BR112021007668A2 - composições imunogênicas - Google Patents

Abstract

composições imunogênicas. a presente invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo omvs e (a) antígeno pertussis acelular, (b) um toxoide tetânico e (c) um toxoide diftérico, em que as omvs são derivadas de bordetella pertussis. a invenção também apresenta composições para uso em um método para aumentar a resposta imunológica em um paciente, compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma composição da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM- POSIÇÕES IMUNOGÊNICAS". Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se ao campo de vacinas combi- nadas, que são vacinas contendo uma mistura de imunógenos de mais de um patógeno, de modo que a administração da vacina pode imuni- zar um indivíduo contra mais de um patógeno. Mais particularmente, a invenção refere-se a vacinas de reforço contra difteria, tétano e coque- luche. Antecedentes da Invenção

[002] Vacinas contendo antígenos de mais de um organismo pa- togênico em uma única dose são conhecidas como vacinas "multiva- lentes" ou "combinadas". As vacinas combinadas oferecem aos paci- entes a vantagem de receber um número reduzido de injeções, o que pode resultar em uma vantagem clínica de maior complacência (por exemplo, vide capítulo 29 da referência i). Várias vacinas combinadas já foram aprovadas para uso humano na UE e nos EUA, incluindo va- cinas trivalentes para proteção contra difteria, tétano e coqueluche. Tais vacinas podem ser identificadas como DTaP e Tdap. Embora a DTaP e a TdaP sejam ambas vacinas combinadas contra difteria, téta- no e coqueluche, as vacinas DTaP são usadas para imunização primá- ria enquanto que as vacinas TdaP são usadas para vacinações de re- forço subsequentes. A diferença entre as composições da vacina pri- mária e da vacina de reforço está na dosagem. Mais particularmente, no que diz respeito às vacinas de reforço, estas vacinas geralmente compreendem doses mais baixas de alguns componentes antigênicos, por exemplo, o teor de toxoide diftérico da BOOSTRIX é 10- vezes mais baixo que aquele da INFANRIX. Isto aparece indicado pelo uso da letra minúscula ‘d’ se referindo a uma quantidade mais baixa de to- xoide diftérico.

[003] A proporção de componentes antigênicos também pode ser alterada. Por exemplo, a proporção do toxoide diftérico e do toxoide tetânico é de 2,5:1 na INFANRIX, mas é de 1:2 na BOOSTRIX. Assim sendo, essas vacinas de reforço apresentam uma grande redução na dose de toxoide diftérico, tanto em quantidades absolutas como tam- bém em quantidades relativas para o teor de toxoide tetânico.

[004] No entanto, nos últimos anos, o reaparecimento da doença causada pela Bordetella pertussis vem sendo observado nos países com alta cobertura vacinal. Apesar de os motivos exatos para este ressurgimento não estarem claros, causas em potencial incluem imu- nidade baixa e alterações epidemiológicas nas cepas em circulação.

[005] Portanto, é um objeto da invenção apresentar vacinas com- binadas adicionais e aprimoradas para proteger contra Corynebacte- rium diphtheriae, Clostridium tetani e Bordetella pertussis. Também é um objeto da invenção apresentar vacinas TdaP adicionais e aprimo- radas adequadas para uso humano como um reforço em adultos, ado- lescentes e crianças com idade de quatro anos ou mais que já recebe- ram a imunização infantil. Sumário da Invenção

[006] A invenção baseia-se em estudos de vacinas combinadas que compreendem vesículas de membrana externa (OMVs) de Borde- tella pertussis. Os inventores descobriram que estas vacinas combina- das produzem títulos de anticorpos específicos para os antígenos cor- respondentes com pouca ou nenhuma interferência imunológica entre os vários antígenos. A presença de OMVs de Bordetella pertussis pro- porciona uma resposta de anticorpos melhorada contra Bordetella e surpreendentemente também melhora a resposta de anticorpos contra outros antígenos na composição.

[007] Assim, em um primeiro aspecto é apresentada uma compo- sição imunogênica compreendendo (a) uma vesícula de membrana externa (OMV), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que a OMV é derivada de Bor- detella pertussis. Particularmente a OMV é derivada de uma cepa de Bordetella pertussis expressando um toxoide pertussígeno genetica- mente destoxificado. Mais particularmente a OMV é derivada de uma cepa de Bordetella pertussis expressando o toxoide pertussígeno ge- neticamente destoxificado PT 9K/129G.

[008] Assim sendo, a invenção apresentauma composição imu- nogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bor- detella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são deri- vadas de uma cepa de Bordetella pertussis expressando um toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado, particularmente o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT 9K/129G.

[009] A invenção apresenta ainda uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella per- tussis (OMVs) compreendendo toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado, particularmente PT 9K/129G, (b) um antígeno de per- tússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico.

[0010] A invenção apresenta ainda uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella per- tussis (OMVs) compreendendo toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado, particularmente PT 9K/129G, em que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glucosami- na (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo, (b) um an- tígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico.

[0011] O toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT- 9K/129G compreende duas substituições aminoacídicas na subunida- de S1, especificamente R9K e E129G (vide, por exemplo, o documen-

to EP0396964). Dessa forma, ainda mais particularmente, as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxifica- do PT-9K/129G. Ainda mais particularmente, 100% do toxoide pertus- sígeno na vesícula de membrana externas é PT geneticamente desto- xificado, particularmente PT 9K/129G.

[0012] Em algumas modalidades, as OMVs de Bordetella pertussis usadas na invenção têm uma estrutura de lipídio A modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da es- trutura do núcleo. Em algumas modalidades, a cepa de Bordetella per- tussis da qual as OMVs são obtidas compreende um nocaute de ArnT, particularmente deleção do gene codificador de ArnT (∆ArnT). Assim sendo, as OMVs usadas na invenção e derivadas de tais cepas podem ter uma estrutura de lipídio A modificada sem substituições de gluco- samina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo.

[0013] Particularmente, as OMVs usadas na invenção não são tra- tadas com formaldeído, formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogê- nio ou uma combinação dos mesmos. Mais particularmente, as OMVs usadas na invenção não são quimicamente destoxificadas por trata- mento com formaldeído, formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogê- nio ou uma combinação dos mesmos.

[0014] Antígenos de pertússis acelulares adequados incluem toxi- na pertussígena destoxificada (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina (PRN), proteína fimbrial 2 (FIM2), proteína fimbrial 3 (FIM3) e combinações das mesmas. Em certas modalidades o antígeno de pertússis acelular compreende pelo menos dois, por exemplo, pelo menos três antígenos selecionados do grupo que consiste em toxina pertussígena destoxificada (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), per- tactina (PRN), proteína fimbrial 2 (FIM2), proteína fimbrial 3 (FIM3).

Combinações particulares de antígenos de pertússis acelulares para uso na invenção incluem: (1) PT, FHA e PRN; (2) PT, FHA, PRN, FIM2 e FIM3; (3) PT e FHA e (4) PT, FHA, FIM2 e FIM3.

[0015] Particularmente, a composição imunogênica é uma vacina. Mais particularmente, a vacina é para administração a um ser humano. A vacina pode ser para imunização primária. Ainda mais particular- mente a vacina é para uso como um reforço, por exemplo, em imuni- zação secundária. Ainda mais particularmente o toxoide diftérico está presente em uma concentração de cerca de 4 Lf/ml a cerca de 8 Lf/ml. Mais particularmente, o toxoide diftérico está presente em uma con- centração de cerca de 2Lf por dose de 0,5 ml, cerca de 2,5Lf por dose de 0,5 ml, cerca de 3Lf por dose de 0,5 ml, cerca de 3,5Lf por dose de 0,5 ml ou cerca de 4 Lf por dose de 0,5 ml. O toxoide tetânico pode estar presente em uma concentração de cerca de 5 Lf por dose de 0,5 ml.

[0016] Particularmente o toxoide tetânico e o toxoide diftérico es- tão presentes em uma proporção de toxoide tetânico:toxoide diftérico de 1,5:1 a 2,5:1 (medida em unidades Lf), por exemplo, cerca de 2:1 (medida em unidades Lf).

[0017] A composição imunogênica pode compreender um adjuvan- te, particularmente um adjuvante do tipo sal de alumínio.

[0018] Em um segundo aspecto da invenção, é apresentada uma composição imunogênica para uso em um método para aumentar uma resposta imunológica em um paciente, compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma composição imunogênica de acordo com a presente invenção.

[0019] Em um terceiro aspecto da invenção, é apresentado um processo para preparação de uma composição imunogênica de acordo com a presente invenção, compreendendo misturar um primeiro com- ponente compreendendo a vesícula de membrana externa (OMV) e um segundo componente compreendendo o antígeno de pertússis acelular, o toxoide tetânico e o toxoide diftérico. Em certas modalida- des do terceiro aspecto da invenção, a OMV no primeiro componente é liofilizada e o segundo componente compreende antígenos na forma aquosa. Assim sendo, o processo pode compreender ainda a etapa de reconstituição da OMV liofilizada no primeiro componente com os antí- genos aquosos do segundo componente.

[0020] Em um quarto aspecto da invenção, é apresentado um kit para preparação da composição imunogênica de acordo com a pre- sente invenção, compreendendo um primeiro componente compreen- dendo a OMV e um segundo componente compreendendo o antígeno de pertússis acelular, o toxoide tetânico e o toxoide diftérico, em que os dois componentes estão em recipientes separados. Em certas mo- dalidades do quarto aspecto da invenção, a OMV no primeiro compo- nente é liofilizada e o segundo componente compreende antígenos na forma aquosa. Breve Descrição das Figuras

[0021] Figura 1: Reatogenicidade in vitro da cepa vacinal W28 9K/129G ΔarnT comparada à cepa vacinal W28 9K/129G. Fig 1(a) resultados do ensaio do gene repórter de Luciferase para ativação de hTLR4 com W28 9K/129G (Bp WT) e com W28 9K/129G arntKO (Bp ΔarnT). Foram usadas concentrações diferentes de bactérias para es- timular as células HEK293, uma indução proporcional em relação à PBS é reportada. Fig 1(b): ELISA para detecção de IL-6 em sobrena- dantes de PBMCs humanas subsequente à estimulação com diferen- tes concentrações de bactérias.

[0022] Figura 2: OMV preparada a partir de cepas vacinais contém os antígenos de pertússis acelulares FHA, 69K e PT. Aná- lises da mancha ocidental do padrão titulado de subunidades dos antí- genos de pertússis acelulares FHA, 69K e PT purificados carregadas nas quantidades indicadas junto com 1ug de OMV das cepas W28 PT 9K/129G (WT) e W28 PT 9K/129G arnTKO (arnt), imunocoloridos com anti-FHA; antissoros anti-69K e anti-PT.

[0023] Figura 3: Imunização com OMV resulta em níveis baixos de anticorpos antigênicos anti-aP em camundongos. Camundon- gos foram imunizados por via intraperitoneal com 2,5 g de OMV da W28 PT 9K/129G (Bp-OMV (WT)) e da W28 PT 9K/129G arnTKO (BP- OMV (Arnt)) 3 vezes com um intervalo de 3 semanas. Embora so- mente anticorpos anti-69K pudessem ser detectados após a primeira imunização, níveis baixos de todos os 3 antígeno (FHA, 69K, e PT) eram detectáveis após a segunda e a terceira doses pelo ensaio Lu- minex. Fig. 3(a): títulos de IgG anti-FHA; Fig 3(b): títulos de IgG anti- 69K; Fig. 3(c): títulos de IgG anti-PT.

[0024] Figura 4: Imunização com TdaP em combinação com OMV resulta em níveis significativamente mais altos de anticor- pos contra a maioria dos antígenos vacinais em comparação com o TdaP isolado

[0025] Camundongos foram imunizados com Tdap (1/5 da dose humana) com ou sem a combinação de 2,5 mg de OMV da cepa W28 PT 9K/129G arnTKO por via intramuscular e depois de duas imuniza- ções os soros foram coletados e analisados para medir os níveis de anticorpo para cada um dos antígenos TdaP pelo ensaio Luminex. ***p<0,001,**p<0,01 *p<0,05.

[0026] Figura 5: OMV produz anticorpos que inibem a adesão de B. pertussis a células epiteliais in vitro de forma similar à vaci- na de wP. Os soros de 10 camundongos por grupo imunizado com OMV (da W28 9K/129G arntKO), bactérias inteiras (da W28 9K/129G arntKO), vacina de TdaP ou hidróxido de alumínio como controle (nil) foram reunidos, diluídos seriadamente no meio de infecção e incuba- dos com BP536 de B. pertussis do tipo selvagem marcado por 1 hora.

Células A549 foram então infectadas com as misturas de bacté- rias/soros por 1 hora e, depois de abundantes lavagens para remover as bactérias não ligadas, as bactérias associadas às células foram quantificadas por leitura da fluorescência a Ex/Em 485/535 nm. Os re- sultados representam a média +/- D.P. de um representante dos três experimentos independentes realizados em triplicata.

[0027] Figura 6: OMV produz uma resposta protetora potente similar ao padrão vacinal wP contra desafio intracraniano de B. pertussis no teste de Kendrick. Camundongos foram imunizados uma vez por via intraperitoneal com vacina de células inteiras ou com formulações de OMV e desafiados 2 semanas após a imunização com uma suspensão da cepa 18323 de B. pertussis administrada por via intracraniana. A sobrevida dos camundongos é reportada 2 semanas após o desagio de acordo com o teste da potência do desafio intracra- niano de Kendrick. As formulações vacinais incluem a vacina de célu- las inteiras wP contra coqueluche (padrão) a 1/10, 1/50 e 1/250 da do- se humana e OMV da cepa W28 9K/129G (OMV) nas doses indicadas.

[0028] Figura 7: Os títulos séricos de IgG total específica para FHA (Fig. 7(a)) e de IgG2c (Fig. 7(b)) são proporcionais à dose da vacina de OMV. Os anticorpos específicos para FHA presentes nos soros dos camundongos imunizados no dia do desafio foram analisa- dos por ELISA. ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05, n.s. = não significativo. Fig. 7(c) Imunização única com OMV promove respostas Th1/Th17 específicas para B. pertussis. Células do baço (2x106/mL) de ca- mundongos C57BL6 vacinados foram cultivadas na presença de B. pertussis sonicada (SBP, 5 μg/mL). Depois de 72 horas a concentra- ção de IFNγ (indicador de TH1), IL-13 (indicador de TH2), e IL-17 (in- dicador de TH17) nos sobrenadantes foi analisada por ELI- SA.***p<0,001.

[0029] Figura 8: A taxa de depuração de B. pertussis pelos pulmões é diretamente proporcional a uma dose da vacina de OMV. Camundongos C57BL6 foram imunizados com PBS, wP, OMV 0,4, OMV 2, ou com OMV 10 3 semanas antes do desafio. Os camun- dongos foram então infectados com uma cepa virulenta de B. pertussis (Bp338) e a carga bacteriana nos pulmões foi avaliada por contagem das CFU nos homogeneizados de pulmão diluídos seriadamente nos instantes indicados. A linha tracejada indica o limite de detecção. ***p<0,001 wP vs OMV 0,4, ### p<0,001, # p<0,05 wP vs OMV 10, p<0,001, p<0,05 wP vs OMV 2.

[0030] Figura 9: aP formulada com OMV promove IgG2c sérica específica para FHA. Os anticorpos específicos para FHA presentes nos soros dos camundongos imunizados no dia do desafio foram ana- lisados por ELISA. ***p<0,001, *p<0,05.

[0031] Figura 10: Imunização com wP, aP, aP+OMV e OMV iso- lada confere proteção contra o desafio com B. pertussis. Camun- dongos C57BL6 foram imunizados com PBS, wP, aP, aP+OMV ou com OMV isolada 3 semanas antes do desafio. Os camundongos fo- ram então infectados com uma cepa virulenta de B. pertussis (Bp338) e a carga bacteriana nos pulmões foi avaliada por contagem das CFU nos homogeneizados de pulmão diluídos seriadamente nos instantes indicados. ***p<0,001, **p<0,01, *p<0,05.

[0032] Figura 11: Adição de OMV a uma vacina de aP induz uma resposta TH1 favorável. Células do baço (2x106/mL) de ca- mundongos C57BL6 vacinados foram cultivadas na presença de B. pertussis sonicada (SBP, 5 μg/mL). Depois de 72 horas a concentra- ção de IFNγ nos sobrenadantes foi analisada por ELISA.**p<0,01, ***p<0,001.

[0033] Figura 12: Reforço com aP+OMV promove a produção de IFNγ específico para antígenos em camundongos com primeira imunização com aP.

[0034] Células do baço (2x106/mL) de camundongos C57BL6 va- cinados foram cultivadas na presença de FHA (2 μg/mL), PRN (2 μg/mL), B. pertussis sonicada (SBP, 5 μg/mL) ou meio isolado. Depois de 72 horas a concentração de IFNγ, IL-17 e IL-13 nos sobrenadantes foi analisada por ELISA. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Descrição Detalhada da Invenção

[0035] A invenção baseia-se em estudos de composições que compreende vesículas de membrana externa (OMVs) derivada de Bordetella pertussis. Os inventores descobriram que composições imunogênicas compreendendo tanto OMVs quanto antígenos tais co- mo antígenos de pertússis acelulares são capazes de induzir uma res- posta imunológica maior que aquela observada depois de imunização com OMVs isoladas ou com antígenos de pertússis acelulares isola- dos. Além disso, as OMVs também melhoram a resposta imunológica para outros antígenos que não Bordetella, tal como o toxoide tetânico e o toxoide diftérico. O uso do termo "derivado de" refere-se à fonte da OMV como originando da Bordetella pertussis, i.e., a cepa bacteriana a partir da qual as OMVs são produzidas ou originárias. Dessa forma, a presente invenção apresenta uma composição imunogênica com- preendendo (a) uma OMV de Bordetella pertussis, (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico.

[0036] O termo "composição imunogênica" refere-se amplamente a qualquer composição que possa ser administrada para provocar uma resposta imunológica, tal como um anticorpo ou uma resposta imuno- lógica celular, contra um antígeno presente na composição. Portanto, as composições da invenção são imunogênicas. Quando as composi- ções imunogênicas previnem, melhoram, aliviam ou eliminam uma do- ença do indivíduo, então tais composições podem ser chamadas de vacinas. As vacinas de acordo com a invenção são de preferência pro- filáticas (i.e., para prevenir uma infecção). As vacinas profiláticas não garantem proteção total contra a doença porque, mesmo que o pacien- te desenvolva anticorpos, pode haver uma demora ou atraso antes de o sistema imunológico ser capaz de lutar contra a infecção. Por con- seguinte, e para evitar dúvidas, o termo vacina profilática também po- de indicar vacinas que melhoram os efeitos de uma infecção futura, por exemplo, reduzindo a gravidade ou a duração de tal infecção. Os termos "proteção contra infecção" e/ou "proporcionam imunidade pro- tetora" significam que o sistema imunológico de um indivíduo já fora preparado (por exemplo, por vacinação) para desencadear uma res- posta imunológica e repelir a infecção. Particularmente, a resposta imunológica desencadeada é capaz de repelir uma infecção contra inúmeros patógenos, tal como diferentes cepas de bactérias. Um indi- víduo vacinado pode assim ser infectado, mas é mais capaz de repelir a infecção do que um indivíduo controle. OMVs

[0037] As OMVs são conhecidas na literatura e são liberadas es- pontaneamente nos meios de cultura pelas bactérias. As OMVs con- têm componentes, tal como componentes de proteínas e lipídios, da membrana externa bacteriana da bactéria cultivada. ‘OMVs nativas’ (‘nOMVs’ [2]), e OMVs extraídas com detergente (dOMVs), todas fa- zem parte da invenção e são coletivamente denominadas OMVs neste pedido. O termo "módulos generalizados para antígenos de membra- na" também pode ser usado para indicar OMVs obtidas de bactérias mutantes. Em algumas modalidades da invenção, as OMVs são OMVs nativas.

[0038] As OMVs podem ser obtidas de uma cultura de Bordetella pertussis. As OMVs são preparadas a partir da membrana externa de bactérias cultivadas. As vesículas podem ser obtidas por ruptura ou "vesiculação" natural da membrana externa da bactéria para formar vesículas a partir daí.

[0039] Elas podem ser obtidas de bactérias cultivadas em caldo ou em cultura em meio sólido, por exemplo, por separação das células bacterianas do meio de cultura (por exemplo, por filtração ou por cen- trifugação à baixa velocidade para pelotizar as células), lise das célu- las (sem detergente), e separação da fração membrana externa das moléculas citoplasmáticas (por exemplo, por filtração, por precipitação diferencial ou agregação das membranas externas e/ou OMVs, por métodos de separação por afinidade usando ligantes que reconhecem especificamente moléculas da membrana externa, ou por uma centri- fugação à alta velocidade que pelotiza as membranas externas e/ou OMVs).

[0040] As OMVs também podem ser preparadas artificialmente a partir de Bordetella pertussis, por exemplo, usando tratamento com detergente (por exemplo, com desoxicolato ou sarkosyl) ou por meios não detersivos (por exemplo, vide referência 3). Técnicas para a for- mação artificial de OMVs incluem tratamento das bactérias com um detergente de sal de ácido biliar (por exemplo, sais de ácido litocólico, ácido chenodesoxicólico, ácido ursodesoxicólico, ácido desoxicólico, ácido cólico, ácido ursocólico, etc., com desoxicolato de sódio [4 e 5]) em um pH suficientemente alto para não precipitar o detergente [6]. Outras técnicas podem ser realizadas substancialmente na ausência de detergente [Erro! Indicador não definido.] usando técnicas tal como sonicação, homogeneização, microfluidificação, cavitação, cho- que osmótico, trituração, prensa francesa, blendagem, etc.

[0041] Um processo útil para preparação de OMVs está descrito na referência 7 e envolve ultrafiltração de OMVs brutas, no lugar de centrifugação à alva velocidade. O processo pode envolver uma etapa de ultracentrifugação depois que a ultrafiltração ocorre.

[0042] As preparações de OMVs usadas na presente invenção ge- ralmente serão livres de bactérias inteiras, sejam vivas ou mortas. O tamanho das vesículas significa que elas podem ser facilmente sepa- radas das bactérias inteiras por filtração, por exemplo, como tipica- mente usado para esterilização em filtro.

[0043] A OMV é capaz de provocar uma resposta imunológica pa- ra Bordetella pertussis quando administrada a um mamífero. A respos- ta imunológica pode uma resposta imunológica celular ou humoral. Particularmente, a resposta imunológica é uma resposta de anticorpos. Ainda mais particularmente a resposta imunológica é uma resposta imunológica de células T que podem neutralizar a infecção e/ou a viru- lência da Bordetella pertussis. A resposta imunológica produzida pela OMV pode ser direcionada para ou contra um ou mais antígenos pro- teicos da B. pertussis presentes na OMV.

[0044] Apesar de ser uma toxina secretada, a toxina pertussígena está presente em OMVs, por exemplo, derivadas do espaço periplas- mático. Como resultado, as OMVs usadas no estado da técnica já fo- ram tratadas com agentes químicos tal como formalina para destoxifi- car quimicamente qualquer PT. Além de problemas com a remoção da formalina residual, o tratamento químico pode impactar de forma negativa a imunogenicidade das OMVs, por exemplo, reticulando as proteínas.

[0045] O uso de OMVs derivadas de uma cepa de Bordetella per- tussis expressando um toxoide pertussígeno geneticamente destoxifi- cado é, por conseguinte, vantajoso e ainda não foi sugerido no estado da técnica. Particularmente vantajosas são OMVs derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis expressando o toxoide pertussígeno ge- neticamente destoxificado PT 9K/129G. Em particular, para uso na presente invenção, os inventores isolaram OMVs de uma cepa de Bordetella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide per- tussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G. Dessa forma, a destoxificação química das OMVs por tratamento com químicos tais como formaldeído, formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combinações dos mesmos não é necessária. Particularmente, as OMVs da invenção não são quimicamente destoxificadas, mais parti- cularmente as OMVs da invenção não são quimicamente destoxifica- das e/ou tratadas com formaldeído, formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combinações das mesmas.

[0046] O uso de cepas de Bordetella pertussis nas quais o gene ArnT fora nocauteado ou deletado também é vantajoso. As OMVs de- rivadas de tais cepas compreendem o lipídio A que tem uma estrutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos grupos fosfa- to distais da estrutura do núcleo. Como resultado, estas OMVs apre- sentam um nível reduzido de ativação de TLR4 quando comparadas às OMVs derivadas de cepas com um gene ArnT funcional

[0047] As composições imunogênicas da invenção compreendem tanto um componente OMV (a) quanto um componente antígeno de pertússis acelular (b). O componente vesícula de membrana externa (a) compreende muitas proteínas, associadas à membrana ou contidas nas OMVs incluindo, por exemplo, pequenas quantidades de PT, FHA ou pertactina. No entanto, estes componentes associados à OMV não devem ser interpretados como sendo o componente antígeno de per- tússis acelular (b), descrito abaixo, que geralmente será apresentado separadamente das OMVs na forma purificada, por exemplo, como antígenos proteicos recombinantes isolados.

[0048] Em algumas modalidades da invenção, composições com- preendendo OMVs derivadas de Bordetella parapertussis são excluí- das da invenção. Toxoide diftérico

[0049] A difteria é causada por Corynebacterium diphtheriae, uma bactéria aeróbica não esporante Gram-positiva. Este organismo ex-

pressa uma exotoxina ADP-ribosilante codificada por profagos (‘toxina diftérica’), que pode ser tratado (por exemplo, com formaldeído) para dar um toxoide que deixa de ser tóxico, mas que continua antigênico e é capaz de estimular a produção de anticorpos anti-toxina específicos depois da injeção. Toxoides diftéricos estão descritos mais detalhada- mente no capítulo 13 da referência 8. Toxoides diftéricos preferidos são aqueles preparados por tratamento com formaldeído. O toxoide diftérico pode ser obtido por cultivo da C. diphtheriae em meio de cres- cimento (por exemplo, meio de Fenton, ou meio de Linggoud & Fen- ton), que pode ser suplementado com extrato bovino, seguido por tra- tamento com formaldeído, ultrafiltração e precipitação. O material to- xoidado pode ser então tratado por um processo compreendendo fil- tração estéril e/ou diálise.

[0050] As quantidades de toxoide diftérico podem ser expressas em unidades internacionais (IU). Por exemplo, o NIBSC [9] oferece o ‘Diphtheria Toxoid Adsorbed Third International Standard 1999’ [10, 11], que contém 160 IU por ampola. Como uma alternativa ao sistema IU, a unidade ‘Lf’ ("unidades floculantes", a "dose limite de floculação", ou o "limite de floculação") é definida como a quantidade de toxoide que, quando misturada com uma Unidade Internacional de antitoxina, produz uma mistura otimamente floculante [12]. Por exemplo, o NIBSC oferece o ‘Diphtheria Toxoid, Plain’ [13], que contém 300 Lf por ampo- la, o ‘The 1st International Reference Reagent For Diphtheria Toxoid For Flocculation Test’ [14] que contém 900 Lf por ampola. A conversão entre os sistemas IU e Lf depende da preparação particular de toxoi- des.

[0051] Onde materiais bovinos são usados na cultura de C.diphtheriae, eles devem ser obtidos de fontes que sejam livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE) ou de outras encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs).

[0052] O toxoide diftérico na composição imunogênica da invenção está tipicamente presente em uma quantidade que é capaz de provo- car uma resposta imunológica quando administrado. De forma ideal, o toxoide diftérico pode provocar uma resposta imunológica protetora. A quantidade de toxoide diftérico na composição imunogênica da inven- ção é tipicamente de 1-50 Lf/dose. As vacinas de reforço para adoles- centes e adultos tipicamente contêm entre 4 Lf/ml e 8 Lf/ml d toxoide diftérico, por exemplo, 2,5 Lf, de preferência 4 Lf, por dose de 0,5 ml. As vacinas pediátricas tipicamente contêm entre 20 e 50 Lf/ml de to- xoide diftérico, por exemplo, 10 Lf ou 25 Lf por dose de 0,5 ml.

[0053] Para vacinas combinadas pediátricas, a proporção de to- xoide diftérico para toxoide tetânico é tipicamente maior que 1 (i.e., as vacinas pediátricas normalmente possuem um excesso de toxoide dif- térico) e geralmente entre 2:1 e 3:1 (medida em unidades Lf), por exemplo, 2,5:1. Em contraste, para as vacinas de reforço que são ad- ministradas a adolescentes ou adultos (que normalmente já receberam pelo menos uma vacina combinada pediátrica compreendendo toxoide diftérico e toxoide tetânico), a proporção de toxoide tetânico para to- xoide diftérico é tipicamente maior que 1 (i.e., as vacinas de reforço normalmente possuem um excesso de toxoide tetânico) e geralmente entre 1,5:1 e 2,5:1, e.g. 2:1. O toxoide diftérico é tipicamente não con- jugado.

[0054] A quantidade total de toxoide diftérico pode ser equivalente a 1-50 Lf/dose, por exemplo, em vacinas de reforço a uma concentra- ção entre 4 Lf/ml e 8 Lf/ml, por exemplo, 2,5 Lf por dose de 0,5 ml ou 4 Lf por dose de 0,5 ml; em vacinas pediátricas a uma concentração en- tre 20 e 50 Lf/ml, por exemplo, 10 Lf por dose de 0,5 ml ou 25 Lf por dose de 0,5 ml. Em modalidades particulares onde o toxoide diftérico quimicamente destoxificado está ausente, a quantidade de toxoide dif- térico geneticamente destoxificado, particularmente CRM197, presente pode ser equivalente a 1-50 Lf/dose, a uma concentração, por exem- plo, em vacinas de reforço, entre 4 Lf/ml e 8 Lf/ml, por exemplo, 2,5 Lf por dose de 0,5 ml ou 4 Lf por dose de 0,5 ml, e em vacinas pediátri- cas a uma concentração entre 20 e 50 Lf/ml, por exemplo, 10 Lf por dose de 0,5 ml or ou Lf por dose de 0,5 ml.

[0055] O toxoide diftérico pode ser adsorvido em um adjuvante do tipo hidróxido de alumínio.

[0056] Tipicamente, a composição imunogênica compreendendo o antígeno toxoide diftérico é substancialmente livre de conservantes mercúricos. Toxoide tetânico

[0057] O tétano é causado por Clostridium tetani, um bacilo Gram- positivo formador de esporos. Este organismo expressa uma endopep- tidase (‘toxina tetânica’), que pode ser tratada para dar um toxoide que deixa de ser tóxico, mas que continua antigênico e é capaz de estimu- lar a produção anticorpos anti-toxina específicos depois da injeção. Toxoides tetânicos estão descritos mais detalhadamente no capítulo 27 da referência Erro! Indicador não definido.. Toxoides tetânicos preferidos são aqueles preparados por tratamento com formaldeído. O toxoide tetânico pode ser obtido por cultivo de C.tetani em meio de crescimento (por exemplo, um meio Latham derivado de caseína bovi- na), por tratamento com formaldeído, ultrafiltração e precipitação. O material pode ser então tratado por um processo compreendendo fil- tração estéril e/ou diálise.

[0058] As quantidades de toxoide tetânico podem ser expressas em unidades internacionais (IU). Por exemplo, o NIBSC [15] oferece o ‘Tetanus Toxoid Adsorbed Third International Standard 2000’ [16, 17], que contém 469 IU por ampola. Como uma alternativa para o sistema IU, a unidade ‘Lf’ é definida como a quantidade de toxoide que, quan- do misturada com uma Unidade Internacional de antitoxina, produz uma mistura otimamente floculante [18]. Por exemplo, o NIBSC ofere- ce o ‘The 1st International Reference Reagent For Tetanic Toxoid For Flocculation Test’ [19] que contém 1000 Lf por ampola. A conversão entre os sistemas IU e Lf depende da preparação particular de toxoi- des.

[0059] Onde materiais bovinos são usados na cultura de C.diphtheriae, eles devem ser obtidos de fontes que sejam livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE) ou de outras encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs).

[0060] O toxoide tetânico na composição imunogênica da invenção está tipicamente presente em uma quantidade que é capaz de provo- car uma resposta imunológica quando administrado. De forma ideal, o toxoide tetânico pode provocar uma resposta imunológica protetora. A quantidade de toxoide tetânico nas composições imunogênicas da in- venção é tipicamente de 1-20 Lf por dose. As vacinas de reforço para adolescentes e adultos tipicamente contêm 5 Lf de toxoide tetânico por dose de 0,5 ml. As vacinas pediátricas tipicamente contêm entre 5 e 10 Lf de toxoide tetânico por dose de 0,5 ml.

[0061] Ficará óbvio para os especialistas na técnica que em algu- mas modalidades, o toxoide tetânico pode estar presente tanto na for- ma livre (não conjugada) quanto na forma conjugada ou essencialmen- te na forma conjugada, isto é, mais de 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% do toxoide tetânico está presente na forma conjugada. Assim sendo, a quantidade de toxoide tetânico nas composições imu- nogênicas da invenção pode se referir ao toxoide tetânico não conju- gado isolado, ao toxoide tetânico conjugado isolado ou à soma de to- xoide tetânico não conjugado e conjugado. Entretanto, de preferência o toxoide tetânico é livre, não conjugado. Em modalidades preferidas, a quantidade de toxoide tetânico nas composições imunogênicas da invenção refere-se ao toxoide tetânico não conjugado isolado.

[0062] O toxoide tetânico pode ser adsorvido em um adjuvante do tipo hidróxido de alumínio, mas isto não é necessário (por exemplo, adsorção de entre 0-10% do toxoide tetânico total pode ser usada).

[0063] Tipicamente, a composição imunogênica compreendendo toxoide tetânico é substancialmente livre de quaisquer conservantes mercúricos. Antígenos de Pertússis Acelulares

[0064] Bordetella pertussis é uma bactéria aeróbica não esporante Gram-negativ que causa a tosse convulsa. Como descrito mais deta- lhadamente no capítulo 21 da referência 1, vacinas contra B. pertussis já se encontram disponíveis há muitos anos, e se enquadram em duas categorias: vacinas celulares (wP) e acelulares (aP). As vacinas celu- lares compreendem células inteiras de B. pertussis que foram destruí- das e desativadas (por exemplo, por tratamento com formalina e/ou com calor), enquanto que as vacinas acelulares compreendem antíge- nos purificados específicos de B. pertussis, seja purificado da bactéria nativa seja purificado depois de expressão em um hospedeiro recom- binante.

[0065] A invenção pode usar mais de um antígeno de pertússis acelular (aP) em uma única vacina, por exemplo, pelo menos dois ou pelo menos três, dos seguintes antígenos de B.pertussis bastante co- nhecidos e bem caracterizados: (1) toxina pertussígena destoxificada (toxoide pertussígeno, ou ‘PT’); (2) hemaglutinina filamentosa (‘FHA’); (3) pertactina (‘PRN’, também conhecida como ‘proteína de membrana externa de 69 quiloDalton’ ou ‘69K’). É mais preferível que todos estes três antígenos sejam usados. Estes três antígenos são de preferência preparados por isolamento a partir de uma cultura de B. pertussis, por exemplo, cultivada em meio líquido de Stainer-Scholte modificado. O PT e a FHA podem ser isolados a partir do caldo de fermentação (por exemplo, por adsorção em hidroxiapatita gel), enquanto que a pertac-

tina pode ser extraída das células por tratamento térmico e floculação (por exemplo, usando cloreto de bário). Os antígenos podem ser puri- ficados em etapas sucessivas de cromatografia e/ou precipitação. O PT e a FHA podem ser purificados por cromatografia hidrófoba, croma- tografia por afinidade e cromatografia de exclusão por tamanho. A per- tactina pode ser purificada por cromatografia de troca iônica, cromato- grafia hidrófoba e cromatografia de exclusão por tamanho. Métodos para a purificação de PT, FHA e pertactina são conhecidos na literatu- ra

[0066] A FHA e a pertactina podem ser tratadas com formaldeído antes do uso de acordo com a invenção. O PT pode ser destoxificado por tratamento com formaldeído e/ou glutaraldeído. Como uma alter- nativa para este procedimento de destoxificação química, em modali- dades preferidas o PT pode ser um PT mutante no qual a atividade enzimática fora reduzida por mutagênese [20] (por exemplo, o mutante duplo 9K/129G). Quando PT geneticamente destoxificado é incluída, uma quantidade reduzida pode ser usada. Por exemplo, a concentra- ção de toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado na composi- ção pode ser <5 μg/ml, por exemplo, <4, <3, <2,5, <2, <1 µg/ml, etc. Em um volume de dose unitária de 0,5 ml típico, portanto, a quantida- de de pertussígeno geneticamente destoxificado é menor quen 2,5 μg, por exemplo, <2, <1,5, <1, <0,5 µg, por exemplo, de cerca de 0,5 µg a cerca de 2,5 µg.

[0067] Antígenos de pertússis acelulares adicionais que podem ser usados incluem fímbrias (por exemplo, aglutinogênios 2 e 3 também denominados FIM2 e FIM3).

[0068] Os antígenos de aP podem ser usados em um estado não adsorvido, mas são de preferência adsorvidos em um ou mais adju- vantes do tipo sal de alumínio antes de serem usados. Os antígenos de aP são de preferência adsorvidos em um adjuvante do tipo hidróxi-

do de alumínio.

[0069] Tipicamente, a composição imunogênica compreendendo antígenos de aP são substancialmente livres de conservantes mercúri- cos (por exemplo, thimerosal).

[0070] O antígeno de pertússis acelular está tipicamente presente na composição imunogênica da invenção em uma quantidade que é capaz de provocar uma resposta imunológica quando administrado. De forma ideal, o antígeno de pertússis acelular pode provocar uma resposta imunológica protetora. As quantidades de antígenos de per- tússis acelulares são tipicamente expressas em microgramas. A con- centração de PT em uma vacina normalmente varia entre 5 e 50 μg/ml. Typical PT concentrations are 5 μg/ml, 16 μg/ml, 20 μg/ml ou 50 μg/ml. A concentração de FHA em uma vacina normalmente varia entre 10 e 50 μg/ml. Concentrações típicas de FHA são 10 μg/ml, 16 μg/ml ou 50 μg/ml. A concentração de pertactina em uma vacina normalmente va- ria entre 5 e 16 μg/ml. Concentrações típicas de pertactina são 5 μg/ml, 6 μg/ml ou 16 μg/ml. Por exemplo, uma vacina de reforço para adolescentes e adultos tipicamente contém 2,5 a 8 μg PT, 4 a 8 μg FHA (por exemplo, entre 4 e 8 μg FHA) e 2,5 a 8 μg pertactina (por exemplo, entre 2,5 e 8 μg pertactina) por dose de 0,5 ml. Tipicamente, uma vacina de reforço compreende 4 μg PT, 4 μg FHA e 8 μg pertacti- na, mais preferivelmente 5 μg PT, 2,5 μg FHA e 2,5 μg pertactina, por dose de 0,5 ml. Uma vacina pediátrica normalmente compreende 7 μg PT, 10 μg FHA e 10 μg pertactina, por dose de 0,5 ml.

[0071] Onde o componente aquoso inclui PT, FHA e pertactina, suas proporções em peso podem variar, mas podem ser, por exemplo, de cerca de 16:16:5, cerca de 5:10:6, cerca de 20:20:3, cerca de 25:25:8, ou cerca de 10:5:3 (PT:FHA:PRN). Composições imunogênicas específicas da invenção

[0072] As composições imunogênicas especificamente considera-

das da invenção compreendem:  (i) uma OMV de B. pertussis, (ii) um toxoide diftérico, (iii) um toxoide tetânico, (iv) antígeno de pertússis acelular.  (i) uma OMV de B. pertussis, (ii) um toxoide diftérico, (iii) um toxoide tetânico, (iv) toxina pertussígena destoxificada, (v) hema- glutinina filamentosa e (vi) pertactina.  (i) uma OMV de B. pertussis, (ii) um toxoide diftérico, (iii) um toxoide tetânico, (iv) toxoide pertussígeno geneticamente modifica- do, (v) hemaglutinina filamentosa e (vi) pertactina.  (i) uma OMV de B. pertussis, (ii) um toxoide diftérico, (iii) um toxoide tetânico, (iv) toxina pertussígena destoxificada, (v) hema- glutinina filamentosa, (vi) pertactina, (vii) um antígeno de uma cepa de poliovírus tipo 1, (viii) um antígeno de uma cepa de poliovírus tipo 2 e (ix) um antígeno de uma cepa de poliovírus tipo 3.

[0073] As composições imunogênicas da presente invenção pro- vocam uma resposta TH1 melhorada e uma resposta TH2 melhorada, i.e., um aumento na produção tanto de IgG1 quanto de IgG2a. Mais particularmente, as composições provocam uma resposta imunológica TH1 aumentada e/ou uma resposta imunológica TH2 aumentada em relação à imunização apenas com OMV ou apenas com TdaP. Métodos e usos farmacêuticos

[0074] A composição imunogênica da invenção pode compreender ainda um carreador farmaceuticamente aceitável. ‘Carreadores farma- ceuticamente aceitáveis’ típicos incluem qualquer carreador que não induza a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo que está re- cebendo a composição. Carreadores adequados são tipicamente ma- cromoléculas grandes lentamente metabolizadas tal como proteínas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarose [21], trealose [22], lactose, e agregados lipídicos (tal como gotículas de óleo ou liposso-

mas). Tais carreadores são bastante conhecidos pelos especialistas na técnica. As vacinas também podem conter diluentes, tal como água, solução salina, glicerol etc. Adicionalmente, substâncias auxilia- res, tal como agentes umectantes ou umectantes, substâncias tampão de pH, entre outros, podem estar presentes. Solução salina fisiológica livre de pirogênio estéril e tamponada com fosfato é um carreador típi- co. Uma discussão completa de excipientes farmaceuticamente acei- táveis encontra-se disponível na referência 23.

[0075] As composições da invenção podem estar na forma aquosa (i.e., soluções ou suspensões) ou em uma forma seca (por exemplo, liofilizada). Se for usada uma vacina seca, então ela será reconstituída em um meio líquido antes da injeção. A liofilização de vacinas é co- nhecida na literatura, por exemplo, o produto Menjugate™ é apresen- tado na forma liofilizada. Quando as composições imunogênicas da invenção incluem um componente liofilizado, é típico que aquele com- ponente seja preparado separadamente, misturado e então liofilizado. Para estabilizar os antígenos durante a liofilização, componentes não ativos, por exemplo, como estabilizantes, podem adicionados antes da secagem por congelamento. Estabilizantes preferidos para inclusão são lactose, sacarose e manitol, assim como misturas dos mesmos, por exemplo, misturas de lactose/sacarose, misturas de sacaro- se/manitol, etc. Uma vacina final obtida por reconstituição aquosa do material liofilizado pode assim conter lactose e/ou sacarose. É preferí- vel usar excipientes amorfos e/ou tampões amorfos ao preparar vaci- nas liofilizadas [24].

[0076] Pode ser preferido incluir um álcool de açúcar (por exem- plo, manitol) e/ou um dissacarídeo (por exemplo, sacarose ou trealo- se), por exemplo, entre 1mg/ml e 30mg/ml (por exemplo, cerca de 25 mg/ml) na composição.

[0077] As composições podem ser apresentadas em fracos, ou elas podem ser apresentadas em seringas já cheias. As seringas po- dem ser fornecidas com ou sem agulhas. Uma seringa vai incluir uma única dose da composição, ao passo que um frasco pode incluir uma única dose ou múltiplas doses.

[0078] As composições da invenção são de preferência adminis- tradas aos pacientes em doses unitárias de 0,5 ml. Ficará entendido que menções a doses de 0,5 ml incluem a variação normal, por exem- plo, 0,5ml+0,05ml. Para as situações de múltiplas doses, as quantida- des das doses múltiplas serão extraídas e acondicionadas juntas em um único recipiente, por exemplo, 5 ml para um recipiente de múltiplas doses com 10 doses (ou 5,5 ml com 10% de excesso).

[0079] As composições aquosas da invenção também são ade- quadas para reconstituir outras vacinas de uma forma liofilizada. Onde uma composição da invenção for usada para tal reconstituição extem- porânea, a invenção apresenta um kit, que pode compreender dois frascos, ou pode compreender uma seringa já cheia e um frasco, com o conteúdo da seringa sendo usado para reativar o contendo do frasco antes da injeção.

[0080] As vacinas também podem ser preparadas em uma forma em que a vacina possa ser preparada extemporaneamente no momen- to de uso misturando-se dois componentes um com o outro. Tais mo- dalidades de dois componentes incluem misturação de líquido/líquido e misturação de líquido/sólido, por exemplo, por misturação do materi- al aquoso com o material liofilizado.

[0081] Assim sendo, um kit útil para a invenção compreende um primeiro componente compreendendo o componente OMV e um se- gundo componente compreendendo (a) antígenos de pertússis acelu- lares, (b) um toxoide tetânico, (c) um toxoide diftérico; em que os dois componentes estão em recipientes separados (por exemplo, frascos e/ou seringas). O componente OMV no primeiro componente pode ser liofilizado. Em algumas modalidades, o primeiro componente não compreende um adjuvante. O segundo componente pode compreen- der antígenos aquosos. Em algumas modalidades, o segundo compo- nente compreende um adjuvante, por exemplo, um adjuvante do tipo sal de alumínio.

[0082] A invenção também apresenta um processo para prepara- ção da composição imunogênica da invenção, compreendendo mistu- rar um primeiro componente compreendendo a OMV e um segundo componente compreendendo (a) antígenos de pertússis acelulares, (b) um toxoide tetânico e (c) um toxoide diftérico. A OMV no primeiro componente pode ser liofilizada. O segundo componente pode com- preender antígenos aquosos. O processo pode compreender uma eta- pa adicional de reconstituição da OMV liofilizada no primeiro compo- nente com os antígenos aquosos do segundo componente. O primeiro componente pode não compreender um adjuvante. O segundo com- ponente pode compreender um adjuvante, por exemplo, um adjuvante do tipo sal de alumínio.

[0083] As composições da invenção podem ser acondicionadas em uma forma de uma única dose ou em uma forma de múltiplas do- ses. Para as formas de múltiplas doses, frascos são preferidos às se- ringas pré-cheias. Os volumes de dosagem efetivos podem ser esta- belecidos de forma rotineira, mas uma dose humana típica da compo- sição tem um volume de 0,5ml, por exemplo, para injeção intramuscu- lar.

[0084] O pH da composição varia de preferência entre 6 e 8, prefe- rivelmente cerca de 7. Um pH estável pode ser mantido pelo uso de um tampão. As composições aquosas administradas a um paciente podem ter um pH entre 5,0 e 7,5, e mais tipicamente entre 5,0 e 6,0 para estabilidade ótima; onde um toxoide diftérico e/ou um toxoide te- tânico estão presentes, o pH varia de forma ideal entre 6,0 e 7,0.

[0085] As composições imunogênicas da invenção tipicamente compreender um tampão dihidrogenofosfato de potássio. O tampão dihidrogenofosfato de potássio pode compreender cerca de 1-10 mM de tampão dihidrogenofosfato de potássio, por exemplo, 1,25 mM, 2,5 mM ou 5,0 mM. Se uma composição compreender um sal de hidróxi- do de alumínio, é preferível usar um tampão histidina [25]. A composi- ção pode ser estéril e/ou livre de pirogênio. As composições da inven- ção podem ser isotônicas em relação aos seres humanos.

[0086] As composições da invenção são imunogênicas, e são mais preferivelmente composições vacinais. As vacinas de acordo com a invenção podem ser profiláticas (i.e., para prevenir uma infecção) ou terapêuticas (i.e., para tratar uma infecção), mas tipicamente serão profiláticas. As vacinas profiláticas não garantem proteção total contra a doença porque, mesmo que o paciente desenvolva anticorpos, pode haver uma demora ou atraso antes de o sistema imunológico ser ca- paz de lutar contra a infecção. Por conseguinte, e para evitar dúvidas, o termo vacina profilática também pode indicar vacinas que melhoram os efeitos de uma infecção futura, por exemplo, reduzindo a gravidade ou a duração de tal infecção.

[0087] Os termos "proteção contra infecção" e/ou "proporcionam imunidade protetora" significam que o sistema imunológico de um indi- víduo já fora preparado (por exemplo, por vacinação) para desencade- ar uma resposta imunológica e repelir a infecção. Particularmente, a resposta imunológica desencadeada é capaz de repelir uma infecção contra inúmeros patógenos, tal como diferentes cepas de bactérias. Um indivíduo vacinado pode assim ser infectado, mas é mais capaz de repelir a infecção do que um indivíduo controle. Composições imuno- gênicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imuno- logicamente eficaz de antígenos, assim como quaisquer outros com- ponentes, conforme necessário. Por ‘quantidade imunologicamente eficaz’ entende-se que a administração daquela quantidade a um indi- víduo, seja em uma única dose ou como parte de uma série, é eficaz para tratamento ou prevenção. Comumente, o resultado desejado é a produção de uma resposta imunológica específica para o antígeno (por exemplo, patógeno) que é capaz de proteger ou contribuir para proteger o indivíduo contra o patógeno. Esta quantidade varia depen- dendo das condições de saúde e físicas do indivíduo a ser tratado, da idade, do grupo taxonômico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata etc.), da capacidade do sistema imuno- lógico do indivíduo de sintetizar anticorpos, do grau de proteção dese- jado, da formulação da vacina, da avaliação do médico assistente da situação clínica, e outros fatores relevantes. Espera-se que a quanti- dade varie dentro de uma faixa relativamente ampla que pode ser de- terminada por ensaios de rotina.

[0088] As composições da invenção podem ser preparadas em várias formas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas. A composi- ção pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, como um inalador, usando um pó fino ou um spray. A composição po- de ser preparada como um supositório ou como um pessário. A com- posição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como spray, gotas, gel ou pó [por exemplo, referências 26 e 27]. O sucesso da administração nasal de sacarídeos pneumocó- cicos [28, 29], sacarídeos Hib [30], sacarídeos MenC [31] e misturas de conjugados dos sacarídeos Hib e MenC [32] já foi reportado.

[0089] As composições da invenção podem incluir um antimicrobi- ano, particularmente quando acondicionados no formato de múltiplas doses.

[0090] As composições da invenção podem compreende um de- tergente, por exemplo, um Tween (polissorbato), tal como Tween 80.

Os detergentes geralmente estão presentes em níveis baixos, por exemplo, <0,01%.

[0091] As composições da invenção podem incluir sais sódicos (por exemplo, cloreto de sódio) pada dar tonicidade. Uma concentra- ção de 10+2mg/ml NaCl é típica. Em algumas modalidades, uma con- centração de 4-10mg/ml NaCl pode ser usada, por exemplo, 9,0, 7,0, 6,75 ou 4,5 mg/ml.

[0092] As composições geralmente terão uma osmolalidade entre 200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, de preferência entre 240-360 mOsm/kg, e mais preferivelmente na faixa de 280-320 mOsm/kg. Já foi relatado que a osmolalidade não tem impacto na dor causada pela va- cinação [33], mas manter a osmolalidde nesta faixa é contudo preferí- vel.

[0093] As composições da invenção geralmente incluirão um tam- pão. Um tampão fosfato é típico.

[0094] As composições da invenção podem ser administradas jun- to com outros agentes imunorreguladores. Em particular, as composi- ções podem incluir um ou mais adjuvantes. Tais adjuvantes incluem, porém sem limitação, composições contendo minerais.

[0095] Composições contendo minerais adequadas para uso como adjuvantes na invenção incluem sais minerais, tal como sais de alumí- nio e sais de cálcio (ou misturas dos mesmos). Sais de cálcio incluem fosfato de cálcio, (por exemplo, as partículas "CAP" reveladas na refe- rência 34). Sais de alumínio incluem hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., com os sais adquirindo qualquer forma adequada (por exemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.). Adsorção a esses sais é preferida. As compo- sições contendo minerais também podem ser formuladas como uma partícula de sal metálico [35].

[0096] Os adjuvantes conhecidos como hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio podem ser usados. Os nomes são convencionais,

mas são usados apenas a título de conveniência, e não são uma des- crição exata do composto químico efetivo que está presente (por exemplo, vide capítulo 9 da referência 36). A invenção pode usar qual- quer um dos adjuvantes do tipo "hidróxido" ou "fosfato" que são geral- mente usados como adjuvantes. Os adjuvantes conhecidos como "hi- dróxido de alumínio" são tipicamente sais de oxi-hidróxido de alumínio, que usualmente são pelo menos parcialmente cristalinos. Os adjuvan- tes conhecidos como "fosfato de alumínio" são tipicamente hidroxifos- fatos de alumínio, normalmente contendo também uma pequena quan- tidade de sulfato (i.e., sulfato de hidroxifosfato de alumínio). Eles po- dem ser obtidos por precipitação, e as condições reacionais e as con- centrações durante a precipitação influenciam o grau de substituição de fosfato por hidroxila no sal.

[0097] Uma morfologia fibrosa (por exemplo, como vista em mi- crografias eletrônicas de transmissão) é típica para adjuvantes do tipo hidróxido de alumínio. O pI dos adjuvantes do tipo hidróxido de alumí- nio é tipicamente e cerca de 11 i.e., o próprio adjuvante tem uma carga superficial positiva no pH fisiológico. Capacidades adsortivas entre 1,8- 2,6 mg de proteína por mg de Al+++ em um pH 7,4 foram reportadas para adjuvantes do tipo hidróxido de alumínio.

[0098] Os adjuvantes do tipo hidróxido de alumínio geralmente têm uma razão molar PO4/Al entre 0,3 e 1,2, de preferência entre 0,8 e 1,2, e mais preferivelmente 0,95+0,1. O fosfato de alumínio geralmente se- rá amorfo, particularmente para sais de hidroxifosfato. Um adjuvante típico é hidroxifosfato de alumínio com uma razão molar PO4/Al entre 0,84 e 0,92, incluída a 0,6 mg Al3+/ml. O fosfato de alumínio geralmen- te será particulado (por exemplo, morfologia semelhante a placas co- mo observada em micrografias eletrônicas de transmissão). Diâmetros típicos dos particulados estão na faixa de 0,5-20 µm (por exemplo, cerca de 5-10 µm) depois da adsorção de qualquer antígeno. Capaci-

dades adsortivas entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ em um pH 7,4 foram reportadas para adjuvantes do tipo fosfato de alumínio.

[0099] O ponto de carga zero (PZC) do fosfato de alumínio está inversamente relacionado ao grau de substituição de fosfato por hidro- xila, e este grau de substituição pode variar dependendo das condi- ções reacionais e da concentração dos reagentes usados para prepa- rar o sal por precipitação. O PZC também é alterado por uma variação na concentração de íons de fosfato livres em solução (mais fosfato = PZC mais ácido) ou por adição de um tampão tal como um tampão histidina (deixa o PZC mais básico). Os fosfatos de alumínio usados de acordo com a invenção geralmente terão um PZC entre 4,0 e 7,0, mais preferivelmente entre 5,0 e 6,5, por exemplo, cerca de 5,7.

[00100] As suspensões de sais de alumínio usadas para preparar as composições da invenção podem conter um tampão (por exemplo, um tampão fosfato ou um tampão histidina ou um tampão Tris), mas nem sempre o mesmo é necessário. As suspensões são de preferên- cia estéreis e livres de pirogênio. Uma suspensão pode incluir íons de fosfato aquoso, por exemplo, presentes a uma concentração entre 1,0 e 20 mM, de preferência entre 5 e 15 mM, e mais preferivelmente cer- ca de 10 mM. As suspensões também podem compreender cloreto de sódio.

[00101] A invenção pode usar uma mistura de um hidróxido de alu- mínio e um fosfato de alumínio. Neste caso, pode haver mais fosfato de alumínio do que hidróxido de alumínio, por exemplo, a uma razão ponderal de pelo menos 2:1, por exemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.

[00102] A concentração de Al+++ em uma composição para adminis- tração a um paciente é de preferência menor que 10mg/ml, por exem- plo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Uma fai- xa preferida varia entre 0,3 e 1mg/ml. Um máximo de 0,85 mg/dose é preferido.

[00103] Um adjuvante do tipo fosfato de alumínio típico é hidroxifos- fato de alumínio amorfo com uma razão molar PO4/Al entre 0,84 e 0,92, inclusive a 0,6 mg Al3+/ml. Adsorção com uma dose baixa de fos- fato de alumínio pode ser usada, por exemplo, entre 50 e 100 µg Al3+ por dose.

[00104] O uso de adjuvantes do tipo sal de alumínio é particular- mente preferido, e os antígenos geralmente são adsorvidos em tais sais. É possível nas composições da invenção adsorver alguns antí- genos em um hidróxido de alumínio, mas ter outros antígenos associ- ados a um fosfato de alumínio. Em geral, no entanto, é preferível usar apenas um único sal, por exemplo, um hidróxido ou um fosfato, mas não ambos. Nem todos os antígenos precisam ser adsorvidos, i.e., al- guns ou todos eles podem estar livres em solução. Métodos de tratamento

[00105] A invenção também apresenta composições imunogênicas para uso no aumento de uma resposta imunológica em um mamífero, compreendendo administrar uma composição imunogênica da inven- ção ao mamífero. A composição imunogênica é de preferência capaz de aumentar uma resposta imunológica em um mamífero. A resposta imunológica é de preferência protetora e de preferência envolve anti- corpos, e é mais preferivelmente uma vacina. Em algumas modalida- des a vacina é para uso em vacinação primária. A composição imu- nogênica pode aumentar uma resposta de reforço. As composições da invenção são de preferência administradas aos pacientes em doses de 0,5 ml (como discutido acima).

[00106] A invenção também apresenta um método para aumentar uma resposta imunológica em um mamífero, compreendendo adminis- trar uma composição imunogênica da invenção ao mamífero. A res- posta imunológica é de preferência protetora e de preferência envolve anticorpos. O método pode aumentar uma resposta de reforço. As composições da invenção são de preferência administradas aos paci- entes em doses de 0,5 ml (como discutido acima).

[00107] O mamífero é de preferência um ser humano. Onde a vaci- na é para uso profilático, o ser humano é de preferência uma criança (por exemplo, uma criança começando a andar ou um bebê, particu- larmente um neonato) ou um adolescente. Uma vacina destinada a crianças também pode ser administrada a adultos, por exemplo, para avaliação da segurança, posologia, imunogenicidade, etc. Uma classe preferida de seres humanos para tratamento são as mulheres em ida- de de engravidar (por exemplo, adolescentes e mais velhas). Uma ou- tra classe preferida é a de mulheres grávidas.

[00108] Em algumas modalidades, o paciente fora pré-imunizado com um toxoide diftérico ou um derivado do mesmo. Em outras moda- lidades, o paciente fora pré-imunizado com um toxoide tetânico ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, o paciente fora pré- imunizado tanto com um toxoide diftérico ou um derivado do mesmo quanto com um toxoide tetânico ou um derivado do mesmo.

[00109] A invenção também apresenta uma composição da inven- ção para uso como um medicamento.

[00110] A invenção também apresenta o uso de uma composição da invenção na produção de um medicamento para aumentar uma resposta imunológica em um mamífero.

[00111] Estes usos e métodos são de preferência para a prevenção e/ou o tratamento de uma doença causada por um ou mais dentre Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani e Bordetella pertussis. C. diphtheria podem causar difteria; C. tetani podem causar tétano; B. pertussis podem causar tosse convulsa.

[00112] O indivíduo em quem a doença é prevenida pode não ser o mesmo indivíduo que recebe a composição imunogênica da invenção.

Por exemplo, uma composição imunogênica pode ser administrada a uma mulher (antes ou durante a gravidez) para proteger o filho (a chamada ‘imunização maternal’ [37-39]. A imunização da mulher grá- vida proporciona imunidade mediada por anticorpos ao bebê através da imunidade maternal passiva. A imunidade passiva ocorre natural- mente quando anticorpos maternos são transferidos para o feto atra- vés da placenta. A imunidade passiva é especificamente importante para os bebês porque eles nascem sem qualquer imunidade adquirida de forma ativa. A administração de composições da invenção a uma mulher grávida aumenta a imunidade da mulher, e anticorpos são pas- sados para o recém-nascido através da placenta, conferindo imunida- de maternal passiva ao bebê. No entanto, a imunidade passiva nos bebês é apenas temporária e começa a diminuir depois das primeiras poucas semanas, ou meses de vida. A imunidade passiva é apenas temporária, pode ser importante para receber a administração de uma composição da invenção, para induzir imunidade ativa no bebê, antes de a imunidade passiva diminuir. A administração de uma segunda composição imunogênica ao bebê depois do nascimento induz a imu- nidade ativa no bebê, e estende a imunidade passada da mãe durante a gravidez.

[00113] Conforme usado neste pedido, um bebê é um indivíduo com menos de um ano de idade (por exemplo, menos de 1 dia de ida- de, 1 semana de idade, 2 semanas de idade, 3 semanas de idade, 4 semanas de idade, 2 meses de idade, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses de idade, 9 meses de idade, 10 meses de idade, 11 meses de idade, menos de 12 meses de idade).

[00114] É possível administrar à mulher grávida a composição da invenção em qualquer época durante a gestação. Por exemplo, a composição pode ser administrada à mulher durante o primeiro, o se- gundo ou o terceiro trimestre de gestação. Em algumas modalidades,

a composição é administrada à mulher durantes das 6-12 últimas se- manas de gestação (por exemplo, 28 semanas de gestação, 29 sema- nas de gestação, 30 semanas de gestação, 31 semanas de gestação, 32 semanas de gestação, 33 semanas de gestação, 34 semanas de gestação, 35 semanas de gestação, 36 semanas de gestação, 37 se- manas de gestação, 38 semanas de gestação, 39 semanas de gesta- ção). Particularmente, a composição da invenção é administrada à mu- lher grávida pelo menos quatro semanas antes do parto. Em algumas modalidades, um regime de uma dose é administrado à mulher grávida entre as semanas 32 e 36 de gestação. Em outras modalidades, um regime de duas doses é administrado à mulher grávida, com a primeira dose sendo administrada com aproximadamente 32 semanas de ges- tação e a segunda dose sendo administrada com aproximadamente 36 semanas de gestação.

[00115] O bebê pode receber a composição em qualquer época du- rante o primeiro ano de vida, e depois disso, se desejado. Geralmente a composição será administrada ao bebê uma, duas, três, quatro ou mais vezes durante o primeiro ano de vida. Por exemplo, a composi- ção da invenção pode ser administrada ao bebê uma ou mais vezes selecionadas dentre o nascimento, com 2 semanas de idade, 4 sema- nas de idade, 6 semanas de idade, 2 meses de idade, 3 meses de idade, 4 meses de idade, 6 meses de idade, 9 meses de idade, e 12 meses de idade. Particularmente, a composição da invenção é admi- nistrada ao bebê em uma época antes de os anticorpos maternos te- rem diminuído até títulos não protetores. Administrações subsequenes podem ocorrer em qualquer programa desejado.

[00116] Em uma modalidade, é apresentado um método de prote- ção de um bebê contra uma doença causada por um ou mais dentre Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani e Bordetella pertussis compreendendo as etapas de (a) administrar uma composição da in-

venção a uma mulher enquanto estiver grávida do referido bebê; e (b) opcionalmente administrar uma composição da invenção ao bebê quando ele nasce.

[00117] Assim sendo, também é apresentado um método de prote- ção de um bebê contra uma ou mais doenças dentre difteria, tétano e tosse convulsa compreendendo as etapas de (a) administrar uma composição da invenção a uma mulher enquanto estiver grávida do referido bebê; e (b) opcionalmente administrar uma composição da invenção ao bebê quando ele nasce.

[00118] As composições preferidas da invenção podem conferir um título de anticorpos que é superior ao critério para soroproteção para cada componente antigênico para uma percentagem aceitável de indi- víduos humanos. Antígenos com um título de anticorpos associado acima do qual um hospedeiro é considerado soroconvertido contra o antígeno são bastante conhecidos, e tais títulos foram publicados por organizações tal como a OMS. De preferência mais de 80% de uma amostra estatisticamente significativa de indivíduos é soroconvertida, mais preferivelmente mais de 90%, ainda mais preferivelmente mais de 93% e mais preferivelmente ainda mais de 96-100%.

[00119] As composições da invenção geralmente serão administra- das diretamente a um paciente. A distribuição direta pode ser feita por injeção parenteral (por exemplo, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, ou ao espaço intersticial de um tecido), ou por administração retal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar ou outra administração mucosa. A administra- ção intramuscular na coxa ou no braço é preferida. A injeção pode ser por meio de uma agulha (por exemplo, uma agulha hipodérmica), mas uma injeção sem agulha pode ser alternativamente usada. Uma dose intramuscular típica é 0,5 ml.

[00120] A invenção pode ser usada para provocar imunidade sistê-

mica e/ou mucosa.

[00121] A composição imunogênica da invenção pode ser adminis- trada em uma única dose ou em múltiplas doses. A administração de uma única dose é preferida na invenção. Alternativamente, uma outra dose unitária acompanhada por uma primeira dose unitária pode ser efetiva. Tipicamente, a segunda (ou terceira, quarta, quinta etc.) dose unitária é idêntica à primeira dose unitária. Tipicamente, as composi- ções imunogênicas da invenção sãoa administradas em três doses unitárias. Tipicamente, as composições imunogênicas da invenção se- rão administradas por via intramuscular, por exemplo, por administra- ção intramuscular na coxa ou no braço.

[00122] Múltiplas doses podem ser usadas em um programa de imunização primária e/ou em um programa de imunização de reforço. Um programa de dose primária pode ser acompanhado por um pro- grama de dose de reforço. O tempo adequado entre as doses iniciais (por exemplo, entre 4-16 semanas), e entre a dose inicial e a dose de reforço, pode ser determinado rotineiramente.

[00123] Para obter eficácia total, um programa de imunização pri- mária típica (particularmente para uma criança) pode envolver a admi- nistração de mais de uma dose. Por exemplo, as doses podem ser da- das em: 0 e 6 meses (o tempo 0 sendo a primeira dose); em 0, 1, 2 e 6 meses; no dia 0, dia 21 e em seguida uma terceira dose entre 6 e 12 meses; em 2, 4 e 6 meses; em 3, 4 e 5 meses; em 6, 10 e 14 sema- nas; em 2, 3 e 4 meses; ou em 0, 1, 2, 6 e 12 meses. Composições pediátricas também podem ser usadas como doses de reforço, por exemplo, para crianças, no segundo ano de vida.

[00124] As composições também podem ser usadas como doses de reforço, por exemplo, para crianças, no segundo ano de vida. As composições vacinas de reforço da invenção para adolescentes são administradas em uma única dose a pessoas com 10 anos de idade ou mais. A composição imunogênica da invenção pode ser administrada como uma vacina de reforço a um paciente que fora previamente vaci- nado contra difteria e tétano, e também de preferência contra coquelu- che. Estes pacientes podem ser distinguidos da população em geral por terem uma resposta de memória imunológica contra a vacina ante- rior. Os pacientes podem ter recebido suas vacinas mais recentes con- tra difteria e/ou tétano pelo menos cinco antes de receberem a vacina da invenção. Os pacientes que recebem a vacina podem ter idade en- tre 4 e 65 anos, por exemplo, 11-64 anos, 10-18 anos, etc.

[00125] Qualquer via de administração adequada pode ser usada. Por exemplo, uma composição pode ser administrada por via intra- muscular, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica, ou intradérmica. Se desejado, a composição pode ser administrada por uma via intra- mucosa tal como por via intraoral, intranasal, intravaginal, e intra-retal. A administração a uma mulher grávida e ao bebê pode ser feita pela mesma via ou por vias diferentes. As composições da invenção podem ser administradas por injeção intramuscular, por exemplo, no braço ou na perna.

[00126] As vacinas produzidas pela invenção podem ser adminis- tradas aos pacientes ao mesmo tempo que uma vacina separada, por exemplo, ao mesmo tempo que uma vacina conjugada pneumocócica tal como PREVNAR™, ao mesmo tempo que uma vacina contra influ- enza, ao mesmo tempo que uma vacina contra rotavírus, ao mesmo tempo que uma vacina contra MMR, etc.

[00127] Onde as composições da invenção incluem um adjuvante à base de alumínio, pode ocorrer sedimentação dos componentes du- rante o armazenamento. A composição deve, portanto, ser agitada an- tes de ser administrada a um paciente. A composição agitada será uma suspensão branca turva. Modalidades

Modalidade 1. Uma composição imunogênica compreendendo (a) uma vesícula de membrana externa (OMV), (b) um antígeno de per- tússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que a OMV é derivada de Bordetella pertussis.

Modalidade 2. Uma composição imunogênica compreendendo (a) uma vesícula de membrana externa de Bordetella pertussis (OMV), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um to- xoide diftérico.

Modalidade 3. A composição imunogênica de acordo com a Moda- lidade 1 ou com a Modalidade 2, em que o antígeno de pertússis ace- lular é selecionado do grupo que consiste em (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertacti- na (PRN). Modalidade 4. A composição imunogênica de acordo com a Moda- lidade 3, em que o antígeno de pertússis acelular compreende PT, FHA e PRN.

Modalidade 5. A composição imunogênica de acordo com a Moda- lidade 4, em que PT, FHA e PRN estão presentes em uma proporção de 16:16:5 (medida em peso). Modalidade 6. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades precedentes, em que o toxoide diftérico está presente em uma concentração entre 4 Lf/ml e 8 Lf/ml, por exemplo, 4 Lf por dose de 0,5 ml.

Modalidade 7. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 6, em que o toxoide diftérico está presente em uma concentração entre 20 e 50 Lf/ml, por exemplo, 25 Lf por dose de 0,5 ml.

Modalidade 8. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades precedentes, em que o toxoide tetânico está presente em uma concentração de cerca de 5 Lf por dose de 0,5 ml.

Modalidade 9. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 8, em que o toxoide tetânico está presente em uma concentração entre 5 e 10 Lf por dose de 0,5 ml.

Modalidade 10. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 9, em que o toxoide diftérico e o toxoide te- tânico estão presentes em uma proporção de toxoide diftérico:toxoide tetânico que é maior que 1, por exemplo, entre 2:1 e 3:1 (medida em unidades Lf), tal como 2,5:1. Modalidade 11. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 9, em que o toxoide diftérico e o toxoide te- tânico estão presentes em uma proporção de toxoide tetânico:toxoide diftérico que é maior que 1, por exemplo, entre 1,5:1 e 2,5:1 (medida em unidades Lf), tal como 2:1. Modalidade 12. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades precedentes, em que a composição imunogêni- ca contém um adjuvante.

Modalidade 13. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades precedentes, em que a composição imunogêni- ca contém um adjuvante do tipo sal de alumínio.

Modalidade 14. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades precedentes, em que a composição é uma solu- ção ou suspensão líquida injetável.

Modalidade 15. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades 1 a 14, em que a composição é liofilizada.

Modalidade 16. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades precedentes, em que a composição é livre de conservantes.

Modalidade 17. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades precedentes, em que a composição é uma vaci- na.

Modalidade 18. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades precedentes, em que a composição é para ad- ministração a um ser humano.

Modalidade 19. A composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades precedentes, em que a composição é para uso como um medicamento.

Modalidade 20. Um método para aumentar a resposta imunológica em um paciente, compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma composição de acordo com qualquer uma das Modalidades pre- cedentes.

Modalidade 21. Um método para aumentar a resposta imunológica em um paciente, compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma composição compreendendo (a) uma vesícula de membrana ex- terna de Bordetella pertussis (OMV), (b) um antígeno de pertússis ace- lular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico.

Modalidade 22. Um processo para preparação da composição imu- nogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-19, com- preendendo misturar um primeiro componente compreendendo a vesí- cula de membrana externa (OMV) e um segundo componente com- preendendo o antígeno de pertússis acelular, o toxoide tetânico e o toxoide diftérico.

Modalidade 23. O processo de acordo com a Modalidade 22, em que a OMV no primeiro componente é liofilizada.

Modalidade 24. O processo de acordo com a Modalidade 22 ou com a Modalidade 23, em que o segundo componente compreende antíge- nos aquosos.

Modalidade 25. O processo de acordo com a Modalidade 24, com- preendendo uma etapa adicional de reconstituição da OMV liofilizada no primeiro componente com os antígenos aquosos do segundo com- ponente.

Modalidade 26. O processo de acordo com qualquer uma das Moda- lidades 22 a 25, em que o primeiro componente não compreende um adjuvante.

Modalidade 27. O processo de acordo com qualquer uma das Moda- lidades 22 a 26, em que o segundo componente compreende um adju- vante, por exemplo, um adjuvante do tipo sal de alumínio.

Modalidade 28. Um kit para preparação da composição imunogênica de acordo com qualquer uma das Modalidades 1-19, compreendendo um primeiro componente compreendendo a OMV e um segundo com- ponente compreendendo o antígeno de pertússis acelular, o toxoide tetânico e o toxoide diftérico, em que os dois componentes estão em recipientes separados.

Modalidade 29. O kit de acordo com a modalidade 28, em que a OMV no primeiro componente é liofilizada.

Modalidade 30. O kit de acordo com a Modalidade 28 ou com a Mo- dalidade 29, em que o segundo componente compreende antígenos aquosos.

Modalidade 31. O kit de acordo com qualquer uma das Modalidades 28-30, em que o primeiro componente não compreende um adjuvante.

Modalidade 32. O kit de acordo com qualquer uma das Modalidades 28-31, em que o segundo componente compreende um adjuvante, por exemplo, um adjuvante do tipo sal de alumínio.

Modalidade 33. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis expressan- do um toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado, particular- mente o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT 9K/129G.

Modalidade 34. Uma composição imunogênica compreendendo (a)

vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis expressan- do o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT 9K/129G.

Modalidade 35. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G.

Modalidade 36. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas.

Modalidade 37. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas e/ou tratadas com formaldeído, formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combinações ou derivados dos mesmos.

Modalidade 38. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G e em que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo.

Modalidade 39. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, em que o lipídio A nas OMVs tem uma es- trutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos gru- pos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas e/ou tratadas com formaldeído, formali- na, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combinações ou derivados dos mesmos.

Modalidade 40. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular selecionado do grupo que consiste em (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertacti- na (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G.

Modalidade 41. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular selecionado do grupo que consiste em (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertacti- na (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, em que o lipídio A nas OMVs tem uma es- trutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos gru- pos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas.

Modalidade 42. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular selecionado do grupo que consiste em (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertacti- na (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, em que o lipídio A nas OMVs tem uma es- trutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos gru- pos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas e/ou tratadas com formaldeído, formali- na, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combinações ou derivados dos mesmos.

Modalidade 43. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertacti- na (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações

R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G.

Modalidade 44. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertacti- na (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, em que o lipídio A nas OMVs tem uma es- trutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos gru- pos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas.

Modalidade 45. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertacti- na (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que com- preende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, em que o lipídio A nas OMVs tem uma es- trutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos gru- pos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas e/ou tratadas com formaldeído, formali- na, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combinações ou derivados dos mesmos.

Modalidade 46. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um to- xoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bor-

detella pertussis expressando um toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado, particularmente o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT 9K/129G.

Modalidade 47. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um to- xoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bor- detella pertussis expressando o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT 9K/129G.

Modalidade 48. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um to- xoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bor- detella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide per- tussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G.

Modalidade 49. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um to- xoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bor- detella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide per- tussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas.

Modalidade 50. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um to- xoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bor- detella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide per-

tussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas e/ou tratadas com for- maldeído, formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combina- ções ou derivados dos mesmos.

Modalidade 51. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um to- xoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bor- detella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide per- tussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, e em que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glu- cosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo.

Modalidade 52. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um to- xoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bor- detella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide per- tussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, e em que o gene ArnT fora nocauteado ou deletado, em que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo.

Modalidade 53. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um to- xoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bor- detella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide per- tussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, em que o lipídio

A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glu- cosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas e/ou tratadas com formaldeído, formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combinações ou derivados dos mesmos.

Modalidade 54. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um to- xoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bor- detella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide per- tussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, e em que o gene ArnT fora nocauteado ou deletado, em que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas e/ou tratadas com formaldeído, formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combinações ou de- rivados dos mesmos.

Modalidade 55. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular selecionado do grupo que consiste em (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina fila- mentosa (FHA) e (iii) pertactina (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide per- tussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G.

Modalidade 56. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular selecionado do grupo que consiste em (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina fila- mentosa (FHA) e (iii) pertactina (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide per- tussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, em que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glu- cosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas.

Modalidade 57. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular selecionado do grupo que consiste em (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina fila- mentosa (FHA) e (iii) pertactina (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e em que o gene ArnT fora no- cauteado ou deletado, e que expressa o toxoide pertussígeno geneti- camente destoxificado PT-9K/129G, em que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas e/ou tratadas com formaldeído, formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combinações ou de- rivados dos mesmos.

Modalidade 58. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertactina (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para inclu-

ir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G.

Modalidade 59. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertactina (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para inclu- ir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, em que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glucosami- na (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são quimicamente destoxificadas.

Modalidade 60. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs), (b) (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertactina (PRN), (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para inclu- ir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G, e em que o gene ArnT fora nocauteado ou deletado, em que o lipídio A nas OMVs tem uma estru- tura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo e em que as OMVs não são qui- micamente destoxificadas e/ou tratadas com formaldeído, formalina, glutaraldeído, peróxido de hidrogênio e combinações ou derivados dos mesmos.

Modalidade 61. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs) com- preendendo toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado, (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico. Modalidade 62. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs) com- preendendo toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado, em que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substitui- ções de glucosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo, (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico. Modalidade 63. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs) com- preendendo o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT- 9K/129G, (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetâni- co e (d) um toxoide diftérico. Modalidade 64. Uma composição imunogênica compreendendo (a) vesículas de membrana externa de Bordetella pertussis (OMVs) com- preendendo o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT- 9K/129G, em que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glucosamina (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo, (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um to- xoide tetânico e (d) um toxoide diftérico. Modalidade 65. A composição imunogênica das Modalidades 61 a 64 em que 100% do toxoide pertussígeno na vesícula de membrana externas é PT geneticamente destoxificado. Modalidade 66. A composição imunogênica das Modalidades 61 a 65 em que 100% do toxoide pertussígeno na vesícula de membrana externas é o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT 9K/129G. Generalidades

[00128] O termo "compreendendo" abrange "incluindo", por exem-

plo, uma composição "compreendendo" X pode incluir alguma coisa mais, por exemplo, X + Y.

A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancial- mente livre" de Y pode ser completamente livre Y.

Em algumas moda- lidades, o termo "compreendendo" refere-se à inclusão do agente ativo indicado, tal como polipeptídios mencionados, assim como a inclusão de outros agentes ativos, e carreadores, excipientes, emolientes, esta- bilizantes etc. farmaceuticamente aceitáveis, como são conhecidos na indústria farmacêutica.

Em algumas modalidades, o termo "consistindo essencialmente em" refere-se a uma composição cujo único princípio ativo é o princípio ativo indicado, por exemplo, antígenos, no entanto, podem ser incluídos outros compostos que são para estabilização, preservação etc. da formulação, mas que não estão diretamente en- volvidos no efeito terapêutico do princípio ativo indicado.

O uso da ex- pressão de transição "consistindo essencialmente em" significa que o escopo de uma reivindicação deve ser interpretado como abrangendo ou materiais ou etapas mencionados enumerados na reivindicação, e aqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas da invenção reivindicada.

Vide, In re Herz, 537 F,2d 549, 551- 52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (grifado no original); vide tam- bém MPEP § 2111,03. Assim sendo, o termo "consistindo essencial- mente em", quando usado em uma reivindicação esta invenção, não deve ser interpretado como sendo equivalente a "compreendendo". O termo "consistindo em" e suas variações significam limitado a", a me- nos que expressamente indicado em contrário.

Em certos territórios, o termo "compreendendo um princípio ativo consistindo em" pode ser usado no lugar de "consistindo essencialmente em". O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x±10%, x±5%, x±4%, x±3%, x±2%, x±1%. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "subs-

tancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. onde ne- cessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção. Onde os métodos mencionam as etapas de administra- ção, por exemplo, como (a), (b), (c), etc., estas são etapas sequen- ciais, i.e., a etapa (c) vem depois da etapa (b) que é precedida pela etapa (a). Os anticorpos geralmente serão específicos para seu alvo, i.e., eles terão mais afinidade para o alvo do que para uma proteína controle irrelevante, tal como albumina sérica bovina.

[00129] A menos que especificamente indicado, um processo com- preendendo uma etapa de misturação de dois ou mais componentes não requer qualquer ordem de misturação específica. Assim sendo, os componentes podem ser misturados em qualquer ordem. Onde há mais de três componentes, então dois componentes podem ser com- binados um com o outro, e em seguida a combinação pode ser combi- nada com o terceiro componente, etc.

[00130] Os anticorpos geralmente serão específicos para seu alvo. Assim sendo, eles terão mais afinidade para o alvo do que para uma proteína controle irrelevante, tal como albumina sérica bovina.

[00131] Onde um componente está descrito como sendo "adsorvi- do" em um adjuvante, é preferível que pelo menos 50% (em peso) da- quele antígeno seja adsorvido, por exemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou mais. Se um componente for totalmente adsorvido, então ele não deve ser detectável no sobrenadante de uma composi- ção depois de centrifugação.

[00132] As quantidades dos conjugados geralmente são dadas em função da massa de sacarídeo (i.e., a dose do conjugado (carreador + sacarídeo) como um todo é mais alta que a dose estipulada) para evi- tar variação devido à escolha do carreador.

[00133] Onde materiais animais (e particularmente bovinos) são usados na cultura de células, eles devem ser obtidos de fontes que são livres de encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs), e em particular livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE).

MODOS DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Materiais e métodos Vacina de TdaP

[00134] Foram usadas vacinas de TdaP comercialmente disponí- veis. A vacina de TdaP é adjuvantada com hidróxido de alumínio e contém toxoide tetânico, toxoide diftérico e os antígenos de pertússis acelulares (PT, FHA e 69K, também denominados pertactina ou PRN). Cepas bacterianas e condições de crescimento

[00135] As seguintes cepas de B. pertussis foram usadas neste es- tudo: W28 PT 9K/129G (Pizza et al., 1989) que carrega uma toxina pertussígena geneticamente destoxificada e seu derivado nocauteado (KO) arnT sem o gene arnT gerado da maneira descrita abaixo. Em geral, as bactérias foram armazenadas e cultivadas da maneira descri- ta em Gasperini et al., 2018 e resumidamente da seguinte maneira: as bactérias foram armazenadas a 80 °C e recuperadas por plaqueamen- to sobre placas de agar Bordet-Gengou (BG), suplementadas com 15% (v/v) de sangue de ovelha, por 3 dias a 37 °C. As bactérias foram então inoculadas a uma densidade ótica inicial a 600 nm (OD600) de 0,05–0,1 em meio de Stainer-Scholte suplementado com 0,4% de (p/v) de monocloritado de L-cisteína, 0,1% (p/v) de FeSO4, 0,2% (p/v) de ácido ascórbico, 0,04% (p/v) de ácido nicotínico, 1% (p/v) de glutationa reduzida. As culturas foram cultivadas em agitadores giratórios a 37 °C. Cepas recombinantes DH5 de E. coli foram armazenadas a 80 °C, recuperadas por plaqueamento sobre placas de agar LB suplementado com 20 g/ml de cloranfenicol por 16 horas a 37 °C. Para culturas líqui- das, as bactérias foram inoculadas em meio LB suplementado com 20 g/ml de cloranfenicol e foram cultivadas em agitadores giratórios a 37 °C por 16 horas.

Construção de arnT KO

[00136] Para construir uma cepa mutante arnT de B. pertussis, simi- lar àquela que foi descrita em Geurtsen et al., 2009, nós amplificamos uma parte do DNA a montante do arnT da cepa W28 PT-9K/129G de B. pertussis usando os iniciadores 5′- ATAGAATTCACGCGGTG- CGGCGCCAGCGC -3′ (SEQ ID NO:1) e 5′- ATAGGATCCGCCAG- GACCTGGCCTGGCC -3′ (SEQ ID NO: 2), contendo um sítio EcoRI e um sítio BamHI (sublinhados). Adicionalmente, um fragmento de DNA a jusante de arnT foi obtido por PCR com os iniciadores 5′- ATAGGA- TCCGGACGAAGCCTTCAAGGGGC -3′ (SEQ ID NO: 3) e 5′- ATAAAGCTTCGTCCAGGCGCGCCAGCGC -3′ (SEQ ID NO: 4), con- tendo um sítio BamHI e um sítio HindIII (sublinhados). Ambos os pro- dutos de PCR foram clonados em pUC19 junto com um cassete de resistência à canamicina (KanR) contendo sítios BamHI em ambas as extremidades. O plasmídeo resultante pUC19-arnTup-KanR-arnTdown foi digerido comm as enzimas de restrição EcoRI e HindIII e o fragmento EcoRI-HindIII resultante foi ligado vetor suicida pSORTP1 restrito ao EcoRI-HindIII. O construto final, designado pSORTP1-arnTKO foi usado para construir um mutante arnT de B. pertussis (cepa W28 PT 9K/129G) por permuta alélica. Os transformantes foram rastreados por PCR usando vários conjuntos de iniciadores. Purificação de OMVs

[00137] OMVs foram geradas a partir de W28 PT 9K/129G e seu derivado arnTKO. As culturas líquidas de B. pertussis foram recupera- das depois de crescimento por 3 dias em balões defletidos de 250 mL. A razão de volume de líquido-ar resultou crítica para o rendimento de produção de OMV e foi mantida em uma razão de 1:5. As bactérias foram então pelotizadas por centrifugação a 5.000 x g por 30 minutos. Os sobrenadantes livres de células foram recuperados e filtrados por filtros Stericups de 0,22 μm (Millipore). Depois de ultracentrifugação a

175.000 x g por 2 horas, a pelota de OMVs resultante foi lavada com solução salina tamponada com fosfato da Dulbecco (D-PBS), nova- mente ultracentrifugada a 175.000 x g por 2 horas e por fim ressus- pendida em 100 µl de D-PBS. As OMVs foram quantificadas pelo en- saio de Lowry (DC Protein Assay, BioRad) quanto ao teor de proteínas totais de acordo com as instruções do fabricante. Resultados

[00138] As preparações de vesículas de membrana externa foram preparadas a partir de duas cepas vacinais destoxificadas de B. per- tussis, a cepa W28 PT 9K/129G expressando uma toxina pertussígena geneticamente destoxificada, e um derivado da cepa W28 PT 9K/129G arnTKO com uma estrutura de lipídio A geneticamente modificada sem as substituições de glucosamina nos grupos fosfato distais da estrutu- ra do núcleo, através da deleção do gene codificador de ArnT. O mu- tante arnT KO da cepa W28 PT 9K/129G (Bp-arnt) apresenta 10 ve- zes menos ligação de TLR4 Figura 1(a) e induz significativamente me- nos secreção de IL-6 a partir de PBMCs do que a cepa W28 PT 9K/129G (Bp-WT) Figura 1(b).

[00139] Foi demonstrado que tanto as OMVs da cepa vacinal W28 9K/129G (Bp WT) quanto da cepa vacinal W28 9K/129G arntKO (Bp ΔarnT) continham pequenas quantidades dos componentes FHA, 69K e toxina pertussígena (Figura 2). E os camundongos imunizados com ambas as OMVs produziram níveis detectáveis de anticorpos para to- dos os três componentes acelulares de pertússis (Figura 3). Imunização de camundongos para gerar anti-soro de camundon- go

[00140] Camundongos BALB/c (fêmeas, 6 semanas de idade) (Charles River Laboratories International Inc., Wilmington, MA) recebe- ram ou três imunizações intraperitoneais (IP) com um intervalo de três semanas ou duas imunizações intramusculares (IM) com um intervalo de 4 semanas, com formulações de 100 µl (50 µL/pata). Os soros fo- ram coletadas 2 semanas depois de cada imunização. As OMVs foram formuladas nas doses indicadas para cada estudo em 2 mg/mL Al(OH)3. Para as formulações combinadas, as OMVs foram formuladas nas doses de 0,1, 0,5 e 2,5 µg doses com 1/5 da dose humana de an- tígenos de TdaP (vide abaixo) em um volume total de 100 µl em 2 mg/mL Al(OH)3. Dose humana da vacina de TdaP (0,5 mL) PT FHA 69K D T Al(OH)3 4 µg 4 µg 8 µg 2 Lf (1,2 μg) 5 Lf (3,2 μg) 1 mg Imunoensaio Luminex em anti-soros de camundongo

[00141] Os títulos de IgG total contra todos os antígenos vacinais foram analisados pelo imunoensaio Luminex penta-plex da maneira descrita (Agnolon et al., 2015) e como a seguir. Os títulos estão ex- pressos em Unidades Luminex Relativas por ml (RLU/ml), resultantes da conversão das intensidades de fluorescência medianas (MFI) regis- tradas através de referência hiper-imunes. Um imunoensaio Luminex penta-plex baseado em microesferas MagPlex foi desenvolvido de acordo com as instruções do fabricante para quantificar títulos de anti- corpos anti-TdaP em soros de camundongos. Os títulos de IgG foram determinados nos animais individuais depois de incubação de microes- feras acopladas a antígenos com soros diluídos (1:10000, pós-1; 1:20000, pós-2). Um anticorpo secundário conjugado com ficoeritrina foi usado para detecção (1:400). As medidas de IgG foram determina- das como intensidades de fluorescência medianas (MFI) no analisador Luminex FLEXMAP 3D (Luminex Corporation, Austin, TX) com a ajuda do software Bio-Plex Manager 5,0 (Bio-Rad, Hercules, CA). Um anti- soro específico para cada antígeno foi usado como referência para converter os valores de MFI de IgG total em RLU/ml (Unidades Lumi- nex Relativas). O limite de quantificação (LOQ) do ensaio foi determi- nado para cada antígeno e foi considerado como limiar para resultados positivos. Os resultados estão mostrados na Figura 4. Ensaio de inibição da adesão

[00142] Para o ensaio de inibição da adesão de B. pertussis, bacté- rias foram cultivadas por 16 horas em cultura líquida e em seguida pe- lotizadas a 8000 × g por 5 minutos e ressuspendidas em d-PBS a OD600 0,5. Para a marcação fluorescente das células de B. pertussis, um volume de 445 μl de suspensão bacterianma foi misturado com 50 μl de NaHCO3 1 M e 5 μl de éster succinimidílico de ácido carboxílico Alexa Fluor 488 (Life Technologies, Waltham, MA) e incubado por 15 minutos a 37 °C. Depois de centrifugação a 8.000 x g por 5 minutos à temperatura ambiente, o sobrenadante foi removido e a pelota foi la- vada uma vez com 1 ml de d-PBS para remover o corante não ligado e as bactérias foram finalmente ressuspendidas no meio F12-K a uma OD600 0,2. Os soros de camundongo reunidos foram diluídos seriada- mente 1 para 4 no meio F-12K contendo 1% (v/v) de soro de camun- dongo naïve e incubados com B. pertussis marcada por 1 hora a 37 °C na razão de 1:1. Cem microlitros de misturas de bactérias/soro foram transferidos em triplicata para células A549 plaqueadas. As células infectadas foram incubadas por 1 hora a 37 °C. Depois de abundante lavagem para remover as bactérias não ligadas, a fluorescência foi medida a uma excitaçã/emissão de 485/535 nm pela leitora de micro- placas Tecan Infinite F200PRO.

[00143] A imunização de camundongos com wP das três doses di- ferentes de OMV resultou na indução de anticorpos que podem inibir a capacidade da B. pertussis de aderir a culturas de células in vitro de células A549 epiteliais. O soro dos camundongos imunizados com bactérias inteiras inativadas apresentou o nível mais alto de inibição de aderência bacteriana, e a inibição de aderência bacteriana induzida por uma vacina de OMV foi proporcional à dose do antígeno. A vacina de TdaP não induziu níveis altos de anticorpos nos camundongos que inibissem a adesão de bactérias marcadas de forma fluorescente e apenas diluições séricas baixas (1/40 ou mais) resultaram em fluores- cência reduzida no ensaio. Constatou-se que a OMV na dose mais alta de 10 μg induzia anticorpos após a vacinação que conferem o nível mais alto de inibição de aderência bacteriana que foi equiparável àquele induzido pelo controle com bactérias totais (Figura 5). Teste da potência do desafio intracraniano de Kendrick

[00144] Camundongos CD1 (6 semanas de idade) foram vacinados uma vez por via intraperitoneal (i.p.) com 500 µL de formulações vaci- nais e desafiados 2 semanas após a imunização com 30 µl de uma suspensão da cepa 18323 de B. pertussis administrada por via intra- craniana e a sobrevivência dos camundongos foi acompanhada por 2 semanas após o desafio de acordo com o teste da potência do desafio intracraniano de Kendrick (Kendrick et al., 1947) e de acordo com as diretrizes da Farmacopeia Europeia. O padrão NIBSC em três doses (1/10, 1/50 e 1/ 250 da dose humana) foi usado como controle positivo, e as OMVs foram formuladas em doses de 0,4, 2 e 10 µg em 2 mg/mL Al(OH)3.

[00145] O teste de proteção intracerebral em camundongos (teste de Kendrick) é efetivo para determinação da potência das vacinas de células inteiras contra coqueluche e é o único teste que mostrou uma correlação com proteção em crianças (Xing et al., 201440). A imuniza- ção de camundongos com OMV em doses crescentes (doses de 0,4, 2 e 10 μg) conferiu níveis crescentes de proteção contra o desafio intra- craniano com B. pertussis (Figura 6) que foi equiparável ao padrão NIBSC de wP. A proteção induzida por vacinas de OMV foi proporcio- nal à dose do antígeno e foi bem-sucedida na provocação de uma res- posta protetora potente que foi equiparável àquela da wP (Figura 6). Desafio aerossol

[00146] Camundongos C57BL/6 (fêmeas, 10 semanas de idade)

foram vacinados uma vez por via intraperitoneal (i.p.) com 100 µl de formulações vacinais e desafiados 3 semanas depois como já descrito (Misiak et al., 2017a) e como descrito abaixo. A vacina de células intei- ras de pertússis (wP) foi usada como um controle positivo em 1/5 ou 1/10 da dose humana, como indicado. As OMVs foram formuladas em doses de 0,4, 2, e 10 µg doses como indicado em 2 mg/mL Al(OH)3. Para as formulações combinadas as OMVs foram formuladas a uma dose de 2,5 µg dose com 1/5 da dose humana de TdaP (vide abaixo) em um volume total de 100 µl em 2 mg/mL Al(OH)3 Dose humana de TdaP PT FHA PRN TT DT Alum (volume de dose de (8 µg) (8 µg) (2,5 µg) (5 Lf) (2 Lf) (1 mg) 0,5 mL)

[00147] O soro e o baço foram coletados de camundongos imuni- zados (4 camundongos por grupo) 3 semanas após a vacinação, um dia antes do desafio. A produção de citocinas antígeno-específicas por células do baço e os anticorpos séricos foram analisados por ELISA. Os demais camundongos foram então desafiados com uma cepa viru- lenta de B. pertussis como descrito abaixo e as CFUs nos pulmões foram avaliadas 1, 3, 7 e14 dias após a infecção.

[00148] A infecção respiratória dos camundongos foi efetuada por exposição dos camundongos à B. pertussis aeroseol (cepa BP338; 1 × 109 CFU/ml) por 10 minutos seguido por 10 minutos de repouso usan- do um nebulizador PARI TurboBOY SX. O curso da infecção por B. pertussis foi acompanhado pela realização de contagens de CFU nos pulmões de grupos de três a quatro camundongos em intervalos de- pois do desafio. Os pulmões foram assepticamente removidos e ho- mogeneizados em 1 ml de solução salina fisiológica estéril com 1% de caseína. O homogeneizado não diluído e diluído seriadamente (100 μl) provenientes dos pulmões individuais foi plaqueado em duplicata em placas de agar Bordet-Gengou e as colônias bacterianas foram conta- das depois de 6 dias de incubação a 37°C.

[00149] Os títulos dos anticorpos foram medidos por ELISA como já descrito (Misiak et al., 2017b) e como descrito abaixo. Os anticorpos específicos para FHA foram quantificados por ELISA usando FHA li- gado às placas (1 µg /mL), IgG1 ou IgG2a anti-camundongo conjugado com biotina e estreptavidina conjugada com peroxidase (BD Pharmin- gen, Franklin Lakes, NJ). Os níveis de anticorpos estão expressos co- mo o título objetivo final médio ± SEM, determinado por extrapolação da parte linear da curva de titulação para 2 SE acima do valor de refe- rência obtido com soro não imune.

[00150] A imunização de camundongos com wP e as três doses diferentes de OMV resultou na indução de produção de anticorpos es- pecíficos para B. pertussis. A wP promoveu os títulos mais altos de IgG total anti-FHA, que foram significativamente maiores comparados com todas as três doses de IMV (Figura 7). Verificou-se que a vacina- ção foi wP promoveu as respostas TH1 mais altas e, por conseguinte, o título mais alto de IgG2c anti-FHA (Figura 7). IgG2c anti-FHA foi de- tectada no soro de 1 dos 4 e 3 dos 4 camundongos vacinados com OMV 2 e com OMV 10, respectivamente. Não foi detectado IgG2c es- pecífico para FHA nos camundongos imunizados com OMV 0,4. As diferenças nas respostas específicas para FHA sugerem um teor muito mais de FHA na OMV em comparação com a wP.

[00151] Títulos elevados de anticorpos protetores junto com indu- ção de uma resposta TH1 são a chave para proteção contra B. pertus- sis. A imunização de dose única com wP, OMV 0,4, OMV 2 e OMV 10 conferiram níveis de proteção diferentes contra o desafio respiratório com B. pertussis (Figura 8). Os camundongos imunizados com a vaci- na de wP apresentaram o nível de proteção mais alto e a maioria deles ficou livre da infecção no dia 7 após o desafio. Além disso, os camun- dongos imunizados com wP apresentaram contagens significativamen- te mais baixas de CFU em todos os instantes após a infecção em rela-

ção aos camundongos que receberam a vacina de OMV em todas as três concentrações testadas. A proteção induzida por uma vacina de OMV foi proporcional à dose de antígeno. No entanto, a proteção in- duzida pela OMV 10 não foi tão eficaz quanto induzida pela vacinação com wP. As áreas sob as curvas de depuração confirmaram que a wP era a melhor na proteção dos camundongos contra o desafio com B. pertussis aerossol. Foi constatado que a OMV na dose mais alta de 10 μg conferia o nível mais alto de proteção no modelo de camundongo do desafio com B. pertussis. Entretanto, verificou-se que ela ainda era significativamente menos eficaz que a vacina de wP. Também foi veri- ficado que as respostas de IgG2c específicas para FHA eram as mais altas nos camundongos que receberam a vacina de wP e IgG2c sérica específica para FHA que não aumentou com uma dose da vacina de

OMV

[00152] Os dados apresentados neste pedido mostram que o nível de proteção conferida por uma vacina de OMV é diretamente proporci- onal à dose de antígeno usado. Ressalta-se também que, mesmo na mais alta dose escolhida, as vacinas de OMV não são tão protetoras quanto as de wP.

[00153] Para comparar a eficácia protetora contra o desafio com B. pertussis que a OMV pode ter quando adicionada em combinação com a formulação de pertússis acelular foi usado o modelo de desafio ae- rossol com uma vacina de pertússis acelular formulada com alúmen ou com alúmen+OMV, com a vacina de células inteiras como um controle positivo. A imunização de camundongos com wP, aP e aP+OMV indu- ziu níveis elevados de IgG total anti-FHA (Figura 9). Além disso, títulos elevados de IgG total foram detectados em um grupo OMV apenas. Não foi observada qualquer diferença significativa entre os quatro gru- pos de vacina. Títulos elevados de IgG1 anti-FHA foram detectados em todos os grupos de vacina, com os títulos mais altos de IgG1 de-

tectados no soro de camundongos vacinados com aP e com aP+OMV (Figura 9). No entanto, nenhuma diferença significativa foi detectada entre os grupos. IgG2c específica para FHA foi detectada no soro de 2 dos 4 wP, 4 dos 4 aP+OMV e 1 dos 4 camundongos vacinados com OMV (Figura 9c). Não foi detectada qualquer IgG2c anti-FHA no grupo aP. A resposta de IgG2c à aP apenas foi significativamente aumenta- da pela adição de OMV.

[00154] Constatou-se que a imunização de camundongos com uma única dose de wP, aP, aP+OMV assim como com OMV apenas confe- re proteção contra o desafio respiratório com B. pertussis (Figura 10). Os camundongos imunizados com a vacina de wP apresentaram o ní- vel mais alto de proteção e ficaram livres da infecção no dia 7 após o desafio. A vacinação com aP e com OMV conferiu níveis de proteção similares. Entretanto, estas vacinas foram significativamente menos eficazes que a vacina de wP. Em contraste, foi constatado que a com- binação aP+OMV conferiu um nível de proteção equiparável àquele induzido pela vacina de wP. Não foi detectada qualquer diferença sig- nificativa entre essas duas vacinas em qualquer dos instantes testa- dos. As áreas sob as curvas de depuração confirmaram que a wP e a aP+OMV eram as mais potentes das vacinas testadas.

[00155] Assim sendo, uma única imunização com 1/5 da dose hu- mana de todas as formulações vacinais testadas induziu imunidade protetora contra B. pertussis em camundongos C57BL6. Foi constata- do que a imunização com OMV apenas conferia proteção significativa, que foi equiparável àquela induzida pela vacina de aP.

[00156] Fortes respostas Th1 foram detectáveis em wP, aP+OMV e OMV isoladas, mas não em camundongos vacinados com aP. Respos- tas Th1 aumentadas nos camundongos vacinados com aP+OMV com- parados aos camundongos que receberam a vacina de aP estavan correlacionadas com títulos elevados de IgG2c anti-FHA, que estavam virtualmente ausentes nos camundongos imunizados com aP. Os da- dos apresentados neste relatório mostram que a adição de OMV à va- cina de aP aumenta fortemente sua eficácia protetora e induz uma tro- ca para produção de IgG2c anti-FHA e respostas TH1 tanto durante a vacinação primária quanto as vacinações de reforço (Figura 11). Vacinação de reforço

[00157] Nos experimentos anteriores foram usados camundongos naïve para imunização. Este seria o caso para uma vacinação primária (i.e., vacinas pediátricas). Ainda assim, a vacinação de reforço tam- bém é necessária posteriormente e a maioria dos indivíduos nos paí- ses desenvolvidos terão tomado as atuais vacinas comercialmente disponíveis que induzem uma resposta mais propensa à resposta TH2. Esta situação foi mimetizada usando uma vacina pediátrica comerci- almente disponíveis (Infanrix Hexa) para a primeira imunização (imuni- zação primária) e diferentes formulações de reforço comercialmente disponíveis ou experimentais - incluindo TdaP+OMV - para a imuniza- ção secundária.

[00158] A adição de OMV a uma vacina de TdaP aumentou signifi- cativamente as respostas TH1, ao passo que diferentes vacinas de TdaP mesmo na presença de um adjuvante indutor de TH1 (Alum- TLR7) não alterou o equilíbrio das TH (Figura 12). Conclusões

[00159] Foram feitas as seguintes observações sobre a imunogeni- cidade das formulações vacinais investigadas: • As OMVs, e as vacinas contra difteria, tétano e coquelu- che produziram títulos de anticorpos específicos para os antígenos correspondentes em camundongos imunizados com todas as formula- ções investigadas. • Não foi observada interferência imunológica entre as OMVs e as combinações vacinais contra tétano/difteria/coqueluche.

 Respostas de IgG e anticorpos funcionais à vacinação com uma combinação de OMV/antígenos de difteria/tétano/pertússis produziram títulos significativamente mais altos do que aqueles obser- vados subsequente à vacinação com uma vacina apenas de OMV ou apenas de TdaP.  A adição de OMV à vacina de aP induz uma muedança para produção de IgG2c anti-FHA e respostas Th1 foram detectáveis em camundongos vacinados com wP, aP+OMV e apenas OMV, mas não em camundongos vacinados com aP.

[00160] A adição de OMV à vacina de aP em uma vacina combina- da aumenta bastante sua eficácia protetora em relação a respostas protetoras de OMV ou de aP quando administradas isoladas. Conclu- indo, não houve evidência de forte interferência entre qualquer uma das vacinas investigadas. Foi constatado que a imunização apenas com OMV confere proteção significativa no teste de potência de Ken- dricks e no modelo de desafio aerossol. A adição de OMVs a vacinas de pertússis acelular leva a uma proteção maior do que com qualquer das vacinas de aP ou de OMV isoladas. Sem desejarmos nos ater à teoria, isto pode ocorrer devido aos antígenos protetores adicionais contidos nas vacinas e/ou devido à indução de um perfil de TH1 favo- rável tanto na vacinação primária quanto na vacinação de reforço.

[00161] Ficará entendido que a invenção foi descrita apenas a título de exemplo e que modificações podem ser feitas, porém permanecen- do dentro do escopo e espírito da invenção.

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Claims (25)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis expressando um toxoide pertussígeno geneticamente desto- xificado, particularmente o toxoide pertussígeno geneticamente desto- xificado PT 9K/129G.

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis que compreende um gene S1 que fora modificado para incluir as mutações R9K e E129G e que expressa o toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado PT-9K/129G.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindica- ção 2, caracterizada pelo fato de que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis na qual o gene ArnT fora nocauteado ou deletado.

4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o lipídio A nas OMVs tem uma estrutura modificada sem substituições de glucosami- na (GlcN) nos grupos fosfato distais da estrutura do núcleo.

5. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o antígeno de pertússis acelular é selecionado do grupo que consiste em (i) toxina pertussígena destoxificada (PT), (ii) hemaglutinina filamentosa (FHA) e (iii) pertactina (PRN).

6. Composição imunogênica de acordo com a reivindica- ção 5, caracterizada pelo fato de que o antígeno de pertússis acelular compreende PT, FHA e PRN.

7. Composição imunogênica de acordo com a reivindica-

ção 6, caracterizada pelo fato de que o PT é um toxoide pertussígeno geneticamente destoxificado.

8. Composição imunogênica de acordo com a reivindica- ção 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que PT, FHA e PRN estão pre- sentes em uma proporção de 16:16:5 (medida em peso).

9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o toxoide difté- rico está presente em uma concentração de cerca de 4 Lf/ml a cerca de 8 Lf/ml, por exemplo, 4 Lf por dose de 0,5 ml.

10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o toxoide difté- rico está presente em uma concentração de cerca de 20 a cerca de 50 Lf/ml, por exemplo, 25 Lf por dose de 0,5 ml.

11. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o toxoide te- tânico está presente em uma concentração de cerca de 5 a cerca de 10 Lf por dose de 0,5 ml.

12. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o toxoide dif- térico e o toxoide tetânico estão presentes em uma proporção de to- xoide diftérico:toxoide tetânico que é maior que 1, por exemplo, entre 2:1 e 3:1 (medida em unidades Lf), tal como 2,5:1.

13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o toxoide dif- térico e o toxoide tetânico estão presentes em uma proporção de to- xoide tetânico:toxoide diftérico que é maior que 1, por exemplo, entre 1,5:1 e 2,5:1 (medida em unidades Lf), tal como 2:1.

14. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que a composi- ção imunogênica contém um adjuvante.

15. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a composi- ção imunogênica contém um adjuvante do tipo sal de alumínio.

16. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a composi- ção é uma solução ou suspensão líquida injetável.

17. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a composi- ção é liofilizada.

18. Composições imunogênicas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizadas pelo fato de que a com- posição é livre de conservantes.

19. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a composi- ção é uma vacina.

20. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a composi- ção é para administração a um ser humano.

21. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a composi- ção é para uso como um medicamento.

22. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que é para uso no aumento da resposta imunológica em um paciente, compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

23. Composição imunogênica de acordo com a reivindica- ção 22, caracterizada pelo fato de que é para uso no aumento da res- posta imunológica em um paciente contra Corynebacterium diphtheri- ae, Clostridium tetani e Bordetella pertussis.

24. Uso de uma composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento e/ou uma vacina e/ou um kit para aumentar uma resposta imunológica em um paciente e/ou para o tratamento de uma doença causada por um ou mais dentre Coryne- bacterium diphtheriae, Clostridium tetani e Bordetella pertussis.

25. Invenção, que está sob qualquer forma das suas con- cretizações ou em qualquer categoria de reivindicação que se possa reivindicar, por exemplo, produto, ou processo, ou uso abrangido pelo objeto inicialmente descrito, revelado, ou ilustrado no pedido de paten- te,

[1] kit, compreendendo um primeiro componente com- preendendo o componente OMV e um segundo componente compre- endendo (a) antígenos de pertússis acelulares, (b) um toxoide tetânico, (c) um toxoide diftérico; em que os dois componentes estão em recipi- entes separados (por exemplo, frascos e/ou seringas), e/ou compre- endendo uma composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21,

[2] processo para preparação de uma composição imu- nogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, compreendendo misturar um primeiro componente compreendendo a vesícula de membrana externa (OMV) e um segundo componente compreendendo o antígeno de pertússis acelular, o toxoide tetânico e o toxoide diftérico, em que preferencialmente a OMV no primeiro com- ponente é liofilizada e o segundo componente compreende antígenos está na forma aquosa, sendo que o dito processo pode compreender ainda a etapa adicional de reconstituição da OMV liofilizada no primei- ro componente com os antígenos aquosos do segundo componente,

[3] uso de (a) vesículas de membrana externa (OMVs), (b) um antígeno de pertússis acelular, (c) um toxoide tetânico e (d) um toxoide diftérico, em que as OMVs são derivadas de uma cepa de Bordetella pertussis expressando um toxoide pertussígeno genetica- mente destoxificado, particularmente o toxoide pertussígeno geneti- camente destoxificado PT 9K/129G, caracterizada pelo fato de que é na preparação de uma composição e/ou um medicamento e/ou uma vacina e/ou um kit para aumentar uma resposta imunológica em um paciente e/ou para o tratamento de uma doença causada por um ou mais dentre Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani e Borde- tella pertussis.