CN101555483A - 细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽及其重组枯草芽孢疫苗的制备与应用 - Google Patents
细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽及其重组枯草芽孢疫苗的制备与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101555483A CN101555483A CNA2009100515153A CN200910051515A CN101555483A CN 101555483 A CN101555483 A CN 101555483A CN A2009100515153 A CNA2009100515153 A CN A2009100515153A CN 200910051515 A CN200910051515 A CN 200910051515A CN 101555483 A CN101555483 A CN 101555483A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- egfabp
- vaccine
- echinococcus granulosus
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 97
- 201000003808 Cystic echinococcosis Diseases 0.000 title claims abstract description 94
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 90
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 90
- 241000244170 Echinococcus granulosus Species 0.000 title claims abstract description 73
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 66
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 16
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 title abstract 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 208000009366 Echinococcosis Diseases 0.000 claims abstract description 32
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 241000726221 Gemma Species 0.000 claims description 75
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 59
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 59
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 59
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 55
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 27
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 16
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 13
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 11
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 claims description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 7
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 4
- 101150037486 cotC gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 claims description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 206010014096 Echinococciasis Diseases 0.000 abstract description 16
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 11
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 abstract description 9
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 abstract description 7
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 abstract description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 abstract description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 abstract description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 5
- 241000282465 Canis Species 0.000 abstract description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 abstract description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 abstract description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 description 49
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 29
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 20
- 241000244160 Echinococcus Species 0.000 description 19
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 10
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 10
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 10
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 10
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 9
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 101100449439 Drosophila melanogaster grass gene Proteins 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000034994 death Effects 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 5
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 5
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 5
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 5
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 4
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000007235 immunity generation Effects 0.000 description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 4
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 206010011732 Cyst Diseases 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 206010027336 Menstruation delayed Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000244163 Echinococcus multilocularis Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 2
- 101100226596 Gallus gallus FABP gene Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 2
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 102220369447 c.1352G>A Human genes 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 208000019503 echinococcus granulosus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 2
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 238000010023 transfer printing Methods 0.000 description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFJIVOKAWHGMBH-UHFFFAOYSA-N 4-hexylbenzene-1,3-diol Chemical compound CCCCCCC1=CC=C(O)C=C1O WFJIVOKAWHGMBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022579 ATP dependent 26S protease Proteins 0.000 description 1
- 241000256173 Aedes albopictus Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241001032451 Bacillus indicus Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000754688 Cercaria Species 0.000 description 1
- 241000242722 Cestoda Species 0.000 description 1
- 241001327965 Clonorchis sinensis Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101150058771 FABP gene Proteins 0.000 description 1
- 102000030914 Fatty Acid-Binding Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(C)=O XUYPXLNMDZIRQH-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108700007696 Tetrahydrofolate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006035 Tryptophane Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 102220369446 c.1274G>A Human genes 0.000 description 1
- 102220369445 c.668T>C Human genes 0.000 description 1
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N chembl564271 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]2C(C)SC[C@H](N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NC(=O)[C@@H](NC2=O)CSC1C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C(=C\C)/NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]2NC(=O)CNC(=O)[C@@H]3CCCN3C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]3N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NC(=O)C(=C)NC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(O)=O)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)C1=CC=CC=C1 RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 108091022862 fatty acid binding Proteins 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 231100000206 health hazard Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004279 orbit Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102220023257 rs387907546 Human genes 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 108010082567 subtilin Proteins 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及细粒棘球绦虫EgFABP－Eg95多肽及其重组枯草芽孢疫苗的制备与应用。本发明提供了细粒棘球绦虫EgFABP－Eg95多肽、其编码基因及其抗体，本发明进一步提供了含有细粒棘球绦虫EgFABP－Eg95多肽编码基因的遗传工程化的宿主菌，本发明还提供了一种适用于包虫病中间宿主的疫苗及一种适用于包虫病终宿主的疫苗。利用本发明的细粒棘球绦虫EgFABP－Eg95多肽重组枯草芽孢疫苗，具有很高的抗逆性，耐高温、高盐、酸、碱和干燥，极易作为饲料添加剂使用，该疫苗可刺激宿主Th1和Th2应答，保护人和牛羊等中间宿主免受虫卵的感染，同时也可作为终宿主犬科动物的疫苗，促进成虫的排出，从而消除包虫病的传染源。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽及其重组枯草芽孢疫苗的制备与应用。
背景技术
益生菌(probiotics)属于微生态范畴，动物肠道内正常菌群中有益的微生物菌种经培养、发酵、干燥、加工等特殊工艺制成含有活菌或活菌制剂(Minocha A.Probiotics forpreventive health.Nutr Clin Pract.2009，24(2)：227-41)。这些微生态制剂能够去除或抑制肠道病原菌，维持肠道微生态平衡，调节宿主免疫机能，还合成和提供维生素、有机酸和多种酶类，降解饲料，达到防病、促生长、提高产量和品质。目前用于饲料中添加剂的菌种主要是芽孢杆菌类、乳酸菌类、酵母菌类三大类。其中枯草芽孢杆菌是美国FDA批准可用于食品和饲料工业的41种益生菌之一，是一种可用作饲料添加剂的需氧的非致病菌(Ducle H，et al，Characterization of Bacillus probiotics available for human use.ApplEnviron Microbiol.2004，70(4)：2161-71)。
枯草芽孢杆菌在贮藏过程中都以内生孢子的形式存在，不消耗饲料养分，可保持饲料的品质。芽孢杆菌抗逆性强，具有耐高温、耐酸碱、耐挤压等特点，可耐受颗粒饲料加工的影响。进入肠道后，在肠道上部迅速复活，复活率接近100％。它能使空肠内的pH值下降，氨浓度降低，并消耗大量的氧，维持肠道厌氧环境，抑制病菌的生长，维持肠道正常生态平衡，并有平衡和稳定乳酸菌的作用。它能产生活性很高的蛋白、淀粉、脂肪以及多种氨基酸。由于上述特点，芽孢杆菌是所有菌种中最理想的微生物添加剂(Hong HA，et al，The safetyof Bacillus subtilis and Bacillus indicus as food probiotics.J Appl Microbiol.2008Aug；105(2)：510-20)。近年来，我国从法、德、美等国家进口的益生菌种主要是芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌还可作为理想的疫苗递送系统(Ferreira LC，et al，Bacillus subtilis asa tool for vaccine development：from antigen factories to delivery vectors.FerreiraRC，Schumann W.An Acad Bras Cienc.2005，77(1)：113-24)。枯草芽孢杆菌由于其强大的表达和分泌能力以及对人畜的高安全性，被许多研究者作为外源蛋白，尤其是药物蛋白的表达系统(Lovett PS，Schoner RG.Expression plasmid for B.subtilis.Gene Amplif Anal.983；3：117-34.)。用敲除了细胞膜和细胞壁上的蛋白酶枯草芽孢杆菌突变株WB600作为表达系统，大大提高了对外源蛋白的表达分泌能力。该系统成功地高效表达了链激酶和人β-干扰素-1(Wong SL，Ye R，Nathoo S.Engineering and production of streptokinase in aBacillus subtilis expression-secretion system.Appl Environ Microbiol.1994Feb；60(2)：517-23.)。
枯草杆菌的芽孢蛋白是一种条件控制的分泌蛋白，有非常强大的启动子(Donovan W，etal，Genes encoding spore coat polypeptides from Bacillus subtilis.J Mol Biol.1987Jul 5；196(1)：1-10)，将外源基因与其重组，构建重组工程菌，表达分泌融合蛋白，掺入芽孢外膜中(Zhou Z et al，Immunogenicity of recombinant Bacillus subtilis sporesexpressing Clonorchis sinensis tegumental protein.Parasitol Res.2008Jan；102(2)：293-7)。重组工程菌大规模培养后，制备成芽孢粉作为饲料添加剂使用。重组芽孢在肠道上部复活后，迅速增殖，在肠粘膜表面形成生理性菌膜，分泌重组的抗原，刺激粘膜免疫，在空肠内大量的氧被消耗的情况下，重新形成表达抗原的芽孢，芽孢同样可以刺激粘膜免疫，利用该系统作为疫苗载体，开创了一条疫苗研究的新途径。
包虫病是世界性流行的危害严重的人兽共患寄生虫病。包虫病包括由细粒棘球绦虫感染引起的囊型包虫病和多房棘球绦虫引起的泡型包虫病。包虫病的传染源是感染了细粒棘球绦虫或多房棘球绦虫成虫的犬科动物，如狗、狼、狐狸等。成虫寄生在这些终宿主的小肠内，产生和排出大量的孕节，随粪便排出体外。孕节在外界环境中释放出大量的虫卵。这些虫卵污染牧草和水体，被各类食草类动物或人食入后，在消化道孵出六钩蚴，经肠壁到达肝、肺、腹腔、脑等全身多处组织器官，并发育为中绦期幼虫——棘球蚴或泡球蚴及囊型和泡型包虫。囊型包虫与宿主组织之间有一层无细胞结构的纤维样囊壁，形成了一道虫体与宿主之间的物理屏障，随着感染时间的延长，虫体不断增长，挤压宿主组织，引起占位性病变。一旦囊壁破裂，大量的囊液外泄，其中多种变应原引起的超敏反应可导致过敏性休克。泡型包虫与宿主组织之间没有囊壁隔开，囊泡中的原头节向外呈出芽性扩张生长，并具有类似肿瘤的浸润和转移能力，因此被称为“虫癌”，虫体在组织内一边生长，一边受宿主免疫系统攻击而死亡和钙化，引起各受累器官严重的功能障碍。在流行区，牛、羊、骆驼、马、野生的啮齿类动物感染十分普遍，给畜牧业带来巨大的经济损失。人的感染也比较普遍，造成的健康危害和疾病负担非常严重。因此，包虫病的预防控制受到流行区各个国家和地区的高度重视(张贤昌，包虫病防治，华南预防医学2007，33(4)：74-76)。
疫苗是包虫病防治的重要策略之一(Lightowlers MW.Vaccination against hydatiddisease.Dev Biol(Basel).2002；110：81-7.)。包虫在长期进化和适应过程中，形成了宿主选择性和宿主对虫体的免疫杀伤和免疫相容。包虫在感染过程中，90％以上的六钩蚴被免疫系统所摧毁，只有少数能存活下来并发育为中绦期；原头蚴在感染终宿主时，也仅有1~2％可以发育为成虫。这种免疫力的存在是包虫疫苗研制的基础。成虫寄生在犬科动物的小肠内，疫苗免疫保护机制不同于中绦期疫苗，成虫分泌的蛋白抗原成分刺激宿主肠粘膜免疫系统，产生以分泌IgA为主的粘膜免疫和系统免疫，但IgA的水平与虫负没有相关性，而IgE的水平与虫负密切相关，IgE升高可以促进成虫的排出。因此，针对成虫的疫苗抗原的筛选以产生特异性IgE的抗原为主。针对包虫中间宿主的疫苗，经实验证实具有完全保护的抗原有六钩蚴阶段特异表达Eg95抗原(Woollard DJ，et al，Protection against hydatid diseaseinduced with the EG95 vaccine is associated with conformational epitopes.Vaccine.2000Oct 15；19(4-5)：498-507)和整个生活史阶段都表达的脂肪酸结合蛋白(Fabp)抗原(Lightowlers MW，et al，Immunity and vaccine control of Echinococcus granulosusinfection in animal intermediate hosts.Parassitologia.2004 Jun；46(1-2)：27-31)。FABP大量表达于成虫皮层表面，介导虫体从宿主小肠中摄取虫体所必需的脂肪酸。Fabp具有变应原性质，可以刺激终宿主产生特异性IgE，引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒，促进成虫的排出。
发明内容
本发明的第一个目的是提供细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽、其编码基因及其抗体，并提供他们的制备与应用。
本发明的第二个目的是提供含有细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽编码基因的遗传工程化的宿主菌，其制备及其作为疫苗或饲料添加剂的应用。
本发明的第三个目的是提供适用于包虫病中间宿主的疫苗，其应用及效果评价方法。
本发明的第四个目的是提供适用于包虫病终宿主的疫苗，其应用及效果评价方法。
本发明的第一方面，提供了一种分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列是由细粒棘球绦虫六钩蚴特异表达的基因Eg95和虫体各期表达的基因FABP基因经连接序列拼接而成的重组基因。具体的，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：
(a)编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；
优选的，上述多核苷酸序列具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
本发明的多核苷酸是从细粒棘球绦虫成虫的全长cDNA文库中发现的。它包含了两个独立的基因EgFABP和Eg95。其中EgFABP含有完整的编码序列，Eg95是去除了5’端的分泌信号肽序列和3’端的跨膜序列的部分编码序列。这两部分序列通过编码4个甘氨酸的连接序列拼接在一起，这四个甘氨酸所组成的柔性接头片段，可使表达的两个肽段保持其原有的构象特征。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的多核苷酸包括：成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；术语“成熟多肽”是指天然蛋白多肽，去掉了信号肽序列或在翻译后修饰过程中去掉部分多肽的连续或非连续的多肽；附加编码序列指的是天然蛋白本身所没有的，为了保证蛋白的结构和功能而额外添加的编码短肽的多核苷酸。
本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸片段。如本发明所用，“多核苷酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少20-30个核苷酸，核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码EgFABP、Eg95基因或将二者连接起来的序列。
本发明中的多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的编码EgFABP、Eg95基因的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段；3)表达序列标签(EST)技术分离的多核苷酸片段；4)化学合成反向互补配对的DNA序列以获得双链DNA；5)用聚合酶链式反应(PCR)体外扩增获得双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。更经常选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体全长cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(2)种方法中，检测EgFABP和Eg95基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
在第(3)种方法中，提取mRNA，并利用特殊的逆转录酶合成在5’额外添加数个PolyC，并设计与这个PolyC部分互补的带有极稀有酶切位点的延长引物，与另一个mRNA与3’端polyA尾互补的带有极稀有酶切位点的引物，RT-PCR扩增所有mRNA中的完整基因。将这些扩增的全长cDNA克隆到质粒中，转化宿主菌，随机挑取阳性克隆测序，并对获得的序列与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较，将与Eg95和EgRABP具有同源性基因挑选出来。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法如双脱氧链终止法测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明的第二方面，提供了一种分离的细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的多肽，该多肽选自下组：(a)具有SEQID NO：2氨基酸序列的多肽。
(b)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的片段、衍生物和类似物。
本发明的多肽可以是重组多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
本发明中，编码细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中使用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pCDNA3表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性或卡那霉素抗性等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。
本发明中，编码细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。
用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种能与前述细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的多肽及其片段、衍生物特异性结合的抗体。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还提供了针对细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段，抗体种类包括了IgG及其亚类、IgA、IgE等。
多克隆抗体的生产可用细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。制备细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产。而已有的生产单链抗体的技术也可用于生产抗细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的单链抗体。
抗细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95在虫体中的分布和分泌排泄。
与细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。本发明中的抗体可用于预防或阻断细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95引起的病理改变。
本发明还涉及定量和定位检测细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，包括酶比活性的测定和免疫学测定。试验中所检测的细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95水平，可以用包虫病感染程度(虫负)的一个指标。
本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。
在本发明的第四个方面，本发明提供了一种遗传工程化的宿主菌，为含有前述编码细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的多核苷酸(或变异体)序列的载体转化或转导的宿主细胞。
“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：原核细胞中的大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9、白蚊伊蚊C63细胞、家蚕细胞等；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
作为选择之一，上述遗传工程化的宿主菌为可在菌体表面表达细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该遗传工程化的宿主菌的特点是在营养缺乏或缺氧的条件下，繁殖体内形成内生芽孢，此时含有细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的编码基因的质粒启动表达，将该多肽与芽孢组分蛋白融合表达，并展示在芽孢表面。该遗传工程化的宿主菌中，含有编码细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的多核苷酸(或变异体)序列的载体为将EgFABP-Eg95多核苷酸序列与含有枯草芽孢外层蛋白cotC的基因的启动子序列及编码序列的表达质粒pUS18重组获得。优选的，上述枯草芽孢杆菌为WB600。优选的，上述细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的编码基因编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸，进一步优选的，上述细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的编码基因编码具有SEQID NO：1的核苷酸序列。
用重组表达质粒转化枯草杆菌，并在芽孢阶段特异表达细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的制备方法的基本过程与本发明的第二个方面基本相同，其差别不是以分离纯化EgFABP-Eg95多肽为目的，而是获得能在表面表达展示EgFABP-Eg95多肽的重组芽孢。本发明所采用的宿主菌为去掉了细胞膜上分布的六个蛋白酶的编码基因的改造后的工程菌宿主菌WB600。该菌属于革兰氏阳性菌，没有内毒素，并且属于脊椎动物肠道的益生菌，具有很高的生物安全性和外源基因的表达效率，常被用于药物蛋白或食品工业用蛋白的表达宿主菌。
本发明采用了枯草芽孢外层蛋白cotC的基因的启动子序列及编码序列，插入到表达质粒pUS18多克隆位点EcoRI和Xba I之间，其它基因可以在XbaI下游多克隆酶切位点中插入。该质粒含有枯草芽孢杆菌质粒特有的复制起始位点，只能在枯草芽孢中复制，不能在其他细菌中复制。通过本领域技术人员所熟知的基因工程操作技术，如将表达质粒和纯化EgFABP-Eg95多核苷酸序列进行双酶切后，经T4DNA连接酶连接后，用氯化锂或电穿孔的方法转化枯草杆菌繁殖体，用含卡那霉素的固体培养基分离阳性重组菌，阳性菌经PCR扩增EgFABP-Eg95鉴定后，在液体培养基中扩大培养，收集菌体，提取质粒，测序鉴定。将经鉴定的重组枯草杆菌在液体培养基中扩大培养到高密度后，改成芽孢转化培养基，继续培养，使菌体全部或绝大部分形成内生的休眠状态的芽孢，破碎菌体细胞壁后，离心洗涤，获得纯化的芽孢。
重组芽孢可通过多种方法鉴定，一种是提取不含EgFABP-Eg95编码基因和含有EgFABP-Eg95编码基因的重组芽孢的总蛋白，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白凝胶电泳和染色，观察含有EgFABP-Eg95编码基因的重组芽孢所产生的特异的蛋白条带，分析蛋白的分子率是否与理论分子量相符。另外一种方法是用纯化的EgFABP-Eg95的免疫血清和荧光标记二抗来对芽孢进行免疫荧光检测；并通过流式细胞术对重组芽孢的荧光强度和阳性率进行检测。重组芽孢在荧光显微镜下可看到表面发出强烈的荧光；而正常的芽孢自发荧光的强度很弱或没有荧光。
作为选择之二，上述遗传工程化的宿主菌还可为在繁殖体阶段分泌表达细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的重组表达质粒转化枯草芽孢杆菌。该宿主菌的特点是在受体动物小肠上段，由芽孢转变为繁殖体，此时含有细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的编码基因的质粒启动表达，并将该多肽分泌到菌体外，作用于小肠上皮细胞及免疫相关细胞。该遗传工程化的宿主菌中，含有编码细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的多核苷酸(或变异体)序列的载体为将EgFABP-Eg95多核苷酸序列与枯草杆菌分泌型载体pUS186重组获得。优选的，上述枯草芽孢杆菌为WB600。优选的，上述细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的编码基因编码具有SEQID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸，进一步优选的，上述细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的编码基因编码具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
该重组菌与前述重组芽孢型工程菌的不同之处是采用的是枯草杆菌分泌型载体pUS186，将EgFABP-Eg95克隆到XbaI和PstI之间。该质粒在枯草杆菌繁殖体中启动EgFABP-Eg95的大量表达和分泌。分泌的EgFABP-Eg95主要存在于培养基中，可以通过蛋白浓缩免疫印迹的方法检测到。
上述遗传工程化的宿主菌可用于制备包虫病疫苗或用作饲料添加剂。在制备疫苗或添加剂时，可添入常规辅料。
本发明的第五方面，涉及一种适用于中间宿主的针对细粒棘球绦虫六钩蚴感染所致包虫病的疫苗，该疫苗含有由前述可在菌体表面表达细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的枯草芽孢杆菌培养而得的芽孢。
上述疫苗是把含有细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽或编码该酶的多核苷酸的工程菌，在富营养条件下培养大量增殖后，改换成在缺氧或营养不足的条件下产生内生孢子，在低营养的培养条件下，启动芽孢相关基因的表达，主要是芽孢壁相关基因的启动子激活，从而带动了EgFABP-Eg95多肽与芽孢组分蛋白cotc以融合蛋白的形式大量表达，参入到正常cotc蛋白中，共同组成芽孢壁，并展示在芽孢表面，构成了重组芽孢疫苗。该疫苗具有很强的环境抗逆性，耐受饲料加工过程，可以作为饲料添加剂使用，并能抵抗动物胃肠的消化降解作用，将虫体特异性抗原多肽递呈给肠粘膜的免疫细胞，芽孢本身也具有良好的佐剂作用。该重组芽孢以添加剂形式加入动物饲料或人的食物中，芽孢直接被小肠粘膜中的吞噬细胞摄取和加工，刺激机体产生局部粘膜免疫和系统免疫应答；同时芽孢在小肠上段萌发为能够生长和增殖的繁殖体，大量消耗肠道中的氧，降低肠道的pH值，抑制病原菌生长，繁殖体又转变为重组芽孢，经小肠下段排出。再生的重组芽孢同样可以刺激消化道下端的粘膜免疫。该疫苗可以添加剂但不限于食物添加剂的形式使用，如通过滴鼻的方式使用，同样可刺激机体产生局部粘膜免疫和系统免疫应答。一般口服的剂量要超过滴鼻剂量一个数量级。该疫苗的实验不需使用其他任何形式的佐剂。
对疫苗使用效果的评价，可以通过实验动物进行实验室评价。一般采用包虫病的敏感实验动物昆明鼠。疫苗的使用可分为预防用和治疗用。预防用疫苗是先对被试昆明鼠通过定量重组芽孢灌胃或滴鼻的方式进行，每隔一周接种一次，连续4次。于每次接种前和最后一次接种后的第7天，从眼眶筋脉丛采血收集血清，并收集大鼠粪便。血清通过ELISA检测其中反映免疫应答类型的IL-2、IFN-γ和IL-4及IL-10等Th1和Th2型细胞因子的水平；以及检测EgFABP-Eg95特异性抗体的种类、亚类及其水平，如IgG，IgG1、IgG2a、IgG4、IgE和IgA，通过这些指标的分析来揭示EgFABP-Eg95重组枯草芽孢通过粘膜免疫产生的免疫应答类型和反应的强度，比较不同的免疫途径产生的免疫应答的差异。
对疫苗的保护效果，也可以通过敏感的实验动物进行攻击感染实验。将实验动物随机分为三组：重组芽孢免疫组、正常芽孢免疫组、安慰剂组。这些动物在接受相同途径的免疫后，当重组芽孢组针对EgFABP-Eg95的抗体滴度达到一个稳定的高水平时，利用活的等量虫卵经口或将原头蚴经腹腔注射的方式感染免疫动物，经过半年后，处死实验动物，观察每组动物腹腔和内脏中的棘球蚴数量和组织病理改变程度，计算减虫率，分析预防效果。
除了采用实验动物外，疫苗的保护效果还可以在流行区进行现场实验。把重组芽孢作为牛、羊、马、骆驼等重要家畜幼仔的饲料添加剂，定量连续服用一周作为一次免疫；每月免疫一次，共免疫四次作为一个免疫疗程，每隔3个月进行一个免疫疗程，对出栏的牲畜在屠宰后检查组织和内脏中的包虫进行计数。以同一批未经免疫的同种宿主作为对照组，观察免疫组的感染度和感染率，对疫苗的保护效果进行现场实验评价。
此外对疫苗是否对经等量或虫卵感染并已发展为棘球蚴的动物按一定程序进行接种，经过一段时间的免疫后，处死动物，检查动物的腹腔和内脏，对棘球蚴进行计数。分析接受免疫处理后的动物感染的改善程度，包括棘球蚴数量的减少和组织病理的改善。
本发明的第六方面，本发明涉及一种适用于终宿主的针对细粒棘球绦虫成虫感染的疫苗，该疫苗含有由前述含有编码本发明多肽的分泌型表达质粒的工程菌培养而得的芽孢。较佳的，所述工程菌为芽孢。该工程菌在体外大量培养后按本发明第五方面制备芽孢的方法，制备枯草芽孢，同样作为添加剂加入到狗的食物中，芽孢在终宿主消化道上端萌发为繁殖体，进行生长分裂、并在肠粘膜上定居形成生物膜，分泌型重组质粒大量表达细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽，这些重组表达产物分泌到细胞外，刺激粘膜免疫细胞产生局部和系统免疫。该疫苗一般是采用芽孢口服免疫的方式，而不是直接用重组蛋白来免疫，也不将重组蛋白展示在芽孢表面，此时，芽孢虽然也能起到佐剂作用，但不会改变机体对分泌EgFABP-Eg95的免疫应答方式。在中间宿主中，针对六钩蚴和棘球蚴的保护性免疫主要依靠以Th1为主的免疫应答，细胞免疫发挥了更重要的作用；而在终宿主体内，保护性免疫主要依赖于IgE介导的免疫变态反应促进虫体的排出，因此，Th2应答发挥更重要的作用。芽孢在肠道内刺激肠粘膜免疫系统，主要促进Th1应答，而Th1应答在肠道蠕虫感染中被认为会加重感染；而在小肠上段，当繁殖体分泌大量的EgFABP-Eg95抗原时，芽孢已不存在，可溶性EgFABP-Eg95抗原分子刺激肠粘膜免疫系统，主要刺激Th2应答，尤其是能促进特异性IgE的产生，因此，比重组芽孢能发挥更好的抗感染效果。
对疫苗使用效果的评价，可以通过实验动物进行实验室评价。一般采用终宿主犬作为实验动物。疫苗主要作为预防用。先对被试犬只进行连续3个月的药物驱虫，通过粪便虫卵和孕节检查确定已没有成虫感染后3个月，将定量的基因工程芽孢通过食物给犬只接种，连喂1周，此后每隔2周喂1周.连续4次。于每次接种前和最后一次接种后的第7天，麻醉后从耳静脉采血收集血清，并收集大鼠粪便。血清通过ELISA检测其中反映免疫应答类型的IL-2、IFN-γ和IL-4及IL-10等Th1和Th2型细胞因子的水平；以及检测EgFABP-Eg95特异性抗体的种类、亚类及其水平，如IgG，IgG1、IgG2a、IgG4、IgE和IgA，通过这些指标的分析来揭示EgFABP-Eg95重组枯草芽孢通过粘膜免疫产生的免疫应答类型和反应的强度，比较不同的免疫途径产生的免疫应答的差异。
对疫苗的保护效果，也可以通过对免疫犬只进行攻击感染实验。将实验动物随机分为三组：重组芽孢免疫组、正常芽孢免疫组、安慰剂组。这些动物在接受相同方案的免疫后，当重组芽孢组针对EgFABP-Eg95的抗体滴度达到一个稳定的高水平时，利用活的等量原头蚴经口感染免疫动物，经过1个月后，处死实验动物，观察每组动物全消化道中成虫数，及肠粘膜的组织病理改变程度，计算减虫率，分析预防效果。
本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：
“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。
蛋白质或多核苷酸“变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
“缺失”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。
“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。
″基本上纯″是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95蛋白。基本上纯的细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。
“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。
“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。
“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(I)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的，用于保守性取代的氨基酸例如，带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的头部基团有相似亲水性的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸；或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代，如用烷基、酰基或氨基替换氢原子；或者(III)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)通过本文的阐述，这样的片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
“抗体”是指完整的抗体分子及其片段，如Fab、F(ab’)2及Fv，其能特异性结合细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的抗原决定簇。
“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化。“分离的细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的多肽”是指细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95蛋白多肽的纯度能用于氨基酸序列分析。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的，例如，利用本发明可以涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法。
本发明经过广泛而深入的研究，从细粒棘球绦虫中分离了编码细粒棘球绦虫绦虫六钩蚴保护性抗原Eg95和各个虫期保护性抗原FABP，并将这两个基因构成融合基因，表达纯化了重组蛋白，并将其进一步构建到了芽孢表达型和分泌表达型载体中，转化益生菌枯草芽孢菌WB600，获得了保护性抗原重组芽孢菌和分泌型重组芽孢菌，揭示了基于此重组蛋白和重组工程菌在疫苗方面的应用。本发明的重组的枯草芽孢杆菌经大量培养制备成芽孢粉后，具有很高的抗逆性，耐高温、高盐、酸、碱和干燥，极易作为饲料添加剂使用。芽孢随食物进入动物消化道后，能够抵抗胃酸，到达小肠，刺激肠粘膜的免疫系统产生粘膜免疫；芽孢在小肠萌发后，能够迅速的生长和增殖，在肠粘膜形成益生菌群，大量表达分泌抗原，持续刺激粘膜免疫。当肠道中的氧被消耗后，菌体又形成芽孢，随粪便排出。该疫苗可刺激宿主Th1和Th2应答，保护人和牛羊等中间宿主免受虫卵的感染，同时也可作为终宿主犬科动物的疫苗，促进成虫的排出，从而消除包虫病的传染源。
附图说明
图1FABP-Eg95基因的PCR产物(琼脂糖凝胶电泳)
图2重组质粒pET-28a(+)-FABP-Eg95的PCR及酶切鉴定图
图3重组质粒pET-28a(+)-FABP-Eg95在大肠杆菌BL-21/DE3的表达产物及纯化产物的12％SDS-PAGR电泳分析
图4重组蛋白的Western blotting分析
图5EgFABP-Eg95重组芽孢表达载体的酶切鉴定图
图6EgFABP-Eg95重组芽孢的免疫荧光(a)、(c)和流式细胞术(b)、(d)鉴定
图7EgFABP-Eg95重组枯草杆菌分泌型表达(a)3道为浓缩的培养上清；(b)2是western-blot鉴定
图8重组芽孢免疫效果分析
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95的克隆
用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取细粒棘球绦虫成虫总RNA。用Quik mRNA IsolationKit(Qiegene公司产品)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA。利用下列引物进行PCR扩增EgFABP基因：
Primer1：5’-GCACATATGGAGGCATTCCTTGTAACCTGG-3’(SEQ ID NO：3)
Primer2：5’-TCCTCCTCCTCCCGCCACCTTTG-3’(SEQ ID NO：4)
扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期：94℃30sec；45℃30sec；72℃2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pMD19-T载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的1-399bp完全相同。结果见附图1
利用下列引物进行PCR扩增Eg95基因的胞外区片段：
Primer1：5’-GGAGGAGGAGGACAGGAATACAAAGG-3’(SEQ ID NO：5)
Primer2：5’-GCACTCGAGGGATCCACTAGTCATTACAG-3’(SEQ ID NO：6)
扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期：94℃30sec；45℃30sec；72℃2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pMD19-T载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的400-744bp完全相同。
将EgFABP和Eg95扩增产物混合后，取1ul做模板，用下列引物扩增EgFABP-Eg95融合基因：
Primer1：5’-GCACATATGGAGGCATTCCTTGTAACCTGG-3’(SEQ ID NO：3)
Primer2：5’-GCACTCGAGGGATCCACTAGTCATTACAG-3’(SEQ ID NO：6)
扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期：94℃30sec；45℃30sec；72℃2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pMD19-T载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的1-744bp完全相同。(结果见附图1)
实施例2：EgFABP-Eg95基因在大肠杆菌中表达和鉴定
将经过NdeI和XhoI双酶切后的PMD19-T-FABP-Eg95质粒和pET-28a(+)质粒连接后转化大肠杆菌BL21/DE3感受态菌，卡那霉素筛选阳性克隆，挑取阳性重组菌接种于液体培养基LB中扩大培养，提取重组质粒，进行PCR、双酶切鉴定。(结果见附图2)取含重组质粒的菌液50μL，接种于5mL含卡那霉素100μg/mL的液体培养基LB中(菌液/培养基为1/100)，37℃250r/min振摇至OD600＝0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度1mmol/L诱导表达6h。离心收集菌体，在沉淀中加入100μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5-10min，13000r/min离心1min，取上清10μL进行SDS-PAGE电泳分析。同时诱导空载体菌作对照。设pET-28a(+)空载体菌的诱导前后及含有重组质粒菌体的诱导前做对照。凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后分析目的蛋白表达方式。(结果见附图3)
按照上述方法对阳性克隆进行大量诱导表达，离心收集菌体，按每克菌体加入4mL 1×结合缓冲液重悬菌体，冰上放置30min后冰上超声裂解(功率150W，持续1s，停2s，共15min)，4℃13000r/min离心20min收集沉淀，按照每1000ml菌液加入6.6mL 10％SDS溶解包涵体，沉淀溶解后迅速用1×结合缓冲液将SDS的浓度稀释至0.3％，搅拌溶解过夜后，室温下13000r/min离心20min，取上清，用0.45μm滤膜过滤，用Ni-IDA Agarose进行蛋白纯化，收集蛋白洗脱液，取30μL加入10μL 4×SDS-PAGE上样缓冲液处理样品，12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮兰R250染色。将洗脱的目的蛋白在0.15mol/L的PBS(pH7.4)透析液中4℃透析24h(其间换透析液2-3次)。
将纯化的蛋白进行SDS-PAGE(12％)电泳，用电转印仪(100V电压)电泳1.5h将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜，将含蛋白Marker条带剪下观察膜转印效果。其他的膜按泳道剪成条状，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，PBS洗涤3次，5min/次。一抗分别为包虫病人血清、正常人血清和包虫病人血清，均为1∶100稀释，室温孵育2h，PBS洗涤3次，5min/次。沥干后分别加入辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG(1∶2000稀释)，室温孵育1h，PBS洗涤3次，每次5min。最后用3，3-二氨基联苯胺(DAB)将膜显色5~10min，去离子水终止反应。(结果见附图4)
实施例3抗细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95抗体的产生
用经亲和层析纯化的细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用该蛋白加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml重组细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95结合。该抗体是多克隆抗体，在琼脂免疫双扩试验中与重组抗原效价在1∶32以上，与虫体粗抗原的反应效价在1∶16以上。
实施例4：EgFABP-Eg95重组枯草芽孢的制备
以带有EgFABP-Eg95基因的T质粒为模板，用下列引物重新扩增EgFABP-Eg95基因
Primer1：5’ATTCTAGAGATGGAGGCATTCCTTGTAACC 3’(SEQ ID NO：7)
Primer2：5’CGAAGCTTTCAGGATCCACTAGTCATTACAG 3’(SEQ ID NO：8)
扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期：94℃30sec；45℃30sec；72℃2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pMD19-T载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的1-744bp完全相同。结果见附图5(a)。
目的片段与枯草表达质粒Pus18-Cotc经XbaI和Hind III双酶切后，琼脂糖凝胶回收，DNAT4连接酶连接后转化枯草杆菌WB600感受态，涂布在含有卡那霉素的琼脂平板上培养24小时，挑取菌落一部分，经PCR初步鉴定阳性菌株。将阳性菌株接种于5ml GMI培养基，30℃180r/min摇床培养过夜。提取枯草杆菌质粒，进行双酶切，双酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，以Cotc引物对阳性质粒进行测序鉴定，基因克隆正确。结果见附图5(b)。
枯草杆菌芽孢培养：挑取单克隆菌落接种于5mlLB培养液，37℃摇床培养过夜。按1∶100接种DSM芽孢培养基(不含抗生素)，37℃250r/mi n摇床培养24h。
芽孢染色观察：分别于芽孢培养0h、12h、24h，取100μl培养液涂片。干燥后，持续加5％孔雀绿，用酒精灯加热至冒蒸汽(务使蒸干)。染色20min后，待冷却，自来水冲洗。再用0.5％复红染色5min，自来水冲洗，晾干，显微镜下观察结果。结果见附图6(a)
芽孢收集及定量：芽孢收集及洗涤按Nicholson方法〔82〕进行，8000r/min离心15min收集菌体，去上清，加入溶菌酶至终浓度4mg/ml，室温15min。用1MNaCl洗涤芽孢，加PMSF至终溶度1μmol/L，充分混匀，8000r/min离心15min收集菌体。再用1MKCl洗涤1次、蒸馏水洗涤2次。最终，将芽孢溶于一定量蒸馏水中，68℃1h杀灭残留的枯草杆菌繁殖体。取1μl芽孢用蒸馏水稀释，显微镜下用细胞计数池计数，其余芽孢于-20℃保存备用。结果见附图6(3)
芽孢外壳蛋白的提取：将1010以上芽孢置于5mlSDS-DTT液，37℃2.5h，1M Tris-HCl(PH8.0)洗涤6次。将芽孢沉淀悬于5ml破壁缓冲液，冰上超声破碎(160W，超声1s，停2s，超声5min)。4℃8500g离心15min，收集沉淀。加1×SDS上样缓冲液煮沸5-10min后行15％SDS-PAGE观察结果。
EgFABP-Eg95抗血清与非重组芽孢外壳蛋白的预吸附：将实施例3所制备的抗血清与提取的pUS18-CotC芽孢外壳蛋白4℃吸附过夜，以去除可能存在的抗芽孢抗体。
芽孢外壳蛋白Western blotting分析：使用预吸附的EgFABP-Eg95抗血清对芽孢外壳蛋白进行Western blotting分析。
免疫荧光检测芽孢表面EgFABP-Eg95蛋白的表达：将0.5ml24h培养芽孢液13000r/min离心2min，去上清。沉淀悬于含2.4％多聚甲醛、0.04％戊二醛的Na-PO4(PH7.4)缓冲液，室温10min，冰上50min。PBS(PH7.4)洗涤3次，沉淀悬于200μlGTE液(50mm葡萄糖、20mmTris-HCl(PH7.5)、10mm EDTA、2mg/ml的溶菌酶)。将20μl芽孢悬液涂于凹玻片上，37℃温箱干燥10min。取出，浸于-20℃甲醇5min，丙酮30s。干燥后，加2％小牛血清(2％BSA-PBS)室温封闭1h。PBST洗涤3次，每次脱色摇床缓摇3min。加入1∶60大鼠抗EgFABP-Eg95蛋白血清(已预吸附)，37℃湿盒1h。PBST洗涤3次，加1∶50抗大鼠IgG-FITC，37℃湿盒1h。PBST洗涤3次，荧光显微镜观察。
流式细胞仪检测芽孢表面EgFABP-Eg95蛋白的表达：将0.5ml24h培养芽孢液13000r/min离心2min，去上清。沉淀悬于含2.4％多聚甲醛、0.04％戊二醛的Na-PO4(PH7.4)缓冲液，室温10min，冰上50min。PBS洗涤3次，沉淀悬于200μlGTE液，37℃30min。PBS洗涤3次，重悬于一抗中(1∶60)，37℃1h。PBS洗涤3次，沉淀悬于100μl 1∶50抗大鼠IgG-FITC，室温1h。PBS洗涤1次，重悬于PBS，流式细胞仪计数。
免疫荧光和流式细胞检测结果表明获得的芽孢外壳蛋白含有细粒棘球绦虫gFABP-Eg95多肽，并测定枯草芽孢的重组率在85％以上。
实施例5：分泌型EgFABP-Eg95重组枯草杆菌的制备
将实施例4中的PCR扩增产物与质粒PUS186经XbaI和HindIII双酶切后，回收，连接并以同样的方式转化WB600感受态，在卡那霉素抗性板上筛选阳性克隆。阳性克隆经PCR、提取质粒双酶切和测序鉴定。挑取单克隆菌落接种于500ml LB培养液，37℃摇床培养过夜。离心收集培养上清，浓缩后经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色和Western-Blot鉴定(结果见附图7)确认细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽表达。阳性重组菌株按实施例4的方法制备芽孢。
实施例6：制备疫苗应用于中间宿主及效果评价
将实施例2所制备的EgFABP-Eg95重组蛋白和实施例4所制备的EgFABP-Eg95重组枯草芽孢分别免疫6周龄的昆明鼠。重组蛋白初次免疫采用弗氏完全佐剂皮下注射，每只鼠接种抗原量100ug，此后，每隔1周加强1次，加强免疫采用弗氏不完全佐剂。另外重组抗原还可以10％的氢氧化铝作为佐剂，对昆明鼠进行滴鼻免疫，每只鼠每次剂量为50ug，隔1周加强1次；重组枯草芽孢利用灌胃针胃内灌注用生理盐水悬浮的重组芽孢，每次接种剂量为1×1010个芽孢，同样隔周接种1次。每次接种前从眼静脉丛采血，分离血清，收集粪便，加PBS搅匀后离心，去沉渣和漂浮物，收集粪液。
抗体滴度测定：将重组EgFABP-Eg95重组蛋白用碳酸盐包被缓冲液包被微孔板，每孔加抗原2ug，用常规ELISA检测血清和粪液中特异的IgG、IgG1、IgG2a、IgA、和IgE，判断重组蛋白和重组芽孢免疫所产生的免疫应答类型，比较两者疫苗和两种途径免疫产生的免疫应答的差异。结果见附图8
抗感染保护效果的评价：对疫苗的保护效果，也可以通过敏感的实验动物进行攻击感染实验。将实验动物随机分为三组：重组芽孢免疫组、正常芽孢免疫组、安慰剂组。这些动物在接受相同途径的免疫后，当重组芽孢组针对EgFABP-Eg95的抗体滴度达到一个稳定的高水平时，利用活的虫卵10000个经口或将原头蚴经腹腔注射的方式感染免疫动物，经过半年后，处死实验动物，观察每组动物腹腔和内脏中的棘球蚴数量和组织病理改变程度，计算减虫率，分析预防效果。结果见表1.
除了采用实验动物外，疫苗的保护效果还可以在流行区进行现场实验。把重组芽孢作为牛、羊、马、骆驼等重要家畜幼仔的饲料添加剂，定量连续服用一周作为一次免疫；每月免疫一次，共免疫四次作为一个免疫疗程，每隔3个月进行一个免疫疗程，对出栏的牲畜在屠宰后检查组织和内脏中的包虫进行计数。以同一批未经免疫的同种宿主作为对照组，观察免疫组的感染度和感染率，对疫苗的保护效果进行现场实验评价。
此外对疫苗是否对经等量或虫卵感染并已发展为棘球蚴的动物按一定程序进行接种，经过一段时间的免疫后，处死动物，检查动物的腹腔和内脏，对棘球蚴进行计数。分析接受免疫处理后的动物感染的改善程度，包括棘球蚴数量的减少和组织病理的改善。
实施例7：制备疫苗应用于终宿主及其效果评价
将实施例5所制备的分泌型工程菌在体外大量培养后按实施例4的方法，制备枯草芽孢。先对被试犬只进行连续3个月的药物驱虫，通过粪便虫卵和孕节检查确定已没有成虫感染后3个月，将定量的基因工程芽孢通过食物给犬只接种，连喂1周，此后每隔2周喂1周.连续4次。于每次接种前和最后一次接种后的第7天，麻醉后从耳静脉采血收集血清，并收集狗的粪便。同时将重组EgFABP-Eg95蛋白滴鼻免疫狗作为对照。血清通过ELISA检测其中反映免疫应答类型的IL-2、IFN-γ和IL-4及IL-10等Th1和Th2型细胞因子的水平；以及检测EgFABP-Eg95特异性抗体的种类、亚类及其水平，如IgG，IgG1、IgG2a、IgG4、IgE和IgA，通过这些指标的分析来揭示EgFABP-Eg95重组枯草芽孢通过粘膜免疫产生的免疫应答类型和反应的强度，比较不同的免疫途径产生的免疫应答的差异。
对疫苗的保护效果，也可以通过对免疫犬只进行攻击感染实验。将实验动物随机分为4组：重组芽孢免疫组、正常芽孢免疫组、重组蛋白免疫组、安慰剂组。这些动物在接受相同方案的免疫后，当重组芽孢组针对EgFABP-Eg95的抗体滴度达到一个稳定的高水平时，利用活的原头蚴20000个经口感染免疫动物，经过1个月后，处死实验动物，观察每组动物全消化道中成虫数，及肠粘膜的组织病理改变程度，计算减虫率，分析预防效果。结果见表2.
表1重组芽孢疫苗免疫昆明鼠检获虫体数
表2芽孢疫苗免疫狗检获虫体数及虫卵数
序列表
<110>中山大学中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
<120>细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽及其重组枯草芽孢疫苗的制备与应用
<130>PCN
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>774
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽编码基因
<400>1
atggaggcat tccttgtaac ctggaagatg gagaaaagtg agggtttcga caagatcatg 60
gaacgccttg gggtggattt cgtcactcgc aagatgggca atttggttaa acccaacctc 120
atagtcactg atctgggtgg cggcaagtat aaaatgagat cggagagcac gttcaagacc 180
accgaatgct ccttcaaact gggtgagaag ttcaaggagg tgactccgga ttcacgcgag 240
gtcacttcat tgatcacagt ggagaatggg gtgatgaagc atgagcagga tgacaaaacc 300
aaggtcacct acattgaacg tgtggttgag ggcaatgagc tgaaagcgac cgtgaaggtg 360
gatgaagtgg tttgcgtgcg aaactactca aaggtggcgg gaggaggagg acaggaatac 420
aaaggaatgg gcgtagagac aaggacaaca gagactccgc tccgtaaaca cttcaatttg 480
actcctgtgg gttctcaggg cattcgctta agttgggaag tccaacactt gtctgacctc 540
aaaggaacag atatttctct aaaagcggtg aatccttctg acccgttagt ctacaaaaga 600
caaactgcaa aattctcaga tggacaactc actatcggcg aactgaagcc ctccacatta 660
tacaaaatga ctgtggaagc agtgaaagcg aaaaagacca ttttgggatt caccgtagac 720
attgagacac cgcgcgctgg caagaaggaa agcactgtaa tgactagtgg atcc 774
<210>2
<211>258
<212>PRT
<213>artificial sequence
<220>
<223>细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽
<400>2
Met Glu Ala Phe Leu Val Thr Trp Lys Met Glu Lys Ser Glu Gly Phe
1 5 10 15
Asp Lys Ile Met Glu Arg Leu Gly Val Asp Phe Val Thr Arg Lys Met
20 25 30
Gly Asn Leu Val Lys Pro Asn Leu Ile Val Thr Asp Leu Gly Gly Gly
35 40 45
Lys Tyr Lys Met Arg Ser Glu Ser Thr Phe Lys Thr Thr Glu Cys Ser
50 55 60
Phe Lys Leu Gly Glu Lys Phe Lys Glu Val Thr Pro Asp Ser Arg Glu
65 70 75 80
Val Thr Ser Leu Ile Thr Val Glu Asn Gly Val Met Lys His Glu Gln
85 90 95
Asp Asp Lys Thr Lys Val Thr Tyr Ile Glu Arg Val Val Glu Gly Asn
100 105 110
Glu Leu Lys Ala Thr Val Lys Val Asp Glu Val Val Cys Val Arg Ash
115 120 125
Tyr Ser Lys Val Ala Gly Gly Gly Gly Gln Glu Tyr Lys Gly Met Gly
130 135 140
Val Glu Thr Arg Thr Thr Glu Thr Pro Leu Arg Lys His Phe Asn Leu
145 150 155 160
Thr Pro Val Gly Ser Gln Gly Ile Arg Leu Ser Trp Glu Val Gln His
165 170 175
Leu Ser Asp Leu Lys Gly Thr Asp Ile Ser Leu Lys Ala Val Asn Pro
180 185 190
Ser Asp Pro Leu Val Tyr Lys Arg Gln Thr Ala Lys Phe Ser Asp Gly
195 200 205
Gln Leu Thr Ile Gly Glu Leu Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Lys Met Thr
210 215 220
Val Glu Ala Val Lys Ala Lys Lys Thr Ile Leu Gly Phe Thr Val Asp
225 230 235 240
Ile Glu Thr Pro Arg Ala Gly Lys Lys Glu Ser Thr Val Met Thr Ser
245 250 255
Gly Ser
<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>3
gcacatatgg aggcattcct tgtaacctgg 30
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>4
tcctcctcct cccgccacct ttg 23
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>5
ggaggaggag gacaggaata caaagg 26
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>6
gcactcgagg gatccactag tcattacag 29
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>7
attctagaga tggaggcatt ccttgtaacc 30
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>8
cgaagctttc aggatccact agtcattaca g 31
Claims (10)
1.一种分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列选自下组的一种核苷酸序列或其变体：
(a)编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
2.如权利要求1所述分离的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸(a)具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
3.一种分离的细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽，该多肽选自下组：
(A)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(B)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽的片段、衍生物和类似物。
4.一种能与权利要求3所述分离的细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽及其片段、衍生物特异性结合的抗体。
5.一种遗传工程化的宿主菌，为含有编码权利要求3所述细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的多核苷酸序列的载体转化或转导的宿主细胞。
6.如权利要求5所述遗传工程化的宿主菌，其特征在于：所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌；所述载体为将编码权利要求3所述细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的多核苷酸序列，与含有枯草芽孢外层蛋白cotC的基因的启动子序列及编码序列的表达质粒pUS18重组获得；所述遗传工程化的宿主菌能在菌体表面表达所述细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽。
7.如权利要求5所述遗传工程化的宿主菌，其特征在于：所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌；所述载体为将编码权利要求3所述细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽的多核苷酸序列与枯草杆菌分泌型载体pUS186重组获得；所述遗传工程化的宿主菌能在繁殖体阶段分泌表达所述细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽。
8.一种适用于中间宿主的针对细粒棘球绦虫六钩蚴感染所致包虫病的疫苗，所述疫苗含有由权利要求5或6所述遗传工程化的宿主菌培养而得的芽孢。
9.一种适用于终宿主的针对细粒棘球绦虫成虫感染的疫苗，所述疫苗含有由权利要求5或7所述遗传工程化的宿主菌培养而得的芽孢。
10.一种饲料添加剂，含有权利要求5-7中任一权利要求所述遗传工程化的宿主菌培养制得的芽孢。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100515153A CN101555483B (zh) | 2009-05-19 | 2009-05-19 | 细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽及其重组枯草芽孢疫苗的制备与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2009100515153A CN101555483B (zh) | 2009-05-19 | 2009-05-19 | 细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽及其重组枯草芽孢疫苗的制备与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101555483A true CN101555483A (zh) | 2009-10-14 |
| CN101555483B CN101555483B (zh) | 2011-04-27 |
Family
ID=41173761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2009100515153A Expired - Fee Related CN101555483B (zh) | 2009-05-19 | 2009-05-19 | 细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽及其重组枯草芽孢疫苗的制备与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101555483B (zh) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102212531A (zh) * | 2010-04-02 | 2011-10-12 | 复旦大学 | 一种重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的制备方法及其用途 |
| CN102863524A (zh) * | 2012-08-28 | 2013-01-09 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白、其制备方法和用途 |
| CN103041382A (zh) * | 2013-01-14 | 2013-04-17 | 新疆医科大学 | 细粒棘球蚴重组bcg疫苗及制备方法 |
| CN103861093A (zh) * | 2014-03-21 | 2014-06-18 | 重庆澳龙生物制品有限公司 | 一种羊棘球蚴亚单位疫苗及其制备方法和应用 |
| CN105267988A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-01-27 | 北京中农生物工程有限公司 | 一种新型cpg dna免疫佐剂棘球蚴疫苗 |
| CN105267989A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-01-27 | 北京中农生物工程有限公司 | 一种新型水溶性免疫佐剂棘球蚴疫苗 |
| CN106093435A (zh) * | 2016-07-14 | 2016-11-09 | 四川农业大学 | 细粒棘球绦虫谷氧还蛋白‑1的应用 |
| CN111269890A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-12 | 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） | 抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用 |
| CN113016713A (zh) * | 2021-03-03 | 2021-06-25 | 新疆医科大学第一附属医院 | 从犬粪中分离细粒棘球绦虫虫卵及体外孵化出六钩蚴进行原发性感染动物造模的方法 |
| CN113577257A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-11-02 | 新疆医科大学第一附属医院 | 细粒棘球绦虫EgTeg和EgFABP1多表位疫苗及应用 |
| CN114848808A (zh) * | 2022-03-24 | 2022-08-05 | 四川大学 | 基于阳离子脂多肽及细胞因子的免疫增强剂及制法、应用 |
| CN115010814A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-09-06 | 佛山市正典生物技术有限公司 | 一种诺如病毒p颗粒嵌合棘球蚴eg95蛋白的重组蛋白及其应用 |
-
2009
- 2009-05-19 CN CN2009100515153A patent/CN101555483B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102212531A (zh) * | 2010-04-02 | 2011-10-12 | 复旦大学 | 一种重组多主枝孢霉变应原Cla h8蛋白的制备方法及其用途 |
| CN102863524A (zh) * | 2012-08-28 | 2013-01-09 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 诊断细粒棘球蚴病的重组抗原蛋白、其制备方法和用途 |
| CN103041382A (zh) * | 2013-01-14 | 2013-04-17 | 新疆医科大学 | 细粒棘球蚴重组bcg疫苗及制备方法 |
| CN103861093A (zh) * | 2014-03-21 | 2014-06-18 | 重庆澳龙生物制品有限公司 | 一种羊棘球蚴亚单位疫苗及其制备方法和应用 |
| CN105267988A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-01-27 | 北京中农生物工程有限公司 | 一种新型cpg dna免疫佐剂棘球蚴疫苗 |
| CN105267989A (zh) * | 2015-11-18 | 2016-01-27 | 北京中农生物工程有限公司 | 一种新型水溶性免疫佐剂棘球蚴疫苗 |
| CN106093435A (zh) * | 2016-07-14 | 2016-11-09 | 四川农业大学 | 细粒棘球绦虫谷氧还蛋白‑1的应用 |
| CN106093435B (zh) * | 2016-07-14 | 2018-01-23 | 四川农业大学 | 细粒棘球绦虫谷氧还蛋白‑1的应用 |
| CN111269890A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-06-12 | 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） | 抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用 |
| CN111269890B (zh) * | 2020-03-25 | 2023-07-04 | 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） | 抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用 |
| CN113016713A (zh) * | 2021-03-03 | 2021-06-25 | 新疆医科大学第一附属医院 | 从犬粪中分离细粒棘球绦虫虫卵及体外孵化出六钩蚴进行原发性感染动物造模的方法 |
| CN113016713B (zh) * | 2021-03-03 | 2022-12-02 | 新疆医科大学第一附属医院 | 从犬粪中分离细粒棘球绦虫虫卵及体外孵化出六钩蚴的方法 |
| CN113577257A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-11-02 | 新疆医科大学第一附属医院 | 细粒棘球绦虫EgTeg和EgFABP1多表位疫苗及应用 |
| CN113577257B (zh) * | 2021-07-28 | 2023-06-20 | 新疆医科大学第一附属医院 | 细粒棘球绦虫EgTeg和EgFABP1多表位疫苗及应用 |
| CN114848808A (zh) * | 2022-03-24 | 2022-08-05 | 四川大学 | 基于阳离子脂多肽及细胞因子的免疫增强剂及制法、应用 |
| CN114848808B (zh) * | 2022-03-24 | 2023-04-25 | 四川大学 | 基于阳离子脂多肽及细胞因子的免疫增强剂及制法、应用 |
| CN115010814A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-09-06 | 佛山市正典生物技术有限公司 | 一种诺如病毒p颗粒嵌合棘球蚴eg95蛋白的重组蛋白及其应用 |
| CN115010814B (zh) * | 2022-06-28 | 2024-02-27 | 佛山市正典生物技术有限公司 | 一种诺如病毒p颗粒嵌合棘球蚴eg95蛋白的重组蛋白及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101555483B (zh) | 2011-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101555483B (zh) | 细粒棘球绦虫EgFABP-Eg95多肽及其重组枯草芽孢疫苗的制备与应用 | |
| Zhou et al. | Oral administration of a Bacillus subtilis spore-based vaccine expressing Clonorchis sinensis tegumental protein 22.3 kDa confers protection against Clonorchis sinensis | |
| CN102666575B (zh) | 分枝杆菌疫苗 | |
| CN104519896B (zh) | 用于治疗变态反应的核酸 | |
| Jayaraj et al. | Vaccination against fasciolosis by a multivalent vaccine of stage-specific antigens | |
| CN107257853B (zh) | 新型肠出血性大肠杆菌噬菌体Esc-CHP-1及其用于抑制肠出血性大肠杆菌增殖的用途 | |
| CN108883140A (zh) | 治疗1型糖尿病的组合物和方法 | |
| CN101473028B (zh) | 重组乳杆菌及其用途 | |
| US20110269165A1 (en) | Lactic acid bacteria and their cellular components inducing immunoregulatory function, and method of obtaining the same | |
| KR20190110605A (ko) | 돼지 코로나바이러스 백신 | |
| ES2915100T3 (es) | Lisozima microbiana para su uso en el tratamiento del síndrome del intestino irritable o de la enfermedad inflamatoria intestinal | |
| CA2552392C (fr) | Souches vaccinales d'apicomplexes de la famille des sarcocystidae | |
| JP2005501533A (ja) | アイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａｍａｘｉｍａ）の配偶子母細胞由来の組換え５６及び８２ｋＤａ各抗原をコードする核酸及びその使用 | |
| CN113354722A (zh) | 细粒棘球绦虫Severin蛋白在检测囊型包虫病和细粒棘球绦虫感染试剂盒中的应用 | |
| CN110256570A (zh) | 一种重组融合抗菌肽及应用 | |
| CN117431200A (zh) | 一种在芽孢表面展示新城疫病毒hn蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用 | |
| CN1240001A (zh) | 链球菌毒素c突变体及其使用方法 | |
| Li et al. | Immunogenicity of self-adjuvanticity oral vaccine candidate based on use of Bacillus subtilis spore displaying Schistosoma japonicum 26 KDa GST protein | |
| CN106397602B (zh) | 一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗 | |
| Sun et al. | Construction of a Lactobacillus plantarum-based claudin-3 targeting delivery system for the development of vaccines against Eimeria tenella | |
| CN100460509C (zh) | 旋毛虫副肌球蛋白基因及其应用 | |
| CN101481691B (zh) | 旋毛虫70KDa热休克蛋白及其应用 | |
| CN1277925C (zh) | 表达ctb和人胰岛素融合蛋白的重组家蚕杆状病毒及其应用 | |
| CN106397563A (zh) | 用于预防羊弓形虫感染的核苷酸序列、载体、蛋白、疫苗和制备方法及其应用 | |
| Zhou et al. | Expression of Caenorhabditis elegans-expressed Trans-HPS, partial aminopeptidase H11 from Haemonchus contortus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110427 Termination date: 20160519 |