KR101329374B1 - 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 항원을 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 일부 실시양태에서 하나 이상의 개질된 연결기를 포함한다.

Description

면역자극성 올리고뉴클레오타이드{IMMUNOSTIMULATORY OLIGONUCLEOTIDES}
본 발명은 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
박테리아 DNA는 B 세포 및 천연 킬러 세포(natural killer cell)를 활성화하는 면역 자극 효과를 갖지만, 척추동물 DNA는 그렇지 않다([Tokunaga, T., et al., 1988. Jpn. J. Cancer Res. 79:682-686]; [Tokunaga, T., et al., 1984, JNCI 72:955-962]; [Messina, J.P., et al., 1991, J. Immunol. 147:1759-1764]; 및 [Krieg, 1998, In: Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein and A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448]). 박테리아 DNA의 이러한 면역 자극 효과는 특히 염기 내용에서 메틸화되지 않은 CpG 다이뉴클레오타이드(CpG 모티프)의 존재의 결과이고, 이는 박테리아에서는 흔하지만 척추동물 DNA에서는 메틸화되고 불충분하게 표시된다([Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549]; [Krieg, 1999 Biochim. Biophys. Acta 1489:107-116]). 박테리아 DNA의 면역 자극 효과는 이들 CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)를 이용하여 흉내내질 수 있다. 이런 CpG ODN은 B 세포 증식; 사이토카인 및 면역글로불린 분비; 천연 킬러(NK) 세포 용균 활성 및 IFN-γ 분비; 및 수지상(dendritic) 세포(DC) 및 동시자극 분자를 발현하고 사이토카인, 특히 Th1-형 T 세포 반응의 전개를 자극하는데 중요한 Th1-형 사이토카인을 분비하는 다른 항원 제시 세포의 활성화를 비롯하여 인간 및 뮤린(murine) 백혈구에 매우 자극성인 효과를 갖는다. 천연 포스포다이에스터 주쇄 CpG ODN의 이들 면역 자극 효과는, CpG 모티프가 메틸화되거나, GpC로 변화되거나, 또는 다르게 제거되거나 변화되면 이 효과가 극적으로 감소된다는 면에서, 매우 CpG 특이적이다([Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549]; [Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10]).
CpG 올리고뉴클레오타이드의 면역자극 활성은 CpG 모티프의 수, CG 다이뉴클레오타이드 측면(flanking)의 서열, CpG 모티프의 위치 및 CpG 모티프 사이의 간격에 의존하는 것으로 이전에 보고되어 왔다([Ballas et al., 1996, , J. Immunol. 157(5): 1840-5]; [Hartmann et al., 2000, J. Immunol., 164(3): 1617-24]; [Klinman et al., 2003, Clin. Exp. Immunol., 133(2): 227-32]). 3' CpG 모티프가 제거된 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 놀랍게도 그의 면역자극 활성을 유지하는 것으로 본원에 개시되어 있다. 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 항원을 포함하는 백신, 및 이런 백신의 이용 방법이 추가로 개시되어 있다.
본 발명의 한 양태에서, 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (서열 번호:1)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 개질된 연결기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오타이드간 연결은 포스포로티오에이트 연결기이다. 일부 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 친유성 치환된 뉴클레오타이드 유사체 및 피리미딘-퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 양태에서, 항원 및 서열 번호:1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 백신이 제공된다. 일부 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 효과량으로 존재한다. 다른 실시양태에서, 유도된 항원-특이적 면역 반응은 Th1 면역 반응이다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물 항원, 자가 항원 또는 중독성 물질이다. 다른 실시양태에서, 박테리아 항원은 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)와 관련되어 있거나, 또는 박테리아 항원은 충치를 야기하는 박테리아와 관련되어 있다. 추가의 실시양태에서, 박테리아는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus sanguis), 락토바실러스 아시도필리스(Lactobacillus acidophilis) 또는 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)이다. 다른 실시양태에서, 박테리아 항원은 치주 질환을 야기하는 박테리아와 관련되어 있다. 추가의 실시양태에서, 박테리아는 포피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 또는 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 항원은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 단순 포진 바이러스 1, 단순 포진 바이러스 2, 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1) 또는 HIV-2와 관련되어 있다. 다른 실시양태에서, 기생충 항원은 말라리아를 일으키는 기생충과 관련되어 있다. 일부 실시양태에서, 자가 항원은 종양 항원, 알츠하이머병과 관련된 항원, 인간 항체에 대한 항원, 또는 인간 내인성 레트로바이러스 요소로부터 발현되는 항원이다. 추가의 실시양태에서, 종양 항원은 HER2, MAGE, NYESO, PSA, CEA 또는 EGFR의 변이체 형태이다. 다른 실시양태에서, 항원이 알츠하이머병과 관련되어 있는 경우, 항원은 타우(tau) 또는 β-아밀로이드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 IgE이다. 일부 실시양태에서, 항원은 담체에 컨쥬게이트되어 있는 니코틴 합텐(hapten)이다. 추가의 실시양태에서, 니코틴 합텐이 컨쥬게이트되어 있는 담체는 디프테리아 독소(DT)이다. 다른 실시양태에서, 항원은 펩타이드, 재조합 단백질, 정제된 단백질, 전체 사멸된 병원균, 살아있는 약독화된 바이러스 또는 바이러스 벡터, 살아있는 약독화된 박테리아 또는 박테리아 벡터, 폴리사카라이드, 합텐이거나 또는 플라스미드 DNA에 의해 인코딩된다.
일부 실시양태에서, 항원은 담체에 컨쥬게이트되어 있다. 추가의 실시양태에서, 담체는 디프테리아 독소(DT)이다. 다른 실시양태에서, 담체는 바이러스류 입자이다. 추가의 실시양태에서, 바이러스류 입자는 RNA 파지 Q-β, B형 간염 표면 항원(HBsAg) 또는 B형 간염 코어 항원(HBcAg)이다. 일부 실시양태에서, 백신은 하나 이상의 아쥬방트(adjuvant)를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 아쥬방트는 TLR9가 아닌 Toll-류 수용체(TLR)이다. 다른 실시양태에서, 작용제는 TLR 3을 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, TLR 3 작용제는 안정화된 폴리I:C이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 TLR 4를 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, TLR 4 작용제는 리포폴리사카라이드(LPS)의 유도체이다. 추가의 실시양태에서, LPS 유도체는 MPL 또는 GLA이다. 다른 실시양태에서 작용제는 TLR 5를 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, TLR 5 작용제는 플라겔린(flagellin)이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 TLR 7 또는 8을 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, TLR 7 또는 8 작용제는 이미다조퀴놀린 계열의 작은 분자이다. 다른 실시양태에서, 아쥬방트는 알루미늄 염이다. 추가의 실시양태에서, 알루미늄 염은 알루미늄 하이드록사이드이다. 일부 실시양태에서, 아쥬방트는 면역 자극성 복합체(ISCOM)이다. 다른 실시양태에서, 아쥬방트는 수중유 또는 유중수 유화제이다. 일부 실시양태에서, 아쥬방트는 리포솜이다. 다른 실시양태에서, 아쥬방트는 전달 시스템이다. 추가의 실시양태에서, 전달 시스템은 나노입자 또는 미세입자이다.
일부 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 개질된 연결기를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오타이드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다. 일부 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 친유성 치환된 뉴클레오타이드 유사체 및 피리미딘-퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 백신은 투여를 위해 배합된다. 추가의 실시양태에서, 백신은 근육내, 피하, 피내, 정맥내 또는 복강내인 비경구 경로를 통한 투여를 위해 배합된다. 또다른 실시양태에서, 백신은 피부, 경피 또는 점막 표면인 국소 경로를 통한 투여를 위해 배합된다. 추가의 실시양태에서, 점막 경로는 경구, 비강내, 질내, 직장내, 협측내 또는 안내이다.
본 발명의 일부 양태에서, 치료를 필요로 하는 대상에서 항원-특이적 면역반응을 유도하는 방법은 대상에서 항원-특이적 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양의 서열 번호:1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 항원을 대상에게 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 미생물 항원, 자가 항원 또는 중독성 물질이다. 추가의 실시양태에서, 미생물 항원은 박테리아 항원, 바이러스 항원 또는 기생충 항원이다. 다른 실시양태에서, 박테리아 항원은 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)와 관련되어 있거나, 또는 박테리아 항원은 충치를 야기하는 박테리아와 관련되어 있다. 추가의 실시양태에서, 박테리아는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus sanguis), 락토바실러스 아시도필리스(Lactobacillus acidophilis) 또는 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)이다. 다른 실시양태에서, 박테리아 항원은 치주 질환을 야기하는 박테리아와 관련되어 있다. 추가의 실시양태에서, 박테리아는 포피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 또는 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 항원은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 단순 포진 바이러스 1, 단순 포진 바이러스 2, 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1) 또는 HIV-2와 관련되어 있다. 다른 실시양태에서, 기생충 항원은 말라리아를 일으키는 기생충과 관련되어 있다. 일부 실시양태에서, 자가 항원은 종양 항원, 알츠하이머병과 관련된 항원, 인간 항체에 대한 항원, 또는 인간 내인성 레트로바이러스 요소로부터 발현되는 항원이다. 추가의 실시양태에서, 종양 항원은 HER2, MAGE, NYESO, PSA, CEA 또는 EGFR의 변이체 형태이다. 다른 실시양태에서, 항원이 알츠하이머병과 관련되어 있는 경우, 항원은 타우(tau) 또는 β-아밀로이드이다. 일부 실시양태에서, 항원은 IgE이다. 일부 실시양태에서, 항원은 담체에 컨쥬게이트되어 있는 니코틴 합텐이다. 추가의 실시양태에서, 니코틴 합텐이 컨쥬게이트되어 있는 담체는 디프테리아 독소(DT)이다. 다른 실시양태에서, 항원은 펩타이드, 재조합 단백질, 정제된 단백질, 전체 사멸된 병원균, 살아있는 약독화된 바이러스 또는 바이러스 벡터, 살아있는 약독화된 박테리아 또는 박테리아 벡터, 폴리사카라이드, 합텐이거나 또는 플라스미드 DNA에 의해 인코딩된다.
일부 실시양태에서, 항원은 담체에 컨쥬게이트되어 있다. 추가의 실시양태에서, 담체는 디프테리아 독소(DT)이다. 다른 실시양태에서, 담체는 바이러스류 입자이다. 추가의 실시양태에서, 바이러스류 입자는 RNA 파지 Q-β, B형 간염 표면 항원(HBsAg) 또는 B형 간염 코어 항원(HBcAg)이다. 일부 실시양태에서, 백신은 하나 이상의 아쥬방트를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 아쥬방트는 TLR9가 아닌 Toll-류 수용체(TLR)이다. 다른 실시양태에서, 작용제는 TLR 3을 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, TLR 3 작용제는 안정화된 폴리I:C이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 TLR 4를 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, TLR 4 작용제는 리포폴리사카라이드(LPS)의 유도체이다. 추가의 실시양태에서, LPS 유도체는 MPL 또는 GLA이다. 다른 실시양태에서 작용제는 TLR 5를 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, TLR 5 작용제는 플라겔린이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 TLR 7 또는 8을 위한 것이다. 추가의 실시양태에서, TLR 7 또는 8 작용제는 이미다조퀴놀린 계열의 작은 분자이다. 다른 실시양태에서, 아쥬방트는 알루미늄 염이다. 추가의 실시양태에서, 알루미늄 염은 알루미늄 하이드록사이드이다. 일부 실시양태에서, 아쥬방트는 면역 자극성 복합체(ISCOM)이다. 다른 실시양태에서, 아쥬방트는 수중유 또는 유중수 유화제이다. 일부 실시양태에서, 아쥬방트는 리포솜이다. 다른 실시양태에서, 아쥬방트는 전달 시스템이다. 추가의 실시양태에서, 전달 시스템은 나노입자 또는 미세입자이다.
일부 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 개질된 연결기를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오타이드의 모든 뉴클레오타이드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다. 일부 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 친유성 치환된 뉴클레오타이드 유사체 및 피리미딘-퓨린 다이뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 및/또는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 투여를 위해 배합된다. 추가의 실시양태에서, 항원 및/또는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 근육내, 피하, 피내, 정맥내 또는 복강내인 비경구 경로를 통한 투여를 위해 배합된다. 또다른 실시양태에서, 항원 및/또는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 피부, 경피 또는 점막 표면인 국소 경로를 통한 투여를 위해 배합된다. 추가의 실시양태에서, 점막 경로는 경구, 비강내, 질내, 직장내, 협측내 또는 안내이다. 일부 실시양태에서 항원 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 동일하거나, 유사하거나, 상이한 경로를 통해 투여된다. 다른 실시양태에서, 항원 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 함께, 동시에 또는 따로따로 투여된다. 추가의 실시양태에서 항원 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 서로 24시간 이내에 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상은 수의사에 의해 치료되는 종이다. 다른 실시양태에서, 대상은 비-설치류 대상이다. 일부 실시양태에서, 대상은 인간이다.
도 1은 마우스에서 체액 면역 반응의 증대에 관한 것이다. 성체(6 내지 8주; n = 10/군) 마우스를 아쥬방트 없이 또는 CPG 24555, 10103 또는 7909 (10㎍) 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137 (10㎍; OVA 단독)과 조합된 1㎍의 HBsAg(왼쪽 패널) 또는 20㎍의 OVA(오른쪽 패널)로 면역접종시켰다. 최종 부스팅한지 2주 후(HBsAg의 경우) 또는 1주 후(OVA의 경우)의 혈장을 항원-특이적 총 IgG, IgG1 및 IgG2a/c 수준(항-HBs 또는 항-OVA)에 대해 분석하였다. 각각의 막대는 총 IgG에 대한 기하학적 평균(± SEM) 역가를 나타낸다. 역가는 비-면역 혈청의 2배의 흡광값을 생성하는 가장 높은 희석으로 정의되고 0.05의 컷-오프 값을 갖는다. 각각의 막대 상의 숫자는 항원 특이적 IgG2a(또는 2c)/IgG1의 비를 나타낸다.
도 2는 마우스에서 유도된 체액 면역 반응의 성질에 관한 것이다. 성체(6 내지 8주; n = 10/군) 마우스를 아쥬방트 없이 또는 CPG 24555, 10103 또는 7909 (10㎍) 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137 (10㎍; OVA 단독)과 조합된 1㎍의 HBsAg(왼쪽 패널) 또는 20㎍의 OVA(오른쪽 패널)로 면역접종시켰다. 최종 부스팅한지 2주 후(HBsAg의 경우) 또는 1주 후(OVA의 경우)의 혈장을 HBsAg(항-HBs) 또는 OVA(항-OVA)에 대한 IgG1(투명한 막대) 및 IgG2a 또는 IgG2c(흑색 막대) 수준에 대해 평가하였다. 각각의 막대는 전체 군(n=10)에 대한 ELISA 종말 점 희석 역가의 기하학적 평균(± SEM)을 나타낸다. 역가는 비-면역 혈청의 2배의 흡광값을 생성하는 가장 높은 희석으로 정의되고 0.05의 컷-오프 값을 갖는다.
도 3은 마우스에서 유도된 세포독성 T 림프구 반응을 나타낸다. 성체(6 내지 8주; n = 5/군) 마우스를 아쥬방트 없이 또는 CPG 24555, 10103 또는 7909 (10㎍) 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137 (10㎍; OVA 단독)과 조합된 1㎍의 HBsAg(왼쪽 패널) 또는 20㎍의 OVA(오른쪽 패널)로 면역접종시켰다. 최종 부스팅한지 2주 후(HBsAg의 경우) 또는 1주 후(OVA의 경우)의 비장세포를 표준 51Cr 방출 분석을 이용한 항원 특이적 CTL 반응에 대해 분석하였다.
도 4는 TLR9 결핍 마우스에서 CTL 반응에서 CpG 매개된 증대가 없음을 나타낸다. TLR 결핍 마우스(6 내지 8주; n = 5/군)를 아쥬방트 없이 또는 CPG 24555, 10103 또는 7909 (10㎍) 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137 (10㎍)과 조합된 20㎍의 OVA로 면역접종시켰다. 최종 부스팅한지 1주 후의 비장세포를 표준 51Cr 방출 분석을 이용한 OVA 특이적 CTL 반응에 대해 분석하였다.
도 5는 야생형 대 TLR9 결핍 마우스에서 OVA 특이적 CD8 T 세포를 나타낸다. 야생형 및 TLR 결핍 성체 마우스(6 내지 8주; n = 5/군)를 아쥬방트 없이 또는 CPG 24555, 10103 또는 7909 (10㎍) 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137 (10㎍)과 조합된 20㎍의 OVA로 면역접종시켰다. 최종 부스팅한지 1주 후의 비장세포를 MHC 클래스 I H-2Kb -SIINFEKL 사량체를 이용한 OVA 특이적 CD8 T 세포에 대해 분석하였다.
도 6은 마우스에서의 항원 특이적 IFN-g 분비를 보여준다. 성체(6 내지 8주; n = 5/군) 마우스를 아쥬방트 없이 또는 CPG 24555, 10103 또는 7909 (10㎍) 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137 (10㎍; OVA 단독)과 조합된 1㎍의 HBsAg(왼쪽 패널) 또는 20㎍의 OVA(오른쪽 패널)로 면역접종시켰다. 최종 부스팅한지 2주 후(HBsAg의 경우) 또는 1주 후(OVA의 경우)의 비장세포를 72시간동안 도면에 도시된 바와 같이 관련 항원으로 자극하고, 배양 상층액을 ELISA로 IFN-γ에 대해 분석하였다.
도 7은 TLR9 결핍 마우스에서 항원 특이적 IFN-g 분비에서의 CpG 매개된 증대가 없음을 나타낸다. TLR9 결핍 마우스(6 내지 8주; n = 5/군)를 아쥬방트 없이 또는 CPG 24555, 10103 또는 7909 (10㎍) 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137 (10㎍; OVA 단독)과 조합된 20㎍의 OVA로 면역접종시켰다. 최종 부스팅한지 1주 후의 비장세포를 72시간동안 0, 0.5 및 1mg/ml의 농도의 OVA로 자극하고 배양 상층액을 ELISA로 IFN-γ에 대해 분석하였다.
도 8은 마우스에서 항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군을 나타낸다. 성체(6 내지 8주; n = 5/군) 마우스를 항원 단독으로 또는 CPG 24555, 10103 또는 7909 (10㎍)와 함께 1㎍의 HBsAg로 면역반응시켰다. 부스팅한지 2주 후의 비장세포를 HBsAg 항원(CD4의 경우) 또는 HBs I군 펩타이드(CD8의 경우) 및 CD4(패널 A) 및 CD8(패널 B)로 다시 자극하고, IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 T 세포 개체군을 유동 세포계측기를 이용하여 정량하였다.
도 9는 인간 PBMC에서의 선천적인 면역성을 나타낸다. 인간 PBMC (5x106/ml)를 다양한 농도의 CPG 10103, CPG 24555 또는 비-CpG 대조군 ODN 22881과 함께 24시간 또는 48시간동안 배양하였다. 세포 상층액을 수집하고 상업적인 ELISA 키트를 이용하여 사이토카인/케모카인 분비에 대해 분석하였다. 도 9a는 IFN-α, MCP-1 및 IP-10 분비를 보여준다. 도 9b는 IL-6, IL-10 및 IL-2R 분비를 보여준다.
도 10은 BALB/c 마우스에서의 생체내 선천적 면역성을 나타낸다. BALB/c 마우스에 PBS(위약 대조군), CPG 24555, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137을 100㎍ 투여 수준으로 피하 주사하였다. 주사한지 3시간 후에 동물에서 채혈하고, 혈장을 상업적 ELISA를 이용하여 IP-10(도 10a) 및 IL-12(도 10b) 또는 IL-6(도 10c)에 대해 분석하였다.
도 11은 BALB/c 마우스에서의 생체 내 체액 면역성을 보여준다. BALB/c 마우스를 HBsAg (1㎍) ± CPG 24555 또는 10103 (10㎍), OVA (20㎍) ± CPG 24555 또는 10103 (10㎍), 또는 Texas 1/77의 인플루엔자 A HA, H3N2 (1㎍) + 알룸(alum) (25㎍ Al3+) ± CPG 24555 또는 10103 (10㎍)으로 근육내 면역접종하였다. 마우스를 제0일 및 제14일(HBsAg), 제0일, 제7일 및 제21일(OVA) 또는 단지 제0일(HA)에 면역접종하였다. 도 11a는 최종점 ELISA에 의해 측정된 부스팅 2주 후의 HBsAg 특이적 총 IgG 역가를 보여준다. 도 11b는 최종 부스팅 1주 후에 OVA 특이적 총 IgG 역가를 나타낸다. 도 11c는 최종점 ELISA에 의해 측정된 면역후의 다양한 시점에서 HA 특이적 총 IgG의 동역학을 보여준다.
도 12는 BALB/c 마우스에서의 T 세포 반응을 보여준다. BALB/c 마우스에HBsAg(1㎍)를 단독으로 또는 10㎍의 CPG ODN 2455, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 근육내 주사하였다. 마우스를 제0일 및 제14일에 주사하였다. 도 12a는 부스탕 2주일후에 51Cr 방출에 의해 측정된 HBsAg 특이적 CTL을 보여준다. C57bl/6 마우스에 OVA(20㎍)를 단독으로 또는 10㎍의 CPG ODN 2455, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 근육내 주사하였다. 마우스를 제0일, 제7일 및 제21일에 주사하였다. 도 12b는 최종 부스팅 1주 후에 51Cr 방출에 의해 측정된 OVA 특이적 총 CTL을 나타낸다.
도 13은 BALB/c 마우스에서의 T 세포 반응을 나타낸다. BALB/c 마우스에 HBsAg(1㎍)를 단독으로 또는 10㎍의 CPG ODN 2455, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 근육내 주사하였다. 마우스를 제0일 및 제14일에 주사하였다. 최종 부스팅 2주 후의 비장세포를 72시간동안 각각의 항원과 함께 배양하고, 배양 상청액을 ELISA에 의해 IFN-γ에 대해 시험하였다. C57bl/6 마우스에 OVA(20㎍)를 단독으로 또는 10㎍의 CPG ODN 2455, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 근육내 주사하였다. 마우스를 제0일, 제7일 및 제21일에 주사하였다. 최종 부스팅 1주 후의 비장 세포를 72시간동안 각각의 항원과 함께 배양하고, 배양 상청액을 ELISA에 의해 IFN-γ에 대해 시험하였다(도 13b).
도 14는 면역접종 6주 후의 항-HA를 나타낸다. 암컷 BALB/c 마우스를 50㎕의 총 체적 중의 HA (1㎍) ± CpG 또는 대조군 ODN (10㎍) ± 알룸(25㎍ Al3+)으로 면역접종하였다. 항-HA의 양을 면역접종한지 6주 후에 측정하였다.
도 15는 면역접종 4주 후의 헤마글루틴화 억제(HIA) 역가를 나타낸다. 헤마글루틴화 억제 분석(HIA)을 이용하여 항체의 작용성을 평가하였다. 단독으로 또는 알룸과 조합되어 HIA 역가를 증대시키는 능력을 측정하였다.
도 16은 HA-특이적 IFNγ 분비를 나타낸다. 암컷 BALB/c 마우스를 50㎕의 총 체적 중의 HA (1㎍) ± CpG 또는 대조군 ODN (10㎍) ± 알룸(25㎍ Al3+)으로 면역접종하였다. 면역접종 6주 후에 제거된 비장세포를 항원 특이적 IFNγ 분비에 대한 분석에 이용하였다.
도 17은 비-인간 영장류에서의 체액 반응을 나타낸다. 시아노몰구스(Cyanomolgus) 원숭이(3살 내지 5살; 1군당 5마리)에게 제0주, 제4주 및 제8주에 엔게릭스(Engerix)-B(10㎍의 HBsAg; 250㎍의 Al3 +)를 단독으로 또는 0.5mg의 CPG 7909 또는 CPG 24555와 함께 근육내 주사하여 면역접종시켰다. 동물을 일정한 시간 간격으로 채혈하고, 상업적으로 이용가능한 키트(MONOLISATM Anti-HBS)를 이용하여 HBsAg-특이적 항체 역가를 측정하였다.
도 18은 비-인간 영장류에서의 체액 반응을 나타낸다. 시아노몰구스 원숭이(3살 내지 5살; 1군당 5마리)에게 제0주, 제4주 및 제8주에 엔게릭스(Engerix)-B(10㎍의 HBsAg; 250㎍의 Al3 +)를 단독으로 또는 0.5mg의 CPG 7909 또는 CPG 24555와 함께 근육내 주사하여 면역접종시켰다. 2번째 면역접종 4주 후 및 3번째 면역접종 2주 후의 혈장을 나트륨 티오시아네이트 회피 방법을 이용한 항체 결합력(avidity)에 대해 분석하였다.
도 19는 비-인간 영장류에서 T 세포 반응을 나타낸다. 시아노몰구스 원숭이(3살 내지 5살; 1군당 5마리)에게 제0주, 제4주 및 제8주에 엔게릭스(Engerix)-B(10㎍의 HBsAg; 250㎍의 Al3 +)를 단독으로 또는 0.5mg의 CPG 7909 또는 CPG 24555와 함께 근육내 주사하여 면역접종시켰다. 백신접종 이전 및 백신접종 후 여러 시점에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 유동 세포계측기에 의해 HBsAg 특이적 CD4 T 세포 매개된 세포내 사이토카인 분비에 대해 시험하였다. 도 19a는 IFN-γ 분비를 나타낸다. 도 19b는 IL-2 분비를 나타낸다. 도 19c는 TNF-α 분비를 나타낸다.
도 20은 T 세포 반응: 다기능성 CD4 T 세포: 정량적 분석을 나타낸다. 시아노몰구스 원숭이(3살 내지 5살; 1군당 5마리)에게 제0주, 제4주 및 제8주에 엔게릭스(Engerix)-B(10㎍의 HBsAg; 250㎍의 Al3 +)를 단독으로 또는 0.5mg의 CPG 7909 또는 CPG 24555와 함께 근육내 주사하여 면역접종시켰다. 3번째 면역접종 2주 후의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 유동 세포계측기에 의해 1, 2 또는 3가지 사이토카인을 분비하는 HBsAg 특이적 CD4 T 세포에 대해 시험하였다. 도 20a는 분석된 백만개의 CD4 T 세포당 1, 2 또는 3가지 사이토카인을 분비하는 HBsAg 특이적 CD4 T 세포의 수를 나타낸다. 도 20b는 총 HBsAg 특이적 CD4 T 세포 개체군 내부에서 1종(single), 2종(double) 및 3종(triple) 사이토카인 생산 T 세포의 비율을 보여준다.
도 21은 T 세포 반응: 다기능성 CD4 T 세포: 정량적 분석을 나타낸다. IL-2, IFN-γ 및 TNFα 또는 이들 사이토카인의 조합을 분비하는 세포의 수를 측정하였다. 시아노몰구스 원숭이(3살 내지 5살; 1군당 5마리)에게 제0주, 제4주 및 제8주에 엔게릭스(Engerix)-B(10㎍의 HBsAg; 250㎍의 Al3 +)를 단독으로 또는 0.5mg의 CPG 7909 또는 CPG 24555와 함께 근육내 주사하여 면역접종시켰다. 3번째 면역접종 2주 후의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 유동 세포계측기에 의해 IL-2, IFN-γ 및 TNFα, 또는 이들 사이토카인의 조합을 분비하는 HBsAg 특이적 CD4 T 세포에 대해 시험하였다.
서열의 설명
서열 번호 1: 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 ODN CPG 24555의 뉴클레오타이드 서열.
서열 번호 2: 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 CPG 10103의 뉴클레오타이드 서열.
서열 번호 3: 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 CPG 7909의 뉴클레오타이드 서열.
서열 번호 4: 비-CpG 올리고뉴클레오타이드 22881의 뉴클레오타이드 서열.
서열 번호 5: 비-CpG 올리고뉴클레오타이드 2137의 뉴클레오타이드 서열.
본 발명의 양태는 부분적으로 면역자극성 올리고뉴클레오타이드로부터 CpG 모티프를 제거하는 것이 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 항원-특이적 면역 반응을 증대시키는 능력에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 놀라운 발견에 근거한다. 놀랍게도 상기 CpG 모티브를 제거하면 상이한 항원-특이적 T 세포 개체군의 생성이 허용되는 것으로 발견되었다. 특히 상기 항원-특이적 T 세포 개체군이 더 많은 IFN-감마 분비 T 세포 및 보다 많은 다기능성 T 세포를 포함하는 것으로 발견되었다.
본 발명의 양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 핵산 서열 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'(ODN CPG 24555; 서열 번호:1)을 갖는다. 서열 번호:1의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 핵산 서열은 가장 3'쪽의 CG 다이뉴클레오타이드가 반전되어 있다는 점에서 이전에 보고된 면역자극성 올리고뉴클레오타이드(ODN 10103) 5'TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3'(서열 번호:2)와 상이하다. 2가지의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 사이의 활성에서의 유사성은 놀라운데, CpG 올리고뉴클레오타이드의 면역자극성 활성이 CpG 모티프의 수, CG 다이뉴클레오타이드 양쪽의 서열, CpG 모티프의 위치 및 CpG 모티프 사이의 간격에 의존하는 것으로 이전에 보고되었기 때문이다([Ballas et al., 1996, , J. Immunol. 157(5): 1840-5]; [Hartmann et al., 2000, J. Immunol., 164(3): 1617-24]; [Klinman et al., 2003, Clin. Exp. Immunol., 133(2): 227-32]). 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 CPG ODN 24555 (서열 번호:1)에서 가장 3'쪽의 CG 다이뉴클레오타이드를 제거하였더니 이전의 논의에서 예상된 것처럼 이 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 항원-특이적 면역 반응을 증대시키는 능력에 부정적인 영향을 미치지는 않았다. CPG ODN 24555는 CPG ODN 10103과 비교하였을 때 유사한, 일부 경우에는 개선된, 면역자극성 활성을 입증하였다.
또한, CPG ODN 24555는 CPG ODN 10103과 비교하였을 때 항원-특이적 T 세포의 다른 개체군을 유도하는 것으로 발견되었다(도 8, 표 1 및 표 2 참조). 특히, 놀랍게도 아쥬방트로서 CPG ODN 24555를 이용하여 생성된 항원-특이적 T 세포 개체군(특히 항원-특이적 CD4+ T 세포 개체군)이 CPG ODN 10103 또는 CPG ODN 7909를 이용하여 생성된 항원-특이적 T 세포 개체군에 비해 보다 많은 IFN-감마 분비 T 세포 및 보다 많은 다기능성 T 세포를 포함하는 것으로 발견되었다.
예를 들면 CpG ODN 10103을 이용하여 수득된 항원-특이적 CD4+ T 세포 개체군과 비교하였을 때 IFN-γ를 생성하는 보다 높은 비율의 항원-특이적 CD4+ T 세포가 수득되었다. 또한, CPG ODN 10103 또는 CPG ODN 7909를 이용하여 수득된 항원-특이적 CD4+ T 세포 개체군과 비교하였을 때 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두, IFN-γ 및 IL-2 둘 모두, 또는 TNF-α 및 IL-2 둘 모두를 생성하는 다기능성 항원-특이적 CD4+ T 세포 개체군을 보다 높은 비율로 수득하였거나, 심지어는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-12를 분비하는 3종 생산자가 또한 수득되었다. 또한, CPG ODN 10103을 이용하여 수득된 항원-특이적 CD8+ T 세포 개체군과 비교하였을 때 TNF-α를 생성하는 다기능성 항원-특이적 CD4+ T 세포 개체군을 보다 높은 비율로 수득하였다. CPG ODN 10103 또는 CPG ODN 7909를 이용하여 수득된 항원-특이적 CD8+ T 세포 개체군과 비교하였을 때 IFN-γ 및 IL-2 둘 모두, 또는 TNF-α 및 IL-2 둘 모두를 생성하는 다기능성 항원-특이적 CD8+ T 세포 개체군을 보다 높은 비율로 수득하였거나, 심지어는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-12를 분비하는 3종 생산자가 또한 수득되었다.
면역원성에서 T 세포의 다기능성의 중요성이 최근 강조되어 왔다. 특히 케모카인 생산(예를 들면 IFN-γ, TNF-α 및 IL-12)의 측면에서 항원 특이적 T 세포의 다기능성이 일부 경우에 이들의 보호 능력과 관련된(예를 들면 [Harari A, et al., Immunol Rev. 2006;211:236-54], [Makedonas G and Betts MR. Springer Semin Immunopathol. 2006;28(3):209-19], [Precopio ML et al., J Exp Med. 2007 204(6):1405-16], [Xu R et al. Vaccine. 2008; 26(37):4819-29] 참조) 것은 1종 사이토카인을 분비하는 T 세포와 비교하였을 때 이들의 더 우수한 기능기 작용에 기인한 것으로 생각된다.
CPG ODN 24555는 유리하게는 백신 설정에서 중요할 수 있는 아쥬방트로서 이용될 경우 다기능성 항원-특이적 T-세포 개체군의 생성을 허용한다.
면역자극성 핵산은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 일반적으로, 이중 가닥 분자는 생체 내에서 보다 안정하지만, 단일 가닥 분자는 증가된 면역 활성을 갖는다. 본 발명의 일부 양태에서는 핵산이 단일 가닥인 것이 바람직하고, 다른 양태에서는 핵산이 이중 가닥인 것이 바람직하다.
용어 "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 본원에서 여러 뉴클레오타이드(즉, 포스페이트 기 및 치환된 피리미딘(예를 들면 사이토신(C), 티미딘(T) 또는 우라실(U)) 또는 치환된 푸린(예를 들면 아데닌(A) 또는 구아닌(G))중 하나인 교환가능한 유기 염기에 연결된 당(예를 들면 라이보스 또는 데옥시라이보스)을 포함하는 분자)를 의미하기 위해 서로 교환가능하게 이용된다. 본원에서 이용되는 바와 같이 용어들은 올리고데옥시라이보뉴클레오타이드, 올리고라이보뉴클레오타이드(즉, 폴리뉴클레오타이드에서 포스페이트 제거), 및 임의의 다른 유기 염기 함유 중합체를 의미한다. 핵산 분자는 현존하는 핵산 공급원(예를 들면 게놈 또는 cDNA)으로부터 수득될 수 있지만, 바람직하게는 합성(예를 들면 핵산 합성에 의해 생산됨)이다.
발명의 양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 천연 RNA 및 DNA에 비해 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 가교, β-D-라이보스 단위 및/또는 천연 뉴클레오사이드 염기(아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 우라실)를 비롯한 다양한 화학적 개질 및 치환을 포함할 수 있다. 화학적 개질의 예는 당 분야의 숙련자들에게 공지되어 있고, 예를 들면 [Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA 1993]; [Crooke, S.T. et al. (1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129]; 및 [Hunziker J. et al., (1995), Mod. Synth. Methods 7:331-417]에 개시되어 있다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드는 천연 DNA 또는 RNA로 구성된 동일한 서열의 올리고뉴클레오타이드와 비교하였을 때 각각의 개질이 특정한 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 가교 및/또는 특정한 β-D-리보스 단위 및/또는 특정한 천연 뉴클레오사이드 염기 위치에 위치한 하나 이상의 개질을 가질 수 있다.
본 발명의 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 개질을 포함할 수 있다. 이런 개질은 a) 뉴클레오사이드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간의 개질된 뉴클레오사이드간 가교에 의한 대체, b) 뉴클레오사이드의 3' 및/또는 5' 말단에 위치한 포스포다이에스터 가교의 데포스포 가교로의 대체, c) 당 포스페이트 주쇄에서 나온 당 포스페이트 단위의 다른 단위로의 대체, d) β-D-리보스 단위의 개질된 당 단위로의 대체, 및 e) 천연 뉴클레오사이드 염기의 대체에서 선택될 수 있다.
핵산은 또한 치환된 푸린 및 피리미딘, 예를 들면 C-5 프로핀, 피리미딘 및 7-데아자-7-치환된 푸린 개질된 염기([Wagner et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:840-4])를 포함한다. 푸린 및 피리미딘은 아데닌, 사이토신, 구아닌, 티미딘, 5-메틸사이토신, 2-아미노푸린, 2-아미노-6-클로로푸린, 2,6-다이아미노푸틴, 하이포잔틴 및 다른 천연 및 비-천연 발생 핵염기, 치환되고 비치환된 방향족 잔기를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 다른 이런 개질은 당 분야의 숙련자들에게 잘 공지되어 있다.
개질된 염기는 DNA 및 RNA에서 전형적으로 발견되는 천연 발생 염기, 예를 들면 T, C, G, A 및 U와 화학적으로 상이하지만, 이들 천연 발생 염기와 기본적인 화학적 구조를 공유하는 임의의 염기이다. 개질된 뉴클레오사이드 염기는 예를 들면 하이포잔틴, 다이하이드로우라실 슈도우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-아미노우라실, 5-(C1-C6)-알킬우라실, 5-(C2-C6)-알켄일우라실, 5-(C2-C6)-알킨일우라실, 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-하이드록시사이토신, 5-(C1-C6)-알킬사이토신, 5-(C2-C6)-알켄일사이토신, 5-(C2-C6)-알킨일사이토신, 5-클로로사이토신, 5-플루오로사이토신, 5-브로모사이토신, N2-다이메틸구아닌, 2,4-다이아미노푸린, 8-아자푸린, 치환된 7-데아자푸린, 바람직하게는 7-데아자-7-치환된 및/또는 7-데아자-8-치환된 푸린, 5-하이드록시메틸사이토신, N4-알킬사이토신(예를 들면, N4-에틸사이토신), 5-하이드록시티옥시사이토신, 5-하이드록시메틸데옥시사이티딘, N4-알킬데옥시사이티딘 (예를 들면 N4-에틸데옥시사이티딘), 6-티오데옥시구아노신, 니트로피롤의 데옥시라이보뉴클레오사이드, C5-프로핀일피리미신, 다이아미노푸린(예를 들면 2,6-다이아미노푸린), 이노신, 5-메틸사이토신, 2-아미노푸린, 2-아미노-6-클로로푸린, 하이포잔틴 또는 천연 뉴클레오사이드 염기의 다른 개질에서 선택될 수 있다. 이 목록은 예시이고, 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 발명의 일부 양태에서, 본원에 개시된 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 CpG 다이뉴클레오타이드는 바람직하게는 비메틸화된다. 비메틸화된 CpG 모티프는 비메틸화된 사이토신-구아닌 다이뉴클레오타이드 서열(즉, 비메틸화된 5' 사이토신에 이은 3' 구아노신, 포스페이트 결합에 의해 연결됨)이다. 다른 양태에서, CpG 모티프는 메틸화되어 있다. 메틸화된 CpG 모티프는 메틸화된 사이토신-구아닌 다이뉴클레오타이드 서열(즉, 메틸화된 5' 사이토신에 이은 3' 구아니신, 포스페이트 결합에 의해 연결됨)이다.
본 발명의 일부 양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 개질된 사이토신을 함유할 수 있다. 개질된 사이토신은 올리고뉴클레오타이드의 면역자극 활성을 손상시키지 않고 사이토신을 대체할 수 있는 사이토신의 천연 발생 또는 비-천연 발생 피리미딘 염기 유사체이다. 개질된 사이토신은 5-치환된 사이토신(예를 들면 5-메틸-사이토신, 5-플루오로-사이토신, 5-클로로-사이토신, 5-브로모-사이토신, 5-요도-사이토신, 5-하이드록시-사이토신, 5-하이드록시메틸-사이토신, 5-다이플루오로메틸-사이토신 및 비치환되거나 치환된 5-알킨일-사이토신), 6-치환된 사이토신, N4-치환된 사이토신(예를 들면 N4-에틸-사이토신), 5-아자-사이토신, 2-머캅토-사이토신, 아이소사이토신, 슈도-아이소사이토신, 축합된 고리 시스템을 갖는 사이토신 유사체(예를 들면 N,N'-프로필렌 사이토신 또는 페녹사진)을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 바람직한 사이토신의 일부는 5-메틸-사이토신, 5-플루오로-사이토신, 5-하이드록시-사이토신, 5-하이드록시메틸-사이토신 및 N4-에틸-사이토신을 포함한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 사이토신 염기는 보편적 염기(예를 들면 3-니트로피롤, P-염기), 방향족 고리 시스템(예를 들면 플루오로벤젠 또는 다이플루오로벤젠) 또는 수소 원자(dSpacer)로 치환된다. 일부 양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 우라실 및/또는 이의 유도체(예를 들면 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-브로모비닐-우라실, 4-티오-우라실, 5-하이드록시-우라실, 5-프로핀일-우라실)를 함유할 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 개질된 구아닌을 함유할 수 있다. 개질된 구아닌은 올리고뉴클레오타이드의 면역자극 활성을 손상하지 않고 구아닌을 대체할 수 있는 천연 발생 또는 비-천연 발생 푸린 염기 유사체이다. 개질된 구아닌은 7-데아자구아닌, 7-데아자-7-치환된 구아닌, 하이포잔틴, N2-치환된 구아니(예를 들면 N2-메틸-구아닌), 5-아미노-3-메틸-3H,6H-티아졸로[4,5-d]피리미딘-2,7-다이온, 2,6-다이아미노푸린, 2-아미노푸린, 푸린, 인돌, 아데닌, 치환된 아데닌(예를 들면 N6-메틸-아데닌, 8-옥소-아데닌), 8-치환된 구아닌(예를 들면 8-하이드록시구아닌 또는 8-브로모구아닌) 및 6-티오구아닌을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 본 발명의 다른 양태에서, 구아닌 염기는 보편적 염기(예를 들면 4-메틸-인돌, 5-니트로-인돌 또는 K-염기), 방향족 고리 시스템(예를 들면 벤즈이미다졸 또는 다이클로로-벤즈이미다졸, 1-메틸-1H-[1,2,4]-트라이아졸-3-카복실산 아미드) 또는 수소 원자(dSpacer)에 의해 치환된다.
일부 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 개질된 뉴클레오타이드간 연결을 포함할 수 있다. 이들 개질된 연결은 부분적으로 분해에 대해 저항성일 수 있다(예를 들면 안정화된다). "안정화된 핵산 분자"는 생체 내 분해(예를 들면 엑소- 또는 엔도-뉴클레아제를 통해)에 비교적 저항성인 핵산 분자를 의미한다. 안정화는 길이 또는 2차 구조의 함수일 수 있다. 수만 내지 수십만베이스 염기 길이인 핵산은 비교적 생체 내 분해에 대해 저항성이다. 더 짧은 핵산의 경우, 2차 구조가 이들의 효과를 증가시키고 안정화시킨다. 스템 루프 구조의 형성은 핵산 분자를 안정화시킬 수 있다. 예를 들면 핵산의 3' 말단이 업스트림 영역에 대해 자가-상보성을 가지면 이는 다시 접혀서 스템 루프 구조를 형성할 수 있고, 그런 다음, 핵산이 안정화되어 보다 많은 활성을 나타낸다.
핵산 안정화는 또한 포스페이트 주쇄 개질을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서 포스포로티오에이트 연결기를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 최대 활성을 제공하고 올리고뉴클레오타이드를 세포내 헥소 및 엔도-뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호한다.
생체 내에서의 사용을 위해, 핵산은 바람직하게는 분해(예를 들면 엔도- 및 엑소-뉴클레아제를 통한)에 비교적 저항성이다. 생체 내에서 투여되었을 때 핵산 주쇄의 개질이 개선된 핵산의 활성을 제공함이 입증되었다. 2차 구조, 예를 들면 스템 루프는 분해에 대해 핵산을 안정화시킬 수 있다. 다르게는, 핵산 안정화는 포스페이트 주쇄 개질을 통해 달성될 수 있다. 바람직한 안정화된 핵산은 적어도 부분적인 포스포로티오에이트 개질된 주쇄를 갖는다. 포스포로티오에이트는 포스포로아미데이트 또는 H-포스포네이트 화학을 이용한 자동화된 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트는 예를 들면 미국 특허 제4,469,863호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있고; 알킬포스포트라이에스터(하전된 산소 잔기는 미국 특허 제5,023,243호 및 유럽 특허 제092,574호에 개시된 바와 같이 알킬화됨)는 상업적으로 이용가능한 시약을 이용한 자동화된 고상 합성에 의해 제조될 수 있다. 다른 DNA 주쇄 개질 및 치환 제조 방법이 개시되어 왔다([Uhlmann, E. and Peyman, A. (1990) Chem. Rev. 90:544]; [Goodchild, J. (1990) Bioconjugate Chem. 1:165]). CpG 모티프를 갖는 2'-O-메틸 핵산 또한 에톡시-개질된 CpG 핵산 처럼 면역 활성화를 야기한다. 실제로, CpG 효과를 완전히 파괴하는 주쇄 개질은 발견되지 않았지만, 이는 C를 5-메틸 C로 대체함으로써 현저히 감소된다. 포스포로티오에이트 연결기를 갖는 구축물은 최대 활성을 제공하고, 세포내 엑소- 및 엔도-뉴클레아제에 의한 분해로부터 핵산을 보호한다. 다른 개질된 핵산은 포스포다이에스터 개질된 핵산, 포스포다이에스터와 포스포로티오에이트 핵산의 조합, 메틸포스포네이트, 메틸포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, p-에톡시 및 이의 조합을 포함한다. 이들 조합 및 이들의 면역 세포에 대한 특정한 효과는 각각 PCT 공개 공보인 제PCT/US95/01570호 (WO 96/02555) 및 제PCT/US97/19791호 (WO 98/18810) 및 2001년 2월 27일자로 허여된 미국 특허 제6,194,388 B1호 및 2001년 5월 29일자로 허여된 미국 특허 제6,239,116 B1호에서 CpG 핵산에 대해 보다 자세하게 논의되어 있다. 이들 개질된 핵산은 개선된 뉴클레아제 저항, 증가된 세포 흡수, 증가된 단백질 결합 및/또는 변화된 세포내 국소화로 인해 보다 더 많은 자극 활성을 나타낼 수 있다.
생체 내 투여를 위해, 핵산은 표적 세포(예를 들면 B 세포, 단핵 세포, 천연 킬러(NK) 세포)에 대해 더 높은 친화성, 표면 및/또는 표적 세포에 의한 증가된 세포 흡수를 생성하여 "핵산 전달 복합체"를 형성하는 분자와 결합될 수 있다. 핵산은 당 분야에 잘 공지된 기법을 이용하여 적절한 분자와 이온 또는 공유 결합될 수 있다. 다양한 커플링제 또는 가교결합제를 이용할 수 있고, 예를 들면 단백질 A, 카보다이이미드 또는 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP)일 수 있다. 다르게는 핵산은 잘 공지된 기법을 이용하여 리포좀 또는 바이로좀으로 캡슐화될 수 있다.
다른 안정화된 핵산은 비이온성 DNA 유사체, 예를 들면 알킬- 및 아릴-포스페이트(여기서 하전된 포스포네이트 산소는 알킬 또는 아릴 기로 대체된다), 포스포다이에스터 및 알킬포스포트라이에스터(여기서, 하전된 산소 잔기는 알킬화된다)를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 어느 한 말단 또는 양 말단 모두에서 다이올, 예를 들면 테트라에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜을 함유하는 핵산 또한 뉴클레아제 분해에 실질적으로 저항성인 것으로 보인다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 친유성 치환된 뉴클레오타이드 유사체 및/또는 피리미딘-푸린 다이뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오타이드는 1개 또는 2개의 접근가능한 5' 단부를 가질 수 있다. 예를 들면 3'-3' 연결기를 통해 2개의 올리고뉴클레오타이드를 부착시켜 1 또는 2개의 접근가능한 5' 단부를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 생성함으로써 2개의 이런 5' 단부를 갖는 개질된 올리고뉴클레오타이드를 만드는 것이 가능하다. 3'3'-연결은 포스포다이에스터, 포스포로티오에이트 또는 임의의 다른 개질된 뉴클레오사이드간 가교일 수 있다. 이런 연결기를 달성하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들면 이런 연결기는 [Seliger, H. et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3' and 5'-5' internucleoti다이c linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleosides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77] 및 [Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735]에 개시되어 있다.
또한, 3' 말단 뉴클레오사이드 사이의 연결기가 포스포다이에스터, 포스포로티오에이트 또는 다른 개질된 가교가 아닌 3'3'-연결된 올리고뉴클레오타이드는 추가의 이격자, 예를 들면 트라이- 또는 테트라-에틸렌글리콜 포스페이트 잔기를 이용하여 제조될 수 있다([Durand, M. et al., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204], 미국 특허 제5,658,738호 및 미국 특허 제5,668,265호]). 다르게는, 비-뉴클레오타이드 연결기는 표준 포스포르아미다이트 화학을 이용하여 에탄다이올, 프로판다이올 또는 무염기 데옥시라이보스(dSpacer) 단위로부터 유래될 수 있다([Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical Recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7]). 비-뉴클레오타이드 연결기는 한번 또는 여러번 도입되거나 서로 조합되어 연결되는 2개의 올리고뉴클레오타이드의 3'단부 사이의 임의의 바람직한 간격을 허용할 수 있다.
뉴클레오사이드의 3' 및/또는 5' 단부에 위치한 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 가교는 개질된 뉴클레오사이드간 가교로 대체될 수 있고, 여기서 개질된 뉴클레오사이드간 가교는 예를 들면 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, NR1R2-포스포로아미데이트, 보란포스페이트, α-하이드록시벤질 포스포네이트, 포스페이트-(C1-C21)-O-알킬 에스터, 포스페이트-[(C6-C12)아릴-(C1-C21)-O-알킬]에스터, (C1-C8)알킬포스포네이트 및/또는 (C6-C12)아릴포스포네이트 가교, (C7-C12)-α하이드록시메틸-아릴(예를 들면 제WO 95/01363호에 개시되어 있음)에서 선택되고, 여기서 (C6-C12)아릴, (C6-C20)아릴 및 (C6-C14)아릴은 선택적으로 할로겐, 알킬, 알콕시, 니트로, 시아노로 선택적으로 치환되고, 여기서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, (C1-C18)-알킬, (C6-C20)-아릴, (C6-C14)-아릴, (C1-C8)-알킬, 바람직하게는 수소, (C1-C8)-알킬, 바람직하게는 (C1-C4)-알킬 및/또는 메톡시에틸이거나, R1 및 R2는 이들이 갖고 있는 질소 원자와 함께 O, S 및 N에서의 추가의 헤테로원자를 추가로 함유할 수 있는 5원 또는 6원 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
뉴클레오사이드의 3' 및/또는 5' 단부에 위치한 포스포다이에스터 가교가 데포스포 가교로 대체되고(데포스포 가교는 예를 들면 [Uhlmann E. and Peyman A. in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp. 355 ff]에 개시되어 있다), 여기서 데포스포 가교는 예를 들면 데포스포 가교 포름아세탈, 3'-티오포름아세탈, 메틸하이드록실아민, 옥심, 메틸렌다이메틸-하이드라조, 다이메틸렌설폰 및/또는 실릴 기에서 선택된다.
본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 선택적으로 키메릭 주쇄를 가질 수 있다. 키메릭 주쇄는 하나 이상의 유형의 연결기를 포함하는 것이다. 한 실시양태에서, 키메릭 주쇄는 화학식 5'Y1N1ZN2Y2 3'(여기서, Y1 및 Y2는 1 내지 10개의 뉴클레오타이드를 갖는 핵산 분자이다)로 표현될 수 있다. Y1 및 Y2는 각각 하나 이상의 개질된 뉴클레오타이드간 연결기를 포함한다. 키메릭 올리고뉴클레오타이드의 2개 이상의 뉴클레오타이드가 주쇄 개질을 포함하기 때문에, 이들 핵산은 안정화된 면역자극성 핵산의 예시적인 한가지 유형이다.
키메릭 올리고뉴클레오타이드에 관해, Y1 및 Y2는 서로 독립적으로 고려된다. 이는 각각의 Y1 및 Y2가 동일한 분자에서 서로 다른 서열 및 서로 다른 주쇄 연결을 가질 수 있거나 가질 수 없음을 의미한다. 일부 실시양태에서, Y1 및/또는 Y2는 3 내지 8개의 뉴클레오타이드를 갖는다. N1 및 N2는 N1ZN2가 총 6개 이상의 뉴클레오타이드를 갖는 한 0 내지 5개의 뉴클레오타이드를 갖는 핵산 분자이다. N1ZN2의 뉴클레오타이드는 포스포다이에스터 주쇄를 갖고 개질된 주쇄를 갖는 핵산을 포함하지 않는다. Z는 면역자극성 핵산 모티프이고, 바람직하게는 본원에 개시된 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에서 선택된다.
화학식 Y1N1ZN2Y2의 중심 뉴클레오타이드(N1ZN2)는 포스포다이에스터 뉴클레오타이드간 연결기를 갖고, Y1 및 Y2는 하나 이상의 개질된 뉴클레오타이드간 연결기를 갖고, 하나 이상의 개질된 뉴클레오타이드간 연결기를 가질 수 있거나, 심지어는 모든 개질된 뉴클레오타이드간 연결기를 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, Y1 및/또는 Y2는 2개 이상, 또는 2 내지 5개의 개질된 뉴클레오타이드간 연결기를 갖거나, 또는 Y1은 5개의 개질된 개질된 뉴클레오타이드간 연결기를 갖고, Y2는 2개의 개질된 뉴클레오타이드간 연결기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 개질된 뉴클레오타이드간 연결기는 포스포로티오에이트 개질된 연결기, 포스포로다이티오에이트 연결기 또는 p-에톡시 개질된 연결기이다.
핵산은 또한 2' 위치에서 하이드록실 기가 아니고 5' 위치에서 포스페이트 기가 아닌 저분자량 유기 기에 공유 결합되어 있는 주쇄 당을 갖는 핵산을 포함한다. 따라서, 개질된 핵산은 2'-O-알킬화된 라이보스 기를 포함할 수 있다. 또한, 개질된 핵산은 당, 예를 들면 아라비노스 또는 2'-플루오로아라비노스를 라이보스 대신 포함할 수 있다. 따라서, 핵산은 주쇄 조성에서 비균질적이고 이에 의해 펩타이드-핵산(이는 핵산 염기가 있는 아미노산 주쇄를 갖는다)과 같이 함께 연결된 중합체 단위의 임의의 가능한 조합을 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 주쇄 조성에서 균일하다.
당 포스페이트 주쇄(즉, 당 포스페이트 주쇄는 당 포스페이트 단위로 구성된다)에서 나온 당 포스페이트 단위(즉, β-D-라이보스 및 포스포다이에스터 뉴클레오사이드간 가교는 함께 당 포스페이트 단위를 형성한다)는 다른 단위로 대체될 수 있고, 여기서 다른 단위는 예를 들면 "모폴리노-유도체" 다량체(예를 들면 [Stirchak E. P. et al. (1989) Nucleic Acid Res. 17:6129-41]에 개시된 바와 같다)를 구축하기에 적합하고, 즉, 예를 들면 모폴리노-유도체로 대체되거나; 폴리아미드 핵산("PNA"; 예를 들면 [Nielsen P. E. et al. (1994) Bioconjug. Chem. 5:3-7]에 개시된 바와 같다)을 구축하기에 적합하고, 즉, 예를 들면 PNA 주쇄 단위, 예를 들면 2-아미노에틸글라이신으로 대체될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 다른 탄화수소 주쇄 개질 및 대체, 예를 들면 포스페이트 기를 갖는 펩타이드 핵산(PHONA), 잠긴 핵산(LNA), 및 알킬 연결기 또는 아미노 연결기를 갖는 주쇄 부분을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 알킬 연결기는 분지되거나 비분지되고, 치환되거나 비치환되고, 키랄적으로 순수하거나 라세미 혼합물이다.
β-라이보스 단위 또는 β-D-2' 데옥시라이보스 단위는 개질된 당 단위로 대체될 수 있고, 여기서 개질된 당 단위는 예를 들면 β-D-라이보스, α-D-2' 데옥시라이보스, L-2' 데옥시라이보스, 2'-F-2'-데옥시라이보스, 2'-F-아라비노스, 2'-O-(C1-C6)알킬-라이보스에서 선택되고, 바람직하게는 2'-O-(C1-C6) 알킬-라이보스는 2'-O-메틸라이보스, 2'-O-(C1-C6)알켄일-라이보스, 2'-[O-(C1-C6)알킬-O-(C1-C6)알킬]-라이보스, 2'-NH2-2'-데옥시라이보스, β-D-자일로-푸라노스, α-아라비노푸라노스, 2,4-다이데옥시-β-D-에리트로-헥소-피라노스, 탄소환(예를 들면 [Froehler J. (1992) Am. Chem. Soc. 114:8320]에 개시된 바와 같음) 및/또는 개방 쇄 당 유사체(예를 들면 [Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223]에 개시된 바와 같음) 및/또는 이환당 유사체(예를 들면 [Tarkoy M. et al. (1993) Helv. Chim. Acta. 76:481]에 개시된 바와 같음)이다.
일부 실시양태에서, 당은 2'-O-메틸라이보스이고, 특히 하나 또는 둘 모두의 뉴클레오타이드가 포스포다이에스터 또는 포스포다이에스터류 뉴클레오사이드간 연결기에 의해 연결된다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 당 분야에 잘 공지된 임의의 다수의 방법을 이용하여 데 노보(de novo) 합성될 수 있다. 예를 들면 b-시아노에틸 포스포르아미다이트 방법([Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H., (1981) Tet. Let. 22:1859]); 뉴클레오사이드 H-포스포네이트 방법([Garegg et al., (1986) Tet. Let. 27:4051-4054]; [Froehler et al., (1986) Nucl. Acid Res.14:5399-5407]; [Garegg et al., (1986) 27:4055-4058]; [Gaffney et al., (1988) Tet. Let. 29:2619-2622]). 이들 화학은 시장에서 이용가능한 다양한 자동화된 핵산 합성기에 의해 수행될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 합성 올리고뉴클레오타이드로서 언급된다. 다르게는 T-풍부 및/또는 TG 다이뉴클레오타이드는 플라스미드에서 대규모로 생산될 수 있고([Sambrook T. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989] 참조), 여러 조각으로 분리되거나, 전체 플라스미드로서 투여된다. 핵산은 존재하는 핵산 서열(예를 들면 게놈 또는 cDNA)로부터 공지된 방법, 예를 들면 제한 효소, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 이용하는 방법으로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드간 연결기는 포스포로티오에이트 연결기이다.
개질된 주쇄, 예를 들면 포스포로티오에이트는 포스포로아미데이트 또는 H-포스포네이트 화합물중 하나를 이용한 자동화된 기법을 이용하여 합성될 수 있다. 아릴- 및 알킬-포스포네이트는 예를 들면 미국 특허 제4,469,863호에 개시된 바와 같이 제조될 수 있고, 알킬포스포트라이에스터(여기서 하전된 산소 잔기는 미국 특허 제5,023,243호에 개시된 바와 같이 알킬화된다)는 상업적으로 이용가능한 시약을 이용한 자동화된 고상 합성에 의해 제조될 수 있다. 다른 DNA 주쇄 개질 및 치환을 제조하기 위한 방법이 개시되어 있다(예를 들면 [Uhlmann, E. and Peyman, A., Chem. Rev. 90:544, 1990]; [Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990]).
이런 방식으로 제조된 핵산은 단리된 핵산으로 언급된다. "단리된 핵산"은 일반적으로 이것이 세포, 핵, 미토콘트리아 또는 크로마틴으로부터 분리되고 오염물로서 간주될 수 있는 임의의 다른 성분으로부터 분리된 핵산을 의미한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3'으로 구성되고, 여기서 *는 포스포로티오에이트 연결기를 나타낸다.
한 실시양태에서, 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 높은 비율의 IFN-γ 분비 항원-특이적 CD4+ T-세포를 유도한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원-특이적 CD4+ T-세포 개체군 중에서 40% 이상, 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 53%가 IFN-γ를 분비하는 항원-특이적 CD4+ T-세포이도록 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, IFN-γ 분비 항원-특이적 CD4+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포계측기에 의해 결정된다. 이런 결정의 예는 본원의 실시예 1에 개시되어 있다("항원 특이적 다중 사이토카인 분비 T 세포 개체군" 참조).
한 실시양태에서, 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2 분비 항원-특이적 CD4+ T-세포 개체군 중에서 10% 이상, 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 22%가 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 항원-특이적 CD4+ T-세포이도록 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 다기능성 항원-특이적 CD4+ T-세포의 상기 비율은 다색성 유동 세포계측기에 의해 측정된다. 이런 측정의 예는 본원의 실시예 1에 개시되어 있다("항원 특이적 다중 사이토카인 분비 T 세포 개체군" 참조).
한 실시양태에서, 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2 분비 항원-특이적 CD8+ T-세포 개체군 중에서 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 45% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 47%가 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 항원-특이적 CD8+ T-세포이도록 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 다기능성 항원-특이적 CD8+ T-세포의 상기 비율은 다색성 유동 세포계측기에 의해 측정된다. 이런 측정의 예는 본원의 실시예 1에 개시되어 있다("항원 특이적 다중 사이토카인 분비 T 세포 개체군" 참조).
본 발명의 핵산은 독립형(stand alone) 치료법으로 이용될 수 있다. 독립형 치료법은 예방학적 또는 치료학적으로 이로운 결과가 단일 시약 또는 조성의 투여로부터 달성될 수 있는 치료법이다. 따라서, 본원에 개시된 핵산은 감염성 질환의 예방 또는 치료에 단독으로 사용될 수 있고, 이는 핵산이 이들 질병의 치료 결과에 이로운 면역 반응을 유도할 수 있기 때문이다. 본원에 언급된 방법의 일부는 다른 치료 시약과 조합된 핵산의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 핵산은 백신에 이용될 수 있다. 백신으로 이용되는 경우, 핵산은 항원과 함께 투여될 수 있다. 바람직하게는 항원은 예방되거나 치료되고자 하는 질병에 대해 특이적이다. 예를 들면 질환이 감염성 질병이면, 항원은 감염성 유기체(예를 들면 박테리아, 바이러스, 기생충, 진균 등)에서 유래되고, 질환이 자가 항원을 포함하는 경우(예를 들면 종양, 신경퇴화성 질환, 예를 들면 알츠하이머병, 인간 항체에 대한 항원 또는 인간 내인성 레트로바이러스 요소로부터 발현된 항원), 항원은 바람직하게는 항원과 관련된 특정한 질환으로부터 유래된다. 질환이 중독성 물질과 관련된 경우, 항원은 바람직하게는 항원과 관련된 특정한 중독성 물질로부터 유래된다(예를 들면, 니코틴 합텐).
본원에서 이용되는 용어 "질환" 및 "질병"은 상호교환적으로 이용된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 질환의 치료 또는 예방을 위해 백신에서 아쥬방트로서 이용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이고, 여기서 상기 백신은 하나 이상의 항원을 포함하고, 질환은 다기능성 항원 특이적 T 세포의 생성으로부터 이익을 얻는다.
CPG ODN 24555가 CPG ODN 10103을 이용하여 수득된 항원-특이적 CD4+ T 세포 개체군에 비해 더 높은 비율의 IFN-γ를 생성하는 항원-특이적 CD4+ T 세포를 유도하는 것으로 발견되었다. 또한 CPG ODN 10103 또는 CPG ODN 7909를 이용하여 수득된 항원-특이적 CD4+ T 세포 개체군에 비해, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두, IFN-γ 및 IL-2 둘 모두, 또는 TNF-α 및 IL-2 둘 모두를 생성하는 다기능성 항원-특이적 CD4+ T 세포 개체군, 또는 심지어는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-12를 분비하는 3종 생산자가 보다 높은 비율로 수득되었다. CPG ODN 10103 또는 CPG ODN 7909를 이용하여 수득된 항원-특이적 CD8+ T 세포 개체군에 비해, IFN-γ 및 IL-2 둘 모두, 또는 TNF-α 및 IL-2 둘 모두를 생성하는 다기능성 항원-특이적 CD8+ T 세포 개체군, 또는 심지어는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-12의 3종 생산자가 보다 높은 비율로 수득되었다.
IFN-γ, TNF-α 및 IL-12는 다양한 질병에 관여하고 있다. 예를 들면 TNF-α는 암에 관련되어 있고, IFN-γ는 감염성 질병, 예를 들면 바이러스 감염에 관련되어 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방용 백신에서 아쥬방트로서 사용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방용 백신에서 아쥬방트로서 사용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이고, 여기서 상기 백신은 하나 이상의 종양 항원, 바람직하게는 본원에 개시된 임의의 종양 항원을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 감염성 질병의 치료 또는 예방용 백신에서 아쥬방트로서 사용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 감염성 질병의 치료 또는 예방용 백신에서 아쥬방트로서 사용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이고, 여기서 상기 백신은 하나 이상의 미생물 항원, 바람직하게는 본원에 개시된 임의의 미생물 항원을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에서, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 감염(즉, 감염성 질환), 자가 항원과 관련된 질환, 또는 중독성 물질과 관련된 질환을 예방하기 위한 예방 백신으로서 유용하다. 바람직하게는 예방용 백신은 백신이 추구하는 질환으로 진단되지 않은 대상, 보다 바람직하게는 이들 질환중 하나가 발전할 위험이 있는 것으로 간주되는 대상에서 사용된다. 예를 들면 대상은 감염성 유기체로 감염될 위험이 있는 대상, 또는 자가 항원과 관련된 질병에 걸리기 쉬운 대상 또는 중독성 물질과 관련된 질환에 걸리기 쉬운 대상일 수 있다.
본원에서 이용되는 위험이 있는 대상은 병원균에 의한 감염, 자가 항원과 관련된 질환 또는 중독성 물질과 관련된 질환에 노출될 임의의 위험을 갖는 대상이다. 위험에 처한 대상은 또한 이런 질환이 전개될 경향을 갖는 대상을 포함한다. 일부 경향은 유전적일 수 있다(그리고 이에 의해 유전자 분석 또는 가족력중 하나에 의해 확인될 수 있다). 일부 경향은 환경적이다(예를 들면 감염성 물질, 자가 항원 또는 중독성 물질에 이전에 노출됨). 감염이 발전할 위험이 있는 대상의 경우, 이런 대상의 예는 특정한 유형의 감염성 물질이 존재하거나 발견되어온 지역에 살고 있거나 여행할 예정인 대상이거나, 또는 생활 양식이나 의학적 처치를 통해 감염성 유기체를 함유할 수 있는 체액과 직접적으로 또는 간접적으로 접촉한 유기체에 노출된 대상일 수 있다. 감염이 전개될 위험에 처한 대상은 또한 의료 기관이 특정한 감염성 유기체에 대한 백신접종을 권고한 일반적인 개체군을 포함한다.
대상은 수의학적 약물로 치료되는 대상, 설치류 또는 비-설치류 대상이다. 비-설치류 대상은 인간, 척추 동물, 예를 들면 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 영장류(예를 들면 원숭이) 및 어류(수산양식 종, 예를 들면 연어)를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 설치류 대상은 래트 및 마우스를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상은 인간이다.
면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 또한 감염으로부터의 단기 보호를 위해 항원이 없는 대상에게 투여될 수 있다. 이 경우, 장기 보호를 위해 반복 투여가 허용될 것이다.
감염된 대상은 감염성 병원균에 노출되고 신체 또는 신체 폐기물에 급성 또는 만성적인 검출가능한 수준의 병원체를 갖는 대상이다. 치료학적으로 사용되는 경우, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들면 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 감염성 병원체의 수준을 감소시키거나 박멸할 수 있는 항원 특이적 전신 또는 점액성 면역 반응을 상승시키는 항원과 함께 치료학적으로 사용될 수 있다.
본원에서 이용되는 감염성 질병은 신체에서 외래 미생물의 존재로부터 발생하는 질병이다. 병원체 진입의 주요 부위인 신체의 점액성 표면을 보호하기 위해 효과적인 백신 전략 및 치료법을 개발하는 것이 특히 중요하다.
자가 항원과 관련된 질환은 대상에서 면역 반응을 야기하는 대상자의 자체 세포 또는 세포 생성물인 항원에 의해 야기되는 임의의 질환이다. 예를 들면 일부 실시양태에서, 자가 항원은 종양 항원, 알츠하이머병과 관련된 항원, 항체에 대한 항원, 또는 인간의 내인성 레트로바이러스 요소로부터 발현되는 항원이다. 종양 항원은 HER2, MAGE, NYESO-1, PSA, CEA 또는 EGFR의 변이체 형태일 수 있다. 알츠하이머병과 관련된 항원은 타우(tau) 또는 β-아밀로이드일 수 있다. 항체에 대한 항원은 인간 항체에 대한 항원이고, 예를 들면 일부 실시양태에서 항원은 IgE이다.
일부 실시양태에서, 종양 항원은 MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A6, MAGE A10, MAGE A12, HAGE (CT13), BAGE, BORIS, SSX-2, LAGE-1, CAMEL(LAGE-1 alt 리딩 프레임), GAGE 1,2,3, TRAG-3, NY-ESO-1, 멜란(Melan)-A/MART-1, 타이로시나제, tyrp1 (gp75), tyrp2, gp100/pmel17, PAP, PSA, CEA, Ep-CAM, PSMA, MUC1, MUC2, HER-2, AFP, EphA2, FGF-5, htert, iCE, Livin (ML-IAP), RAGE, RU2, 수르비빈(Survivin), 수르비빈 2B, WT1, 톰슨-프아이덴라이흐(Thomsen-Friedenreich)(TF) 항원, 5T4, PSCA, STEAP, TGR, 아디포필린(Adipophilin), AIM-2, G250, OGT, TGFaRII, CO-95 (KIAA1416), CO-94(seb4D), CO-9(HDAC 5), CO-61(HIP1R), CO-58(KNSL6), CO-45, CO-42(TRIP4), CO-41(MBD2), Ren-32(Lamin C), TNKL(BC-203), CO-26(MNK 1), SDCCAG3, GA733-2, STn, CA125, EGFRvIII, BCR-abl, 고친화성 폴레이트 수용체, 메소텔린(Mesothelin), hCG, FAP 알파, 사이클린(Cyclin) 1, 토포아이소머라제, 세르핀(Serpin) B5/마스핀(Maspin), 레구마인(Legumain), CDK4, PRAME, ADAM 17, EDDR1, CDC2, 복제 단백질(Replication Protein) A, CDK2, GM2, 글로보(Globo) H, TF(c), Ley, Tn(c), STn(c), GD2, GD3 또는 GD3L이다.
중독성 물질과 관련된 질환은 환자에게 중독성 물질에 대한 중독이 전개되게 하는 화학적 또는 생물학적 물질이 관련된 임의의 질환이다. 예를 들면 일부 실시양태에서, 중독성 물질은 니코틴 또는 코카인이다. 일부 실시양태에서, 니코틴 항원은 담체에 공액된 니코틴 합텐일 수 있다. 일부 실시양태에서, 니코틴 합텐이 공액되는 담체는 디프테리아 독소이다.
본원에서 이용되는 용어 "치료", "치료된" 또는 "치료"는 병원균으로 감염된 대상(감염될 위험이 있는 대상)의 저항성을 증가시키거나, 달리 말하자면 환자가 병원균으로 감염될 가능성을 감소시키고, 대상(감염된 대상)이 감염된 후에 감염과 싸울 수 있도록, 예를 들면 감염이 감소되거나, 없어지거나, 악화되는 것을 방지하는 예방적 치료를 의미한다.
용어 "치료", "치료된" 또는 "치료"는, 자가 항원과 관련된 질환에 대해 사용되는 경우, 이런 질환 또는 질병의 전개에 대한 대상(자가 항원과 관련된 질환의 위험에 처한 대상)의 저항을 증가시키거나, 대상에서 자가 항원과 관련된 질환이 전개될 가능성을 감소시키는 것과 관련된 예방적 치료, 및 대상(자가 항원과 관련된 질환의 위험에 처한 대상)에서 이런 질환이 전개된 후, 또는 이런 질환의 전개 증후 또는 증상이 전개된 후에 질환의 효과를 감소시키는, 예를 들면 질환과 관련된 증후 또는 증상을 감소시키거나, 없애거나, 악화되는 것을 방지하는 치료를 의미한다.
용어 "치료", "치료된" 또는 "치료"는, 중독성 물질과 관련된 질환에 대해 사용되는 경우, 이런 질환 또는 질병의 전개에 대한 대상(중독성 물질과 관련된 질환의 위험에 처한 대상)의 저항을 증가시키거나, 대상에서 중독성 물질과 관련된 질환이 전개될 가능성을 감소시키는 것과 관련된 예방적 치료, 및 대상(중독성 물질과 관련된 질환의 위험에 처한 대상)에서 이런 질환이 전개된 후, 또는 이런 질환의 전개 증후 또는 증상이 전개된 후에 질환의 효과를 감소시키는, 예를 들면 질환과 관련된 증후 또는 증상을 감소시키거나, 없애거나, 악화되는 것을 방지하는 치료를 의미한다.
본원에 개시된 바와 같은 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 이용한 대상의 치료는 감염을 감소시키거나, 감염을 완전히 없애거나, 자가 항원과 관련된 질환과 관련된 증상/증후를 감소시키거나, 질환을 완전히 없애거나, 중독성 물질과 관련된 질환과 관련된 증상/증후를 감소시키거나, 질환을 완전히 없앤다. 이런 치료의 결과로서 감염성 질환, 자가 항원과 관련된 질환, 중독성 물질과 관련된 질환에 관한 이런 증후가 감소되거나, 증후가 유지되거나 없어지면, 대상은 치료된 것으로 간주될 수 있다. 감염성 질병의 경우, 이런 치료는 또한 대상에 존재하는 감염성 물질의 양(예를 들면 이런 양은 당 분야의 숙련자들에게 공지된 ELISA와 같은 표준 분석법을 이용하여 측정될 수 있다)의 감소를 포함한다. 자가 항원과 관련된 질환의 경우, 이런 치료는 대상에 존재하는 자가 항원의 양의 감소 또는 자가 항원의 결과로서 유도된 면역 반응의 감소를 포함한다. 중독성 물질과 관련된 질환의 경우, 이런 치료는 또한 중독성 물질에 추가하여 이와 관련된 증상/증후의 감소를 포함한다.
본원에서 이용되는 "항원"은 면역 반응을 일으킬 수 있는 분자이다. 항원은 세포, 세포 추출물, 단백질, 재조합 단백질, 정제된 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 폴리사카라이드, 폴리사카라이드 컨쥬게이트, 펩타이드 및 폴리사카라이드의 비-펩타이드 모의체(mimic) 및 플라스미드 DNA에 의해 코딩되는 다른 분자, 합텐, 소분자, 지질, 당지질, 탄화수소, 전체 사멸된 병원체, 바이러스 및 바이러스 추출물, 살아있는 약독화된 바이러스 또는 바이러스 벡터, 살아있는 약독화된 박테리아 또는 박테리아 벡터 및 다세포 유기체, 예를 들면 기생충 및 알레르겐을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 용어 항원은 넓게는 숙주의 면역계에 의해 외래의 것으로 인식되는 임의의 유형의 분자를 포함한다. 항원은 미생물 항원, 자가 항원 및 중독성 물질을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
일부 양태에서, 항원은 담체에 컨쥬게이트되어 있다. 일부 실시양태에서, 담체는 디프테리아 독소 또는 바이러스류 입자이다. 일부 실시양태에서, 바이러스류 입자는 RNA 파지 Q-β, B형 간염 표면 항체(HBsAg) 또는 B형 간염 코어 항원(HBcAg)으로 구성된다.
본원에서 이용되는 "미생물 항원"은 미생물의 항원이고, 바이러스, 박테리아, 기생충 및 진균을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 박테리아 항원은 박테리아 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus)와 관련된 것들이다. 다른 실시양태에서, 박테리아 항원은 충치를 야기하는 박테리아, 예를 들면 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus sanguis), 락토바실러스 아시도필리스(Lactobcaillus acidophilis) 또는 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)와 관련된 것들이다. 일부 실시양태에서, 박테리아 항원은 치주 질병을 야기하는 박테리아, 예를 들면 포피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 또는 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)와 관련된 것들이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 항원은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 단순 포진 바이러스 1(HSV1), 단순 포진 바이러스 2(HSV2) 또는 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1) 또는 HIV-2와 관련된 것들이다. 일부 실시양태에서, 기생충 항원은 말라리아를 야기하는 기생충과 관련된 것들이다.
이런 항원은 손상되지 않은 미생물 및 이의 천연 단리물 및 단편 또는 유도체 및 또한 천연 미생물 항원과 동일하거나 유사하고 그 미생물에 특이적인 면역 반응을 유도하는 합성 화합물을 포함한다. 화합물이 천연 미생물 항원에 대한 면역 반응(체액 및/또는 세포)를 유도한다면 화합물이 천연 미생물 항원과 유사하다. 이런 항원은 당 분야에서 일상적으로 이용되고 당 분야의 숙련자들에게 잘 공지되어 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 대상은 항원에 "노출된다." 본원에서 이용되는 용어 "노출"은 대상을 항원과 접촉시키는 능동적인 단계 또는 생체 내에서 항원으로의 대상의 수동적인 노출중 하나를 의미한다. 대상을 항원에 능동적으로 노출시키는 방법은 당 분야에 잘 공지되어 있다. 일반적으로 항원을 정맥내, 근육내, 경구, 경피, 점막, 비강내, 기관지내 또는 피하 투여와 같은 임의의 수단에 의해 대상에게 직접 투여한다. 항원은 국소적으로 또는 전신 투여될 수 있다. 항원 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 방법은 하기에 보다 상세하게 개시되어 있다. 항원이 체내의 면역 세포에 노출되기 위해 이용가능한 경우, 대상은 항원에 수동적으로 노출된다. 대상은 예를 들면 외래 병원체의 체내로의 진입에 의해 항원에 수동적으로 노출될 수 있다.
대상이 항원에 수동적으로 노출되는 방법은 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 투여 시기에 특히 의존할 수 있다. 예를 들면, 감염성 질병이 전개될 위험에 처한 대상에서, 위험이 가장 클 때는 정기적으로 대상에게 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 투여할 수 있다. 또한, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 여행자가 감염성 물질에 노출될 위험이 있는 외국으로 여행가기 전에 투여될 수 있다. 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 또한 대상이 노출될 때 항원에 대한 전신 또는 점액 면역 반응을 유도하는 생물학적 무기에 노출되는 위험에 처한 군인 또는 민간인에게 투여될 수 있다.
인간에서 발견되어온 바이러스의 예는 레트로비리다에(예를 들면 인간 면역결핍 바이러스, 예를 들면 HIV-1(이는 또한 HTLV-III, LAV, HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III로도 불림)와 같은 인간 면역결핍증 바이러스; 및 HIV-LP와 같은 다른 단리체); 피코르나비리다에 (Picornaviridae) (예를 들어, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 장내바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스 (rhinovirus), 에코바이러스 (echovirus)); 칼시비리다에 (Calciviridae) (예를 들어, 위장염을 일으키는 균주); 토가비리다에 (Togaviridae) (예를 들어, 말 뇌염 바이러스, 풍진 바이러스); 플라비리다에 (Flaviridae) (예를 들어, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로노비리다에 (Coronoviridae) (예를 들어, 코로나바이러스); 라브도비리다에 (Rhabdoviradae) (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 광견병 바이러스); 필로비리다에 (Filoviridae) (예를 들어, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae) (예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스); 오르토믹소비리다에 (Orthomyxoviridae) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스); 벙가비리다에 (Bungaviridae) (예를 들어, 한탄 바이러스, 벙가 바이러스, 플레보바이러스 (phlebovirus) 및 나이로 바이러스); 아레나 비리다에 (Arena viridae) (출혈성 열 바이러스); 레오비리다에 (Reoviridae) (예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리다에 (Birnaviridae); 헤파드나비리다에 (Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스); 파르보비리다에 (Parvoviridae) (파르보바이러스); 파포바비리다에 (Papovaviridae) (파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리다에 (Adenoviridae) (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리다에 (Herpesviridae) (단순 포진 바이러스 (HSV) l 및 2, 수두대상포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 헤르페스 바이러스); 폭스비리다에 (Poxviridae) (천연두 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도비리다에 (lridoviridae) (예를 들어, 아프리카 돼지 열 바이러스); 및 분류되지 않은 바이러스 [예를 들어, 해면상 뇌병증의 병인체, 델타 간염의 병인체 (B형 간염 바이러스의 결핍 새틀라이드 (satellite)인 것으로 생각됨), 비-A형, 비-B형 간염의 병인체 (클래스 1 = 내부 전달됨; 클래스 2 = 비경구 전달됨 (즉, C형 간염); 노르워크 (Norwalk) 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스]가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 단순 포진 1(HSV1), 단순 포진 2(HSV2), 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV1) 또는 HIV2이다.
본원에 개시된 많은 미생물 항원이 인간의 질환에 관한 것이지만, 본 발명은 또한 다른 비-인간 척추동물을 치료하는데 유용하다. 비-인간 척추동물은 또한 본원에 개시된 면역자극성 핵산으로 예방되거나 치료될 수 있는 감염을 전개할 수 있다. 예를 들면 감염성 인간 질병의 치료에 추가하여, 본 발명의 방법은 동물의 감염을 치료하는데 유용하다.
그람 음성 및 그람 양성 박테리아 둘다 척추동물에서 항원으로 작용한다. 이러한 그람 양성 박테리아에는 파스테렐라 종 (Pasteurella species), 스태필로코커스 종 (Staphylococci species), 및 스트렙토코커스 종 (Streptococcus species)이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 그람 음성 박테리아에는 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli), 슈도모나스 종 (Pseudomonas species) 및 살모넬라 종 (Salmonella species)이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 감염성 박테리아의 구체적 예에는 헬리코박터 파이로리스 (Helicobacter pyloris), 보렐리아 부르그도르페리 (Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아 (Legionella pneumophilia), 마이코박테리아 (Mycobacteria) 종 (예를 들어, 마이코박테리아 튜버큘로시스 (M. tuberculosis), 마이코박테리아 아비움 (M. avium), 마이코박테리아 인트라셀룰라 (M. intracellulare), 마이코박테리아 칸사이 (M. kansaii), 마이코박테리아 고르도나 (M. gordonae), 스태필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노르호에아 (Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (군 A 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae) (군 B 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 (비리단스 군), 스트렙토코커스 패칼리스 (Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스 (Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 (협기성 종), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 종 (Campylobacter sp.), 엔테로코커스 종 (Enterococcus sp.), 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스 (Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리아 (corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 종 (corynebacterium sp.), 이리시펠로트릭스 루시오패씨아 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리디움 퍼프링게르스 (Clostridium perfringers), 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 엔테로박터 애로게네스 (Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 파스퇴렐라 뮬토시다 (Pasturella multocida), 박테로이데스 종 (Bacteroides sp.), 퓨조박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐포르미스 (Streptobacillus monilformis), 트레포네마 팔리디움 (Treponema pallidium), 트레포네마 퍼테뉴 (Treponema pertenue), 렙토스피라 (Leptospira), 리케챠 (Rickettsia) 및 악티노마이세스 이스라엘리 (Actinomyces israelli)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서는 박테리아가 충치를 야기하는 것, 예를 들면 스트렙토코커스 뮤탄스, 스트렙토코커스 소브리누스, 스트렙토코커스 산구이스, 락토바실러스 아시도필리스 또는 악티노마이세스 비스코서스이다. 다른 실시양태에서, 박테리아는 치추 질환을 야기하는 것, 예를 들면 포피로모나스 깅기발리스 또는 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스이다.
박테리아 병원체의 폴리펩타이드는 철-조절된 외막 단백질(IROMP), 외막 단백질(OMP) 및 절종증을 야기하는 아에로모니스 살모니시다(Aeromonis salmonicida)의 A-단백질, 박테리아 신장 질환(BKD)를 야기하는 레니박테리움 살모니나룸(Renibacterium salmoninarum)의 p57 단백질, 주 표면 관련 항원(msa), 표면 발현된 사이토톡신(mpr), 표면 발현된 헤몰리신(ish) 및 예르시니아증의 편모 항원; 세포외 단백질(ECP), IROMP, 및 파스퇴렐라균 감염증의 구조 단백질; 비브리오시스 안구일라룸(Vibrosis anguillarum) 및 비브리오시스 오르달리(V. ordalii)의 OMP 및 편모 단백질; 에드와드시엘로시스 익탈루리(Edwardsiellosis ictaluri) 및 에드와드시엘로시스 타르다(Edwardsiellosis tarda)의 편모 단백질, OMP 단백질, aroA 및 purA; 및 사이토파가 컬럼나리(Cytophaga columnari)의 구조 및 조절 단백질; 및 리케챠의 구조 및 조절 단백질을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
진균의 예에는 크립토코커스 네오포르만스 (Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캡슐라툼 (Histoplasma capsulatum), 코시디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 캔디다 알비칸스 (Candida albicans)가 포함된다. 다른 감염성 유기체 (즉, 원생생물)에는 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 플라스모디움 말라리아 (Plasmodium malariae), 플라스모디움 오발 (Plasmodium ovale) 및 플라스모디움 비박스 (Plasmodium vivax)와 같은 플라스모디움 (Plasmodium) 종, 및 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii)가 포함된다. 혈액-유래 및(또는) 조직 기생충에는 플라스모디움 종, 바베시아 마이크로티 (Babesia microti), 바베시아 디버겐스 (Babesia divergens), 레이쉬마니아 트로피카 (Leishmania tropica), 레이쉬마니아 종, 레이쉬마니아 브라질리엔시스 (Leishmania braziliensis), 레이쉬마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 트리파노소마 감비엔스 (Trypanosoma gambiense) 및 트리파노소마 로데시엔스 (Trypanosoma rhodesiense (아프리카 수면병)), 트리파노소마 크루지 (Trypanosoma cruzi (샤가스병 (Chagas' disease)) 및 톡소플라스마 콘디이가 포함된다. 일부 실시양태에서, 미생물은 말라리아와 관련된 것이다. 다른 의학 관련 미생물은 문헌 (예컨대, 문헌[C.G.A Thomas, Medical Microbio1ogy, Bailliere TindalI, Great Britain 1983 참조]에 광범위하게 기재되어 있다.
비-인간 척추동물의 치료를 위한 많은 백신은 [Bennett, K., Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendiums, Inc., 1995]에 개시되어 있다. 상기 논의된 바와 같이, 항원은 감염성 미생물, 예를 들면 바이러스, 기생충, 박테리아 및 진균 및 천연 공급원으로부터 유래되거나 합성된 이의 단편을 포함한다. 인간 및 비-인간 척추동물 둘 모두의 감염성 바이러스는 레트로바이러스, RNA 바이러스 및 DNA 바이러스를 포함한다. 이 레트로바이러스의 군은 단순 레트로바이러스 및 복합 레트로바이러스 둘 모두를 포함한다. 단순 레트로바이러스는 B형 레트로바이러스, C형 레트로바이러스 및 D형 레트로바이러스의 아군을 포함한다. B형 레트로바이러스의 예는 마우스 유방암 바이러스(MMTV)이다. C형 레트로바이러스는 C형의 아군 A(루스(Rous) 육종 바이러스(RSV), 조류 백혈병 바이러스(ALV) 및 조류 골수아구증 바이러스(AMV) 포함) 및 C형 B군(고양이 백혈병 바이러스(FeLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GALV), 비장 괴사 바이러스(SNV), 세망내피증 바이러스(RV) 및 유인원 육종 바이러스(SSV) 포함)을 포함한다. D형 레트로바이러스는 마손-화이자(Mason-Pfizer) 원숭이 바이러스(MPMD) 및 유인원 레트로바이러스 1(SRV-1)을 포함한다. 복합 레트로바이러스는 렌티바이러스, T-세포 백혈병 바이러스 및 포미(foamy) 바이러스를 포함한다. 렌티바이러스는 HIV-1을 포함하지만 또한 HIV-2, SIV, 비스나(Visna) 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 및 말의 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)를 포함한다. T-세포 백혈병 바이러스는 HTLV-1, HTLV-II, 유인원 T-세포 백혈병 바이러스(STLV) 및 소 백혈병 바이러스(BLV)를 포함한다. 포미 바이러스는 인간 포미 바이러스(HFV), 유인원 포미 바이러스(SFV) 및 소 포미 바이러스(BFV)를 포함한다.
척추동물에서 항원인 다른 RNA 바이러스의 예는 오르토레오바이러스 속(포유동물 및 조류 레트로바이러스 둘 모두의 여러 혈청유형), 오르비바이러스 속(블루텅 바이러스, 유게난기 바이러스, 케메로보 바이러스, 아프리카 마역 바이러스 및 콜로라도 진드기 열 바이러스), 로타바이러스 속(인간 로타바이러스, 네브라스카 송아지 설사 바이러스, 유인원 로타바이러스, 소 또는 양 로타바이러스, 조류 로타바이러스)를 비롯한 레오비리다에 과의 일원; 엔테로바이러스 속(폴리오바이러스, 콕사키 바이러스 A 및 B, 장내 세포 변성 인간 오판(ECHO) 바이러스, A형 간염 바이러스, 유인원 엔테로바이러스, 뮤린 뇌척수염(ME) 바이러스, 폴리오바이러스 뮤리스, 소 엔테로바이러스, 돼지 엔테로바이러스), 카르디오바이러스 속(뇌척수 심근염 바이러스(EMC), 멘고바이러스), 리노바이러스 속(113가지 이상의 아형을 포함하는 인간 리노바이러스; 다른 리노바이러스), 아프토바이러스 속(수족구 질병(FMDV))을 비롯한 피코르나비리다에 과; 돼지 바이러스의 수포성 발진, 산 미구엘 강치 바이러스, 고양이 피르코나바이러스 및 노르워크 바이러스를 비롯한 칼시비리다에 과; 알파바이러스 속(동부 말 뇌염 바이러스, 심리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿤구냐 바이러스, 오뇽-뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염 바이러스, 동부 말 뇌염 바이러스), 플라비리우스 속(모기 매개 황열병 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 머레이 계곡 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 쿤진 바이러스, 중부 유럽 진드기 매개 바이러스, 극동 진드기 매개 바이러스, 키아사누르 포레스트 바이러스, 루핑 III 바이러스, 포와산 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스), 루비바이러스 속(루벨라 바이러스), 페스티바이러스(점막 질병 바이러스, 돼지 콜레라 바이러스, 보더병 바이러스)를 비롯한 토가비리다에 과; 부니바이러스 속(부니암웨라 및 관련 바이러스, 캘리포니아 뇌염 군 바이러스), 플레보바이러스 속(샌드플라이 열 시실리아 바이러스, 리프트 계곡 열 바이러스), 나이로바이러스 속(크림-콩고 출혈열 바이러스, 나이로비 양 질병), 및 우쿠바이러스 속(우쿠니에미 및 관련 바이러스)을 비롯한 부니아비리다에 과; 인플루엔자 바이러스 속(인플루엔자 바이러스 A형, 많은 인간 아형)을 비롯한 오르토믹소비리다에 과; 돼지 인플루엔자 바이러스 및 조류 및 말 인플루엔자 바이러스; 인플루엔자 B형(많은 인간 아형) 및 인플루엔자 C형(가능한 분리된 속); 파라믹소바이러스 속(파라인플루엔자 바이러스 1형, 센다이 바이러스, 혈구흡착 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 2형 내지 5형, 뉴캐슬 질병 바이러스, 이하선염 바이러스), 모빌리바이러스 속(홍역 바이러스, 아급성 경화성 범발성 뇌염 바이러스, 디스템퍼 바이러스, 우역 바이러스), 뉴모바이러스 속(호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 소 호흡기 세포융합 바이러스 및 폐렴 바이러스)을 비롯한 파라믹소비리다에 과; 베지큘로바이러스 속(VSV), 찬디푸라 바이러스, 플랑더스-하트 공원 바이러스, 리사바이러스 속(광견병 바이러스), 어류 라브도바이러스 및 2가지의 거의 확실한 라브도바이러스(마버그 바이러스 및 에볼라 바이러스)를 비롯한 라브도비리다에 과; 림프구 맥락수막염 바이러스(LCM), 타카리브 바이러스 복합체 및 라사 바이러스를 비롯한 아레나비리다에 과; 감염성 기관지염 바이러스(IBV), 간염 바이러스, 인간 장내 코로나 바이러스 및 고양이 감염성 복막염(고양이 코로나바이러스)를 비롯한 코로노아비리다에를 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.
척추동물에서 항원인 예시적인 DNA 바이러스는 오르토폭스바이러스 속(바리올라 메이저, 바리올라 마이너, 원숭이 수두 백시니아, 우두, 버팔로 수두, 토끼 수두, 기지증), 레포리폭스바이러스 속(점액종, 섬유종), 아비폭스바이러스 속(계두, 다른 조류 수두 바이러스), 카프리폭스 바이러스 속(양두, 염소 수두), 수이폭스바이러스(돼지 수두), 파라폭스바이러스(전염성 자세 피부염 바이러스, 유사우두, 소 대중적 구내염 바이러스)를 비롯한 폭스비리다에 과; 이리도비리다에 과(아프리카 돼지 열 바이러스, 개구리 바이러스 2 및 3, 어류의 림포시스티스 바이러스); 알파-헤르페스 바이러스(단순포진 1형 및 2형, 바리셀라-조스터, 말 유산 바이러스, 말 헤르페스 바이러스 2 및 3, 위광견병 바이러스, 감염성 소 각결막염 바이러스, 감염성 소 비기관염 바이러스, 고양이 비기관염 바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스), 베타-헤르페스 바이러스(인간 사이토메갈로 바이러스 및 돼지 및 원숭이의 사이토메갈로바이러스)를 비롯한 헤르페스비리다에 과; 감마-헤르페스 바이러스(엡스타인-바 바이러스(EBV), 마렉병 바이러스, 헤르페스 사이미리, 헤르페스 바이러스 아텔레스, 헤르페스 바이러스 실빌라구스, 기니아 피그 헤르페스 바이러스, 루케 종양 바이러스); 마스트아데노바이러스 속(인간 아군 A, B, C, D, E 및 미분류군)을 비롯한 아데노비리다에 과; 유인원 아데노바이러스(23개 이상 혈청), 감염성 개 간염 및 소, 돼지, 양, 개구리 및 많은 다른 종의 아데노바이러스, 아비아데노바이러스 속(조류 아데노바이러스); 및 비-배양성 아데노바이러스; 파필로마바이러스 속(인간 파필로마 바이러스, 소 파필로마 바이러스, 쇼프 토끼 파필로마 바이러스 및 다른 종의 다양한 병원성 파필로마 바이러스), 폴리오마바이러스 속(폴리오마바이러스, 유원인 공포(vacuole)형성제(SV-40), 토끼 공포형성제(RKV), K 바이러스, BK 바이러스, JC 바이러스 및 다른 영장류 폴리오마 바이러스, 예를 들면 림프절 파필로마 바이러스)를 비롯한 파포비리다에 과; 아데노-관련 바이러스 속, 파보바이러스 속(고양이 범백혈구감소증 바이러스, 소 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 알루샨 밍크 질병 바이러스 등)을 비롯한 파르보비리다에 과를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다. 또한, DNA 바이러스는 쿠루(kuru) 및 크로이츠펠트-야콥병 바이러스 및 만성 감염성 신경병증제(CHINA 바이러스)와 같은 상기 과에 속하지 않는 바이러스를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD4+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD4+ T-세포의 40% 이상, 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 53%가 IFN-γ를 분비하는, 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 항원을 투여함을 포함하는 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ를 분비하는 항원-특이적 CD4+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 결정된다. 이런 측정의 예는 본원의 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 대상에서 항원-특이적 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD4+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD4+ T-세포의 10% 이상, 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 22%가 2종 사이토카인 생산자인, 바람직하게는 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는, 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 항원을 투여함을 포함하는 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 항원-특이적 CD4+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 측정된다. 이런 측정의 예는 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 대상에서 항원-특이적 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD8+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD8+ T-세포의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 약 47%가 2종 사이토카인 생산자인, 바람직하게는 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는, 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 항원을 투여함을 포함하는 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 항원-특이적 CD8+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 측정된다. 이런 측정의 예는 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원 및 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 대상에서 항원-특이적 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 투여된다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD4+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD4+ T-세포의 40% 이상, 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 53%가 IFN-γ를 분비하는, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ를 분비하는 항원-특이적 CD4+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 결정된다. 이런 측정의 예는 본원의 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD4+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD4+ T-세포의 10% 이상, 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 22%가 2종 사이토카인 생산자인, 바람직하게는 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 항원-특이적 CD4+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 측정된다. 이런 측정의 예는 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD8+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD8+ T-세포의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 약 47%가 2종 사이토카인 생산자인, 바람직하게는 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 항원-특이적 CD8+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 측정된다. 이런 측정의 예는 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD4+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD4+ T-세포의 40% 이상, 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 53%가 IFN-γ를 분비하는, 백신에서 아쥬방트로서 이용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ를 분비하는 항원-특이적 CD4+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 결정된다. 이런 측정의 예는 본원의 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD4+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD4+ T-세포의 10% 이상, 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 22%가 2종 사이토카인 생산자인, 바람직하게는 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 백신에서 아쥬방트로서 이용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 2종 생산 항원-특이적 CD4+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 측정된다. 이런 측정의 예는 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD8+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD8+ T-세포의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 약 47%가 2종 사이토카인 생산자인, 바람직하게는 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 백신에서 아쥬방트로서 사용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 항원-특이적 CD8+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 측정된다. 이런 측정의 예는 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD4+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD4+ T-세포의 40% 이상, 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 약 53%가 IFN-γ를 분비하는, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ를 분비하는 항원-특이적 CD4+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 결정된다. 이런 측정의 예는 본원의 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD4+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD4+ T-세포의 10% 이상, 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 22%가 2종 사이토카인 생산자인, 바람직하게는 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 항원-특이적 CD4+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 측정된다. 이런 측정의 예는 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 IFN-γ, TNF-α 및/또는 IL-2를 분비하는 항원 특이적 CD8+ T 세포 개체군 중에서 유도된 항원-특이적 CD8+ T-세포의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 약 47%가 2종 사이토카인 생산자인, 바람직하게는 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는, 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 이용하기 위한 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. 한 실시양태에서, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두를 분비하는 항원-특이적 CD8+ T-세포의 비율은 다색성 유동 세포측정기에 의해 측정된다. 이런 측정의 예는 실시예 1('항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군' 단락 참조)에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 항원은 본원에 개시된 임의의 것이다.
핵산 분자의 "효과량"이라는 용어는 바람직한 생물학적 효과를 실현하는데 필요하거나 충분한 양을 의미한다. 예를 들면 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 비메틸화된 CpG를 함유하는 핵산의 효과량은 미생물 감염 또는 종양을 제거하는데 필요한 양일 수 있다. 백신 아쥬방트로서 사용하기위한 효과량은 대상에서 백신에 대한 면역 반응을 부스팅하는데 유용한 양일 수 있다. 감염성 질병, 자기 항원과 관련된 질병 또는 중독성 물질과 관련된 질병을 치료하기위한 "효과량"은 항원-특이적 면역 반응을 유도하는데 효과적인 양일 수 있다. 임의의 특정한 용도를 위한 효과량은 치료되는 질병 또는 질환, 투여되는 특정한 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 대상의 크기, 또는 질병 또는 질환의 심각성과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 당 분야의 숙련자들은 과도한 실험에 대한 필요없이 특정한 올리고뉴클레오타이드의 효과량을 경험적으로 결정할 수 있다.
본 발명의 양태에서, 백신은 아쥬방트를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아쥬방트는 TLR9가 아닌 톨(Toll)류 수용체(TLR)에 대한 작용제이다. 일부 실시양태에서 TLR에 대한 작용제는 TLR3(예를 들면 안정화된 폴리I:C), TLR4(예를 들면 리포폴리사카라이드(LPS)의 유도체, 예를 들면 MPL 또는 GLA), TLR5(예를 들면 플라겔린), TLR7(예를 들면, 이미다조퀴놀린 계열의 작은 분자) 또는 TLR8(예를 들면, 이미다조퀴놀린 계열의 작은 분자)에 대한 작용제이다. 일부 실시양태에서, 아쥬방트는 알루미늄 염, 예를 들면 수산화알루미늄, 면역 자극성 복합체(ISCOM), 수중유 또는 유중수 현탁액, 리포솜, 또는 전달 시스템, 예를 들면 나노입자 또는 마이크로입자이다.
용어 효과량의 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오타이드란 원하는 생물학적 효과를 실현하는데 필요하거나 충분한 양을 의미한다. 예를 들면 항원-특이적 면역 반응을 유도하기 위해 항원과 함께 투여되는 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 효과량은 항원에 노출되었을 때 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 필요한 양이다. 본원에 개시된 개시내용과 조합하여, 다양한 활성 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및 가중 인자, 예를 들면 효능, 상대적 생물학적 이용가능성, 환자의 체중, 부작용의 심각성 및 바람직한 투여 방식 중에서 선택함으로써, 실질적인 독성을 야기하지 않지만 특정한 대상을 치료하는데 효과적인, 효과적인 예방적 또는 치료적 치료 섭생이 계획될 수 있다. 임의의 특정한 용도를 위한 효과량은 치료되는 질병 또는 질환, 투여되는 특정한 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오타이드, 대상의 크기 또는 질병 또는 질환의 심각성과 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 당 분야의 숙련자들은 본원의 개시내용을 참고하여 과도한 실험을 하지 않고서도 특정한 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오타이드 및/또는 항원 및/또는 다른 치료제의 효과량을 실험적으로 결정할 수 있다.
국소 전달을 위해 본원에 개시된 화합물의 대상 투여량은 전형적으로 투여당 약 0.1 ㎍ 내지 50 mg의 범위이고, 이는 용도에 따라 매일, 매주 또는 매달, 및 이들 사이의 임의의 다른 시기에 투여될 수 있다. 보다 전형적으로 국소 투여량은 투여당 약 10 ㎍ 내지 10 mg의 범위이고, 전형적으로 약 100 ㎍ 내지 1 mg의 범위이고, 2 내지 4회 투여는 며칠 또는 몇주의 간격을 갖는다. 보다 전형적으로 면역 자극제 투여량은 투여당 1 ㎍ 내지 10 mg의 범위이고, 가장 전형적으로는 10㎍ 내지 1 mg의 범위이고, 매일 또는 매주 투여한다. 항원-특이적 면역 반응을 유도할 목적으로 비경구 전달되기 위한 본원에 개시된 화합물의 대상 투여량(여기서, 화합물은 항원과 함께 전달되지만 다른 치료제와는 함께 전달되지 않는다)은 전형적으로 백신 아쥬방트 또는 면역 자극 용도를 위한 효과적인 국소 투여량에 비해 5 내지 10,000배 더 높고, 보다 전형적으로는 10 내지 1,000배 더 높고, 가장 전형적으로는 20 내지 100배 더 높다. 비경구 전달을 위해, 예를 들면 CpG 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 다른 치료제와 조합되거나 특수 전달 비히클에서 투여되었을 때 선천적인 면역 반응을 유도하기 위한, ADCC를 증가시키기 위한, 항원 특이적 면역 반응을 유도하기 위한 비경구 전달을 위한 본원에 개시된 화합물의 투여량은 전형적으로 투여당 약 0.1 ㎍ 내지 10 mg의 범위이고, 이는 용도에 따라 다양하고, 매일, 매주, 매달, 및 이들 사이의 임의의 다른 시기에 투여될 수 있다. 보다 전형적으로 이들 목적을 위한 비경구 투여량은 투여당 10 ㎍ 내지 5 mg의 범위이고, 가장 전형적으로는 100㎍ 내지 1 mg의 범위이고, 2 내지 4회 투여는 며칠 또는 몇주의 간격을 갖는다. 그러나, 일부 실시양태에서, 이들 목적을 위한 비경구 투여는 전술된 전형적인 투여량에 비해 5 내지 10,000배 더 높은 범위로 사용될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 화합물의 경우, 치료 효과량은 먼저 동물 모델로부터 결정될 수 있다. 치료 효과량은 또한 인간에서 시험된 (인간에 대한 임상 실험이 시작됨) CpG 올리고뉴클레오티드, 및 유사한 약학 활성을 나타내는 것으로 알려진 화합물, 예를 들어 다른 아쥬방트, 예를 들어 LT 및 백신접종을 위한 다른 항원에 대한 인간 데이타로부터 결정할 수 있다. 비경구 투여를 위해서는 투여량이 많아야 한다. 사용되는 투여량은 상대적인 생물학적 이용가능성 및 투여되는 화합물의 효능을 기초로 조절될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 당업계에 잘 알려진 다른 방법을 기준으로 하여 최대 효과를 달성하기 위해 투여량을 조절하는 것은 당업자에게는 용이한 일이다.
본 발명의 제제는 약학적으로 허용가능한 용액으로 투여되며, 이 용액은 통상적으로, 약학적으로 허용가능한 농도의 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 아쥬방트, 및 선택적으로 다른 치료 성분을 함유할 수 있다.
치료에 사용하기 위해서, 효과량의 CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오타이드를 목적하는 표면으로 전달하는 임의의 방식에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여는 당업자에게 알려진 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 투여 경로에는 비경구(예를 들면 근육내, 피하, 경피, 정맥내, 방광내 또는 복강내), 국소(예를 들면 피부(경피), 점막), 경구, 비강내, 질내, 직장내, 협측, 안내 또는 설하를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
단독으로 또는 다른 치료제와 조합된 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 본원에 개시된 임의의 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 바람직한 실시양태에서, 투여는 국소이다. 국소 투여는 점막 표면, 예를 들면 입과 생식기의 피부와 같은 피부로의 국소 투여를 포함한다.
면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 이들이 전신으로 전달되는 것이 바람직한 경우, 주사에 의해, 예를 들면 환괴 주입 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여되도록 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 방부제가 첨가된 단위 투여 형태, 예를 들면 앰플 또는 다중 투여 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액 또는 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액의 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 약학 제제는 수용성 형태인 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 수용액을 포함한다. 또한 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들면 호마유 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들면 에틸 올리에이트 또는 트라이글리세라이드 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유한다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 용해성을 증가시켜 매우 농축된 용액으로의 제조를 가능하게 하는 물질을 함유할 수 있다.
면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 이들이 전신으로 전달되는 것이 바람직한 경우, 주사에 의해, 예를 들면 환괴 주입 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여되도록 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 방부제가 첨가된 단위 투여 형태, 예를 들면 앰플 또는 다중 투여 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액 또는 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액의 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제제화제를 함유할 수 있다.
불활성 물질을 이용하여 치료제를 희석시키거나 치료제의 체적을 증가시킬 수 있다. 이런 희석제는 탄화수소, 특히 만니톨, a-락토스, 무수 락토스, 셀룰로스, 슈크로스, 개질된 덱스트란 및/또는 전분을 포함할 수 있다. 칼슘 트라이포스페이트, 마그네슘 카보네이트 및/또는 나트륨 클로라이드를 비롯한 일부 무기 염은 충진제로서 사용될 수 있다. 일부 상업적으로 입수가능한 희석제에는 Fast-Flo, 엠덱스 (Emdex), STA-Rx 1500, 엠콤프레스 (Emcompress) 및 아비셀 (Avicell)이 있다.
치료제가 수성 환경으로 용해되는 것을 돕기 위해, 계면활성제가 습윤제로서 첨가될 수 있다. 계면활성제는 음이온성 세제, 예컨대 라우릴황산나트륨, 디옥틸 나트륨 설포숙시네이트 및/또는 디옥틸 나트륨 설포네이트를 포함할 수 있다. 양이온성 세제가 사용될 수 있고, 상기 세제에는 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토뮴 클로라이드가 포함될 수 있다. 계면활성제로서 제제화에 포함될 수 있는 잠재적 비-이온성 세제의 목록에는 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 피마자유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스가 있다. 이들 계면활성제는 단독으로 또는 상이한 비율로의 혼합물로서 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 제제에 존재할 수 있다.
비경구 투여를 위한 약학 제제는 수용성 형태인 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 수용액을 포함한다. 또한 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들면 호마유 또는 합성 지방산 에스터, 예를 들면 에틸 올리에이트 또는 트라이글리세라이드 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유한다. 선택적으로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 용해성을 증가시켜 매우 농축된 용액으로의 제조를 가능하게 하는 물질을 함유할 수 있다.
다르게는, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드는 사용전에 적합한 비히클, 예를 들면 멸균된, 발열원이 없는 물로 구성되기 위한 분말 형태일 수 있다.
경구 투여의 경우, 화합물(즉, CpG 면역자극성 올리고뉴크레오타이드, 항원 및 다른 치료제)은 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 당업계에 공지된 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 배합하여 쉽게 제제화될 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 치료되는 대상에 의해 경구 섭취되기 위한 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액제 등으로 제제화되도록 할 수 있다. 경구 사용을 위한 약학 제제는 고형 부형제로서 수득되고, 선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원한다면 적절한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득할 수 있다. 적합한 부형제로는 특히, 락토스, 슈크로스, 만니톨, 소르비톨을 비롯한 당; 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)과 같은 셀룰로스 제제 등의 충전제가 있다. 필요한 경우, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 이들의 염, 예를 들어 알긴산나트륨과 같은 붕해제를 첨가할 수 있다. 선택적으로, 경구 제제는 내부의 산성 상태를 중화하기 위한 염수 또는 완충액, 즉 EDTA와 배합되거나 임의의 담체 없이 투여될 수도 있다.
상기 성분 또는 제제의 경구 투여형 또한 고려된다. 성분 또는 제제는 유도체의 경구 전달이 효과적이 되도록 화학적으로 개질될 수 있다. 일반적으로, 고려되는 화학 변형은 성분 또는 제제 그 자체에 하나 이상의 잔기를 부착하는 것이며, 여기서 상기 잔기는 (a) 단백질가수분해의 억제; 및 (b) 위 또는 장에서 혈액 스트림으로의 흡수를 허용한다. 또한, 성분 또는 제제의 전체 안정성의 증가 및 체내의 순환 시간 증가가 바람직하다. 이러한 잔기의 예에는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 및 폴리프롤린이 포함된다. [Abuchowski and Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, pp. 367-383]; [Newmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4: 185-189]. 사용될 수 있는 다른 중합체에는 폴리-1,3-다이옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸이 있다. 상기한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜 잔기가 약학적 용도에 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물의 비강내 전달 또한 고려된다. 비강내 전달은 본 발명의 약학 조성물이 치료 생성물을 코에 투여한 후 생성물이 폐에 점착될 필요없이 직접 혈류로 가는 것을 허용한다. 비강 전달용 제제는 덱스트란 또는 사이클로덱스트란을 갖는 것들을 포함한다.
비강내 투여의 경우, 유용한 장치는 계량 투여량 스프레이를 부착한 작은 경질 병이다. 한 실시양태에서, 계량 투여량은 본 발명의 제약 조성물 용액을 정해진 용적의 챔버(상기 챔버는 챔버 내의 액체가 압축될 경우 스프레이를 형성함으로써 에어로졸 제제를 에어로졸화시키는 크기의 천공을 갖는다) 내로 뽑아냄으로써 전달된다. 본 발명의 약학 조성물을 투여하기 위해 챔버가 압축된다. 특정 실시양태에서, 챔버는 피스톤 배열이다. 이러한 장치는 상업적으로 입수가능하다.
다르게는, 압착시에 스프레이를 형성하는 에어로졸 제제를 에어로졸화하기 위한 크기의 천공 또는 개방부를 갖는 플라스틱 압착 병을 사용한다. 개방부는 일반적으로 병의 상부에 있고, 상부는 에어로졸 제제의 유효한 투여를 위해 콧구멍에 부분적으로 부합되도록 일반적으로 점점 가늘어진다. 바람직하게는, 비강 흡입기는 결정된 투여량의 약물의 투여를 위해 에어로졸 제형의 계량된 양을 제공할 것이다.
협측 투여의 경우, 조성물은 종래 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
화합물은 또한 예를 들면 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 종래의 좌제 베이스를 함유하는 좌제 또는 잔류 관장제와 같은 직장 또는 질 조성물로 배합될 수 있다.
전술된 제제에 추가하여, 화합물은 또한 점적 제제로서 제제화될 수 있다. 이런 장기간 작용 제제는 적합한 중합성 또는 소수성 물질(예를 들면 허용가능한 오일중의 유화액) 또는 이온 교환 수지와 함께 배합되거나, 또는 거의 용해되지 않은 유도체, 예를 들면 거의 용해되지 않는 염으로 제형될 수 있다.
약학 조성물은 또한 적합한 고형 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 함유할 수 있다. 이런 담체 또는 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴 및 중합체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이로 한정되지는 않는다.
적합한 액상 또는 고상 제약 제제 형태로는, 예를 들어 흡입용 수용액 또는 염수 용액 형태, 미세캡슐화 형태, 엔코킬레이트화 형태, 미세한 금 입자상에 코팅된 형태, 리포솜내에 함유된 형태, 분무 에어로졸 형태, 피부에 이식되는 펠릿 형태, 또는 피부로 스크래치되는 날카로운 물건상에 건조된 형태가 있다. 약학 조성물은 또한 활성 화합물을 연장 방출시키는 과립, 분말, 정제, 코팅 정제, (미세)캡슐, 좌제, 시럽, 유화액, 현탁액, 크림, 점적제 또는 제제를 포함하며, 제제 중에 부형제 및 첨가제 및/또는 보조제, 예를 들어 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽윤제, 윤활제, 향미제, 감미제 또는 가용화제를 상기 설명된 바와 같이 통상적으로 사용한다. 약학 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에 사용하기에 적합하다. 약물 전달 방법에 대한 개략적인 검토를 위해서는, 본원에 참고로 포함되어 있는 [Langer, Science 249: 1527-1533, 1990]을 참조한다.
CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드, 임의로 다른 치료제, 및/또는 항원은 그 자체로(순수한 형태로) 또는 약학적으로 허용가능한 염 형태로 투여될 수 있다. 의학적으로 사용되는 경우, 염은 약학적으로 허용가능한 것이어야 하지만, 비-약학적으로 허용가능한 염도 통상적으로 그의 약학적으로 허용가능한 염을 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 염으로는 하기 산으로부터 제조되는 것들이 포함되지만 이에 한정되지 않는다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 설폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-설폰산, 및 벤젠설폰산. 이러한 염은 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염, 예를 들어 카복실산기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염으로 제조할 수 있다.
적합한 완충제로는 다음의 것들이 포함된다: 아세트산 및 그의 염 (1 내지 2％ w/v); 시트르산 및 그의 염 (1 내지 3％ w/v); 붕산 및 그의 염 (0.5 내지 2.5％ w/v); 및 인산 및 그의 염 (0.8 내지 2％ w/v). 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드 (0.003 내지 0.03％ w/v); 클로로부탄올 (0.3 내지 0.9％ w/v); 파라벤 (0.01 내지 0.25％ w/v) 및 티메로살 (0.004 내지 0.02％ w/v)이 포함된다.
본 발명의 약학 조성물은 효과량의 CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드, 및 임의로 항원, 및/또는 임의로 약학적으로 허용가능한 담체 중에 포함된 다른 치료제를 함유한다. 약학적으로 허용가능한 담체라는 용어는 인간 또는 다른 척추동물에 투여하기에 적합한 한가지 이상의 상용성 고상 또는 액상 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 담체라는 용어는 활성 성분과 조합되어 적용을 용이하게 하는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 의미한다. 약학 조성물의 성분은 또한 목적하는 약제 효능에 실질적으로 손상을 주는 상호작용이 없도록 하는 방식으로 본 발명의 화합물과 서로 혼합될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이 실시예는 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니다. 본원을 통해 인용된 참고문헌 (문헌의 참고문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원 및 동시 계류중인 특허 출원 포함)의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1:
면역자극성 올리고뉴클레오타이드 CPG 24555를 모델 항체로서 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 또는 오브알부민(OVA)을 이용하여 근육내(IM) 면역접종하였을 때 마우스에서 항원-특이적 면역 반응을 증대시키는 능력에 대해 올리고뉴클레오타이드 CPG 10103 및 CPG 7909와 비교하였다.
재료 및 방법:
모든 ODN은 동결건조된 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN)로부터 제조되었다. 간략하게, ODN을 내독소가 없는 트리스-EDTA 완충액, pH 8.0(옴니푸르(OmniPur: 등록상표); 뉴저지주 깁스타운 소재의 EM 사이언스 제품)에 용해시키고, 미생물 및 내독소 오염 둘 모두를 방지하게 위해 멸균 조건 하에서 멸균된 내독소가 없는 포스페이트 완충된 염수(PBS), pH 7.2(시그마 케미칼 캄파니; 미주리주 세인트 루이스 소재)에 희석시켰다. 저장 용액을 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다.
암컷 야생형 BALB/c 및 C57BI/6 마우스를 찰스 리버 캐나다(캐나다 퀘벡 소재)에서 구입하였다. C57 백그라운드에서 TLR9 결핍 마우스를 타코닉 팜스(Taconic Farms)에서 키우고 연구를 위해 콜레이 동물 보호소로 이동시켰다. 마우스를 콜레이 파마슈티칼 그룹 캐나다의 동물보호소에서 미세-격리 우리에 수용하였다. 모든 연구는 실험 동물 보호의 평가 및 인증을 위한 협회(AAALAC 인터내셔날) 및 동물 보호에 대한 캐나다 협의회의 가이드라인에 따라 콜레이 캐나다의 동물 보호 위원회에 따라 수행되었다. 연구 시작시 동물의 체중은 약 18 내지 20g 이었다.
마우스의 면역화
B형 간염 표면 항원( HBsAg )
50㎕의 총 체적 중의 1㎍의 HBsAg(ad 아형(Cliniqa, 4076)를 단독으로 또는 10 ㎍의 CPG 24555, CPG 10103 또는 CPG 7909와 함께 BALB/c 마우스(그룹당 10마리)의 왼쪽 경골근 앞쪽 근육에 근육내(IM) 면역화시켰다. 초기 면역시킨지 2주 후, 항응집제로서 헤파린을 이용하여 하악하 정맥을 통해 동물의 피를 뽑고 초기 면역화에 이용된 것과 동일한 백신 제형을 이용하여 부스팅하였다. 부스팅한지 2주 후, 항응집제로서 헤파린을 이용하여 심장 천공하여 동물을 채혈하고, 경추 탈골시켜 안락사시키고, 항원-특이적 CTL 활성, IFN-γ 분비(배양 상층액) 및 다중-사이토카인(IFN-γ, TNF-α 및 IL-2) 분비 CD4 대 CD8 T 세포의 검출에 대한 면역 분석에서 사용하기 위해 비장을 무균 제거하였다. 각각의 채혈 시점에서 얻은 혈장을 총 IgG 및 IgG 아형인 IgG1 및 IgG2a에 특이적인 항원의 검출을 위해 이용하였다.
닭의 오브알부민( OVA )
50㎕의 총 체적 중의 20㎍의 OVA 등급 VII(시그마, A7641)을 단독으로 또는 10 ㎍의 CPG 24555, CPG 10103, CPG 7909 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 C57BI/6 야생형 및 TLR9 결핍(C57BI/6 TLR9-/-) 마우스(그룹당 10마리)를 왼쪽 경골근 앞쪽 근육에 근육내(IM) 면역화시켰다. 초기 면역화시킨 지 14일 및 24일 후에 초기 면역화에 이용된 것과 동일한 백신 제형을 이용하여 부스팅하였다. 부스팅한지 7일 후, 항응집제로서 헤파린을 이용하여 심장 천공하여 동물을 채혈하고, 경추 탈골시켜 안락사시키고, 항원-특이적 CTL 활성, IFN-γ 분비(배양 상층액), 사량체 양성 CD8 T 세포 및 다중-사이토카인(IFN-γ, TNF-α 및 IL-2) 분비 CD4 대 CD8 T 세포의 검출에 대한 면역 분석에서 사용하기 위해 비장을 무균 제거하였다. 혈장을 총 IgG 및 IgG 아형인 IgG1 및 IgG2c에 특이적인 항원의 검출을 위해 이용하였다.
면역 분석
항원 특이적 항체 역가의 결정
종말점 희석 ELISA 분석(이는 각각의 동물에서 나온 시료를 3벌씩 이용하여 수행한다)에 의해 HBsAg(항-HBs) 또는 오브알부민(항-OVA)에 특이적인 항체(총 IgG, IgG1 및 IgG2a/c)를 검출하고 정량하였다. 종말점 역가는 비-면역 혈장에 비해 2배 이상 높은 흡광값(OD 450nm)을 생성하는 가장 높은 혈장 희석으로서 정의되고, 컷-오프 값이 0.05이다. 이들은 (GMT) ± SEM의 그룹 기하 평균 역가로서 보고된다.
CTL 반응의 평가
최종 면역화한지 1주(OVA의 경우) 또는 2주(HBsAg의 경우) 후에 제거된 비장을 항원 특이적 세포독성 T 림프구(CTL) 반응의 분석에 이용하였다. 비장을 10% 우태 혈청(유타주 로간 소재의 하이클론(Hyclone)), 페니실린-스트렙토마이신 용액(각각 1000 U/ml 및 1mg/ml의 최종 농도; 온타리오 버링톤 소재의 인비트로겐(Invitrogen)), L-글루타민(2mM의 최종 농도; 온타리오 버링톤 소재의 인비트로겐) 및 5x10-5 M의 β-머캅토에탄올(온타리오 버링톤 소재의 인비트로겐)이 보충된 RPMI 1640(유타주 로간 소재의 하이클론) 조직 배양 배지중에 단일 세포 현탁액으로 균질화시켰다. 비장 세포 현탁액(3x106 세포/ml) 중의 HBsAg-특이적 림프구를 HBsAg를 발현하는 조사된(irradiated) 뮤린 세포주(P815/S)와 함께 배양함으로써 5일간 재자극하고, 비장 세포 현탁액(3x106 세포/ml) 중의 OVA-특이적 림프구를 OVA를 발현하는 조사된 뮤린 세포주(EG.7)와 함께 배양함으로써 5일간 재자극하였다. 재자극 후, HBsAg 또는 OVA를 발현하는 세포를 죽이는 림프구의 가능성을 51Cr 방출 분석법을 이용하여 측정하였다. 결과를 표적(E:T) 비에 대한 서로 다른 효과자에서의 특이적 용균%로서 나타낸다.
비장 세포에 의한 항원 특이적 IFN -γ 분비의 평가
최종 면역화한지 1주(OVA의 경우) 또는 2주(HBsAg의 경우) 후 비장 세포를 이용하여 항원 재자극 후의 IFN-γ 분비를 측정하였다. 간략하게, 비장 세포 현탁액을 CTL 분석에 대해 수행한 바와 같이 제조하고, 최종 농도를 2% 정상 마우스 혈청(캐나다 온타리오 소재의 세달레인 래보레이토리즈(Cedarlane Laboratories)), 페니실린-스트렙토마이신 용액(각각 1000 U/ml 및 1mg/ml의 최종 농도; 온타리오 버링톤 소재의 인비트로겐), L-글루타민(2mM의 최종 농도; 온타리오 버링톤 소재의 인비트로겐) 및 5x10-5 M의 β-머캅토에탄올(온타리오 버링톤 소재의 인비트로겐)이 보충된 RPMI 1640(유타주 로간 소재의 하이클론) 조직 배양 배지[완전 RPMI 1640]에 ml당 5x106 세포의 최종 농도로 조절하였다. 비장세포 현탁액을 완전 RPMI 1640중의 적절한 농도로 희석된 100㎕의 각각의 자극제(적절한 도면 레전드 상에 기재된 바와 같음)와 함께 96웰 U-바닥 조직 배양 플레이트(웰당 100㎕) 상으로 플레이팅하였다. 콘카나발린 A(10㎍/ml, 시그마)를 양성 대조군으로 이용하고, 배지만으로 배양된 세포를 음성 대조군으로 이용하였다. 각각의 비장 세포 시료를 3벌씩 플레이팅하고, 세포를 37℃에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 72시간동안 배양하였다. 배양 상층액을 배양 기간 끝에 수확하고, 분석할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 시판되는 분석 키트(마우스 IFN-γ OptEIA; 온타리오주 미시사우가 소재의 BD 파밍겐(BD Pharmingen))를 제조자의 지시에 따라 이용하여 배양 상층액의 IFN-γ 수준을 측정한다.
OVA 사량체 양성 CD8 개체군의 정량
전술된 바와 같이 수득된 비장 세포 현탁액을 이용하여 FACS에 의해 OVA 사량체 양성 CD8 개체군을 정량하였다. 개별적인 비장에서 나온 비장 세포(2x106)를 500ml의 염색 완충액(1% 우태 혈청(유타주 로간 소재의 하이클론) 및 0.1% 나트륨 아지드(시그마))을 함유하는 12x75mm 시험관에 옮겼다. 세포를 1200rpm에서 5분동안 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 세포를 4℃에서 10분동안 항-마우스 CD16/CD32(Fc 블록)(BD 파밍겐)과 함께 배양함으로써 Fc 수용체를 블록킹하였다. 세포를 염색 완충액으로 세척하고 클래스-1 OVA-특이적(SIINFEKL) 사량체(베크만 쿨터(Beckman Coulter))를 이용하여 4℃에서 20분동안 염색하였다. 그런 다음, 세포를 염색 완충액으로 다시 세척하고, 4℃에서 20분동안 항-마우스 CD8a-FITC(BD 파밍겐)로 염색하였다. 세포를 염색 완충액으로 세척하고, 500㎕의 염색 완충액에 재현탁시키고, FC500 유동 세포계측기(베크만 쿨터)를 이용하여 분석하였다. OVA-특이적 CD8 T 세포를 CD8a 및 사량체에 둘 모두에 대해 양성인 세포로서 확인하였다. 자료를 CD8 및 사량체 양성 세포의 %로서 표시한다.
항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군의 정량
각각의 군에 대해 수집된 비장 세포 현탁액을 2% 정상 마우스 혈청(캐나다 온타리오 소재의 세달레인 래보레이토리즈(Cedarlane Laboratories)), 페니실린-스트렙토마이신 용액(각각 1000 U/ml 및 1mg/ml의 최종 농도; 온타리오 버링톤 소재의 인비트로겐), L-글루타민(2mM의 최종 농도; 온타리오 버링톤 소재의 인비트로겐) 및 5x10-5 M의 β-머캅토에탄올(온타리오 버링톤 소재의 인비트로겐)이 보충된 RPMI 1640(유타주 로간 소재의 하이클론) 조직 배양 배지 중에서 24웰 조직 배양 플레이트에서 재자극시켰다.
CD4 재자극의 경우: 5x106 개의 세포를 5㎍/ml의 HBsAg를 함유하는 1ml의 최종 체적 중에서 하룻밤동안 자극하였다.
CD8 재자극의 경우: 5x106 개의 세포를 5㎍/ml의 HBs 펩타이드(IPQSLDSWWTSL)를 함유하는 1ml의 최종 체적 중에서 5시간동안 자극하였다.
자극제가 없는 배지를 음성 대조군으로 이용하였고, 여기서 10ng/ml의 PMA(시그마) 및 1㎍/ml의 이오노마이신(시그마)(배양의 마지막 4시간동안 첨가됨)을 양성 대조군으로 이용하였다. 또한, 재자극의 마지막 4시간동안 브레펠덴 A(BD 파밍겐) 및 모넨신(BD 파밍겐)을 첨가하여 단백질 이동을 정지시켰다.
재자극 후, 세포를 염색 완충액으로 세척하고, 세포를 4℃에서 10분동안 항-마우스 CD16/CD32(Fc 블록)(BD 파밍겐)과 함께 배양함으로써 Fc 수용체를 블록킹하였다. 그런 다음, 세포를 원심분리하고, 항-마우스 CD4-ECD(인비트로겐) 또는 항-마우스 CD8-ECD(인비트로겐)중 하나를 5㎍/ml 함유하는 염색 완충액에 재현탁시키고, 4℃에서 30분동안 항온처리하였다. 세포를 염색 완충액으로 세척하고, BD Fix/Perm 용액(BD 파밍겐)에서 20분동안 4℃에서 재현탁시켰다. 세포를 BD Perm 세척 용액(BD 파밍겐)으로 다시 세척하고, 5㎍/ml의 각각의 IL-2-FITC(BD 파밍겐), TNF-APC(BD 파밍겐) 및 IFN-γ-PeCy7(BD 파밍겐)을 함유하는 1x BD Perm 세척 용액(BD 파밍겐)에 재현탁시키고, 광으로로부터 보호된 채로 실온에서 20분동안 항온처리하였다. 세포를 1X BD Perm 세척 용액(BD 파밍겐)으로 세척하고, 정상 염색 완충액에 재현탁시키고, FC500 유동 세포측정기(베크만 쿨터)를 이용하여 분석하였다.
결과
체액 면역 반응
시험된 3개의 CpG ODN(CPG 24555, 10103 및 7909) 모두 야생형 마우스에서 HBsAg 및 OVA-특이적 총 IgG 역가를 유의하게 증가시켰다(P<0.05). 마우스에서 HBsAg 또는 OVA-특이적 총 IgG를 증대시키는 이들의 능력의 측면에서 3가지 CpG ODN 사이에는 유의한 차이가 없었다.
TLR9 결핍 마우스에서 항체 역가를 증대시키는 CPG 24555, CPG 10103 및 CPG 7909의 능력을 OVA를 이용하여 시험하였다. 임의의 백신 섭생을 이용한 부스팅 1주일 후 검출된 전반적인 항체 역가는 100 미만이었고, CpG ODN중 어느 것도 단독으로 또는 비-CpG ODN 2137과 조합된 백신을 이용한 경우에 비해 OVA에 대한 항체 역가를 유의하게 증대시키지 않았다(자료는 도시되지 않음).
마우스에서 IgG 아이소타입 분포는 면역 반응의 성질을 나타내는 것으로 널리 이용되고 있고, 여기서 높은 IgG2a 또는 IgG2c 수준은 Th1 편향된 면역 반응을 나타내고, 높은 IgG1 역가는 Th2 편향된 면역 반응을 나타낸다. 3가지 CpG ODN 모두는 1 초과의 IgG2a/IgG1 및 IgG2c/IgG1 비를 갖는 강한 Th1 편향된 면역 반응을 유도하고, 항원을 단독으로 이용한 경우에 비해 유의하게 개선된 IgG2a/c 역가를 나타낸다(P<0.05)(도 2 참조).
세포 면역 반응: CTL 반응
Th1-계 반응을 측정하는 기능적 방법은 항원을 제시하는 표적 세포에 대한 CTL 활성을 측정하는 것이다. 도 3에 도시된 바와 같이 시험된 모든 CpG ODN은 항체를 단독으로 또는 비-CPG ODN 2137과 조합하여 이용한 경우에 비해 항원-특이적 CTL 반응을 상당히 개선시킬 수 있다(P<0.05; 도 3 우측 패널). 시험된 CpG ODN 사이에는 OVA-특이적 CTL의 유도를 촉진시키는데 있어 유의한 차이가 없었고, 단 6.25:1의 E:T 비에서 CPG 24555 및 CPG 7909 둘 모두 CPG 10103이 투여된 군에 비해 상당히 더 높은 OVA-특이적 CTL을 보여주었다.
HBsAg를 이용한 경우, CPG 7909가 아닌 CPG 24555 및 CPG 10103 둘 모두가 항원이 단독으로 사용된 경우에 비해 상당히 더 높은 항원-특이적 CTL 반응을 유도할 수 있었다(P<0.05; 도 3 좌측 패널). 마우스에서 HBsAg-특이적 CTL 반응의 유도를 촉진하는 능력에 있어 CPG 24555와 CPG 10103 사이에는 유의한 차이가 없었다.
CTL 반응의 CpG ODN 매개된 증가는 TLR9 결핍 마우스에서 관찰되지 않았다(도 4).
항원 특이적 CD8 T 세포
MHC 클래스 I H-2Kb -SIINFEKL 특이적 사량체를 이용하여 OVA로 면역화된 마우스에서 CD8 T 세포를 정량화하였다. 시험된 모든 CpG ODN은 OVA가 단독으로 이용되거나 비-CpG 대조군 ODN 2137과 조합되어 이용된 경우에 비해 항원-특이적 CD8 T 세포를 증가시켰다(도 5). CPG 7909는 OVA-특이적 CD8 T 세포의 유도를 촉진하는데 있어 CPG 24555 및 10103에 비해 우수하였다(P<0.05). OVA-특이적 CD8 T 세포를 유도하는 능력에 있어 CPG 24555와 10103 사이에는 유의한 차이가 없었다(P<0.05).
OVA 특이적 CD8 T 세포의 CPG 매개된 증대는 TLR9 결핍 마우스에서는 관찰되지 않았다(도 5).
항원 특이적 IFN -γ 분비
효소 면역분석을 이용하여 백신화된 항원으로 재자극된 비장 세포의 배양 상층액중에서 사이토카인을 검출함으로써, 세포 면역성의 척도로서 항원 자극에 반응한 인터페론 감마(IFN-γ) 생산을 또한 조사하였다. CPG 24555 또는 CPG 10103와 함께 HBsAg 또는 OVA 중 하나로 면역화된 동물에서 수확된 비장 세포의 배양 상층액은 항원 단독으로 면역화된 경우에 비해 상당히 더 높은 수준의 IFN-γ를 나타내었다. HBsAg를 이용한 경우, CPG 24555는 CPG 10103 또는 CPG 7909에 비해 항원 특이적 IFN-γ 분비를 촉진시키는데 있어 상당히 더 우수하였다(도 6; 왼쪽 패널). OVA를 사용한 경우, 항원 특이적 IFN-γ 분비를 촉진시키는데 있어 CPG 24555는 CPG 10103과는 동일하였지만, CPG 7909보다 우수하였다(도 6; 우측 패널).
항원-특이적 IFN-γ 분비의 CpG ODN 매개된 증대는 TLR9 결핍 동물에서는 관찰되지 않았다(도 7).
항원 특이적 다중-사이토카인 분비 T 세포 개체군
보다 최근의 발견에 따르면, T 세포에 의한 IFN-γ 생산 만으로는 보호성 면역 반응을 유도하는 항원-특이적 T 세포의 능력이 예상되지 않는다. 따라서, 본 연구에서, 본 출원인은 다색성 유동 세포계측기를 이용하여 IL-12, TNF-α 및 IFN-γ를 생산하는 항원-특이적 CD4 및 CD8 T 세포의 능력을 평가하였다.
CD4 및 CD8 T 세포 둘 모두의 경우, IFN-γ 및 TNF-α 분비와 비교하였을 때 비교적 낮은 수준의 IL-12 분비가 관찰되었다(도 8). CD4 T 세포의 경우, CPG 24555는 CPG 10103 및 7909에 비해 더 높은 비율의 2종 사이토카인 분비 T 세포가 유도되도록 도왔다(CPG 24555의 경우 23%인 반면, CPG 10103 및 7909의 경우 각각 4% 및 6%). 전반적으로, 매우 낮은 3종 사이토카인 생산 HBsAg 특이적 CD4 T 세포가 관찰되었다(CPG 24555, 10103 및 7909의 경우 각각 2, 0 및 1%)(도 8A).
CD8 T 세포의 경우, CPG 24555 및 CPG 7909 둘 모두 CPG 10103에 비해 높은 수준의 2종 사이토카인 분비 T 세포를 유도하였다(CPG 24555 및 CPG 7909의 경우 각각 48 및 56%이고, CPG 10103의 경우 단지 19%). CD4 세포와 유사하게, 매우 낮은 %의 3종 사이토카인 생산 HBsAg-특이적 CD8+ T 세포가 관찰되었다(CPG 24555, 10103 및 7909의 경우 각각 1, 0 및 0%)(도 8B).
Figure 112011051994510-pct00001
Figure 112011051994510-pct00002
논의
2개의 모델 항체인 HBsAg 및 OVA를 이용하였을 때 마우스에서 항원-특이적 면역 반응을 증대시키는 능력에 대해 CPG 24555를 CPG 10103 및 CPG 7909와 비교하도록 연구를 디자인하였다. CPG 24555 및 CPG 10103은 CPG 24555가 가장 3' 의 CG 다이뉴클레오타이드의 반전을 가져서 CPG 24555에서 CpG 모티프가 제거된 점을 제외하고는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. CPG 7909는 다수의 백신 항원을 이용한 인간 임상 실험에서 입증된 아쥬방트 활성을 갖는 B 클래스 CpG ODN이다.
CPG 24555에서 3' CpG 모티프의 제거는 항원-특이적 면역 반응을 증대시키는 능력에 임의의 부정적 영향을 미치지 않았고, CPG 10103과 비교하였을 때 동일하거나(사량체 염색으로 측정된 항원-특이적 CD8 T 세포 및 항체 반응), 더 우수한(항원 특이적 IFN-γ 분비) 적응적 면역 반응의 증대를 나타내었다. 유사하게, CPG 24555는 CTL 반응뿐 아니라 항원 특이적 항체 반응의 증대에서 CPG 7909와 동일하였다. CPG 24555는 항원 특이적 IFN-g 분비를 촉진시키는데 있어 CPG 7909에 비해 우수하였다.
TLR9 결핍 마우스에서는 적응적 면역 반응에서의 증대가 보이지 않았기 때문에 시험된 3가지 CpG ODN 모두를 이용한 적응성 면역 반응의 증대는 TLR9 의존적이었다.
표 1에 도시된 바와 같이, CPG 24555를 이용하였을 때 더 높은 비율의 IFN-γ을 생성하는 항원-특이적 CD4+ T 세포가 수득되었다. 또한 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2중 2개 이상의 사이토카인(즉, IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두, IFN-γ 및 IL-2 둘 모두, 또는 TNF-α 및 IL-2 둘 모두, 또는 심지어는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2을 분비하는 3종 생산자)을 생성하는 다기능성 항원-특이적 CD4+ T 세포가 더 높은 비율로 수득되었다.
CD8+ T 세포의 경우(표 2), 2개의 사이토카인, 특히 IFN-γ 및 TNF-α 둘 모두, 또는 IFN-γ 및 IL-2 둘 모두를 생산하는 다기능성 항원-특이적 CD8+ T 세포가 높은 비율로 수득되었다.
이와 함께 이들 결과는 아쥬방트로서 이용되는 경우, CPG 24555가 CPG 10103에 비해 다기능성 항원-특이적 T 세포 개체군을 생산하는데 있어 더 우수함을 보여준다. 이는 다기능성 T 세포가, 특히 케모카인(IFN-γ, TNF-α 및 IL-2) 생산의 측면에서, 단일한 사이토카인을 분비하는 T 세포에 비해 더 우수한 효과기 세포인 것으로 생각되므로 중요할 수 있다.
실시예 2
CPG 24555 및 CPG 10103의 비교
시험된 ODN 의 뉴클레오타이드 서열
CPG ODN 10103
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3'(서열 번호:2)
CPG ODN 24555
5'T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3'(서열 번호:1)
비-CpG ODN 22881
5'T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*T*G*G*C*T*G*C*T*T*T*T 3'(서열 번호:4)
비-CpG ODN 2137
5'T*G*C*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T*T*T*G*T*G*C*T*T 3'(서열 번호:5)
*는 포스포로티오에이트 연결기(PS)를 나타낸다.
서열의 밑줄친 부분은 CPG ODN 10103과 CPG ODN 24555 사이의 차이를 나타낸다.
인간에 대한 최적의 CpG 모티프는 GTCGTT이다.
인간 PBMC 에서의 선천적인 면역성
인간 PBMC(5x106/ml)를 다양한 농도의 CPG 10103, CPG 24555 또는 비-CpG 대조군 ODN 22881과 함께 24시간 또는 48시간동안 배양하였다. 세포 현탁액을 수집하고, 시판되는 ELISA 키트를 이용하여 사이토카인/케모카인 분비에 대해 평가하였다(도 9a 및 도 9b).
BALB /c 마우스에서의 생체 내의 선천적인 면역성
BALB/c 마우스(그룹당 5마리)에 PBS(위약 대조군), CPG 24555, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137을 100㎍ 투여 수준으로 피하 주사하였다. 주사한지 3시간 후에 동물을 채혈하고, 혈장을 상업적 ELISA를 이용하여 IP-10(도 10a) 및 IL-12(도 10b) 또는 IL-6(도 10c)에 대해 분석하였다. 도시된 결과는 그룹의 평균 ± 평균의 표준 편차(NS = 유의하지 않음)이다.
BALB /c 마우스에서 생체 내 체액 면역성
HBsAg(1㎍)를 10㎍의 CPG 24555, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 또는 이들 없이 BALB/c 마우스에 근육내 주사하였다. 마우스를 제0일 및 제14일에 주사하였다. 도시된 결과는 종말점 ELISA에 의해 측정된 부스팅 2주 후의 HBsAg 특이적 총 IgG 역가이다(도 11a).
OVA(20㎍)를 10㎍의 CPG 24555, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 또는 이들 없이 C57bl/6 마우스에 근육내 주사하였다. 마우스에게 제0일, 제7일 및 제21일에 주사하였다. 도시된 결과는 최종 부스팅 1주 후의 OVA 특이적 총 IgG 역가이다(도 11b).
텍사스 1/77에서 나온 인플루엔자 A HA, H3N2(1㎍) ± 알룸(25㎍의 Al3+)를 10㎍의 CPG 24555, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 또는 이들 없이 BALB/c 마우스에 근육내 주사하였다. 마우스를 제0일 및 제14일에 주사하였다. 도시된 결과는 종말점 ELISA에 의해 측정된 면역화 후의 다양한 시점에서 HA 특이적 총 IgG의 동역학이다(도 11c).
BALB /c 마우스에서의 T 세포 반응
HBsAg(1㎍)을 10㎍의 CPG ODN 24555, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 또는 이들 없이 BALB/c 마우스에 근육내 주사하였다. 마우스를 제0일 및 제14일에 주사하였다. 도시된 결과는 부스팅 2주 후 51Cr 방출에 의해 측정된 HBsAg 특이적 CTL이다(도 12a).
OVA(20㎍)를 10㎍의 CPG 24555, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 또는 이들 없이 C57bl/6 마우스에 근육내 주사하였다. 마우스를 제0일, 제7일 및 제21일에 주사하였다. 도시된 결과는 부스팅 1주 후 51Cr 방출에 의해 측정된 OVA 특이적 CTL이다(도 12b).
HBsAg(1㎍)을 10㎍의 CPG 24555, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 또는 이들 없이 BALB/c 마우스에 주사하였다. 마우스를 제0일 및 제14일에 주사하였다. 최종 부스팅 2주 후의 비장 세포를 72시간동안 각각의 항원과 함께 배양하고, 배양 상층액을 ELISA에 의해 IFN-γ에 대해 시험하였다(도 13a).
OVA(20㎍)를 10㎍의 CPG 24555, CPG 10103 또는 비-CpG 대조군 ODN 2137과 함께 또는 이들 없이 C57bl/6 마우스에 근육내 주사하였다. 마우스를 제0일, 제7일 및 제21일에 주사하였다. 최종 부스팅 1주 후의 비장 세포를 72시간동안 각각의 항원과 함께 배양하고, 배양 상층액을 ELISA에 의해 IFN-γ에 대해 시험하였다(도 13b).
결과 및 논의
CPG 10103 및 CPG 24555는 CPG 10103에 존재하는 가장 3' 쪽의 CG 다이뉴클레오타이드가 CPG 24555에서 GC로 반전되어 CPG 24555에서 CpG 모티프가 제거된 점을 제외하면 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 이전의 보고에 근거하면, 측면 서열, 모티프 위치 및 간격이 동일하게 주어졌을 때, CPG 모티프의 수가 증가되면 면역 자극의 개선이 야기되어야만 한다. 종래의 지식에 근거하면, CPG 24555는 CPG 10103에 비해 덜 면역자극성이고 백신 아쥬방트로서 덜 효과적일 것으로 예상되었다. 그러나, 상기 결과는 CPG 24555가 CPG 10103과 유사하거나 이보다 더 우수한 면역자극 능력 및 아쥬방트 활성을 가짐을 입증하였다.
실시예 3
BALB /c 마우스에서 인플루엔자 헤마글루티닌 항원( HA )에 대한 백신 아쥬방트로서의 CPG 10103, CPG 24555 및 CPG 7909의 비교
방법 및 재료
암컷 BALB/c 마우스(그룹당 10마리)의 왼쪽 경골근 앞쪽(TA) 근육에 50㎕의 총 체적 중의 텍사스 1/77에서 나온 인플루엔자 A 헤마토글루티닌(HA), H3N2(1㎍) ± CPG 또는 대조군 ODN(10mg) ± 알룸(25mg Al3+)을 근육내(IM) 주사함으로써 마우스를 면역화시켰다. HA-특이적 항체 반응을 평가하기 위해 면역화후 서로 다른 시간 간격에서 마우스에서 채혈하였다. 한 그룹당 동물의 절반을 면역화시킨지 6주 후에 안락사시켜 세포 매개된 면역 반응(CTL, HA-특이적 IFN-g 분비 및 T-세포 사이토카인 분비의 유동 세포계측기 분석)을 평가하였다.
Figure 112011051994510-pct00003
결과 및 논의
면역화 6주 후의 항- HA
면역화 6주 후, 항-HA의 양을 측정하였다. HA-특이적 IgG를 증대시키는데 있어 CPG 24555가 CPG 10103 및 CPG 7909에 비해 우수하였다.
면역화 4주 후의 헤마글루틴화 억제( HIA ) 역가
헤마글루틴화 억제 분석(HIA)을 이용하여 항체의 성능을 평가하였다. 아쥬방트로서 단독으로 사용되는 경우, CPG 24555는 HIA 역가의 증대란 측면에서 CPG 10103에 비해 우수하였고(p=0.009), CPG 7909와 동일하였다(p=0.1)(도 15). 시험된 3가지 CpG ODN 모두가 알룸과 조합되어 사용될 경우 HIA 역가 증대에 대해 동일하였다.
HA -특이적 IFN γ 분비
분비된 IFNγ의 농도를 측정하였다. CPG 24555는 아쥬방트로서 단독으로 사용될 경우 HA-특이적 IFN-γ 분비의 증대(세포 매개된 면역성의 표지) 측면에서 CPG 10103보다 우수하였다(도 16). 알룸과 조합되어 사용되는 경우 HA-특이적 IFN-γ 분비의 증대 측면에서 CPG 24555는 CPG 10103 및 CPG 7909에 비해 우수하였다.
실시예 4
시아노몰구스 원숭이에서 B형 간염 표면 항원( HBsAg )에 대한 백신 아쥬방트로서 CPG 24555 및 CPG 7909의 비교
재료 및 방법
시아노몰구스 원숭이(3 내지 5살, 2.5 내지 5.5kg; 그룹당 5마리, 단, HBsAg + IMX 군의 경우 4마리)를 하기로 근육내(우측 사두근에 0.6ml IM 주사)로 면역화시켰다:
1) 엔게릭스(Engerix)-B(소아과 투여량; 10mg HBsAg)
2) 엔게릭스-B + CPG 7909(0.5mg)
3) 엔게릭스-B + CPG 24555(0.5mg).
동물을 0주(초기), 4주(1차 부스팅) 및 8주(2차 부스팅)에 3회 면역화시켰다. 초기 면역화 전, 초기 면역화 4주 후(제4주), 1차 부스팅 2주 후(제6주), 1차 부스팅 4주 후(제8주) 및 2차 부스팅 2주 후(제10주)에 동물에서 채혈하였다.
HBsAg 특이적 면역 분석을 하기와 같이 실시하였다:
1) 항체 역가 및 항체 결합능
2) 세포내 사이토카인 분비(IL-2, IFN-γ, TNF-α)
3) 다기능성 T 세포.
4) ELISPOT 분석: IL-2, TNF-α, IFN-γ, 퍼포린(Perforin).
결과 및 논의
체액 반응
본 연구에서 동물이 이전에 B형 간염 바이러스에 노출될 가능성은 백신접종 전에 검출된 높은 수준의 HBsAg 특이적 항체 역가에 의해 명확하였다. 또한, 혈청학에 의해 HBV에 양성으로 시험된 선적 동물중 한마리는 아마도 HBV에 노출된 것으로 제안되었다. 그러나, 본 연구에 사용된 모든 동물은 PCR에 의해 HBV에 대해 음성인 것으로 시험되었다. 각각의 부스팅에 따라 항-HBsAg 역가가 증가하였다. CpG를 엔게릭스-B에 첨가하면 엔게릭스-B를 단독으로 사용한 경우에 비해 HBsAg 특이적 항체 역가가 개선되었다(도 17). 또한, CpG의 첨가는 엔게릭스-B를 단독으로 이용한 경우에 비해 항체 결합능을 개선시켰다(도 18). CPG 24555는 항체 역가 및 항체 결합능 둘 모두를 개선시키는 측면에서 CPG 7909와 동일하였다.
T 세포 반응: CD4 T 세포에 의한 세포내 사이토카인 분비
CpG를 엔게릭스-B에 첨가하면 CD4 T 세포 매개된 INF-γ 및 TNF-α의 빈도를 증가시키지만 IL-2 분비는 증가시키지 않는다(도 19a, b 및 c). 전반적으로 CPG 24555는 CD4 매개된 사이토카인의 유도에 대해 CPG 7909와 동일하거나 이보다 우수하다.
T 세포 반응: 다기능성 CD4 T 세포: 정량 분석
1, 2 또는 3가지 사이토카인을 분비하는 세포의 수를 제10주(2차 부스팅 2주 후)에 측정하였다. CPG 24555는 하나의 사이토카인을 분비하는 엔게릭스-B 특이적 CD4 T 세포를 유도하는데 있어 CPG 7909와 동일하였다. 전반적으로 상대적으로 낮은 수준의 3종 사이토카인 생산 CD4 T 세포가 검출되었다. 그러나, CPG 24555는 CPG 7909 또는 엔게릭스-B 단독에 비해 더 많은 3종 사이토카인 생산 CD4 T 세포를 유도하였다(도 20a). 또한, 엔게릭스-B + CPG 24555로 면역화된 동물은 엔게릭스-B 단독 또는 엔게릭스-B + CPG 7909로 면역화된 동물에 비해 더 높은 비율의 3종 사이토카인 생산 T 세포를 가졌다(도 20b).
T 세포 반응: 다기능성 CD4 T 세포: 정성 분석
IL-2, IFN-γ 및 TNF-α 또는 이들 사이토카인의 조합을 분비하는 세포의 수를 측정하였다. CPG 24555는 다기능성 T 세포를 유도하는데 있어 CPG 7909와 동일하거나 이보다 우수하였다(도 21a 및 도 21b).
T 세포 반응: CD4 T 세포의 다기능성
3종 사이토카인 생산 CD4 T 세포의 비율을 2차 부스팅 2주 후에 측정하였다. CPG 7909에 비해 CPG 24555를 이용한 경우 더 높은 비율의 3종 사이토카인 생산 CD4 T 세포가 관찰되었다.
결론
자료에 근거하여, CPG 24555에서 3' CpG 모티프를 제거하더라도 항원-특이적 면역 반응을 증대시키는 능력에 임의의 부정적인 영향을 미치지 않았고, CPG 10103 및 CPG 7909에 비해 동일하거나 더 우수하게 적응성 면역 반응이 증대됨을 보여주었다. 마우스에서 다중 항원을 이용하여 보여지는 CPG 24555의 아쥬방트 활성은 또한 시아노몰구스 원숭이에서 B형 간염 표면 항원 + CPG 7909와 동일(체액 면역성)하거나 우수한(Ag-특이적 다기능성 T 세포) 아쥬방트 활성을 보여주는 CPG 24555를 이용한 비-인간 영장류로 번역되었다.
당 분야의 숙련자들은 정규적인 실험을 이용함으로써 본원에 개시된 발명의 특정한 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이런 등가물은 하기 청구범위에 포함되고자 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (30)

  1. 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'(서열 번호:1)의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 면역자극성 올리고뉴클레오타이드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 연결기가 개질된, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드.
  3. 제 2 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 연결기가 포스포로티오에이트인, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드.
  4. 제 1 항에 있어서,
    올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 친유성 치환되고, 올리고뉴클레오타이드가 피리미딘-퓨린 다이뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드.
  5. 항원 및 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 백신.
  6. 제 5 항에 있어서,
    면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 항원-특이적 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 존재하는, 백신.
  7. 제 6 항에 있어서,
    유도된 항원-특이적 면역 반응이 Th1 면역 반응인, 백신.
  8. 제 5 항에 있어서,
    항원이 미생물 항원, 자가 항원 또는 중독성 물질인, 백신.
  9. 제 8 항에 있어서,
    미생물 항원이 박테리아 항원, 바이러스 항원 또는 기생충 항원인, 백신.
  10. 제 9 항에 있어서,
    a) 박테리아 항원이 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 충치를 야기하는 박테리아 또는 치주 질환을 야기하는 박테리아와 관련되어 있거나,
    b) 바이러스 항원이 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 단순 포진 바이러스 1, 단순 포진 바이러스 2, 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1) 또는 HIV-2와 관련되어 있거나, 또는
    c) 기생충 항원이 말라리아를 야기하는 기생충과 관련되어 있는, 백신.
  11. 제 10 항에 있어서,
    a) 충치를 야기하는 박테리아가 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코커스 산구이스(Streptococcus sanguis), 락토바실러스 아시도필리스(Lactobacillus acidophilis) 또는 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus)이거나,
    b) 치주 질환을 야기하는 박테리아가 포피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 또는 악티노바실러스 악티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans)인, 백신.
  12. 제 8 항에 있어서,
    자가 항원이 종양 항원, 알츠하이머병과 관련된 항원, 인간 항체에 대한 항원, 인간 내인성 레트로바이러스 요소로부터 발현되는 항원, 또는 담체에 컨쥬게이트된 니코틴 합텐(hapten)인, 백신.
  13. 제 12 항에 있어서,
    a) 종양 항원이 HER2, MAGE, NY-ESO, PSA, CEA 또는 EGFR의 변이체 형태이거나;
    b) 알츠하이머병과 관련된 항원이 타우(tau) 또는 β-아밀로이드이거나;
    c) 항원이 IgE이거나; 또는
    d) 니코틴 합텐이 컨쥬게이트되어 있는 담체가 디프테리아 독소(DT)인, 백신.
  14. 제 5 항에 있어서,
    항원이 펩타이드, 재조합 단백질, 정제된 단백질, 전체 사멸된 병원균, 살아있는 약독화된 바이러스 또는 바이러스 벡터, 살아있는 약독화된 박테리아 또는 박테리아 벡터, 폴리사카라이드, 합텐이거나 또는 플라스미드 DNA에 의해 인코딩되는 것인, 백신.
  15. 제 5 항에 있어서,
    항원이 담체에 컨쥬게이트되어 있는, 백신.
  16. 제 15 항에 있어서,
    담체가 디프테리아 독소(DT) 또는 바이러스-유사 입자이고, 바이러스-유사 입자가 RNA 파지 Q-β, B형 간염 표면 항원(HBsAg) 또는 B형 간염 코어 항원(HBcAg)인, 백신.
  17. 제 5 항에 있어서,
    하나 이상의 아쥬방트를 추가로 포함하는 백신.
  18. 제 17 항에 있어서,
    아쥬방트가 TLR9가 아닌 Toll-류 수용체(TLR)를 위한 작용제(agonist)인, 백신.
  19. 제 18 항에 있어서,
    작용제가 TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 또는 TLR8을 위한 것인, 백신.
  20. 제 19 항에 있어서,
    a) TLR3 작용제가 안정화된 폴리I:C이고;
    b) TLR4 작용제가 모노포스포릴 지질 A (MPL) 또는 글루코피라노실 지질 A (GLA)이거나; 또는
    c) TLR5 작용제가 플라겔린인, 백신.
  21. 삭제
  22. 제 17 항에 있어서,
    아쥬방트가 알루미늄 염, 면역 자극성 복합체(ISCOM), 수중유 또는 유중수 유화액, 리포솜 또는 전달 시스템인, 백신.
  23. 제 22 항에 있어서,
    a) 알루미늄 염이 알루미늄 하이드록사이드이거나; 또는
    b) 전달 시스템이 나노입자 또는 미세입자인, 백신.
  24. 제 5 항에 있어서,
    면역 자극성 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 연결기가 개질된, 백신.
  25. 제 24 항에 있어서,
    a) 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 연결기가 포스포로티오에이트이거나; 또는
    b) 면역자극성 올리고뉴클레오타이드의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 친유성 치환되고, 면역자극성 올리고뉴클레오타이드가 피리미딘-퓨린 다이뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하는, 백신.
  26. 제 5 항에 있어서,
    투여용으로 배합된 백신.
  27. 제 5 항에 있어서,
    a) 백신이 비경구 경로로 투여되도록 배합되고, 여기서 비경구 투여가 근육내, 피하, 피내, 정맥내 또는 복강내이거나; 또는
    b) 백신이 국소 경로를 통해 투여되도록 배합되고, 여기서 국소 경로가 피부, 경피 또는 점막 표면인, 백신.
  28. 제 27 항에 있어서,
    점막 경로가 경구, 비강내, 질내, 직장내, 협측내 또는 안내인, 백신.
  29. 인간을 제외한 대상에서 항원-특이적 면역 반응을 유도하기에 효과적인 양의, 항원 및 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 면역자극성 올리고뉴클레오타이드를 인간을 제외한 대상에게 투여함을 포함하는, 항원-특이적 면역 반응을 필요로 하는 인간을 제외한 대상에서 항원-특이적 면역 반응을 유도하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    항원이 미생물 항원, 자가 항원 또는 중독성 물질인, 방법.
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