tetanus, pertussis) -hepatiitti B -yhdistelmärokoteformulointi, Hib-hepatiitti B 5 -rokoteformulointi, DTP-Hib-hepatiitti B -rokoteformulointi sekä IPV (inaktivoitu poliorokote)-DTP-Hib-hepatiitti B -rokoteformu-lointi.

Edellä mainituissa yhdistelmissä saisi edullisesti olla kompo-10 nentti, joka suojaa hepatiitti A:ta vastaa, erityisesti tapettua heikennettyä kantaa, joka on johdettu kannasta HM-175, jota on läsnä Havrixissa.

Tällaisissa rokotteissa käytettäväksi sopivia komponentteja on 15 kaupallisesti saatavilla, ja yksityiskohtia voi saada WHO:lta (World Health Organisation). Esimerkiksi IPV-komponentti voi olla inaktivoitu Saikin poliorokote. Hinkuyskärokote voi sisältää kokosolutuotetta tai asellulaarituotetta.

, 20 Edullisesti tämän keksinnön mukaisesti aikaansaatu hepatiitti- tai yhdistelmärokote on pediatrinen rokote.

··· Keksinnön mukaisesti aikaansaatua rokotetta voidaan erityisesti : käyttää hoidettaessa tai ehkäistäessä infektioita kuten virus- .·,· 25 tai bakteeri-infektioita tai syövän immunoterapeuttisessa hoi dossa. Rokotteen eräs suositeltava muoto on terapeuttinen rokote, joka sopii meneillään olevien infektioiden hoitoon, esimerkiksi ihmisille, jotka sairastavat hepatiitti B:tä tai herpesinfektioita .

30 ·.. Rokotevalmisteita kuvataan yleisluontoisesti teoksessa New ... Trends and Developments in Vaccines, Eds. Voller et ai, Univer- sity Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Liposomien kap-. . selointia kuvaa esimerkiksi US-patentti 4235877 (Fullerton) .

35 Proteiinien liittämistä makromolekyyleihin on esitetty esimer-‘:*·· kiksi US-patenteissa 4372945 (Likhite) ja 4474757 (Armor et ai).

10 110844

Rokoteannoksessa käytettävä antigeenimäärä valitaan sellaiseksi, että se saa aikaan iinmunoprotektiivisen vasteen aiheuttamatta merkittäviä sivuvaikutuksia tyypillisille rokotettaville. Täl-5 laiset määrät riippuvat siitä, mitä spesifisiä immunogeenejä käytetään. On tavallista, että annoksissa on aina 1-1000 μg totaalista immunogeeniä, edullisesti 2-100 μg ja edullisimmin 4-40 μg. Optimaalinen partikkelirokotemäärä voidaan varmistaa standarditutkimuksin, joissa havainnoidaan vasta-ainetittereitä 10 ja muita vasteita kohteissa. Alkurokotuksen jälkeen kohteet voivat saada tehosteen noin 4 viikon kuluttua.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä ja sen etuja.

15 Esimerkki 1

Hiukkaskooltaan 60-120 nm olevan MPL:n valmistaminen:

Injektointivettä (WFI) injektoitiin lääkepulloihin, jotka sisälsivät lyofilisoitua 3-de-O-asyloitua monofosforyylilipidiä A 20 (MPL) (Ribi Immunochem, Montana) ruiskun avulla pitoisuuteen 1-2 mg/ml. Alkususpensio saatiin sekoittamalla pyörresekoittimessa.

' Pullojen sisältö siirrettiin sitten pyöreäpohjaisiin 25 ml Co- ;· rex-putkiin (10 ml suspensio putkea kohti) ja suspensiota soni- : '. koitiin vesihaudesonikaattorin avulla. Kun suspensio oli kirkas, 2 5 hiukkaskoko arvioitiin dynaamisen valonsironnan avulla (Malvern Zetasizer 3). Käsittelyä jatkettiin kunnes MPL-hiukkasten koko oli 60 - 120 nm.

Suspensioita voidaan joskus säilyttää 4°C:ssa ilman huomattavaa * 30 aggregoitumista enimmillään viiden kuukauden ajan. Isotoninen 110844 N'aC'l (0,15M) tai isotoninen NaCl plus 10 mM fosfaattia aiheuttaa nopeaa aggregoitumista (koko >3-5μΐΐΐ) .

Esimerkki 2 h Hiukkaskooltaan alle 100 nm olevan steriilin liukoisen MPL: n suurimittainen valmistus: I.-yof ilisoitua 3-de-0-asyloitua monofosf oryy.l ilipidiä A saatiin Rifoi Immunochem -yhtiöltä, ja se suspendoitiin injektointive-10 teen (WFI). Suspensiota pumpattiin jatkuvasti ultraäänivir-tauskyvetin läpi. Virtauskyvetti on tyypillisesti valmistettu lasista tai ruostumattomasta teräksestä PTFE-sulkimin GMP-vaatimusten täyttämiseksi. Ultraääni saatiin aikaan käyttämällä ultraäänigeneraattoria ja titaania olevaa äänipäätä, jotka 15 saatiin Lindat im Ultrasonics -yhtiöltä (Louvain-La-Neuve, Belgia). Silmukkaan pantiin lämmönvaihdin, ettei tuote degradoi-tuisi kuumuuden vaikutuksesta. MPL:n lämpötila virtauskyvetin sisäänmenon ja ulostulon välillä pidettiin alueella +4”C - 30 “C, ja sisäänmenon ja ulostulon välisen lämpötilan ero alle 20 20“C:ssa. Lämpöä poistuu myös materiaalin kulkiessa laitteen läpi.

Laite on esitetty kaaviona kuviossa 1.

, 25 2.1. Sonikaatio: i · MPL-jauhetta (50-500 mg) suspendoitiin WFl:hin pitoisuuteen 1-2 • < mg/ml.

\ t ! *« fy · 30 MPL-suspensiota (samalla sekoittaen) pumpattiin jatkuvasti sonikaatiosilmukan läpi (katso kuvio 1) virtausnopeuden ollessa ; 50-100 ml/min, niin että päästiin systeemin tasapainolämpöti- . laan, joka on alueella +4 - +15“c.

; t 35 Systeemin konfiguraatiossa (teho, virtauskyvetti, nesteen virtausnopeus, T") äänipään oma frekvenssikirjo asetetaan s » 1

I k I

12 110844 laitteiston valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ennalta määrätyt rajat ovat 19000 hertsiä ja 2Ί 000 hertsiä 20000 hertsin muutti-mella.

5 Generaattorilla saadaan kontrolloitua optimaalinen sonikaa-tioteho (enemmän siirtoenergiaa, vähemmän lämpöä) annetulla aikavälillä.

Lämpötila pidettiin prosessin aikana alle 30'-C:ssa MPL:n degra-10 doitumisen estämiseksi.

Prosessi on suoritettu kun hiukkaskoko on pienentynyt alle 100 nm:iin ja liuos on silmin tarkasteltuna kirkas. Sonikaatio-prosessin aikana otettiin näytteitä hiukkaskoon arvioimiseksi ib fotokorelaatiospektroskopian avulla (dynaaminen valonsironta) käyttämällä Malvern Zetasizer 3:a samaan tapaan kuin esimerkissä 1. Nesteen kokonaisoleiluajän virtauskyvetissä laskettiin olevan 2,5 - 3,5 minuuttia (katso taulukko 1) kun käytettiin 20 ml virtauskyvettiä ja kierrätysvirtausnopeusarvona 50 ml/min.

20 Tällä virtausnopeudella keskimääräinen oleiluaika on 2b sekuntia sykliä kohti, ja tavallisesti alle 10 sykliä riittää aikaansaamaan halutun vaikutuksen hiukkaskooltaan pieneen MPL:ään.

i i f , : 25 2.2 Sterilointiprosessi: Y Saatu "liuotettu" MPL steriloitiin umpipääsuodatuksen avulla Y’ käyttämällä hydroftilistä 0,22 mem:n PVDE-membraania. Havaittu 1 j 1 paine oli tavallisesti alle l baarin (106 dyn.cnY). Vähintään * < V ’ 30 25 mg ’'liuotettua" MPL:ä saadaan helposti käsiteltyä neliösent- timetriä kohden saannon ollessa yli 85 %.

- , I

: 2.3. Varastoitavuus/stabiilisuus: t t Y 35 steriiliä "liuotettua” MPL sää säilytettiin +2 - 8'C:ssa.

!

Stabiilisuustiedoissa (Malvern) ei ollut havaittavissa merkit- j » * t » > f i i t i k .1 3 110844 tävää hiukkaskoon muuttumista 6 kuukauden varastoinnin jälkeen (katso taulukko 2).

Esimerkki 3 b Hepatiitti B -rokoteformulointi; MPL (hiukkaskoko alle 100 nm) saatiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Aluminiumhydroksidi saatiin Superfossilta (Alhydro-gei).

3 tJ

MP.L uudelleensuspendoitiin injektointiveteen pitoisuuden vaihdellessa alueella 0,2 - 1 mg/ml sonikoimalla vesihauteessa kunnes hiukkaskoon havaittiin fotokorrelaatiovalosironnan avulla olevan 80-500 nm.

1 b 1-20 μ HBsAg (S-antigeeni kuten Engerix B:ssä) fosfaattipuskuria (liuos 1 mg/ml) adsorboitiin 30-100 μq:aan aluminiumhydrok-sidia (liuos 10,38 AI*' mg/ml) yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa samalla sekoittaen. Liuokseen lisättiin sitten 30-50 20 μg MPL (liuos 1 mg/ml). Tilavuus ja osmolaarisuus säädettiin arvoon 600 μΐ käyttämällä WF1 ja fosfaattipuskuria 5 x konsentroituna. Liuosta inkuboitiin huoneen lämpötilassa yhden tunnin ajan ja pidettiin 4C:ssa käyttöhetkeen asti. Formulointi

i « I

____; kypsyy varastoinnin aikana. Tästä saatiin 10 injektioannosta 25 hiirikokeita varten. Aluminiumhydroksidi saatiin Superfossilta (Alhydrogel) .

• <

Esimerkki 4 ’·' ' Hepat! itt Ä - rokotef ormulointi: 30 i MPL (hiukkaskoko alle 100 nm) saatiin esimerkissä 1 kuvatulla / : tavalla. Aluminiumhydroksidi saatiin Superfossilta (Alhydro- gel).

14 110844 HAV (360—22 KU annosta kohti) adsorboitiin etukäteen 10-prosentti .in aluminiumhydroksidin lopullisesta pitoisuudesta (0,5 mg/ml). MPL (12,5 - 100 ^ig annosta kohti) lisättiin liuokseen.

b Jäljelle jäänyt aluminiumhydroksidi lisättiin liuokseen ja annettiin olla yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tilavuudet säädettiin fosfaattipuskurin avulla (fosfaatti 10 mM, NaCl 150 mM), ja lopullista formulointia säilytettiin 4*C:ssa käyttöhetkeen asti.

10

Esimerkki b

Adjuvantin tehokkuuden vertailu rekombinantilla herpex simplex glykoproteiini D alayksikkö -rokotteella;

Ib b.l Tässä kokeessa arvioitiin erilaisten Ai(OH)3-MPL-formulointien kykyä parantaa herpes simplex -virus tyypin 2 katkaistun glykoprotei inin D (HSV2)(rgD2t) suojaavaa immuniteettia profylaktisin ja terapeuttisin marsumallein. immunogeenisyys-kokeita tehtiin myös kädellisillä. Näiden kokeiden tarkoituk-20 sena oli tutkia 3-de-O-asyloidun monofosforyylilipidin A (MLP) hiukkaskoon vaikutusta immunogeenisyyteen sekä rgD2t-Al(OH)3-MPL-formulointien suojatehoa jyrsijöillä ja kädellisillä.

. . Testattiin kolme erilaista AI(OH)3-MPL-formulointia hiukkas- ,,, : kooltaan pienellä MPL:llä: 25 AI (OH) 3-MPL 100 nm (kuvattiin edellä) *··* Ai (OH) 3-MPL ja sorbitoli : AI (OH) 3-MPL ja Tween * t · 30 5.2. Antigeeni/adjuvanttivalmisteet ja immunisointiaikataulut: 5.2.1. Antigeenif ormuloinnit;

Aluminiumhydroksidi (Ai(OH)3) saatiin SuperfOssilta (Alhydro-35 gel, Superfos, Tanska). MPL saatiin Ribi Immunochem Research inc. -yhtiöltä.

110844 .1b 5.2.1.1. rgD2t—Ai(OH)3/MPL TEA: MPL uudelleensuspendoitiin sonikoimalla vesihauteessa hiukkas-kokoon 200-600 nm. Valmiste valmistettiin tavalla, jonka on 5 esittänyt WO-92/16231, ja sitä säilytettiin 4‘C:ssa käyttöhet-keen ast i.

Yhdessä annoksessa oli b μg rgD2t, 0,b mg Ai(OH)3 ja 50 Mg MPL.

10 5» 2.1.2. rgD2t/Al(OH)3/MPL 100 nm: MPL (hiukkaskoko alle 100 nm) saatiin esimerkin 1 kuvaamalla tavalla. rgD2t adsorboitiin aluminiumhydroksidille ja inkuboi-tiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. MPLtä lisättiin liuokseen 15 tarvittavaan pitoisuuteen ja inkuboitiin vielä 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

Valmiste täydennettiin PBSzllä, niin että lopulliseksi pitoisuudeksi tuli 10 mM: P04, 150 mM NaCl. Lopullista formulointia 20 inkuboitiin vielä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja säilytettiin 4°C:ssa käyttöhetkeen asti.

Yhdessä annoksessa oli 5 μg rgD2t, 0,5 mg AI(OH)3 ja 50 pq MPL. 25 5.2.1.3. rgD2t/Al(OH)3/MPL 100 nm ja sorbitoli: » MPL valmistettiin esimerkin 1 kuvaamalla tavalla. rgD2t adsor-: boitiin aluminiumhydroksidille ja inkuboitiin i tunti huoneen : lämpötilassa. Sitten lisättiin 50 % sorbitolia lopulliseen 30 pitoisuuteen 5 %. Sen jälkeen lisättiin Tri s I o mM -liuos : lopulliseen haluttuun tilavuuteen ja liuosta inkuboitiin 1 tun- ;T. nin ajan huoneen lämpötilassa samalla sekoittaen.

I < i

Valmistetta säilytettiin 4'C:ssa käyttöhetkeen asti.

35 ;>,· Yhdessä annoksessa oli 5 μg rgD2t, 0,5 mg AI (OH) 3 ja 50 μg MPL.

1 (» 110844 5,2=,1.,4. rgD2t/Ai (OH) 3/MPL 100 nm ja Tween: MPL valmistettiin esimerkin 1 kuvaamalla tavalla. Jotta MPL:n koko olisi pysynyt. 100 nm:ssä liuokseen lisättiin Tween 80:tä 5 niin että pitoisuus lopullisessa formuloinnissa oli 0,01 %. Sitten formulointi, valmistettiin samaan tapaan kuin edellä kohdassa 5.2.1.3.

Yhdessä annoksessa oli 5 μg rgD2t, 0,5 mg AI(OH)3 ja 50 μg MPL.

.10 5.3. Profylaktiset kokeet marsuilla: Näissä kokeissa marsuryhmät rokotettiin päivinä 0 ja 28 käyttämällä 5 μg rgl)2t kahtena eri aluminiumhydroksidi/MPL-formuloin-15 tina. Immunisointiruiskeet annettiin subkutaanisesti 0,5 ml annoksena. Kuukausi toisen rokotuksen jälkeen marsut altistettiin intravaginaalisesti 10ri pfu -yksikölle HSV2 kannalle MS. Niitä tarkkailtiin päivittäin primaarisen ja uusiutuvan HSV2-taudin kehittymistä seuraten (päivät 4-39 altistuksen jälkeen).

20 5.3.1. Terapeuttiset kokeet marsuilla: . , Näissä kokeissa marsut altistettiin päivänä 0 10Ji pfu -yksikölle . HSV2 kantaa MS. Primaarisesta infektiosta toipumisen jälkeen 25 niitä tarkkailtiin päivittäin uus intaherpestauti a seuraten ' · (päivät 13-21). Marsut rokotettiin päivinä 21 ja 42 rgD2t- • ·· AI(OH)3-MPL-rokotteella. Rokotteet annettiin subkutaanisesti : 0,5 ml annoksina. Eläimiä tarkkailtiin päivittäin herpes- V ·’ leesioiden havaitsemiseksi aina päivään ±60 tai ±84.

"i r\ _»v> : 5.3.2. Immunogeenisyyskokeet kädellisillä: , MPL:iin ja sorbitoliin yhdistetyn rgD2t/Al(OH) 3 :n immungeeni- syyttä arvioitiin tantalusmarakateilla. Apinaryhmät rokotet- I ♦ *. ·' 35 tiin päivinä 0 ja 28 käyttämällä 20 μg rgD2t ja 0,5 mg Al(OH)3 yhdistettynä 50, 20 tai 5 μg:aan MPL sorbitolissa. Arvioitiin • · i / 110844 spesifiset humoraaii- (ELISA- ja neutralointititterit) ja efektorisoluvälitteiset (viivästyneen tyypin hypersensitii-isyysvaste: DTH) immuunivasteet, Kaikissa ryhmissä oli b eläintä. Formuloinnit annettiin subkutaanisesti 1 ml annok-b sena. Formuloinnit valmistettiin kuten edellä. Eläimistä otettiin verta + joka toinen viikko vasta-ainemääritystä varten.

DTH-vaste testattiin 14 päivää toisen rokotuksen jälkeen. Alla 10 on kuvaus käytetystä ihotestistä.

5.4. Näyttämät:

Suoritettiin analysointikokeet arvioitaessa rgD2t-Äl(OH)3-MPL-15 formulointien indusoimia spesifisiä vasta-ainevasteita (määritys anti--rgD2t-£LISÄ-titterein ja anti-HSV2-neutralontititte-rein). Näiden gD2-formulointien antaman suojan tehokkuutta tutkittiin profylaktisin ja terapeuttisin marsumallein. im-munogeenisyyskokeita tehtiin myös apinoilla. Arvioitiin spesi-2υ fiset humoraali- ja DTH-vasteet.

5.4.1. ELISA ja neutral.onti.titter.it: , Änti-rgD2t-vasta-ainetitterit ja anti-HSv2-neutraiointiaktiivi- 25 suudet määritettiin menetelmin, jotka on esittänyt WO-92/16231..

5.4.2. Viivästyneen tyypin hyper sensitiivisyys (DTH): ’·’ ’ rgD2t-formuloinneista tutkittiin myös niiden kyky indusoida T- 30 soluspesifinen immuunivaste apinoissa mitattuna viivästyneen ; tyyppin hypersensitiivisyys (DTH) -vasteilla.

Tantalusmarakatit rokotettiin päivinä 0 ja 28 antamalla intra-muskulaarisesti 20 μ^ gD2-rokoteformulointia. Ihostestit 3b tehtiin 14 päivää toisen rokotuksen jälkeen intradermaalisella ;ruiskeena vatsaan ib tai 5 μ rgD2t suolaliuoksessa. Injek- 110844 ίο tiokohta tarkastettiin 24 ja 4B tuntia myöhemmin etsien merkkejä punoituksesta ja kovettumisesta, ja näiden paikallisreaktioiden koko mitattiin.

5 ft . 4.3. Marsun intravaginaalinen altistusmalli: HSV-genitaali-infektion marsumallia ovat. kuvanneet L Stanberry ym (L Stanberry et ai, 3 of Infectious Diseases 146:397-403, 1982; Intervirology 24:226-231, 1985). Lyhyesti kuvaten näissä .10 profylaktisissa kokeissa marsut altistettiin intravaginaalises-ti 10'3 pfu -yksikölle HSV2 kantaa MS yhden kuukauden kuluttua viimeisestä rokotuksesta. Primaarisen taudin kliinistä kulkua seurattiin havainnoimalla päivittäin altistusta seuraavina päivinä 4-12 genitaali-iholeesioiden esiintymistihyttä ja 15 vakavuusastetta tutkien. Sitten eläimistä tutkittiin päivittäin merkkejä uusintaherpesleesioista päivinä 13-39. Terapeuttisissa kokeissa marsut altistettiin päivänä ϋ 10b pfu -yksikölle HSV2 kantaa MS. Primaarisesta infektiosta toipumisen jälkeen niitä tarkkailtiin päivittäin uusiutuvaa herpestautia 20 seuraten (päivät 13-21), ja sitten ne satunnaistettiin primaari- ja uusintapisteiden mukaan (jokaiseen ryhmään tuli vastaava jakauma elämiä, joiden leesiot olivat lievästä vakavaan) joko jäämään hoidotta tai saamaan rokotuksen. Rokotteet ; annettiin päivinä 20 ja 41 altistuksen jälkeen. Uusiutuvan 25 taudin mallia seurattiin tavallisesti päivään ±70 altistuksen jälkeen.

i s.‘ ' Herpesleesiot kvantitoitiin leesiop.isteasteikolla 0 - 32.

30 ; · ’ 35 19 110844

Pisteytyssysteemi

Leesiotyyppi Pisteet

Ei lainkaan 0 9 Vaginaalileesiot: - vuoto 0,5 - punoitusta 1 tai 2 päivää ilman vuotoa 0,5 - punoitusta ja vuotoa päivän ajan 1 - punoitusta ilman vuotoa vähintään 3 päivää 1 10 Ulkoiset herpesrakkulat - < 4 pientä rakkulaa 2 - > 4 pientä rakkulaa tai vain i suuri 4 - < 4 suurta leesiota 8 - yhteensulautuneita suuria leesioita. i 6 15 - yhteensulautuneita suuria leesioita (2 koko genitaalialueella

Kliiniset näyttämät 20

Primaari-infektio: - Leesion. vakavuus aste -- päivittäisten pisteiden sumina infek-, : tion jälkeisiltä päiviltä 4-12. Leesion vakavuusaste on ilmoi- "· tettu aritmeettisena keskiarvona ±SD samoin kuin keskusarvona : 25 (paremmin sopiva ei-parametrisissa testeissä).

: - Primaari-infektion esiintymistiheydet = % eläimiä, joilla on ·;·, ollut maksimileesiopisteet 0, 0,5, 1, 2, 4, 8 tai 16 (harvoin I ► » 32).

, , 30

Primaari-infektioindeksi - Li (maks. piste i)x(tiheys%) ja i = 0, 0,5, 2, 4, 8 tai 16.

ί t 3 5 » i 2 ϋ 110844 lJusint atauti : - IJusintapäiväluku uusintapäivien lukumäärä infektioita seuraavina päivinä 13-39. Yhtä uusiutumista edeltää leesioton päivä ja sille on tunnusomaista vähintään kahtena päivänä 5 esiintyvä punoitus tai yhden päivän esiintyvä (yksi tai useampi) rakkula. Uusintapäivien lukumäärät on ilmoitettu aritmeettisina keskiarvoina. ±SD ja keskusarvona.

- Uusiutumisen vakavuusaste - infektiota seuraavien päivien 13 10 - 39 päivittäisten pisteiden summa. Tulokset on ilmoitettu aritmeettisina keskiarvoina ±SD ja keskusarvoina.

5.5. Tulokset: 15 Eri rgl)2t-Al (OH) 3-MPL-f ormulointien antaman suo jan tehokkuutta verrattiin profylaktisilla ja terapeuttisilla marsukokeilla. Immunogeenisyyskokeita tehtiin myös kädellisillä. Näiden kokeiden tarkoituksena oli tutkia hiukkaskooltaan erilaisiin MPLrhin yhdistettyjen rgD2t-Al(OH)3:n vaikutusta immunogeeni-20 syyteen ja suojaustehokkuuteen.

5.5.1. Profylaktiset kokeet:

Suoritettiin kaksi koetta, joilla arvioitiin eri rgD2t-Al(OH)3-25 MPL-rokotteiden kykyä saada aikaan suoja primaarista ja uusiu-* tuvaa HSV2-tautia vastaan kun sitä annettiin marsuille ennen · : intravaginaalista virusinokulointia.

i * i( : Koe 1: Vertailu MPL 100 nm ja sorbitoli versus MPL ja TEA: 30 Ryhmä Hartleynaa iTcaCjiuCi jT3 Li j G. (200-250 g) immunisoitiin päivinä 0 ; ja 28 käyttämällä 5 Mg rgD2t-Al(OH)3 yhdistettynä hiukkaskool- taan pieneen MPL:ään (100 nm; MPL sorbitolissa) tai hiukkaskooltaan suurempaan MPL:ään (MPL TEA:ssa) Verrokkieläimet saivat samaan tapaan ruiskeet, jotka sisälsivät pelkkää adju-

r s I

..· 35 vanttia tai niitä ei käsitelty lainkaan. Eläimistä otettiin ;verta 14 ja 28 päivää toisen rokotteen jälkeen ja suoritettiin

» I

> ( i i » *

I I

21 110844 vasta-ainemääritykset ELISA- ja neutralointikokein. Eläimet altistettiin 29 päivää toisen rokotteen jälkeen intravaginaali-sesti 10s* pfu -yksikölle HSV2 kantaa MS. Altistamisen jälkeen eläimistä tutkittiin päivittäin kliinisiä merkkejä akuutista 5 infektiosta (päivinä 4-12 altistuksen jälkeen) samoin kuin merkkejä uusiutuvasta herpestaudista (päivät 13-39 altistuksen jälkeen).

a) Humoraali-immuniteetin indusointi: 10 Kuten taulukosta 3 ilmenee, suuremmat ELISA- ja neutralointi-titterit saavutettiin kun rgD2t-Al(OH)3-formulointi yhdistettiin hiukkaskooltaan pieneen MPL:ään.

b) Rokotteen vaikutus primaariseen HSV2-infektioon (taulukko IS 3):

Verrattuna verrokkiryhmään, joka infektoitui ja sai akuutin primaari-infektion, molemmilla rokotetuilla ryhmillä oli merkittävästi pienempi leesiovakavuusaste (p<0,00005). Merkittävästi pienempi iholeesiotiheys oli havaittavissa ryhmällä, joka 20 sai rokotteena rgD2t-Al(OH)3-MPL 100 nm (p<0,06).

c) Rokotteen vaikutus uusiutuvaan HSV2-tautiin:

Tulokset on annettu taulukossa 4. Verrokkeihin nähden molemmat rokotteet saivat aikaan muutoksen uusiutuvan herpestaudin 25 kulussa, mitattuna uusiutumisjaksojen lukumäärän vähenemisenä ( ' ' p<0,02 rgD2t~Al(OH)3-MPL 100 nm:lla).

s » t » : d) Johtopäätökset: !<-‘ Molemmilla formuloinneilla saatiin merkittävä suoja primaari- 30 infektiota vastaan ja vähennettyä taudin uusiutumista. Nämä • ; tulokset osoittavat, että pienikokoisia MPL-hiukkasia sisältä- i*: villa rgD2t~Al(OH)3-formuloinneilla on erittäin voimakas profy- taktinen vaikutus.

;· 35 110844

Koe 2: Ai (OH) 3/MPL 1.00 nro:n tehokkuus:

Hartley-marsuja (200-250 g) immunisoitiin päivinä 0 ja 28 käyttämällä 5 μη gD2 formuloituna Ai(OH)3 MPL 100 nm:iin.

5 Rokotteet annettiin subkutaanisesti 0,5 ml annoksina.

Annettiin 50 μg annos MPL:ää AI (OH) 3-MPJL,—formulointiin. Verrok-kieläimet saivat samaan tapaan ruiskeet, jotka sisälsivät pelkkää adjuvanttia tai niitä ei käsitelty lainkaan. Eläimistä otettiin verta 14 ja 28 päivää toisen rokotteen jälkeen ja 10 suoritettiin vsta-ainemääritykset ELISA- ja neutralointikokein. Eläimet altistettiin viimeisen immunisoinnin jälkeen intrava-ginaalisesti 10* pfu -yksikölle HSV2 kantaa MS.

a) Humoraali-immuniteetin indusointi: 15 Kuten taulukosta 3 ilmenee, rokotetulla ryhmällä oli hyvät ELISA- ja neutralointititterit. Verrokkiryhmä ei tuottanut lainkaan havaittavaa vasta-ainevastetta.

h) Rokotteen vaikutus primaariseen HSV2-infektioon (taulukko 20 3) :

Verrattuna verrokkiryhmään, joka infektoitui ja sai akuutin primaari-infektion, rokotetulla ryhmällä oli merkittävästi pienempi leesiovakavuusaste (p<0,00005) ja esiintymistiheys . (p<0,002). Yhdelläkään rokotetulla marsulla ei ollut merkkejä 25 ulkoisista iholeesioista.

* » < · • : c) Rokotteen vaikutus uusiutuvaan HSV2-tautiin (taulukko 4): : Verrokkeihin nähden rgD2t-Al(OH)3-MPL-rokote sai aikaan muutok- '· sen uusintaherpestaudin kulussa, mitattuna merkittävänä uusiu- 30 tumisjaksojen vakavuusasteen vähenemisenä (p<0,00005) sekä : uusiutumisjaksojen esiintymistiheyden vähenemisenä ( p<0,01).

d) Johtopäätökset:

Hiukkaskooltaan pieneen MPL:ään yhdistetty rgD2t-Al(OH)3 on 35 erittäin voimakas suojan antaja primaarista ja uusiutuvaa HSV2-r’*.· infektiota vastaan marsuilla.

‘ ! 23 110844

Edellä esitettyjen kokeiden perusteella voidaan sanoa, että pienikokoisilla MPL-Ä1(OH)3-formuloinnneilla saatiin kahdella eri tavalla indusoitua vähintään yhtä voimakas profylaktinen vaste kuin suurikoisella MPL-Al(OH)3-formuloinnilla. Pieniko-5 koisen MPL: n lisäetuna on, että se on helppo steriloida ennen käyttöä.

5.5.2. Terapeuttiseet kokeet: 10 Näiden kokeiden tarkoituksena oli verrata eri rgD2t-Al(OH)3-MPL-formalointien terapeuttista tehoa uusintaherpestaudissa marsuilla, joilla oli varmasti todettu HSV2-infektio.

Marsuihin inokuloitiin intravaginaalisesti päivänä 0 10& pfu -Ib yksikköä HSV2-kantaa MS. Niistä havainnoitiin akuutin infektion kliinisiä merkkejä päivittäin (päivät 4-12) sekä merkkejä uusintaherpestaudista (päivät 13-20). Eläimet satunnaistettiin primaari- ja uusintapisteiden mukaan eri koeryhmiin, niin että jokaiseen ryhmään tuli vastaava jakauma elämiä, joiden leesiot 20 olivat lievästä vakavaan. Mukaan ei otettu marsuja, joilla ei ilmennyt kliinisiä infektion merkkejä. Rokotteet annettiin subkutaanisesti päivinä 21 ja 42 altistuksen jälkeen.

* t > , rgD2t-Äl(OH)3-MPL-formulointien terapeuttista tehoa tutkittiin 25 kolmella eri kokeella.

1 t I I I

·; Koe 1 : rgD2t/Al (OH) 3 :n tehokkuus yhdistettynä suurikokoisten * » : ' MPL-partikkeleiden kanssa (MPL TEÄ:ssa): t » I I » * 30 Uusintatautia sairastavat marsut satunnaistettiin saamaan joko ; : I 20 rgD2t-Al (OH) 3 yhdistettynä suurikokoisiin MPL-hiukkasiin : ·(MPL TEArssa) tai pelkkää adjuvanttia. Rokotteet annettiin päivinä 21 ja 42 altistuksen jälkeen. Uusintataudin kulkua seurattiin päivään 84 asti.

I » 35 * « t / t > » i t 110844

- I A

Kuten taulukosta J ilmenee, rcji.)2t—AI (OH) 3—MPI.--TEA—formulointi ei tehonnut meneillään olevaa uusiutuvaa tautia vähentävästi.

Koe 2: rgD2t/Al(OH)3-MPL 10U nm:n tehokkuus: b

Kahdelle xnarsuryhmälle joko annettiin rokotteena 20 μg rgD2t-A1(OH)3, joka oli yhdistetty pienikokoisiin MPL-hiukkasiin (MPL 100 nm) tai jätettiin hoitamatta.

10 Rokotteet annettiin päivinä 20 ja 41 altistuksen jälkeen. Uusintataudin kulkua seurattiin päivään 69 asti.

Kuten taulukosta 5 ilmenee, toisin kuin kokeessa 1, jossa käytettiin suurikoista MPLrää, rokotus rgD2t-Äl(OH)3-MPL 100 nm 15 -rokotteella muutti varmasti todetun HSV2-taudin uusiutumista verrokkiryhmään verrattuna vähentäen merkittävästi uusiutumisen vakavuusastetta (-39%, p<0,05) sekä uusiutumispäivien lukumäärää (-28%, p<0,1).

20 Koe 3: AI(OH)3:n komparatiivinen tehokkuus yhdistettynä pienikokoisiin MPL-hiukkasiin: , Tässä kokeessa käytettiin kolmatta strategiaa pienikokoisten . MPL-hiukkasten aikaansaamiseen: lisättiin pinta-aktiivista » 25 ainetta, esimerkiksi Tween 80.

> » » Koeryhmät olivat seuraavanlaiset: i · * i V : Ryhmä 1 (n=15) 20 μg rgD2t/Al(OH)3/MPL 100 nm ja tween 30 Ryhmä 2 (n-15) 20 ^g rgD2t/Al(OH)3/MPL 100 nm ja sorbitoli | Ryhmä 1 (n=16) verrokit i r

Verrokkeja joko ei käsitelty lainkaan tai ne rokotettiin pel- * » 3' * källä AI(OH)3-MPL:llä. Rokotteet annettiin päivinä 21 ja 42 35 altistuksen jälkeen. Uusintataudin kulkua seurattiin päivään t ,! 60 asti.

t i t I l » » I * 2 b 110844

Tulokset on esitetty taulukossa 5. Aivan selvä merkittävä terapeuttinen vaikutus voitiin havaita eläimissä, joihin oli rokotettu näitä kahta rgD2t-Al(OH)3-MPL-formulointia. Molemmat formuloinnit vähensivät merkittävästi uusiutumisen vakavuusas-5 tetta, uusintapäivien lukumäärää sekä uusintajaksojen lukumäärää .

Loppupäätelmät: 10 Erittäin voimakas terapeuttinen vaikutus varmasti todettua HSV2-genitaalitautia vastaan oli havaittavissa rgD2t-Al(OH)3-MPL-formuloinneilla, jotka sisälsivät pienikokoisia MPL-hiuk-kasia (noin 100 nm). Sen sijaan tätä terapeuttista vaikutusta ei ollut havaittavissa kun suurikokoisia MPL-hiukkasia (MPL 15 TEA:ssa) lisättiin rgD2t-Al(OH)3-rokotteeseen.

Loppupäätelmänä voidaan sanoa, että marsuilla saadut tulokset osoittavat erittäin selvästi rgD2t-Al(OH)3-MPL-formulointien omaavan profylaktista tehoa kun ne on yhdistetty pienikoisiin 20 MPL-hiukkasiin. Näiden formulointien terapeuttinen teho on parempi kuin rgD2t-Al(OH)3:11a, joka on yhdistetty suurikokoisten MPL-hiukkasten kanssa.

'' ’ 5.5.3. Kädellisillä suoritetut immunogeenisyyskokeet 25 rgD2t/Al(OH)3:1la, joka on yhdistetty pienikokoisten MPL-hiuk-• ' kasten kanssa: * I I | l: : Pienikokoisten MPL-hiukkasten (MPL 100 nm sorbitoli) kanssa • t · v ·’ yhdistetyn rgD2t-Al (OH)3:n immunogeenisyyttä arvioitiin kädel- 30 lisissä (tantalusmarakateilla). 50, 20 tai 5 μq MPL (100 nm) : yhdistettiin 20 μg rgD2t ja AI (OH) 3 (0,5 mg). Annettiin kaksi ruisketta, kuukausina 0 ja 1. Mitattiin spesifiset humoraali-(ELISA- ja neutralointititterit) ja efektorisoluvälitteiset (DTH) immuunivasteet.

•.. ’ 3 5 26 110844 a) Koemenetelmä:

Kolme viiden marakatin ryhmää rokotettiin päivinä 0 ja 28 käyttämällä 20 μg gD2t/aluminiumhydroksidiformulointia, joka sisälsi 50, 20 tai 5 μq MPL. Immunisointi tehtiin intramusku-5 laarisesti 1 ml annoksin. Eläimistä otettin verta joka toinen viikko vasta-ainetutkimuksia varten ELISA- (anti-gD2-titterit) ja neutralointianalyysikokeita varten. Mitattiin myös, kuinka nämä kolme rokoteformulointia pystyivät indusoimaan T-soluvä-litteistä immuniteettia in vivo, mitattuna spesifisen viiväs-10 tyneen tyyppisen hypersensitiivisyys- (DTH-) vasteen indusoin-nin avulla. Jokaisesta ryhmästä kolmelle apinalle suoritettiin ihotesti 14 päivää toisen rokotteen jälkeen käyttämällä 15 tai 5 μg gD2t annettuna suolaliuoksessa vatsaan. Niille suoritettiin myös ihotestit pelkällä suolaliuoksella. Intradermaalisen 15 inokuloinnin aiheuttamaa punotusta ja kovettumista tarkasteltiin 24 ja 48 tuntia myöhemmin.

b) Tulokset:

Serologiset ja DTH-vasteet on esitetty taulukossa 6. Apinaryh-20 mä, joka sai rokotteena gD2t-Al(OH)3-formulointia, joka sisälsi 50 tai 20 μq MPL:ää tuottivat merkittävästi enemmän neutraloivia vasta-aineita kuin ryhmä, joka sai 5 μ<$ MPL-annoksen (p<0,003 ja p<0,008). Merkittävää eroa ei ollut havaittavissa ELISA- tai neutralointitittereissä 50 tai 20 μq MPL-ryhmissä.

25 MPL-annoksen ja efektorisoluvälitteisen immuunivasteen vaiku-* · tuksen välillä oli havaittavissa vastaavuussuhde. Suurimmalla • J osalla apinoista (3/4), jotka saivat rokotteena 50 tai 20 μg i :· MPL-formulointia oli havaittavissa voimakas DTH-vaste. Sen * * · V · sijaan vain yksi apina 5 μq MPL-ryhmästä kehitti ihotestivas- 30 teen.

c) Loppupäätelmät:

Edellä kuvatut tiedot osoittavat, että adjuvanttivaikutus, joka '·' on AI (OH) 3:11a, joka on yhdistetty pienikokoisiin MPL-hiuk- 35 kasiin, ilmenee myös kädellisillä, eikä rajoitu pienikoisiin eläinlajeihin. Korrelaatio MPL-annoksen ja rgD2t-aluminium- 2 7 110844 hydroksidi-MPL-formuloinnin immunogeenisyyden välillä eli havaittavissa apinoissa 20 ja 50 Mg antaessa parhaat serologiset ja DTH-vasteet.

5 Esimerkki............6

Kliiniset kokeet Lynte- ja hepatiitti B -rokotteilla ja pienellä MPL:liä: 6.1. Lymen tautiin tarkoitettu rokote, joka sisältää fuusio-10 proteiinin NS1(1-81) influenssaviruksesta ja OspA:n, joka on johdettu B. burgdorferistä Z27:

Formulointien valmistustavat: 15 6.1.1. Nöi-OspÄ/aluminiumhydroksidi: NS1-OspA valmistettiin menetelmällä, jonka on esittänyt WO-93/04175, adsorboitiin aluminiumhydroksidille ja inkuboitiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Lopullinen tilavuus säädettiin 20 fosfaattipuskurin avulla (P04 10 mM, NaCl 150 mM). Formulointi säilytettiin 4'C:sa käyttöhetkeen asti.

Yhdessä annoksessa oli 10 Mg NSl-OspA/böQMg aluminiumhydroksi- " . dia.

25 • · 6.1.2. NSl-OspA/aluminiumhydroksidi/MPL: ·,; I NSl-OspA adsorboitiin aluminiumhydroksidille ja inkuboitiin 1 : tunti huoneen lämpötilassa. Edellä kuvattuun tapaan valmistet- 30 tu MPL lisättiin formulointiin ja inkuboitiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Sitten formulointi säädettiin lopulliseen tila- I I I » vuuteen fosfaattipuskurin avulla (10 mM P04 , 150 mM NaCl).

; Formulointi säilytettiin 4“C:ssa käyttöhetkeen asti.

!...· 35 yhdessä annoksessa oli 10 μq OspA/bϋ0μq Al(OH)3/50 MgMPL.

2 8 110844 6.1.3. Immunisointiaikataulu:

Vapaaehtoiset ihmiset saivat ruiskeena kolme kertaa intramusku-laarisesti 1 ml annettua formulointia päivinä o, 31 ja 62.

5 Seerumit otettiin 30 päivän kuluttua, 1, II ja III.

Ne analysoitiin sitten ELISA-analyysillä kohteena kokonais-IgG-anti-OspA ja LA-2 :n kaltainen vasta-ainevaste inhibitiotestissä (LA-s-Mab:n on osoitettu olevan infektioita vastaan suojaava 10 vasta-aine hiirillä).

6.2. HBsAg/MPL-formuloinnit ihmisille: 6.2.1. Formulointien valmistaminen: 15 HBsAg 20 μg/aluminiumhydroksidi 500 μg HBsAg adsorboitiin lopulliseen aluminiumhydroksidin kokonaismäärään ja lopullinen tilavuus säädettiin fosfaattipuskuri-20 suolaliuoksella (P04 10 iriM, NaCl 150 mM) 1 ml annosta kohti. Formulointia säilytettiin 4'C:ssa käyttöhetkeen asti.

6.2.2. HBsAg 20 μg/aluminiumhydroksidi 100 μq 25 HBsAg formuloitiin kuten edellä kuvattiin, mutta adsorboitiin ‘ ·' '· vain 100 μg:aan AI (OH) 3. Lopullinen tilavuus oli 1 ml annosta kohti.

:J : 6.2.3. HBsAg 20 μg/aluminiumhydroksidi 100 μg/MPL 50 μg 30 : HBsAg adsorboitiin 100 μ aluminiumhydroksidia ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sitten lisättiin MPL vaadittuun pitoisuuteen ja inkuboitiin 1 tunti huoneen lämpötilassa.

V ’ Siiten formulointi säädettiin lopuuliseen pitoisuuteen (1 mi 35 annosta kohti) sopivalla puskurilla kuten edellä, ja säilytet-.·. : ti in 4C:ssa käyttöhetkeen asti.

29 110844 6,2.4 , I mu niso i ntlaikataul u:

Vapaaehtoisiin ihmisiin (ryhmässä 20) injektoitiin I.M. 1 ml yhtä annetuista formuloinneista.

5

Seerumit koottiin kuukausina 0, 1 3 ja 6. Niistä analysoitiin neutraloivat vasta-aineet kaupallisesti saatavan Abbotin testin avulla.

10 6.3. Tulokset:

Taulukko 8 näyttää, että MPL käytettynä yhdessä aluminiumhy-droksidin ja NSl-OspA:n kanssa 100 nm hiukkasten muodossa on tehokas korkeampien luonteeltaan inhibitoristen vasta-ainetit-15 terien tuottaja kuin antigeeni aluminiumhydroksidilla, ja että seerumikonversion kinetiikka on nopeampaa.

Tämä varmistaa, että liukoisen antigeenin kuten NSl-OspA:n ollessa kyseessä hiukkaskooltaan pieneksi formuloitu MPL säi-20 lyttää adjuvanttiominaisuutensa, joita se jo osoitti eläimissä muiden liukoisten antigeenien kanssa.

Taulukosta 7 voidaan nähdä, että adjuvanttivaikutus, joka häviää kun hepatiitti B -formuloinneissa läsnä olevan alu-25 miniumhydroksidiformuloinnin määrää vähennetään, voidaan saada : : uudestaan aikaan lisäämällä tässä patenttihakemuksessa kuvatta- vaa MPL:ää. MPL parantaa myös seerumikonversionopeutta.

r t · t a

Esimerkki 7 30 Yhdistelmärokoteformulointi: hepatiitti B + hepatiitti A: HBsAg adsorboitiin 90 prosenttiin lopullisesta aluminiumhydrok-sidimäärästä (0,5 mg/ml) ja inkuboitiin yli yön huoneen lämpö-·,' * tilassa. pH säädettiin arvoon 6,2, ja valmisteen annettiin 3 5 olla 14 päivää huoneen lämpötilassa kypsymistä varten.

110844 O o

Hepatiitti A- antigeeniä, 360-22 EU annosta kohti, inaktivoidun HM-175 -kannan johdannaisen (kuten Havrixissa) muodossa adsorboitiin etukäteen 10 prosenttiin aluminiumhydroksidin lopullisesta pitoisuudesta (0,5 mg/ml). Jäljelle jäävä aluminiumhy-5 droksidi lisättiin sitten liuokseen ja annettiin olla yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa samalla kuin sitä sekoitettiin.

Aluminiumhydroksidille adsorboitu HAV lisättiin sitten HBsAg-10 formulointiin.

MPL (hiukkaskoko alle 100 nm) lisättiin HAV/HBsAg-liuokseen lopulliseen pitoisuuteen 12,5 - 100 μςί per 1 ml annos, tilavuus säädettiin lopulliseen annostilavuuteen, ja formulointia säily- 15 tettiin 4‘"'C:ssa käyttöhetkeen asti.

Esimerkki 8

Lisäantigeenejä sisältävät yhdistelmärokotteet: 20 Yhdistelmärokotteet voidaan valmistaa lisäämällä yhtä tai useampaa haluttua antigeeniä edellä esimerkissä 2 tai 3 tai 4 kuvattuihin formulointeihin.

Esimerkki 9 25 Humoraali-immuniteetin lisääminen ja soluvälitteisen immunitee-: : tin indusointi immunisoimalla hiiriä aluminiumhydroksidin ja .,ϊ MPL:n kanssa formuloidulla HBsAgllä:

* I

9.1. AI(OH)3-MPL:n vaikutus anti-HBs-vasta-aineinduktioon: 30 : Balb/c-hiiriä immunisoitiin subkutaanisesti tai intradermaali- >;·. sesti rekombinantilla HBsAgrllä, joka oli adsorboitu AI(OH)3:lie MPL adjuvanttina. Hiiret immunisoitiin kahdesti .· * HBsAg/Al/MPL-formuloinneilla, ja vasta-ainevaste mitattiin 35 ensimmäisen ja toisen annoksen jälkeen. Kokonais-Ig mitattiin ,·, : ELlSA-analyysillä tai AUSAB-pakkauksen avulla (Abbott Lab, 31 110844 111.), ja erityishuomio kohdistettiin isotyypin IgG2a- vasta--aineiden indusointiin, sillä tämä isotyyppi indusoituu pääasiallisesti q-interieronin erityksen kautta. Tämän isotyypin indusoituminen siis heijastaa epäsuorasti soluvälitteisen 5 immuniteetin aktivoitumista, nimittäin Thl-aktivoitumista.

Suhdetta HBsAg/Äl/MPL tutkittiin samoin kuin MPL-hiukkasten kokoa.

10 9.1.1. Koe 1: MPL (>500 nm) annoksen vaikutus AI (OH) 3: lie adsorboidun rekoxn-binantin HBsAg:n immunogeenisyyteen: 15 Kymmenen öalb/c-naarashiiren ryhmän eläimiin injektoitiin subkutaanisesti 2,5 mcg recHBsAg adsorboituna 50 mg Alin (Ai(OH)3 ma) ja lisääntyviä MPL-määriä (3,1 - 50 mcg) hiukkas-koon ollessa >500 nm. Hiiriin ruiskutettiin kahdesti 100 mcl tilavuus, ruiskeiden välinen aika oli kaksi viiikkoa. Eläimis-20 tä otettiin verta ensimmäisen injektion jälkeen (osittainen otto), ja viikko sen jälkeen kun oli annettu tehoste. Kokonais-anti-HBsIgG ja spesifinen igG2a mitattiin ELlsA-ana-lyysin avulla recHBsAg sieppausantigeeninä. Titterit on ilmoitettu vastaamaan laimennosta, joka vastaa 50 % maksimiarvosta 25 (puolivälilaimennos). Tulokset osoittavat lisääntymistä sekä : : spesifisen IgG:n että igG2a:n kohdalla lisääntyvin MPL-annok- sin, erityisesti annoksilla 12,5 - 50 mcg. Tämä vaikutus on > * - ;; nähtävillä sekä primaari- että sekundaarivasteissa, ja on erityisen selvä IgG2a:n kohdalla (yli 20-kertainen lisääntykö iäinen), mikä osoittaa epäsuorasti, että MPL- immun i s o i n t i in-: dusoi g-interferonin erittymistä.

9.1.2. Koe II: MPL (>500 nm) sisältävän ja sisältämättömän V * adsorboidun recHBsAg:n kliinisten erien vertailu: 35 32 110844

Valmistettiin 3 kliinistä erää AI(Oli)3:een adsorboitunutta recHBsAg:tä. Erä DSAH16 ei sisältänyt MPLrää ja toimi verrokkina. Erät DSAR501 ja 502 valmistettiin samaan tapaan (20 mcg recHBsAg adsorboituna 0,5 mg A1+++ Al(OH)3:na), mutta ne sisäl-5 sivät 50 mcg MPL:ää (>500 nm).

Nämä kolme erää injektoitiin subkutaanisesti 10 hiiren ryhmille (200 mcl sisältäen 2,5 mcg HBsAg, 100 meg A1+++ ja 6,25 mcg MPL), kahdesti 2 viikon välein. Hiiriltä otettiin verta päi-10 vänä 14 ja viikko tehosteen jälkeen. Anti-HBs-vasta-aineet mitattiin apuna Ausab-pakkaus tai sisäinen ELISA Ig:tä tai IgG2a:ta varten. Tulokset on esitetty taulukossa 2. Ne osoittavat, että 2 viikkoa ensimmäisen ruiskeen jälkeen MPLrää sisältävät kaksi erää indusoivat erittäin merkittävän anti-HBs-15 vasteen (12,4 ja 41,9 miU/ml) kun taas erä, joka ei sisällä MPLrää indusoi vai marginaalisen vasteen (0,75 miU/ml). Myös vastaajien lukumäärä on suurempi MPLrää käytettäessä (9/10 ja 9/10 versus 1/10 ilman MLPrää). MPLrn vaikutus vahvistuu tehosteen jälkeen, sillä eristä DSAR5Q1 ja 502 saadut titterit 20 ovat noin 6 kertaa suuremmat kuin ilman MPLrää havaitut.

Tämä osoittaa, että ainakin hiirillä MPL (>500 nm) voi parantaa sekä anti-HBs~vasteen kinetiikkaa että anti-HBs-vasteen tasoa.

25 Nämä tulokset saadaan vahvistettua kun mitataan spesifiset IgG ! : ja IgG2a kun on suoritettu immunisointi erillä DSAH16 (ilman MPLrää) ja DSAR502 (MPLrn kanssa): anti-HBs-IgG-titteri on 5 * - * (primaarivaste) ja 3 (sekundaarivaste) kertaa suurempi kun : läsnä on MPLrää.

30 ; .lgG2a-vasteen kohdalla MPLrn vaikutus on jopa hätkähdyttävämpi, ainakin toisen annoksen jälkeen, indikoiden preferentiaalista lgG2a-induktiota. Tämä heijastuu epäsuorasti soluvälitteisen ’ immuniteetin aktivoitumiseen (gammainterferonin erittyminen) ',,,· 35 MPLrää sisältävän valmisteen vaikutuksesta.

I i I » t I i 3 3 110844 9.1.3. Koe III: Mil, {<100 nm) annoksen vaikutus AI(OH)3;lie adsorboidun rekombinantin HBsAqrn immunogeenisyyteen: 10 hiiren ryhmälle (Balb/c, 7 viikon ikäiset naaraat) injektoi-5 ti in subkutaanisesti 1 mcg HBsAgrtä adsorboituna 50 mcg:aan A1++ + (Al(0H)3:na) sekä lisääntyviä määriä (3,1 - 25 mcg) MPL (<100 nm). Hiiriin ruiskutettiin 200 mcg kahdesti 2 viikon välein. Hiiriltä otettiin verta kaksi viikkoa ensimmäisen ruiskeen ja 1 viikko tehosteen jälkeen. Anti-HBs-vaste arvioi-10 tiin ELISA-menetelmällä (kokonais-Ig, XgG, igG2a) yhdistetyistä seerumeista. Titterit on ilmoitettu laimennosten puolivälilai-mennoksina (laimennoksen käänteisarvo antaa 50% suurimmista arvoista). Tulokset osoittavat, että jo 3,1 mcg MPLrää indusoi voimakkaan vasta-ainevasteen lisääntymisen sekä primaari- että 15 sekundaarivasteissa. Vaste kulminoituu määrän ollessa 6,25 mcg ja vähenee sitten kunnes saavuttaa saman tason kuin ilman MPLrää kun käytetään suuria MPL-annoksia (25 mcg). Vasta-ainevasteen malli on samanlainen sekä IgGrllä, IgG2a:lla ja kokonais-Ig:llä. Tulokset eivät ole samoja kun käytetään 20 suurempikokoista MPLrää (>500 nm), ja ne osoittavat, että pienikokoiset (<100 nm) MPL-hiukkaset ovat tehokkaampia kuin suurikokoiset (>500 nm) MPL-hiukkaset (ainakin humoraali-im™ muniteetin osalta), sillä maksimaaliseen vaikutukseen tarvitaan vähemmän MPLrää. Pienikokoisen MPLrn suurempi aktiivisuus 25 todettiin usella kokeilla.

·’ Kuten suurikokoisen MPLrn (>5ϋϋ nm) kohdalla nähdään MPLrn ; j adjuvanttivaikutus on suurempi IgG2arn kohdalla kuin kokonais- ·': IgGrn tai Igrn. Maksimaalisella teholla sekundaariseen vastee- 30 seen (6,25 mcg MPLrllä) IgG2arn kohdalla on 25-kertainen 3i-: ,·, sääntyminen kokonais-IgGrn ja Igrn arvojen ollessa 7,6 ja 4,3.

9.2. Soluvälitteisen immuniteetin indusointi AI(OH)3 reen adsor-V · boidulla recHBsAgrllä - vaikutus MPLrään: 33 35

I I

3 ·ί 110844

Jos humoraali-immuniteetti riittää suoiaamaan hepatiitti EiItä soluvälitteisen immuniteetin (OTL, Thl) indusointi saattaa olla erityisen tärkeää taudin hoidon kannalta.

b Terapeuttisia rokotteita varten tarvitaan kuitenkin uusia formulointeja, sillä Ai(OH)3 pystyy parantamaan humoraalista immuniteettia muttei soluvälitteistä immuniteettia.

Olemme tutkineet MPL:n kykyä indusoida Thl-soluja, jotka pystyit) vät erittämään lL-2:ta ja g (eli gamma) -interferonia Balb/c-hiirissä, jotka on immunisoitu käyttämällä AI (Oil) 3 :een adsorboitua recHBsAg:tä.

9.2.1. Koe 1 : MPL (>500 nm):n vaikutus Thl-soluindusointiin Ib kun on suoritettu Balb/c-hiirien immunisointi käyttämällä AI(OH)3:een adsorboitua HBsAg:tä: 10 Baib/c-hiiren ryhmä (5 viikon ikäiset naaraat) immunisoitiin injektoimalla käpäliin 30 mcl liuosta, jossa oli 10 mcg HBsAg, 20 Ib mcg AH......H- (Al(QH)3:na) sekä 15 mgc MPL. Verraksi hi iret saivat samanlaiset ruiskeet, joissa oli sama määrä recHBsAg:tä joko sekoitettuna FCA:n kanssa (positiivinen kontrolli) tai adsorboituna AI(OH)3:lie ilman MPL:ää (negatiivinen kontrolli).

25 Kuusi päivää immunisoinnin jälkeen hiiret lopetettiin ja niistä : otettiin polvitaiveimusolmukkeet. Imusolmukesoluja (LNC

,.!: 2,105/ml) viljeltiin eripituiset ajanjaksot (24 tunnista 74 : : tuntiin) RPMI-väliaineessa, johon oli lisätty 1 % negatiivista hiiren seerumia ja joka sisälsi 5 mc g/mi recHBsAg. Viljelyn 30 loputtua mitattiin väliaineeseen erittyneet IL-2-, INF-g- ja ; ll-4-määrät. lL-2:ta arvioitiin sen kyvyn mukaan stimuloida t>;·, (arvioituna 3H-tymi di in i lisäyksen avulla) IL-2-riippuvaisen

i « I

CTL-solulinjän (VDA2-solut) proliferaatiota, ja titteri ilmais-·,· * tiin stimulointi-indeksinä (31== stimuloituihin soluihin lisätty /,/ 35 3H-tymidiinimäärä/stimuloimattomiin soluihin lisätty 3H-tyrnii- , ; diinimäärä. IL-4- ja INF-g-määrät laskettiin kaupallisten

t I

35 110844 ELISA pakkausten avulla (Holland Biotechnology INF~g:llu ja Endogen iL-4:llä), Titterit on ilmoitettu pgrammoina iFN-g/ml.

Tulosten mukaan ei huomattavia IL-2-, 1L-4- tai INF-g-määriä 5 erittynyt LNC:stä hiirillä, jotka oli immunisoitu käyttämällä AI(OH)3:lie adsorboitua HBsAg:tä. Sen sijaan korkeita 1L-2-tasoja (IS = 38, 48 h) ja merkittävä INF-g-määrä erottui LNC-soluista hiirillä, jotka oli immunisoitu AI(OH)34 MPL:iin adsorboidulla HBsAg:llä. Tämä erittyminen on samanlaista (INF-10 g) tai runsaampaa (1L~2) kuin hiirillä, jotka on immunisoitu käyttämällä HBsAg + FCÄ ja erittyminen in vitro tapahtuu aikaisemmin.

IL-4:ää ei ollut havaittavissa kun oli suoritettu immunisointi 15 Ai(OH)3:lie adsorboidulla HBsAg:1la, ei edes MPL:n läsnäollessa.

Tämä eritysprofiili viittaa siihen, että Th l -solut (IL-2, INF-g) on indusoitu immunisaatiolla adsorboidulla HBsAg:llä 20 MPL:n läsnäollessa, muttei ilman MPL:ää. Näissä immunisoin-tiolosuhteissa ei kuitenkaan havaittu Th2:ta (iL~4:ää).

9.2.2. KOE II: MPL (<100 nm) annoksen vaikutus Thl-solujen indusointiin kun on suoritettu Balb/c-hiirien immunisointi 25 Al(OH)3:een adsorboidulla recHBsAg:llä: > · t . jj‘ Viiden Balb/c-hiiren ryhmä immunisoitiin antamalla 2 polkuantu- raan 30 mcl liuosta, jossa oli 15 mc g All++:lle (Al(0H)3:na) adsorboitua recHBsAg:tä ja kasvavia määriä MPL:ää (100 nm, 0-15 t 30 mcg).

Kuusi päivää injektoinnin jälkeen hiiret lopetettiin ja polvi-

' I I

taiveimusolmukkeiden soluja viljeltiin, 2,106 solua/ml HPMl:- v · ssä, johon oli lisätty 1% negatiivista hiiren seerumia eripi- , · « ' : 35 tuisin ajanjaksoin (24 tunnista 96/25) kun läsnä oli 5 mcg/ml t ·" ; recHBsAg:tä.

’ I I

110844 J Lf lL-2:n erittymistä mitattiin VDA2-solujen proliferaution stimu-i o itämisenä, ja lL-2-ρίtoisuus on ilmoitettu stimulaatioindek-sinä (SI). lNF-g:n erittymistä mitattiin kaupallisen pakkauksen avulla, tulokset on ilmoitettu pg/ml. b

Havaittiin, että IL-2:n erittyminen lisääntyy pienemmällä MPL-annoksella (7,5 meg) hätkähdyttävästi, ja että maksimaalinen vaikutus saavutetaan käytettäessä lb meg MPL.

10 IL-2:n erittyminen on yleensä suurempaa 24 tunnin kuluttua kuin 48 tai 72 tunnin kuluttua.

INF-g-erittymistä ei tapahdu kun HBsAg adsorboidaan Al(OH)3:lle ilman MPLrää. Pieni MPL-annos (7,b meg) indusoi iNF-g-eritty-15 mistä, ja taaskin maksimaaliseen vaikutukseen päästään käytettäessä 15 meg MPL. Toisin kuin lL-2:n kohdalla, INF~g:n erittyminen viivästyy viljelyssä, ja lisääntyy ajan myötä 96 tuntiin asti, 20 Kaikki nämä tiedot yhdessä viittaavat siihen, että MPL (alle 100 nm) on voimakas Tili-indusoi ja kun se yhdistetty AI (OH) 3: lie adsorboidun HBsAg:n kanssa.

i

Ai(uh)3:Ile adsorboitua HBsAg:ta ja MPL:ää sisältävän forrau-1 25 loinnin tehoa indusoida sekä humoraali- että soluvälitteistä ; immuniteettia Balb/c-hiirissä on tutkittu. Tulokset osoitta- vat, että MPL selvästi parantaa anti-ΗΒε-vasteen kinetiikkaa, sillä paljon enemmän anti-HBs-vasta-aineita löytyy sekä primaa-ri~ että sekundaari-immunisoinnin jälkeen. Myös anti-KBs:n 30 laatu muuttuu, ja on havaittu preferentiaalista I'gG2a-1 rsdusoi-,·, tumista, mikä heijastaa epäsuorasti INF-g-erittymistä ja näin soluvälitteisen immuniteetin indusoitumista.

j ’> Arvioitaessa suoraan Thi-solujen indusoitumista formuloinneil-_i 3b la, jotka sisältävät HBsAg:tä, AI(OH)3:a ja MPL:ää ilmenee ’ > selvästi, että MPL on indusoi tehokkaasti Thl-soluja, jotka » i }

' i i I

110844 erittävät seka 1L-2:ta että INI’- g:tä. tasan ka Itäinen Itisu ]ointi on siis tärkeä terapeuttisten rokotteiden kehittämisessä.

5 Molemmat tulokset saavutettiin käyttämällä MP:ää, jonka hiuk-kaskoko oli alle 100 nm.

Edellä kuvattujen kokeiden tuloksia kuvaavat taulukot 9-14 alla.

10 13. Loppupäätelmät:

Kaiken kaikkiaan tiedot viittaavat siihen, että MPL on parempi immunostimulantti kädellisissä, ihminen mukaan lukien, kuin 15 suurikokoinen MPL. Kun tämä yhdistyy mahdollisuuteen valmistaa suuria steriilejä eriä, pienikokoista MPL:aa voidaan pitää sopivana immunostimulanttina laajalle kirjolle ihmis- ja eläin-rokotteita .

i i t f 1 > (

• I

Ϊ t ! 1 S i : t t ' i » t 110844 KPL hiukkoset ja suodatustalteenottö erilaisin sonikaatioparametrcin b

Koe n:o Pitoisuus Kokonais- Hiukkas- Saanto (mg/ml) oleiluaika koko ennen suodatuksen virtaus- suodatusta jälkeen (%) kyvet i s s ä (ma) (min) 16 1. 2,5 9 2 104 j.7 1 3 79 78,5 18 1. 3,5 95 8 6,4 10 19 2 2,8 77 NÄ 20 1 2,8 98 Nk 1 · 39 110844

Taulukko 2

Steriilin MPL-liuoksen hiukkaskokostabilointi fotonikorrelaatio-spektroskopialla (Malvern), 1 mg/ml 5 ,^========^=============^============:^======^^

Koe n:o Hiukkaskoko Hiukkaskokostabilointi 4°C:ssa (nm) suodattamisen jälkeen (nm) ____ 8 päivää 1 kk 3 kk 6 kk 9 94 81 74 88 82 t 110844 <λ te O CO o

M LA CO CO LA CO

ΰ * I f- , ( σ> es so Ä * M * |

ST lA O

rH e e lT, o ra o

CO O O O O *T

o I- f- "S

'S' O .H CS O I-H

H

W * ca t r, CO νΛ B es co rs o o o M ΰ 1 1* ti w rtE o » o X o E ^

M W

k S m ^ . <?

CL, M ^ r-i CO O CO O

Ph °

O

g O « ® o o

H O LA -1· rH CO

Hi o 52 £ w *

w S

ΓΛ * Ai »A

Γν M v> la la h4 tn v * *· »n >h

UJ O r-l lA O CO

Eh ω rt! o g 8 ;

Hl M s

Hl O S g - h pj > £ 3

Da 1 g

Ifl S3 o JS -H « ^ I- * <3 a S .£ s s ” ΐ “i r* - S D jj ' « " JJj «< ™ » m o CH p « O O H ^ i 'f S I « M CS * 3 τ'

H > g S

ΓΛ 13 CA ro O SO O ^ es

Iki f- I- lA <?| LA -H

£3 JU H B SO CO V SO V »,

WE M f» LA

CJ M <y * E 53 “ M 2 - H M H, H o £ « E ö 2 e W H h ^ 3 1! rt! pC M > rt! ff, ^ <y. t —j ^ 1 3 H Ph W CO lA O CO O _

tHttÄCO LJ O la rs rs M

E § * _:_I" h v ~ v -s -

O H |— s μ S

.: te te s « >,

Pl fc Soi

.X —- '-H

EC/) £ p ~ W D 2-2 *

; ; h b - £ ; H

* ‘ tr* t-J ,-« w <y <y SS te 3 "ώ '3 w • H H -H s ° ^ O, o rt! e c « 3 ft '* J ^ Ortlo 4)t4· » · M » ω o v w > * Ώ —- B rH «-· Ö» Ai > * * j * rt , . , Ä vi li h5 > & ;;; (¾ b eee S ^ " • P — A A A 4 o hi LLi E ^ p I lii HS K K P K -H f h • *r* h o o ή o Ai v rt

iJ H S ~ - M ~ O -H V

t* S H rS ^ O M ^ >OW

* · P4 UJ n * <t u < U -h -h* * · * S*Mh4 Ilhl4> * * Ä **o 3 rHpp(ycsp> P)4jT? * 4 * · I W K es es > es , ^ ö *** rr\ C-ι S ea ΰ Ω w a t fOE=*0 ocpo-Oö. <yo ... ^CP1*· KhPKP Sh p k r?--ΐ - ΐ .·:·. n ° > s S e

, , , M :ci 4J -H

• 0 H (J S i ... Ai f£ f£ e h p i : Ai i 3 ° ? 3 0 +j PJ S S -5

‘ r-HCNO :i< 3!Γ4Μ<3θ H)HP

.’.; dQS§ 7 V V VV si0- ’. ·: < tr D S S cS £ ,1 s -* , i , . B M Π3 J------ ... ~ - — —^il ...

’! iaolaoiaoiao H H es es CO to 110844 Οι s a ν ______ 3 ns

P

m >1 ° ra lO O O O O CM |> nj

P

m

OJ

^ «J* CO <Λ O O O χ S ~ •id* ,» -.ra rf Z. o- *3· o >

g CO CO CM A> o CM H

ta :r*

B M

H H „

4 Jfl 03 O Q

qm CM CO t?> M CM »N ,y 10 H *5 w ta fi 5 5 « 5 g ->· g g 3

Sm ocor-cooo ca ö w " ^ ^ OT ^ *

Ph p o -— ä 3 o ö, * > * P ra Λ Λ > «< «i Ui * ;* P4 s <o *x> o -a* ^ 1¾ Jrf CM μ 5 w * K ti -r> 13 i4 P * rij ^ P >

Hl H » S 5 |J EH S & £i P £ o

H C P > <?> iH rH CO

3 B 2 S m‘ o,' ,* ” M *5 .*,+,*,+, * > «< χ UJ CO M LO CO χ

3 “S H * * n ° * H

3 ö m μ H

Ξ B S r * 5 il μ a < £3 Ή O - o Λ rt· 33 E « M 5 >n 81 r_j w ιΛ P n- ra “ 3 ' ' O p | χ CO '.P <7> CC ω

M ΙΛ -H

£3 P V r< W g K g £5 ^ w h rt s g EH = g X *3 s o p

W s E

p w 3 >i tfl g * " m s ^ k

Γ k> EH * · ‘ ^ ‘ M

fta 1*5 ta α V u) * <n <* i—<

O»-* MM p ti +1 m +1 +1 r« —I

fc-' to Eh -h m* tn +i LO m ä w • QiPH P W pv.<D'£>.a tr1*^ Prt rtju'.te --n *? 3 ra * ! Pj O « m . «-- t # J3 O tl (Ti :it w m -h 7 .5 |_l _ «U 03 ra ' * r „ M P Ή a · Eh 3 ^ .

SH S a 5 S

. , , M Ö m ö o -h p

,,,: 0 3 £ β » -5 -H

p d 2 2 s ϊ S 5 Ϊ : : D EH - H rH rH v ' * ‘ * S I P !·1 P ^ 5 i * t ry^ f\i Oj Λ cl. ca -ή ra . . HH ™ V 30 s I » <a

! ! O *"> t I I 03 -H }H

. Γ 5n ro CO CO rH V 3 I *TH M a π p m -Ή C rH «

• OHeh O O -H O a: V

i s - - * - g 'J £ , . PjmJo *, *S< C-l P | i fH I t) irS O oj

At» J3 MpPtlOMp>“*·^ ^ ro h | :;: -—03 »- «£,(£«£- %, 'i % , ffi D---- r*H W-r v ,¾

' ^ O X P P

» , , M :ca «

. I · 'w^ ra > -H

’ · O H ID " ί 3 ;,, Ai rt! 3 a 5 μ . . A! l EH -S 3 2 ...· ? p p ί 5 5 -

* rH CNJ < «·ί ca M O O ^ M 3 M

' 1 ’ MMM rH rH ^3 ^

> » 0 O H s H « H « n Ö P n X

:·.: «s tn ^ ^ ^ÄSäÄ-.SiS

’ · Eh M > <— — - * * M h ' ' · · m o m o m o m

M M CM CM fO CO

110844 ... , . -.----.-.n-----, — nr^·,,. ......—.---^ · l| β Ρ <% α> Ρ X β νι Λ 3 •t Μ 3 Ρ

itS V

ΓΗ Γ~* p 71 \ s W -Η Ο Ο --4 β O V V It 4¾ ί> γλ a a at Ρ 3 Ο Ρ Κ ΙΛ - — « 3 * 3 4» Ρ ιΤ| 1Γ| β A · * X > ρ 1' LT> ·& ·*· (Ί Μ β 3 ν> qj II 3 Ui V3

o C 0* > — — PE

E C O -* O P 1-4 Γ, o ~H * W > ·—I <U O o WP v H J3 Λ

< t o -HA

P) · rH V "4 β < X Q o rs , A to se· VI V <* H Ä E +r fH - c -rt

Eg CO +1 Cn rH H t -H > H p ·. fl· 4-1 +1 xl -Γ-. p t

Uj -4 CO s f-- [— «Γ PP

E P * ' 3 P

p ri| (n Cn CO -t Φ --4 i> A X -H t P :.q Ρ Φ a <u a . p s v e o --4 : ί ? ? s § - 0 " S 5 -2 g e 5 > en ico »»i- " M ^ rt U S ~ — "-I co co J ^ r< ei « - rt m o rt x x -J,- « » e e rt mv I I S ^ £ Λ 0 3 Φ H -0. - - J c " £ O w K * 3 m ” V.» i g „ e

E g Ξ : - ' " 3 Λ X

M g * “ ~ 'n S H -

H m « 0 _ 3 .ϊ S P

» ortpc H - Ξ £ m 3 « « « S g t « t co £ : s. s £iSSx Λ et. e. C me - -m S 5 n - a Q VO rt +1 m X X 5 * 5

He-, * a s: m . r- +, * « " * 1 C M P .* O , CO LT, ιΓ ΓΙ k v s!. t 3 w r, S E P co A se tn co * 1-1 "'t· u,

g ^ Ö * -H :t t P

Jj ö .....— S» -t Ρ ·ν

W H A rH -H

(M Qj H £? v a --4 _j rtj ° ο τ» a p rij O — f" SO 4' t « TJ >w « o o i«y<y R P 3 en ' v .—i m m ρ

Wc! » — x f f- n v 3 et MH- I V ~ en a EH 3 J’ h , - , a “ " a x rt s X > P Aft LT| r-4 lT| — O P ft t 3 m 4i EE en v ^ m -H-np» B4‘ s* > V e· t- V I c, X5 W — O V r-4 in — -H ;t -H * 14 A I en M p 71 3 , ^ Ψ Ä AS r-4 M Ί*» W 4* !h >1 rt

Cj rH -rv

- t :t -P

52» * — ρ . > v> U ^ ρ ρ :r« M W O Λ --4 41 ρ β

OH > eo 71 qj M -H

p ' 3 ^ 4; a

1_J < t ~ CO rH rH 3 r-4 M, O

P5 W · r- >· > r- ' s t_? EX ÖO sO O vCCl -H ·π e Ö

SD. EE ω «n rH r4 V> -H tC :t O

> Ö 4-1 O 4-1 +1 4-1 m, S 4) S > rH

fYl rtP r4 v co CO CO » ggO--H-H

JT W —4 SO, , V en 3 -H --4 t S

fS, P r4 V e·. 0 f|H ^ 71 "4 P A

-· ’> [X-l > K -H A r4 r4 X

, M 1 ___v ö 1 j ' ' φ r-4 ή «,> ω

τ Ό r4 β Ό IP

. M * s --4 -H --4 Ä Eo * Qi g aa f a r4 > 2 2 2 g ρ-not t g " M » :t » --4 a I rf o O O "4 rH i rt t

' I K o O O AVrHPO

; fO Hr4 r4 r-4 oenp * ' -H t — » • ’ J J m J en e m m « * ιχΐ n, cv evev ^

: g 5 5 5 5 ” ·® d S

^ ίΖ O V H 4» ; * * I H- K EK SO :t :t Φ ; I ϊ n o o oo ^ rt ^ μ ^ „ 5 „ “ ϊ I < rt < ι«ί p a p a ii ^ E4 & H Ϊ7Ι -H Ö» OI X ^ 04 E 2JX ^ x ^ a -H o λΗ O C- O O Ö Or4p P-C33 f * M o enp en ρ en en o P -HOXPfi • · j p p p 41 :f4 X 3 0 0 *** Uö ^Pd^cnP 4JeopflP-H> A 0 ^ g ‘ · * ' M £ e-n > en > en 4' en ^ X 3 p

*»* Λ WAMÖ WQ4<ÖP

, t I O OO-OOi O tn > ö- o ... .· ie Kh we MURK» S-il^Sa

*----1 .. ------------- -rl > Kr 3 -H

* 4i -rl X X

ΙΟ X :r< t P en * J , r4 A TO t f , ‘ * Π ^ β -n ' t y. 4* a t -e-, » * * pb^ fi P 3 :t

, » U O « Ρ P rH

I » .H -h 3 -h en • « * rt Λ P t -H it »“ m X rH 71 A t ‘ ,-) ,¾ co CO CO eo LA se· v - c 1 ‘ rH rH H r-4 M H ^ m 41 D -P --4 , » » P K n n ti ti n π « β ui v< > rt^ ββββ βββ-Η *x-h ,1 r-H m rH on en en eo * * t :t

, t H II- I — --!] * * * x A

. * i m o in o m o m

H iH CN CN CO CO

110844

TU.U 1 Ut LO O J

gD 21 · A LUMI N i UMli Ϋ UliOKS IDI -Mi 'L· 100 nm (sorbitoli) IMMUNOGEENISVyS KÄDELLISILTÄ SEROLOGISET JA DTH—TULOKSET

ROKOTE APINA M: O VASTA-AIN E VASTE DTH..........VASTE ** (kovettuma) ELISA NEUTHL, g[)2 g 1)2 T ITT ERI TITTER I PBS 5μ g lS|ig 5 20μ gD2t KQ 1.00 1863 0 800 - + +4 i

Aluminium- KQ 1.01 5554 1600 hydroksidi KQ I o 2 14870 800 - n· Mr

öO/xg MPL

KQ 103 5486 1600 - 4 4- IM

KQ 104 16270 ! 600 N!) ND ND

GMT (1)655 1.2 1.3 2 0μ gD2t. KQ 105 16170 800 ..... + 4-4-+ 1.0 Aluminium- KQ 106 43 89 8 00 - - - hydroksidi KQ lu/ 20440 1600 - 4+ lm

20Mg MPL

KQ 108 561.3 800 + 4· 1

KQ 109 6765 1600 M) ND ND

GMT 8876 1066 2ϋμ gD2t KQ 1.1.0 2486 200

Aluminium- KQ 11.1 9918 800 - + 44·+ 15 hydroksidi KQ il2 2526 400

5/ig MPL

. i KQ 1.13 71.37 400

! · KQ 114 8396 400 ND ND ND

;Y; GMT__5181__400__ . * Mitattuna 14 pv post II/GMT-geometrinen keskiarvotitteri ELISA titteri~- keskusarvotitteri 20 NEUTR. titteri^vastaa suurinta seerumipitoisuutta, joka antaa v ; 100 % suojan sytopatogeenistä vaikutusta vastaan i : ** ihotesti päivänä 14 post il . Kesto 24 h lukemat + = Imm ++-l-5ium +++=>5mm 1 * 110844 •rl

M

• © o co m o co o vo m ra -p n ie in m o vo o X -P in tn vo

td -H

β +> _

•H

P

Φ

. +1 O rH CS O rl ID

d -P o r—i r~ H 1r| e -p__ o vo o

Es co o o <n S o st1 ti· rH r»

O

o co r~- VO Tr o o o <$> o o m <n σν vo o

ID OI rH

O

•H

Cl • u o es o I® o o öv o rr co h n

• O t> rH rH rH

: p d ® o . tfl o o o o o o o o o > CNCNCS CN CN CS es es es : 53

Oi jy» tr a s. a.

| 1 o tn o -"'tn ocu ·—· <n

; ; : O rH O rH O S rH

‘ > · · m -rl rH -rl rH -rl > . · v- -r| Dl --- -rl SI ^ -H ia i : : oi p oi ρ oi p ’ I -H P <Ö I -H P te I -H 0 «s

rv g-s <ö ,ϋ g Ό (örMgTS Κι M

·"> · „ p -rl .¾ P P -H Jipp-H X P

',1· 0 -H 01 p p -H 01 rjp-H01 PP

... ΡΡί Ρ Λί Ö Ai Ρ Λ d .¾ Ρ>ί I : Ρΐ rl0tP(DX—'-H0tP<D4;^'---t0tP4)X'~' ... Ρ Ρ g p rt! p ^ fiprijinv^

rH (ö PTJöJQi H p O 01 Qj HpOOlft H

P-η rH >j (Π M H rH PQ HHrH>,CQ H H

·· <ö rt! törpa: cupjas^n: (¾ ft ' {rl II I I -- - := ’, ’: m o in o

I—l rH CS

110844

ItiäX ils^ K ϋ 6

Kliinisten OspA-erien immunogeenisyys ihmisissä 5 Anti-OspA LA-^-inhibitiotestissä (ng vast. LA·-2 /m 1) (GMT)

Rokote Pre Post I 3 0 Post II Post III 3 0 pv 0 pv 28 pv 56 pv 84 10 NSl-OspA 118 23 3 409 768

Aluminium-hydroksidi11a SC (%) 2,6 77,2 86,5 100 N S1 —OspA+MPL 134 269 8b h 24 24 15 Aluminium- hydroks idi 1.1 a se (%)__2p5__88,6__9 7,2__100_ 20 N—80 10/ig/annos

Intramuskulaarisesti - · » 1 f I t 110844 b -

H

M

W * £

D 00 CM

fujPj :<d rH o ^ 00 fO

g g > H (N ^ sj1 H CN

h m „ :d t» C5 <N &i 11 s--

SS

° s ^ O H 0} 1-1 m jj m ra ^ Λ Κ tn :<c «.--ocofo

Cl, „ 2 > fO Π ID H H m 11 ,1j > :2 B rt! | w ta m » b e m--- w rc e o u | B ® -H .

vd S M jJ H

^ rf* rt θ\ co io |J3 5 fO r) OJ 1Λ Oi h μΐ p η:ι! 'tf^con^r·

Pj Q (j,> [-'inCOi-Hr-trH

Sh H -H

O I :<ö S ffl ta ft W « -H-- HO cd > g fi

X Q O

Eh rt! >i4 'S*

B OH

:rtj W M (N VO H ID m crtjpl :<β Οϊ <n eri r- in o m μΐ > l£) H (N fO ^

H *· -H

<n :<c » Ift_ o

I—I

< . ta o ö Ö cd • \ : : tr «n m m • ’ O H N " <Ö

g -K „ CM m O H

• o m ιο h cm m H

* Il O' :cd : : m *· ’ O :cd . -¾ :cd Cp .* Λ g 4 ... 0 Y tn H Λ ffl *. : 2 S a ; , h - J| -x • t . *: en o m

H H

110844

£ΐ i I CO

d es ΙΟ es s > ° Qi “? <0 Λ es--

—.1 ~ O

, in

, ·*4 H

S i-ι r- es TT jj m

H ^ *. W Tn iH

m κι ΰ ® ^ > m m

—. t-ho\oo 5 £m V V

S “ 2 I

s ffl j tn 3 se - Π W ®--- H · Es *

Ti UT rti t/S *

rf! +* h rf -rj tH

hj dgin^eyi >> -P es co <h

rf D *. es iH ω rti a H kD

3 H tH o >n tn cd tn s ö B rs £n B O'— C O H-- < W--B tr»

(4 Es H

tn B

B *4 ·· < ir.

·· > P! b S o ro (-? i ta a ^ ° 2 cm « O toin 20 2 *ί d es es tn ftrs in o o » «. D h D D tl ^ vo vo μ? I ---- p" pi rt! i tn h tn •4· M J U rtj tn

< cm e S K

Es 2 — B I

B__w H ta w !> Es o in > B d rs

B C d O

B :<fi «S VO

'< K i tn 2 C W dl y Γ£| en Q. g 3 B s - B «, W__

w O

“ tn «e in m in ^

E o Ή * " H

H d Ή es es es H

h d ·· j e PI f « E £ tn B es fi r° m ° ^ tn oq -h tn <ö in in K rt! 0 ή - - • d r-t es es ; d ·· tö «n I i -

tn B

rt! O

tn ·— m i B ft, ‘ '· :td tH es :oS es ’ o Mi vo o o 1-1 is voo rH H H li) in 1-1 W H in 3 S § S 3 8 ... Λ! tn tn tn -4 tn tn ; ^ Q Q q t* q o rj rj

1 f—I i—I

. : d d »e «e ; ; es 11====1=====0 h |i- ^ i I t , '; en o m

rH rH

110844 s w w

Eh >i m _ H -. ------- -

ψ :«S

W > CN H CO

w -H (Tl m N σι M

g ;<C η σι h ίο n co

O fö & CN t—I CN tH CN

£ <N-- 2 o § tP :<d 5 H > M -H m vo m co „ :cö m H y? r-i eg nj

^ Pi i-H i-H CN i-H

Cp

% ® :«S

H > CN CN m τι “ -r-ι vo co co cn oo

)ji ® lid rH rH in CP VO CO

-f (¼ cn m co co co vo . £ e,-- Ο ΐ H :« oo O 4J -H in vo m in

Sh CD T« :<Ö in vo co in oo

pj Pj Οι Η (Ί to t H

tn q cn a\

rij Γ'· O i-H O VO

n :<C co (O h h ^ W tj, > VO CN CN CN <3*

hi H -H

i-} I :cö H

·· CQ Pc <N

(Ο -H-- -- <c

EC ö CN 00 VO

O O :<ö o i-l co <P oo -- M > co co in co co

Η Ο -H

: 4! ¢4 :ctf in • Pc Ή tn __J__J__ . 3

Eh

D

¢4 rij ω • 3 o ~ cn in m o • ;_i β — hm·.·.

p< fj Cp o i - m m

: p! Cd O 0 CO VO ϊΗ CN

B I O B

o ^ cH —

O Pj V

i-I S ~ ; ; V-- ; : «s ® d — cn W -H P Cp J5 Ή Τί u . ¢4 ·· -H § . ’ ‘ o O CO O ö —

... rM 53 .— χ) i * iH 1—! tH 1—I 1“I

; % dc M Cp ra • · · 0 4! o 0 4| 0 ·—i i — ra m pj ·. : 2 t* r-ι τ! cq ö <Ö 0J dj cd EC cd ; eh s ______ - _ _ ==l •; m o m r-i i-l II I 110844

X Eh Εη O O tP

rs S H ·3< <3* O

Γ' VV β rv r-4 in ö β Ή

\ :rt -H

S1 Λ Ή P

ft 00 EH H O O · I P

:rt rt

^ VV β P

:ri! I__:<d -H

S P| P β PI H P ,

h >1 P

PJ ^ :S ® H *3* EH En O O Ai Cl H rs g g <3* -ri K V V Ö β I__-H >i υ -h -p

v. Ö P P

pQ Φ i—I -H

j rt ,rt in m m o (DM

rt; -H es oo es es co ·ηφ CD 0 Λ r» n i-ι «n rv P i >1 P VV -H "3* S3 P β--t> t H -P Id H -rl fr rt h

En P Ö4 -o ta Φ '-'Λ in in m o rt ns h > co rs rs es oo P -m rt

O O I <3* ,H r-l r-l rs O P

to P f1* VVV ei i ci CJ P is--Φ >- rt p -H H λ; I «d ta > ti h Λ h g ta Ai rt d in m m n p h td ta n rs rs rs rs O Qs W rs P P P P C)*-l P V V V V 0 | rt! D--g rs 01 σ> id -H i h rt1 O id id ω rt h w

1 Λ o rs <D

p rs - - - o φ rt rt

χ t*» co o ή ή ,¾ -m 4J

eh i—i en

--:rt - -H

ta h -r-ι rt ή (xj X id Ή

En ^ rt -n <d ω rs rt o 03 -h id ft H I 00 --*· OO rt rt {k, id <3< rs rH rH ro rt Ö id h H ·Η Φ Ai m--O -n > M 0) o rs PM -H rt ; cfl rt Ai td > l rt ro r- o rt Φ ·π tn ^ es g' -n , <| CS P O P g pj (d ; rt -H td td CD----ri -n • EC *. id rt

iS J rt "H

^ Z g -h Φ rt D H * + p rt ° H"1 rf! ~ ~ O g ® S3 O O P X g rt n En

!? g BPnrtJO H V

^ p ^ ° Ä 5 n :*· ~ £ S ~ ^ 3 , , g rt rt o rt---ra -h > li ω -rj tn o o -H P P :<d

h o pj P Cl g P

! i m pj -h a; \ p o Λ g .H ® ,,, Aistii o o o P β ; Ai tn \ rs i rs rs _ J® ·’«

rt rt ri! tr» rt ffl P

P *· 01 O Φ X P

1 rt pi ρ g p o rt S S e, rt Φ :«s EH S I - K P Ai •: m o

rH

110844

CM

S Γ' CO CO Γ' H Xj to cy» m o

H tO v Ό H N

E-* σ\ B--

H

O

tn 3 λ σ\ Q H f"- CM Γ' B fi Λ vo oi cm vo

H \ CM V LO rH V

tn r-· B &-- m 'r b >

D I

j B

0 B Γ'- Γ*-· 00

tn H Λ CO O n- VO

00 V CN 00 V

rH ^ DC-- E-l Ö Φ B ö S "ä n- r- m r- K 5L ,d vo vo n- to

“ Jj «a* V V «n V

E S M

H ·Η-- tn m M © (¾ „ 00 o tn γ oo vo to ·*"> i H xi i-i in ro o

g> -M CM CM

<! -H r- tn >__ DC Ö

H H

tn ω D '— co H ni ^ oo ή σι D I oo cm iH in K i-4 ^ H H__ g ‘ , ,-v to r- o

• · · rt *- O l'» rH

d Jj CM CM CM 'i* : o o* ' * o--- , t—f ; v b g S ö m K ö - m o

“ (C o r~- ι-l CO

vJ I

1 ^ 5 Λ : i Ξ hi--- . . a ’.· ‘ S tn — ^ O -rl •: . 1-1 s ö m

• · M Ö -H

0 E-l (ö -H O O O

X ΙΛ | rj CM CM CM

x H tn \ Π < rt! tn , , ·~i i-4 tn o 2 H (Q g . · <d K EC ^ , ; EH M 11 m o

H