PT100262B

PT100262B - Metodo de preparacao de vacinas para o tratamento de infeccoes pelo virus simples do herpes

Info

Publication number: PT100262B
Application number: PT100262A
Authority: PT
Inventors: Moncef Slaoui; Myriam Francotte; Jean-Paul Prieels; Nathalie Marie- Garcon-Johnson
Original assignee: Smithkline Beecham Biolog
Priority date: 1991-03-21
Filing date: 1992-03-19
Publication date: 2001-05-31
Also published as: NO933343L; AP9200368A0; GB9105992D0; DK0576478T4; IE920881A1; SK279190B6; DE69205566T3; CZ280505B6; CN1101226C; CN1201692A; CZ195893A3; CA2106492A1; PL170059B1; IE69560B1; EP0576478B2; MY110086A; CN1058191C; CY1936A; JPH06505727A; BR9205745A

Description

O presente invento diz respeito a um método para a preparação de formulações de novas vacinas para o vírus simples do herpes (VSH). Este método consiste em se proceder à mistura de glicoproteínas gD de VSH ou fragmentos imonulógicos com um veículo e com monofosforil-lípido A desacilado em 3.

presente invento relaciona-se com novas formulações de vacina, com métodos para a sua preparação e com a sua utilização em terapia. Em particular, o presente invento relaciona-se com novas formulações para o tratamento de infecçoes pelo Vírus Simples do Herpes, mais particularmente de infecçoes pelo vírus Simples do Herpes 2 (VSH-2).

O VSH-2 é um agente etiológico primário do herpes genitalis e em conjunto com o VSH-1 (o agente causador do herpes labialis) são caracterizados pela sua capacidade para a indução de ambos doenças graves e pelo o estabelecimento de uma infecção latente, primariamente em células das glândulas neurónias.

O Herpes genital está estimado como ocorrendo em cerca de 5 milhões de pessoas só nos E.U.A., com 500.000 casos clínicos todos os anos (infecção primária e recorrente). A infecção primária tipicamente ocorre depois da puberdade e é caracterizada por uma aparência localizada de lesões dolorosas na pele, que persistem durante um período entre 2 a 3 semanas. Nos seis meses seguintes, depois da primeira infecção, 50 % dos pacientes experimentam a recorrência da doença. Cerca de 25 % dos pacientes podem experimentar entre 10 - 15 episódios recorrentes da doença, em cada ano. Em pacientes comprometidos imunologicammente, a incidência da recorrência com frequência elevada é estatisticamente maior do que na população de pacientes normais.

Ambos os vírus VSH-2 e VSH-1 têm um número de componentes de glicoprotéina localizados na superfície do vírus. Estes são conhecidos como gA, gB, gC, gD e gE, etc.

A glicoprotéina D está localizada na membrana virai, e é também encontrada no citoplasma de células infectadas (Eisenberg R. J. et alΓ J of Virol 1980 35 428 - 435). Compreende

393 amino ãcidos, que incluem um peptídeo sinal e tem um peso molecular de aproximadamente 60 kD. De todas as glicoprotéinas envelope de VSH, esta é provavelmente a melhor caracterizada (Cohen et al J. Virology 60 157 - 166) . In vivo é conhecida por jogar um papel principal na ligação virai a membranas celulares. Contudo, a glicoprotéina D tem-se mostrado como sendo capaz de provocar a neutralização de anti-corpos in vivo (Eing et al J. Med. Virology 127: 59 - 65). Contudo, o vírus de VSH-2 latente pode ainda ser reactivado e provocar a recorrência da doença, mesmo na presença de um título de anti-corpos de neutralização elevado em soros de pacientes.

A capacidade de induzir anti-corpos de neutralização sem ajuda é insuficiente para adequadamente controlar a doença. De modo a previnir a recorrência da doença, qualquer vacina serã necessária para a estimulação, não unicamente do anti-corpo de neutralização, mas também para provocar imunidade celular através de células T. O presente invento atinge estes fins.

O presente invento fornece uma vacina que compreende a glicoprotéina D de VSH ou um seu fragmento imunológico, em conjunção com monofosforilo do lípido A 3-o-desacilado (3D-MPL), um derivado desacilado do monofosforilo do lípido A, e um suporte adequado. Tipicamente, a glicoprotéina D serã do VSH-2. O suporte pode ser uma emulsão de óleo em água, ou alúmen, e o 3D-MPL estará presente na gama de 10 pg - 100 pg, preferencialmente de 25 - 50 pg, em que o antigene estará tipicamente presente numa gama de 2 - 50 pg por dose.

O 3D-MPL pode ser obtido de acordo com os métodos descritos na patente Britânica No. 2220211 (RIBI).

Um modo de realização do invento é uma glicoprotéina D de VSH-2 truncada com 308 amino ácidos, que compreende os amino ácidos 1 até 306 que naturalmente ocorrem na glicoprotéina, com a adição de Asparagina e de Glutamina no C terminal da protéina truncada livre da sua região de refúgio da membrana. Esta forma de protéina inclui o peptídeo sinal que está clivado de modo a originar uma proteína de 283 amino ácidos completa. A produção dessa protéina em células de ovário de Hamster Chineses está descrita na patente Europeia de Genentech EP-B-139 417.

A protéina completa truncada preferencialmente usada em formulações de vacinas do presente invento, é designada como rgD₂t.

O antigene de VSH pode ser quimicamente ou de outro modo conjugado a um suporte particular. Uma aproximação particularmente preferida é a conjugação química à superfície do antigene de Hepatitis B particular através de grupos sulfidrilo livres localizados na superfície do antigene da Hepatitis B. Ver em apêndice, a aplicação da Patente dos R.U. No. 90276223.9.

As formulações do presente invento são muito eficazes na indução de imunidade protectora, mesmo com doses muito pequenas de antigene (e.g. tão baixas como 5 pg de rgD₂t).

Eles fornecem protecção excelente contra infecções primárias e estimulam, vantajosamente ambas as respostas humoral específica (anti-corpos de neutralização) e também respostas imunolõgicas provocadas pelo efeito da célula (DTH).

Emulsões de óleo em água não tóxicas preferencialmente, contêm um óleo não tóxico, e.g. esqualano ou esqualeno, um agente de emulsão, e.g. Tween 80, num suporte aquoso. O suporte aquoso pode ser por exemplo, solução salina tamponizada com fosfato.

O presente invento num outro aspecto fornece uma formulação dc vacina como aqui descrita, para utilização em terapia médica, particularmente para utilização no tratamento ou na profilaxia da infecções pelo vírus Simples do Herpes.

A vacina do presente invento conterá uma quantidade protectora imunológica de gD de VSH ou de um seu fragmento imunolõgico e este pode ser prerarado por meio de técnicas convencionais.

A preparação da vacina está na generalidade descrita em New Trends and Developments in Vaccine, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. A encapsulação em liposomas estã descrita, por exemplo, por Fullerton, Patente dos E.U. 4.235.877. A conjugação de proteínas a macrocélulas está descrita, por exemplo, por Likhite, Patente

dos E.U. 4.372.945, e por Armor 4.474.757.	et	al. ,	Patente	dos E.U.
A quantidade de protéina	em	cada	dose de	vacina é
seleccionada como uma quantidade que	induz uma	resposta	protecto-

ra imonulógica sem efeitos segundãrios significantes, adversos em vacinas típicas. Esta quantidade variará dependendo do gene imonulógico específico que é empregue. Geralmente, espera-se que cada dose compreenda de 1 - 1000 μg de protéina, preferencialmente de 2 - 100 pg, mais preferencialmente de 4 - 40 μg. Uma quantidade óptima para uma vacina particular pode ser acertada através de estudos padrão que envolvem a observação de títulos de anti-corpos e de outras respostas em indivíduos. A seguir a uma vacina inicial, os sujeitos recebera uma repetição era cerca de 4 semanas.

Em adição à vacinação das pessoas susceptíveis a infecções por VSH, as composições farmacêuticas do presente invento podem ser usadas no tratamento, imunoterapêutico, de pacientes que sofrem de infecções por VSH.

Num outro aspecto do presente invento, fornece-se um método de manufactura como está aqui descrito, em que o método compreende a mistura da qlicoprotéina D de VSH-2 ou de um seu fraqmento imunolõqico com um suporte, e.q. uma emulsão de óleo em áqua ou alúmen, e 3D-MPL.

Comparação da eficácia do adjuvante de uma Vacina da Subunidade da Glicoprotéina D recombinante do Vírus Simples do

Herpes

Neste estudo, a capacidade de vários adjuvantes para o melhoramento da imunidade protectora de uma qlicoprotéina D recombinante do Vírus Simples do Herpes (VSH) do tipo 2 (rqD₂t) foi avaliada através do modelo de porquinho do índia. Os adjuvantes testados foram hidróxido de alumínio, hidróxido de alumínio em combinação com Monofosforilo do Lípido A Desacilado em 3, e Monofosforilo do Lípido A Desacilado em 3, numa emulsão de óleo em áqua.

1. Descrição do antiqene

O rqD₂t de VSH é uma qlicoprotéina truncada recombinante de engenharia, produzida em células de ovário de hamsters Chineses (CHO) transfectadas (Patente Europeia No. 0 139 417).

2. Preparações de Antigene - Adjuvante e Valores de imunização

Duas experiências separadas foram realizadas para a avaliação da imunidade protectora de várias formulações de rgD₂t nos exemplares porquinhos da índia. Na primeira experiência, grupos de porquinhos da índia foram imunizados três vezes com uma dose de antigene baixa (5 pq de rgD₂t) em 4 formulações de adjuvantes, preparadas como a seguir descrito. Duas semanas depois da última imunização, eles foram desafiados intravaginalmente com VSH do tipo 2 e foram monotorizados diariamente para o desenvolvimento da doença de VSH2 primária ou recorrente. Na segunda experiência, estas formulações foram ainda avaliadas em grupos maiores de aninais. Os factores que influenciam a eficácia destas formulações foram também testados, como a dose do antigene e a composição de adjuvante.

2.1 Preparações de Antigene - Adjuvante

Na primeira experiência, os porquinhos da índia foram imunizados com as formulações de adjuvantes seguintes. Cada dose (5 pq) foi administrada num volume de 0,25 ml.

2.1.1 rqD„t/Alúmen (Hidróxido de Alumínio)

O alúmen foi obtido em Superfos (Alhydrogel, (Boehimte)

Superfos, Denmark). Cinco pq de rgD₂t purificado foi adsorvido durante a noite, aos 4°c, em hidróxido de alumínio (alúmen) que 3+ corresponde a 0,25 mg de equivalentes de Al em 0,25 ml de NaCl 150 mM e tampão de fosfato 10 mM, pH 6,8.

2.1.2 rcyD₂t/Hidróxido de Alumínio mais 3D-MPL

O 3D-MPL foi obtido a partir de RiBi Immunochem Research, Inc. Depois de uma adsorçâo, durante a noite, de 5 pg de gD₂t em alúmen, como descrito em 2.1.1, a preparação de adjuvante foi centrifugada e o seu sobrenadante foi removido. Um volume igual de tampão de adsorçâo que contém 100 pg de 3D-MPL, foi depois adicionado a alúmen ligado a rgO^t.

Para ambas as preparações de rgD₂t/Alúmen, mais do que 98 % de rgD₂t foi encontrado como estando incorporado no adjuvante de hidróxido de alumínio.

2-1.3 roD₂t/3D-MPL numa emulsão de óleo em ácrua (R)

A emulsão de óleo em água foi preparada usando 12 % p/v de lecitina adicionado a óleo de Esqualeno e 0,08 % de Tween 80. 3D-MPL foi adicionado a uma concentração de 100 vezes superior à concentração desejada final. 1 % desta preparação foi depois misturada num volume de 0,25 ml de 5 pg de rgD₂t na fase aquosa, que origina uma emulsão a 1 % de óleo em água, que contém 100 pg de 3D-MPL.

Formulações de adjuvante idênticas preparadas como acima descrito, mas contendo quantidades diferentes de rgD₂t e/ou de estimulador imonulógico foram usadas na segunda experiência. Elas foram administradas num volume total de 0,5 ml. Estas formulações são a seguir descritas.

rcfD t/Alúmen: Cinco ou 2 0 pg de 2 —equivalentes de Al por 0,5 ml de dose.

rgD₂t; 0,5 mg de rqDt/Alúmen mais 3D-MPL : Cinco ou 20 Mg de rgD t; 0,5 2 —- χ mg de equivalentes de Al ; 50 μg de 3D-MPL por 0,5 ml de dose.

rqD₂t/3D-MPL munia emulsão de o/a (R) : Cinco ou 20 gg de rgD₂t foram formulados numa emulsão de o/a como descrito acima (2.1.3). Uma dose de 0,5 ml contém 5 a 20 MU de rgD₂t, 50 μg de 3D-MPL numa emulsão a 1 % de o/a.

rqD₂t/3D-MPL numa emulsão de o/a (S) : O veículo foi preparado da seguinte forma: A uma solução salina tamponizada com fosfato (PBS) que contém 0,4 % de Tween 80 (v/v) foi adicionada a 5 % de Pluronic L121 (v/v) e a 10 % de esqualano e a mistura resultante foi microfluidizada dez vezes através de um microfluidor (Modelo M/110 Microfluidics Corp.), de modo a resultar numa emulsão que compreende unicamente partículas de submicron. 50 μg de 3D-MPL foi depois adicionado à emulsão. Um volume desta emulsão, que contém 3D-MPL foi misturado com um volume igual de antigene duas vezes concentrado e que sofreu vórtice breve para assegurar mistura completa dos componentes. A preparação final consistiu em de 0,2 % de Tween 80, 2,5 % de Pluronic L121, 5 % de Esqualano, 50 μg de 3D-MPL e 5 Mg ou 20 μg de rgD_{2rt nUffla dQse de}0,5 ml.

2.2. Escala de Imunização

Grupos de porquinhos da índia Hartley fêmea (200 - 250 gr) foram imunizados três vezes nos dias 0, 28 e 95 com 5 μg de rgD₂t formulado em 4 diferentes formulações de adjuvantes.

As imunizações foram feitas subcutaneamente com um volume de injecção de 0,25 ml. Os animais de controle foram injectados de acordo com o mesmo procedimento, com adjuvante sozinho ou eles foram não tratados.

Os diferentes grupos foram imunizados da seguinte forma:

Grupo 1 (n=4) : 5 pg de rgD₂t/3D-MPL (100 pg) numa emulsão de o/a (R)

Grupo 2 (n=4) : 5 pg de rgD₂t/Alúmen mais 3D-MPL (100

M9)

Grupo 3 (n=4): 5 pg de rgD₂t/Alúmen

Grupo 4 (n=5): Alúmen sozinho

Grupo 5 (n=5): 3D-MPL (100 pg) sozinho

Grupo 6 (n=8): não tratado

Os animais sangraram todas as 2 semanas para a determinação de anti-corpos através de ensaios de ELISA e ensaios de neutralização, como descrito a seguir.

As diferentes formulações foram também testadas em relação à sua capacidade para a indução de imunidade provocada pelas células T, medidas pela indução das respostas de hipersensibilidade do tipo retardado. As leituras que foram usadas para a avaliação das respostas humorais e celulares induzidas pelas diferentes formulações de rgD₂t, são descritas a seguir.

Para a comparação da imunidade protectora induzida pelas formulações de rgD^, _todos os porquinhos da índia foram 5 desafiados intravaginalmente com 10 unidades formadoras de placas (ufp) de VSH2, da estirpe MS, 2 semanas depois da última imunização. Eles foram monotorizados diariamente para sinais clínicos de infecçâo aguda, assim como para a evidência de doenças herpéticas recorrentes. Amostras de mechas de algodão vaginais foram recolhidas no dia 5 depois do desafio virai c tituladas para a infecçâo virai.

Uma descrição detalhada do modelo intravaginal do porquinho da índia é dada a seguir.

Na segunda experiência, a imunogenicidade das formulações seguintes de ^g^D2rt foi avaliada num grande grupo de animais Duas doses de antigene foram comparadas (5 e 20 gg) e diferentes composições de adjuvantes foram testados. Uma dose de 50 gg de 3D MPL foi usada e os seus efeitos foram comparados com a dose de 100 gg previamente usada.

Grupos de porquinhos da índia Hartley fémea foram imunizados três vezes aos dias 1, 28 e 84, da forma seguinte:

Grupo I (n=8) : emulsão o/a	20 (R)	gg	de rgD₂t/3DMPL	(50	Mg)	de
Grupo II (n=8) :	5	gg	de rgD₂t/3DMPL	(50	Mg)	de
emulsão o/a	(R)
Grupo III (n=10)	: 20	¹ Mg	de rgD₂t/3DMPL	(50	Mg)	de
emulsão o/a	(S)
Grupo IV (n=10)	: 5	Mg	de rgD₂t/3DMPL	(50	Mg)	de
emulsão o/a	(S)
Grupo V (n=10)	: 20	Mg	de rgD₂t/Alúmen	+ 3DMPL	(50
gg)
Grupo VI (n=10)	: 5 gg de	rgD₂t/Alúmen +	3DMPL	(50	M9)
Grupo VII (n=4) :	Alúmen +	3DMPL (50 gg) sozinho
Grupo VIII(n=4) :	3DMPL (50 gg) de emulsão	o/a	(R)
sozinho
Grupo IX (n=8) :	não	tratado

As imunizações são dadas numa dose de 0,5 ml. Os grupos de controle foram imunizados de acordo com o mesmo procedimento com adjuvante sozinho (Grupos VII e VIII) ou foram não tratados (Grupo IX).

ί'7 .

Um último grupo (Grupo X) foi imunizado com uma formulação de gD₂t Alúmen + 3D-MPL que contém 100 pg de 3D-MPL numa dose de 0,25 ml, de acordo com o procedimento descrito na primeira experiência profilática:

Grupo X (n=10) : 5 pg de rgD₂t/Alúmen mais 3DMPL (100 mg) .

Os animais foram sangrados todas as duas semanas para a determinação de anti-corpos individuais por ensaios de ELISA e ensaios de neutralização, como descrito a seguir. Os liquídos de lavagens vaginais foram recolhidos depois da segunda imunização e foram ensaiados para a presença de anti-corpos sistémicos específicos para o gD₂t (anti-corpos anti-gD₂t da classe de lgG). Os porquinhos da índia foram desafiados intravaginalmente com 105 ufp de VSH2 (estirpe MS) 2 semanas depois da última imunização. Depois do desafio, eles foram imunizados diariamente para sinais clínicos de infecção aguda (dias 4 a 12 apõs o desafio), assim como para a evidência de doença herpética recorrente (dias 13 a 39 após o desafio).

3· Leituras

Várias leituras foram feitas para a avaliação de anti-corpos específicos e de respostas provocadas por células induzidas pela vacinação com formulações de rgD₂t. O valor protector destas formulações foi fixada no modelo intravaginal do porquinho da índia.

3.1. ELISA

Um ELISA foi designado para a detecção e quantificação dos anti-corpos gD específicos em soros de porquinhos da índia e em líquidos de lavagens vaginais, usando rgD₂t como antigene de revestimento.

3.1.1. Detecção de anti-corpos TqD específicos para roD^t em soros

Soluções de anti-corpos e de antigene foram usadas a 50 μΐ por cada fundo de prato. 0 antigene foi diluído a uma concentração final de 1 μΐ/ml em PBS e foi adsorvido durante a noite, aos 4°C, aos fundos de prato de microtítlutos de 96 fundos (Maxisorp Immuno-plate, Nunc, Denmark). Os fundos foram depois lavados 5 vezes com PBS Tween a 0,1 % (tampão de lavagem) e incubados durante 1 hora, aos 37 °C, com PBS que contém 1 % de albumina de soro de bovino, 4 % de soro de vitela recém nascido e 0,1 % de Tween (tampão de saturação). Três diluições de soros (partindo em diluição 1/100) no tampão de saturação foram adicionados aos fundos revestidos com rgD₂t e incubados durante 2 horas, à temperatura ambiente. Os pratos foram lavados como acima descrito e o anti-IgG do porquinho da índia de carneiro conjugado com biotina (IgGl e IgG2 específicos, Serotec, Sopar Biochem., Belgium) diluído 1/3000 em tampão de saturação foi adicionado a cada fundo e incubado durante 1 hora e 30 min., aos 37°C. Depois de um passo de lavagem, complexo de peroxidase bio-estanhado estreptavidina (Amersham, UK) diluído 1/1000 em tampão de saturação foi adicionado e incubado durante 30 min, aos 37°C. Os pratos foram lavados como acima descrito e incubados com uma solução de o-fenilenodiamina (Sigma), 0,04 % H₂O₂ em tampão de citrato 0,1 M a pH 4,5.

A reacção colorida foi parada depois de 15 minutos, por adição de H₂SO₄ 2 M e a absorvância foi lida a 492 nm.

O título ELISA foi definido como o recíproco da diluição do soro que produziu uma absorvância (densidade óptica medida a 492 nm) igual a 50 % do valor máximo de absorvância (ponto médio do título).

Os títulos ELISA foram calculados por uma análise de regressão linear de 4 parâmetros, usando um proqama de computador.

3.1.2. Detecção de anti-corpos de IgG específicos para rqD^t em líquidos de lavagens vaginais

Os líquidos de lavagens vaginais foram primeiro calibrados para o seu teor total de IgG por ELISA, da seguinte forma. Pratos imunológicos Maxisorp foram revestidos durante a noite, aos 4°C, com 1 Mg/ml (50 μΐ por cada fundo) de anti-IgG de porquinho da índida de cabra purificada (Sigma, Belgium) diluído em PBS. Os pratos foram lavados e incubados com tampão de saturação como acima descrito. Os líquidos de lavagens vaginais foram diluídos em série com duas diluições (partindo de uma diluição de 1/100) no tampão de saturação e adicionado aos pratos. Uma curva padrão de IgG de porquinho da índia purificado (Sigma, Belgium) foi incluído (duas diluições partindo de uma concentração de 100 ng/ml) em cada prato.

Depois de 2 horas de incubação à temperatura ambiente, os pratos foram lavados como acima descrito e anti-corpos de carneiro específicos conjugados com biotina para IgGl e IgG2 de porquinhos da índia conjugados com biotina (Serotec, Sopar Biochem, Belgium) diluído a 1/100 no tampão de saturação, foi adicionado a cada fundo e incubado durante 1 h e 30 min, aos 37°C. Os passos seguintes (adição de complexo de peroxidase 'V

bio-estanhado - estreptavidina e revelação da cor) foram como descritos acima (3.1.1.).

A concentração do IgG presente total lavagens vaginais foi determinada a partir da IgG, por meio de análise de regressão não linear usando um programa de computador.

nos líquidos de curva padrão de de 4 parâmetros,

Depois de calibração do seu teor de IgG total, os líquidos de lavagens vaginais foram testados para a presença de anti-corpos de IgG específicos para rgD₂t, usando o mesmo ELISA como descrito para as quantificações de soros de anti-corpos de anti-gD. Os resultados foram expressos como as densidades ópticas medidas a 492 nm por 0,5 Mg/ml de IgG total.

3.2. Ensaio de neutralizaçao

Um foi feito da ensaio de neutralização com seguinte forma:

o formato de 96 fundos

As séries de duas diluições de amostras a ser testadas foram preparadas directamente em pratos de 96 F (25 ul/fundo de cada diluição de soro, em duplicado). Cinquenta microlitros de uma mistura contendo 4000 ufp de vírus de HG52 e complemento (diluição final de 1/100 no fundo) foram adicionados a cada fundo. Os pratos foram incubados durante 1 hora, aos 37°C. Um . 5 cento de microlitros de suspensão de células de BHK 21 a 4.10 . . . 4 células/ml foram depois adicionadas a cada fundo (4.10 células/ fundo) . Os pratos foram centrifugados durante 5 minutos, a 1000 rpm e incubados durante cinco dias, aos 37°C, na presença de 7 % de CO₂16

Depois deste período, o meio de cultura foi suavemente removido e 100 μΐ de uma solução de violeta de cristal (10 % de metanol, 90 s de H_2r0, θ,_{3 de v}i_oi_eta de cristal) foram adicionados a cada fundo e incubado durante 20 min., à temperatura ambiente. Os pratos foram depois abundantemente lavados com água da torneira. A presença de placas pode ser facilmente monotorizada por exame microscópico.

O título de neutralização foi definido como o recíproco da diluição do soro mais elevada ao qual nenhuma placa virai foi observada (100 % de protecçâo do efeito citopatogénico). É importante notar que neste ponto, um efeito citopatogénico completo (100 % de dissolução da monocamada da célula) foi observado nos fundos de controle.

3.3. Hipersensibilidade do tipo retardado (DTH)

As diferentes formulações de rgD₂t foram também testadas em relação à sua capacidade para a indução de uma resposta imunológica específica à célula T, medida pela respostas de indução de hipersensibilidade do tipo retardado.

As formulações de adjuvante preparadas para a primeira experiência foram usadas neste estudo. Estas preparações continham 5 ^g de rgD₂t por dose de 0,25 ml. A escala de imunização foi a seguinte: primeira imunização: 0,25 ml de formulação de vacina dada intramuscularmente; imunização de repetição: 0,25 ml de formulação de vacina dada intramuscularmente 21 dias depois; teste à pele: 5 gg de rgD₂t dado intradermicamente (em solução salina) 8 dias depois. Todos os porquinhos da índia foram testados à pele com solução salina como o controle.

Em adição, porquinhos da índia de controle (animais não imunizados) foram testados à pele com rgD₂t. O Eritema e o endurecimento no sítio da injecção transdermica foram monotorizados 24 e 48 hrs depois.

3.4. Modelo intravaginal dos porquinhos da índia

O modelo do porquinho da índia para infecções genitais por VS.H foi descrito por LR Stanberry et al (J. of Infectious Diseases 1982, 146: 397 - 403; Intervirology 1985, 24: 226

231) .

Com brevidade, 2 semanas depois da última imunização, _x 5 os porquinhos da índia foram desafiados com 10 ufp de VSH2 da estirpe MS por instalação intravaginal. O curso clínico da infecção primária foi monotorizado por observação diária da incidência e da gravidade das lesões na pele genital externa durante o perído de 12 dias após o desafio.

Mechas de algodão vaginais foram recolhidas no dia 5 depois do desafio virai e tilutadas para infecção por VSH2 por ensaio em placa, como descrito a seguir. Os animais foram depois examinados diariamente para a evidência de lesões herpéticas recorrentes a partir dos dias 13 a 60. As lesões herpéticas na pele genital externa foram quantificadas através da utilização de uma escala de lesão com valores entre 0 a 4 (0 = nenhuma lesão ou vermelhão; 0,5 = vermelhão; 1 = vesícula; 1,5 = >4 pequenas vesículas; 2 = vesículas maiores; 2,5 = várias vesículas grandes resultantes da fusão de vesículas como as do valor 2; 3 = o número e dimensão da vesículas aumentaram; 3,5 = lesões que cobrem toda a superfície da pele genital; 4 = lesões de úlceras com maceração).

O-grau de protecção fornecido pelas diferentes vacinas de rgD₂t foi avaliada de acordo com o critério descrito abaixo.

Protecção contra doença primária (dias 0 - 12)

O animal foi considerado como não protegido se as lesões seguintes foram registadas:

- mais de que uma área vermelha em qualquer altura,

- uma área vermelha que persiste na mesma área durante pelo menos 3 dias sucessivos (valor de lesão de 0,5),

- uma ou várias vesículas (valor de lesão > 1).

Protecção contra doenças recorrentes (dias 13 - 60)

O animal foi considerado positivo para doença recorrente se ou um valor de lesão de 0,5 foi registado durante 2 dias sucessivos pelo menos, ou se um valor de lesão > 1 foi observado em qualquer dia. Um episódio da doença recorrente foi precedido e seguido por um dia sem qualquer lesão ou vermelhão.

A gravidade da lesão para um animal é calculada como a soma dos valores medidos durante a infecção primária (dias 1 12). A incidência da lesão representa o número de animais que mostram uma lesão > 1 durante o período de observação (dias 1 12 [doença primária] ou dias 13 - 60 [doença recorrente]).

3.5. Titulação do Vírus em mechas de algodão vaginais

Mechas de algodão vaginais foram recolhidas no dia 5 depois do desafio virai. A caverna vaginal foi limpa com uma mecha de algodão com a ponta ensopada em alginato de cãlcio pré-humidifiçada em meio de Basal Eagle com o suplemento de 2 % de soro de cabra fetal, L glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 gg/ml de estreptomicina, 100 pg/ml de gentamicina e 1 pg/τηΐ de anfotericina B (meio da mecha de algodão).

Cada mecha de algodão foi partida e colocada num tubo de poli-alomero de 5 ml 12 x 75 mm esterelizado que contém, 1 ml de meio da mecha de algodão. Os tubos sofreram depois vórtice de modo a retirar o vírus e foram congelados até utilização. Para a titulação própria dita, pratos de cultura de 6 fundos que contêm 5.10 células/fundo foram incubados durante a noite, aos 37°C. Os tubos foram ensopados e várias diluições das amostras no meio da mecha de algodão foram preparadas. Depois da remoção do meio de cultura nos 6 fundos, 200 pl de cada diluição das amostras foram transferidos em duplicado para mono-camadas de células e mantidos durante uma hora, aos 37°C. Quatro ml de um meio de cultura que contém 1,5 % de carboximetilcelulose foram adicionados a cada fundo. Os pratos foram depois incubados durante 2 dias, aos 37°C. Depois deste perído de incubação, o meio foi suavemente removido e 1 ml de uma solução de violeta de cristal (10 % de metanol, 90 % de H₂O₂, 0,3 % de violeta de cristal) foi adicionado a cada fundo, durante 15 min. Os pratos foram depois totalmente lavados e as placas foram contadas. O título de VSH2 foi expresso em pfu/ml.

4. Resultados

Num primeiro grupo de experiências, grupos de porquinhos da índia foram imunizados com uma dose de antigene baixa (5 pg de rgD₂t) formulada em 4 diferentes formulações. Esta dose sub-óptima de antigene foi escolhida de modo a seleccionar a combinação de adjuvante de rgD₂t mais potente que possa fornecer protecção contra doença por VSH primária e recorrente, quando administrada a porquinhos da índia antes de inoculação de VSH2 intravaginal (tentativas profiláticas).

4.1. Indução de imunidade humoral

Como indicado no Quadro 1, grupos vacinados com formulações de rgD₂t que contêm 3D-MPL como estimulante imunológico mostraram títulos de ELISA e títulos de neutralização superiores nos seus soros do que no grupo imunizado com a vacina rgD₂t/Alúmen. Bons meio dos títulos de neutralização foram induzidos depois de 3 imunizações com rgD₂t 3D-MPL o/a (R) ou rgD₂t Alúmen 3D-MPL.

4.2. Indução da resposta do efeito da célula T (DTH)

Os resultados do teste à pele (Quadro 2) mostraram que o rgD₂t formulado em 3D-MPL emulsão de o/a induziu a resposta de DTH mais forte. Uma resposta de DHT especifica foi também induzida por rgD₂t Alúmen 3D-MPL. Experiências idênticas conduzidas em ratos também revelaram que o rgD₂t combinado com Alúmen mais 3D-MPL é muito potente na indução de uma resposta do efeito da célula T in vivo, em contraste com a formulação de rgD₂t Alúmen.

4.3. Efeito da vacinação em doença primária por VSH

Duas semanas depois da terceira imunização, os porquinhos da índia foram desafiados intravaginalmente com VSH2. O efeito da vacinação no curso clínico e viriológico da infecção primária por VSH2 estã ilustrado na Figura 1 e sumarizado no Quadro 3. Quando comparado com os grupos de controle (Grupos 4 a 6) que se tornaram infectados e experimentaram doença primária grave, 100 % de animais vacinados com formulação rgD₂t 3D-MPL o/a mostrou nenhuma evidência da doença herpética, como monotorizado pela incidência e gravidade da lesão na pele. Além disso, estes animais não mostraram qualquer replicação virai no tubo vaginal como determinado por titulação vaginal do vírus no dia 5 após o desafio. Vários resultados idênticos foram obtidos no grupo vacinado com rgD₂t/Alúmen 3D-MPL. Este grupo nunca desenvolveu vesículas herpéticas durante o período de observação (valor de lesão < 1). Além disso, replicação virai muito baixa pode ser detectada nas mechas de algodão vaginais recolhidas. Em contraste, animais com rgD₂t adsorvido em alúmen foram pobremente protegidos (75 % de lesão incidente na pele).

4.4. Efeito da vacinação na doença recorrente por VSH

Os resultados estão ilustrados na Figura 1 e sumarizados no Quadro 4.

A vacinação com formulações de rgD₂t que contêm 3D-MPL (Grupos 1 e 2) significantemente alteraram o desenvolvimento das doenças herpéticas recorrentes. Dois grupos tiveram significantemente menos episódios recorrentes e números de dias do que os controle ou os grupos tratados com rgD₂t Alúmen.

De modo a ainda avaliar os factores que influenciam a eficácia das vacinas de rgD₂t profiláticas que contêm 3DMPL, um segundo grupo de experiências foi iniciado num número superior de porquinhos da índia.

Duas doses de antigene foram comparadas (5 e 20 pg) e composições de adjuvantes diferentes foram testadas. Três imunizações foram administradas aos dias 0, 28 e 84. Os animais foram sangrados todas as duas semanas para a determinação de anti-corpos individuais por ensaios de ELISA e ensaios de neutralização. Os líquidos de lavagens vaginais foram recolhidos depois da segunda imunização e foram testados para a presença de anti-corpos sistémicos específicos para rgD₂t.

Indução de imunidade humoral

Os resultados (Quadro 5) indicaram que todas as formulações de rgD₂t que contêm 3D-MPL foram capazes de estimular títulos de ELISA e títulos de neutralização elevados em soros de porquinhos da índia.

Os meios dos títulos de ELISA e dos títulos de neutralização induzidos depois de três imunizações foram muito idênticos nos soros dos grupos vacinados com uma formulação de rgD₂t que contém ou 5 vg ou 20 μg de gD₂t. Não houve diferença significativa na resposta humoral medida nos grupos imunizados com uma vacina de rgD₂t Alúmen que contém ou 50 pg de 3D-MPL (Grupo VI) ou 100 mg de 3D-MPL (Grupo X).

É interessante notar que anti-corpos anti-rgD₂t sistémicos (classe IgG) podem ser detectados nos líquidos de lavagens vaginais em todos os grupos vacinados. Esta resposta ao anti-corpo anti-rgD₂t localizado mucosamente pode jogar um papel protector importante através da diminuição da carga do vírus de infecção no tubo genital, durante a primeira infecção.

Efeito da vacinação em doenoa primária por VSH

Duas semanas depois da terceira imunização, os porquinhos da índia foram desafiados intraviginalmente com VSH2. O efeito da vacinação no curso clínico ou viriológico da infecção por VSH2 primária está sumarizada no Quadro 6. Quando comparada com os de controle, os animais vacinados com uma formulação de 5 μg de rgD₂t Alúmen 3D-MPL que contém ou 50 μg ou 100 μg de 3D-MPL

(Grupos VI e X) mostraram gravidade de lesão na pele significativamente reduzida (p < 0,05) assim como redução na incidência de lesões na pele.

Muitos resultados idênticos foram observados no grupo vacinado com 5 pg de rgD₂t ^numa emulção de 3D-MPL o/a (Grupo III). Nos três grupos vacinados, replicação virai muito baixa pode ser detectada em mechas de algodão vaginais recolhidas 5 dias depois do desafio.

Efeito da vacinação em doença recorrente por VSH

Os resultados estão dados no Quadro 6. Quando comparados com os grupos de controle, a incidência das lesões na pele e q número do dia de recorrência foram reduzidos significantemente (p > 0,05) em três grupos vacinados. Estes grupos tiveram também episódios menos recorrentes do que os grupos de controle.

5. Conclusões

Os resultados obtidos em porquinhos da índia mostraram claramente que a vacinação com uma formulação de rgD₂t que contém 3D-MPL entregue numa suspensão de óleo em ãgua ou combinado com hidróxido de alumínio, é muito eficaz no fornecimento de protecção contra doenças por VSH2 recorrentes ou primárias, quando administrada a porquinhos da índia antes da inoculação de VSH2. Estas formulações de rgD₂t 3D-MPL são capazes de melhorar as respostas imunes humorais (anti-corpos de neutralização) e induzidas pelo efeito da célula (DTH). Estes resultados são obtidos usando uma dose pequena de (5 pg) .

6. imunogenicidade das formulacoes de gP₂t ^ein

6.1. Imunoqenicidada comparativa de rqD₂t/Alúmen e da forma rgD₂t/Alú^men 3D-MPL

A imunogenicidade de vacinas de rgD₂t/Alúmen e de rgn^t/Alúmen 3P-MPL foram avaliadas em cercopithecus aethiops (African Green Monkeys, AGM). Estas imunizações foram dadas a 0, 1 e 3 meses. Respostas imune humorais específicas (títulos de ELISA e títulos de neutralização) e induzidas pelo efeito da célula (DTH) foram medidas.

6.1.1· Procedimento experimental •Cada formulação contem 20 mg de rgD t e 0,5 mg de 3+ z equivalente de Al /dose. Uma dose de 50 Mg de 3D-MPL foi usada. Grupos de cercopithecus aethiops (AGM) foram imunizados 3 vezes nos dias 0, 28 e 84. As imunizações foram dadas intramuscularmente numa dose de 0,5 ml (20 rgD₂t). Os animais foram sangrados todas as ±2 semanas, para a determinação de anti-corpos por ensaios de ELISA e ensaios de neutralização. As duas formulações foram também testadas em relação à sua capacidade para a indução de imunidade induzida pela célula T, com medida pela indução de respostas de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH). Aos macacos, foram dados intradermicamente na intumescência, diferentes doses de rgD₂t (20, 5 e l /xg) em solução salina 13 dias depois da segunda imunização. Eles foram também testados à pele com solução salina como controle. O eritema e o endurecimento no sítio da injecção transdérmica foram monotorizados às 24 hrs e 48 hrs depois.

6.1.2. Resultados

a) Indução de imunidade humoral

Antes da vacinação, nenhum do soros dos macacos mostrava qualquer actividade de anti-corpos anti-VSH2 (dado não indicado) . Como indicado no quadro 7, ambas vacinas induziram bons títulos de ELISA e títulos de neutralização depois da segunda imunização. Esta resposta do anti-corpo não foi repetida com uma terceira imunização nos macacos vacinados com rgD₂t/Alúmen. Em contraste, os macacos que receberam uma terceira imunização com rgD₂t/Alúmen 3D-MPL produziu um aumento das respostas dos anti-corpos de ELISA e de neutralização (meio do título de ELISA: 10056; meio do título de neutralização: 950).

b) Indução da resposta do efeito da célula T (DTH)

Os resultados do teste à pele (quadro 8) mostraram que o rgD₂t recombinado com Alúmen mais 3D-MPL foi muito potente na indução da resposta do efeito da célula T in vivo, em contraste à formulação de rgD₂t Alúmen. Uma resposta DTH potente foi observada em animais vacinados com rgD₂t Alúmen 3D-MPL testados à pele com 20 mg de rgD₂t. As respostas de DTH específicas foram também medidas com as concentrações de gD₂t mais baixas (5 e 1 pg) na grande maioria dos macacos (3/4 para a dose de 5 gg e 2/4 para a dose de 1 pg). Estas doses de rgD₂t induziram respostas de teste à pele mais fracas do que a concentração de 20 mg de rgD₂t.

6.2. Imunigenicidade das formulações de rqD₂t/Alúmen em macacos rhesus

A imunogenicidade das vacinas de rgD₂t/Alúmen 3D-MPL que contêm doses de rgD₂t diferentes (100 pg, 10 pg, ou 5 pg) foi comparada em macacos rhesus.

6.2.1. Procedimento exeperimental

Cada formulação que continha 0,5 pg de equivalentes de

O -4Al e 50 pg de 3D-MPL por dose. Três grupos de macacos rhesus (4 macacos/grupo) foram imunizados três vezes aos dias 0, 28 e 77, da seguinte forma:

Grupo 1 : 100 pg de rgD₂t Alúmen mais 3D-MPL (50 pg)

Grupo 2 : 20 rgD₂t Alúmen mais 3D-MPL (50 pg)

Grupo 3 : 5 pg de rgD^t Alúmen mais 3D-MPL (50 pg)

As imunizações foram dadas intramuscularmente numa dose de 1 ml. Os animais foram sangrados todas as ± 2 semanas para a determinação de anti-corpos por ensaios de ELISA e de neutralização.

6.2.2. Indução da imunidade humoral

Antes da vacinação, nenhum do soros dos macacos mostrava qualquer actividade de anti-corpo anti-VSH2. Bons títulos de ELISA e de neutralização foram observados em três grupos vacinados que receberam ou 100, 20 e 5 mg de gD₂t em Alúmen + 3D-MPL. (Dado não indicado).

6.3 Conduções

Os resultados obtidos em cercopithecus aethiops claramente indicaram que uma vacina de rgD₂t que contém uma combinação de Alúmen com 3D-MPL significamente melhoram as respostas imunes específicas humoral (anti-corpos de neutralização) e induzidas do efeito da célula (DTH). Quando comparada com esta vacina, uma formulação de rgD₂t Alúmen é menos potente na indução da anti-corpos de neutralização e é incapaz de induzir uma resposta de

DTH in vivo.

Os resultados obtidos em macacos rhesus também mostraram que uma formulação de rgD₂t Alúmen + 3D-MPL é muito eficaz na indução de uma resposta humoral específica, mesmo com baixas doses de antigene (5 μg ou 20 μς de rgD₂t).

7. Conclusões gerais

Os resultados obtidos em porquinhos da índia claramente indicam que formulações de adjuvantes que contêm ou 3D-MPL entregue numa emulsão de óleo em ãgua ou combinado com hidróxido de alumínio são muito eficazes na indução de uma resposta imune protectora com uma vacina de glicoproteína de VSH recombinante num modelo animal de desafio intravaginal de porquinhos da índia, mesmo com doses muito baixas de antigene (5 μg de rgD₂t). Os dados de protecção também mostram que estas formulações de rgD₂t 3D-MPL são muito potentes no fornecimento de protecção. Estas formulações de 3D-MPL são capazes de melhorar respostas imunes humorais específicas (anti-corpos de neutralização) e induzidas pelo efeito da célula (DTH).

Além disso, a formulação de rgD₂t Alúmen 3D-MPL foi indicada como também melhora a imunogenicidade ao nível de anti-corpo e induz uma resposta do efeito da célula T em primatas, sugerindo que este efeito de adjuvante não estã restringido a-pequenas espécies de animais.

QUADRO 1: Resposta do anti-corpo anti-VSH em soros de porquinhos da índia imunizados com formulações de rgD₂t antes e depois do desafio virai.

Grupo	Vacina(1)	Pré-desafio(2)	Pós-desafio(3)
	Antigene	Adjuvante	Título ELISA	Título de Neutraliz	Título E1ISA	Título de Neutraliz
1	rgD₂t	3D-MPL o/a(R)	812911 20822	1600	68720+ 24648	22001765
2	rgD₂t	Alúmen 3D-MPL	398971 30165	20001800	272241 13093	18001765
3	rg^D2t	Alúmen	203461 23704	6001400	286221 24024'	13331461
4	-	Alúmen	< 100	< 50	7371878	142185
5	-	3D-MPL	< 100	< 50	2591244	127511304
6	n trat.	-	< 100	< 50	2251194	1191141

(1) dose de rgD₂t = 5 pg. Os animais foram imunizados três vezes aos dias 0, 28 e 95. Eles foram desafiados 2 semanas depois com 10⁵ ufp de VSH2.

(2) Soros recolhidos no dia antes do desafio (= 14 dias depois da terceira imunização).

(3) Soros recolhidos 2 semanas depois do desafio.

Os valores são dados como a média aritmética do título

DP.

QUADRO 2: Resultados do teste à pele (DTH) em porquinhos da índia vacinados com formulações de rgD₂t.

Formulação	Porquinho da índia #	Leitura às 24 hr	Leitura às 48 hr
E(mm)	E (mm)	E(mm)	I (mm)
rgD₂t 3D-MPL o/a(R)	1	20	15	14	10 (N)
	2	15	10	10	3
	3	20	17 (N)	15	12 (N)
rgD₂t Alúmen 3D-MPL	1	10	8	10	4
	2	15	12	12	3
	3	11	9	12	0
-Alúmen 3D-MPL	1	0	0	0	0
	2	0	0	0	0
	3	0	0	0	0
não tratado	1	0	0	0	0
	2	0	0	0	0

Os porquinhos da índia foram imunizados aos dias 0 e 21 com 5 pg de formulação de rgD₂t (dado intramuscularmente). É dada intradermicamente 5 pg de rgD₂t em solução salina no dia 29. O teste à pele foi lido às 24 h e 48 h.

E - eritema no sítio de injecção ID em milímetros.

I = endurecimento no sítio da injecção ID em milímetros N = necrose no sítio do teste à pele.

QUADRO 3: Efeito da imunização com formulação de rgD₂t no curso clínico e viriológico da infecção por VSH2 primário em porquinhos da índia

Grupo	Vacina (1)	Incidência de lesões na pele (2)	Gravidade de lesões na pele (3)	Títulos de vírus vaginal(4)
Antigen	Adjuvante
1	rgD₂t	3D-MPL o/a (R)	0/4	0,110,3	0
2	rgD₂t	Alúmen 3DMPL	0/4.	1+0,4	6,25112,4
3	rgD₂t	Alúmen	3/4	4,412,7	357516010
4	-	Alúmen	5/5	6,212,6	521616295
5	-	3D-MPL	4/5	5,1±3,6	329814475
6	n trat.		7/8	7,314,7	221414519

(1) dose de rgD₂t = 5 pg. Os animais foram imunizados três vezes aos dias 0, 28 e 95. Eles foram desafiados 2 semanas depois com 10^{4 5} ufp de VSH2.

(2) Número de animais que mostram um valor de lesão > 1 durante um período de 12 dias de observação.

(3) Soma dos valores de lesão (dias 1 - 12) , média aritmética ± DP.

(4) Pico do título de VSH (pfu/ml em mechas de algodão vaginais recolhidas 5 dias depois do desafio.

QUADRO 4: Efeito da imunização com formulação de rgD₂t em doença de VSAH2 genital recorrente em porquinhos da índia

Grupo	Vacina (1)	Incidência na pele (2)	Episódios de de doença recorrente (3)	Número de dias de recorrência (4)
Antigene	Adjuvante
1	rgD₂t	3D-MPL o/a (R)	1/4	1 ± 2	0,7 ± 1,5
2	rgD₂t	Alúmen 3DMPL	2/4	1 ± 0,8	1,7 ± 3,5
3	rgD₂t	Alúmen	3/3	4,3 ± 1,5	8,3 ± 5
4	-	Alúmen	4/5	3,8 ± 3,3	7,6 ± 6,5
5	-	3D-MPL	5/5	2,6 ± 1,1	6 ± 4,4
6	n trat.	-	6/8	3,5 ± 2,2	9,9 ± 6

(1) dose rgD t = 5 gg. Os animais foram imunizados três vezes aos ² . .5

0, 28 e 95. Eles foram desafiados 2 semanas depois com 10 ufp de VSH2.

(2) Número de animais que mostraram um valor de lesão > 1 durante o período de observação (dias 13 - 60) .

(3) Um episódio recorrente é precedido e seguido por um dia sem lesão e caracterizado por pelo menos dois dias com eritema (valor = 0,5) ou um dia com vesícula(s) (valor de lesão > 1). Os resultados são expressos como a média aritmética ± DP (perído de observação : dias 13 - 60).

(4) Dias totais que os animais experimentaram um episódio herpético recorrente, média aritmética ±DP (perído de observação : dias 13 - 39).

QUADRO 5: Comparação do efeito das diferentes formulações de adjuvantes na imunogenicidade de rgD₂t em porquinhos da índia

Grupo	Vacina(1)	Resposta do anti corpo Anti-VSH depois
de duas imunizações	vagina(5)
Nos soros	Ne
	rgD t dose	Adjuvante	Título ELISA Título Neutro	Líquidos(5) de Lavagens
I	20	gg	3DMPL(50gg) o/a (R)	3146219087	8501396	0,78010,376
II	5	gg	3DMPL(50gg) o/a (R)	35015114395	4121264	1,00010,177
III	20	gg	3DMPL(50gg) o/a (S)	16720112641	13801756	0,70010,232
IV	5	gg	3DMPL(50gg) o/a (S)	1499219885	8401571	0,57010,200
V	20	gg	Alúmen 3D MPL(50gg)	1445217476	7401499	0,62010,175
VI	5	gg	Alúmen 3D MPL(50gg)	1017414219	4201301	0,52010,175
VII			Alúmen 3D MPL(50gg)	< 100	< 50	< 0,020
VIII			3DMPL(50gg) o/a (R)	< 100	< 50	< 0,020
IX	-		n tratado	< 100	< 50	< 0,020
X	5	gg	Alúmen 3D	460213953	1631151	0,67111,187

QUADRO 5 (continuação)

Grupo	Vacina(1)	Resposta do anti-corpo Anti-VSH depois
de três imunizações	-título pré-desafio Em soros(4)
rgD t dose	Adjuvante	Título ELISA	Título Neutro
I 20 gg	3DMPL(50gg) o/a (R)	19958 ± 10171	3400 ± 19946
II 5 gg	3DMPL(50gg) o/a (R)	51688 ± 40120	4342 ± 2879
III 20 gg	3DMPL(50gg) o/a (S)	36647 ± 34126	4080 ± 2883
IV 5 gg	3DMPL(50gg) o/a (S)	45082 ± 24221	4560 ± 2502
V 20 gg	Alúmen 3D MPL(50gg)	16015 ± 7846	3280 ± 2276
VI 5 gg VII VIII - IX	Alúmen 3D MPL(50gg) Alúmen 3D MPL(50gg) 3DMPL(50gg) o/a (R) n tratado	20488 ± 9562 < 100 < 100 < 100	2640 ± 1510 < 50 < 50 < 50
X 5 gg	Alúmen 3D	16588 ± 6945	2560 ± 1678

(1) Os animais foram imunizados três vezes aos dias 0, 28 e 84.

. 5

Eles foram desafiados 2 semanas depois com 10 ufp de VSH2.

(2) Soros e os líquidos de lavagens vaginais foram recolhidos 14 dias depois da segunda imunização.

(3) Soros recolhidos no dia antes do desafio (= 14 dias depois da terceira imunização).

(4) Valores são dados como médias aritméticas dos títulos ± DP.

(5) Corresponde à densidade óptica (aos 492 nm) por 0,5 gg/ml do IgG total medido no padrão do ensaio de ELISA de anti-gD₂t, média aritmética ± DP.

quadro 6: Efeito da imunização com formulações de rgD₂t do curso clínico ou viriológico da infecção por VSH2 em porquinhos da índia

	Vacina
	5gg rgD t	5jLtg rgD„t	5/ig rgD t	Controle
	3DMPL 07a	Alúmen 3D	Alúmen 3D	Grupos
	(s)	MPL(50gg)	ΜΡΙ,(100μ9	VII-
	Grupo III	Grupo VI	Grupo X	VIII-IX
Infeccão orim. VSH2 Incidência de lesões na pele (%)	1/9 11%	1/10 10%	0/10 0%	12/14 86%
Gravidade da lesão na pele	1,2 + 1	0,7±0,7	0,9±l	8,6±5,1
título do virus vaginal(pfu/ml)	0	0	1,5±4,7	1077±1682
Infeccão recor. VSH2 Incidência de lesões na pele (%)	2/9 22%	2/10 20%	3/10 30%	11/14 79%
Número de dias de recorrência	1±2,3	1,6±2,1	1,6±2,7	7,3±6
Número de episódios de recorrência	0,2±0,4	0,6±0,7	0,5±0,8	1,9±1,2

Escala experimental: 3 imunizações aos dias 0, 28 e 84.

. . » 5

Desafio 2 semanas depois da última imunização com 10 ufp de VSH2.

Infecção por HSV2 primária:

Incidência de lesões na pele

Gravidade da lesão na pele:

títulos do virus vaginal:

(dias do periodo de observação 4 a 12 após o desafio) (%) : número de animais com vésicula(s)(valor de lesão >1) coma dos valores de lesão (para os dias 4 a 12), média aritmética ± DP títulos do vírus (pfu/ml) em mechas de algodão vaginais recolhidas ao dia 5 depois do desafio

Infecção por VSH2 recorrente: (dias do período de observação 13 a 39 após desafio)

Incidência de lesões na pele (%) :

Número de dias de recorrência:

Número de episódios recorrentes:

número (%) de animais com vesícula(s) (valor de lesão >1) dias totais dos animais que experimentaram uma lesão herpética recorrente, média aritmética ± DP. Os animais foram avaliados como positivos em relação ã lesão recorrente se um valor de lesão de 0,5 (eritema) foi registado durante 2 dias sucessivos pelo menos ou se um valor de lesão >1 (vesícula(s)) foi observado em qualquer dia.

média aritmética ± DP.

QUADRO 7: Resultados de DTH em macacos African Green vacinados com GD2T ALÚMEN ou ALÚMEN 3D MPL

	Leitura	às 24	h	Leitura	às 48	h
Vacina	Macaco	PBS	gD2t	gD2t	gD2t	PBS	gD2t	gD2t	gD2t
	NB		lMg	5gg	20gg		lMg	5gg	20^g
gD2t	JO358	-	ND	-	-	-	ND	—	—
Alúmen	JO359	-	ND	-	-	-	ND	-	-
	JO363	-	ND	-	-	-	ND	-	-
	JO364	-	ND	-	-	-	ND	-	-
	JO366	-	ND	—	-	—	ND	—	-
gD2t	JO348	-	-	E	12-4	-	-	I	I
Alúmen	JO349	-	El-2	15-8	cm	-	E	I	I
3 D MPL	JO375	-	mm	mm	E7-9	-	E	I	I
	JO515	-	El-2	13-4	mm	-	-	-	Efrac
			mm	mm	14-6
			-	-	mm
					E
Contr.	J0320	-	-	-	-		—	—	—
	JS110	—	-	—	—	—	—	—

Os macacos foram imunizados aos dias 0 e 28 com 20 gg de formulação de gD2t (dada intramuscularmente). Foi dada intradermicamente na intumescência em diferentes doses de gD2t em solução salina, 13 dias depois. O teste à pele foi lido às 24 h e 48 h.

E : eritema no sítio da injecção ID

I : endurecimento no sítio da injecção

ND = não foi feita.

QUADRO 8: Imunoyenioidade eoaiparativà das formulações de GD2T Alúmen e GD2T Alúmen 3 D MPL em macacos African Green: Respostas serológicas

	Posto II	Posto	III
14 dias	28dias	56	dias	14	dias
. * Vacina Macaco	Título	Título	Título	Título	Título	Título	Título
NB	ELISA	NEUT.	ELISA	ELISA	NEUT.	ELISA	NEUT.
JO358	1388	400	6572	1135	200	2050	400
JO359	4731	400	3232	1866	100	2110	200
gD2tALUM JO363	1376	200	2316	1300	50	1205	50
JO364	5914	1600	5275	3740	400	6323	800
JO3 66	21104	400	3696	2550	200	2302	200
Méâ.Arit	6902	600	4218	2118	190	2798	330
±DP	±8190	±565	±1697	±1062	±134	±2015	±290
JO3 48	7120	200	10175	4490	200	11082	400
gD2tALUM JO349	14437	1600	15409	7361	800	15848	1600
/3D MPL JO375	7990	800	5170	2953	800	6797	1600
JO515	6515	200	7246	3660	100	6497	200
Méâ. Arit	9015	700	9500	4616	475	10056	950
±DP	±3664	±663	±4442	±1934	±377	±4392	±754

Cada dose de vacina contém 20 Mg de gD2t

Título ELISA = ponto médio do título

Título de NEUT = recíproco da diluição mais elevada que origina 100 % de protecção contra o efeito citopatogénico.

Lisboa, 19 de Março de 1992

J. PEREIRA DA CRUZ

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 33

Claims

ia. - Método de produção de uma vacina, caracterizado por compreender a mistura de glicoproteína D de VSH (vírus simples do herpes) ou de um seu fragmento imunológico com um suporte e com monofosforil-lípido A desacilado em 3.
2a. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o suporte compreender alúmen.

33. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o suporte compreender uma emulsão de óleo em ãgua.

43. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a glicoproteína D ser uma glicoproteína D de VSH-2 ou um seu fragmento imonulõgico.

53. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a glicoproteína D ser uma proteína truncada.

63. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a proteína truncada estar livre da região de ancoragem de C terminal.

73. - Método de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por a glicoproteína D estar em conjunção com um suporte em partículas.

8â. - Método de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por o monofosforil-lípido A desacilado em 3 estar presente na gama de 10 gg - 100 pg por dose.

9a. - Utilização de glicoprotéina gD de VSH ou de um seu fragmento imunológico em conjunção com o monofosforil-lípido A desacilado em 3, caracterizado por a refrida glicoprotéina ser empregada na manufactura de um medicamento para a profilaxia ou o tratamento de infecções por VSH.