CN106397563A - 用于预防羊弓形虫感染的核苷酸序列、载体、蛋白、疫苗和制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

用于预防羊弓形虫感染的核苷酸序列、载体、蛋白、疫苗和制备方法及其应用。本发明提供一种核苷酸序列，包括如下核苷酸序列：（1）SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列；（2）与（1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；（3）与上述（1）或（2）核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。本发明提供一种疫苗，将弓形虫抗原双酶切后连接pET28a表达载体，转化入BL21(DE3)工程菌，诱导其高效表达，纯化后得到可溶性蛋白，最后添加206佐剂制备而成。本发明制备的亚单位灭活疫苗具有较强的细胞免疫和体液免疫效果，能够诱导机体的先天性免疫应答，分泌各种细胞炎性因子，从而有效地预防弓形虫病。

Description

用于预防羊弓形虫感染的核苷酸序列、载体、蛋白、疫苗和制 备方法及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学和生物学领域，涉及一种用于预防羊弓形虫感染的亚单位灭活疫苗和制备方法及其应用，主要涉及一种用于预防羊弓形虫感染的核苷酸序列、载体、蛋白、疫苗和制备方法及其应用。

背景技术

弓形虫病(Toxoplasmosis)是由弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种世界性分布的人兽共患寄生虫病。弓形虫病已成为我国亟待解决的重要公共卫生问题之一，其原因主要体现在以下几点：一、人类弓形虫感染率极高，一般为20%～50%，最高达94%，全球约有1/3的人感染弓形虫，我国人群弓形虫感染率为5%～20%。孕妇感染弓形虫可影响胎儿的发育，严重者致畸甚至死亡，同时造成孕妇流产或早产；对于免疫抑制或免疫缺陷的病人，弓形虫更是一个主要的机会性致病因素。据报道，孕妇感染弓形虫后有30%～46%的机率将其传播给胎儿，引起胎儿先天性感染，造成流产、死胎或先天性弓形虫病；有6%～10%的艾滋病患者并发弓形虫病，而且艾滋病病人所患脑炎中有50%是由弓形虫感染所引起的。孕产妇和肿瘤患者弓形虫抗体阳性率高达10%～60%。二、猫、犬、猪、羊、牛、兔等家畜感染弓形虫非常普遍，其感染率高达10%～50%，猪、牛、羊的流产率达到 30-40.7%；猪感染弓形虫还可引起“无名高热”，病死率达60%，因此弓形虫病是造成家畜流产的重要因素之一，影响畜牧业生产。三、犬猫作为伴侣动物更是掀起一阵"犬猫宠物热"，犬作为弓形虫的重要中间宿主，猫作为唯一终末宿主，与人接触亲密，成为人类弓形虫病的主要传染源。四、弓形虫可以感染所有的有核细胞，(猪牛羊鸡鸭鹅等)动物感染率平均为15.4%，感染后弓形虫以缓殖子形式遍布全身各个组织。这就造成弓形虫很容易经肉、乳、蛋类大量流入食品市场，成为人类的传染源，严重威胁着动物性食品的公共卫生安全。

然而，迄今为止国内外仍然没有理想的商品化防治弓形虫病的疫苗和药物，弓形虫感染后可引起宿主保护性免疫应答，因此研制安全、有效的疫苗应是弓形虫病良好的预防措施。弓形虫疫苗的研制从60年代开始经历了全虫疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗和核酸（或DNA）疫苗等几个阶段。全虫疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，但灭活疫苗对小鼠缺乏免疫保护性，因此无实际应用价值；弓形虫速殖子经紫外线、放射线及化学试剂等处理后毒力减弱，能诱导较强的免疫应答，如Ts-4、T-263和S48，但减毒活疫苗存在减毒不充分和毒力返祖等危险，因此弱毒疫苗不能广泛使用；亚单位疫苗是从虫体裂解物或排泄-分泌抗原中提取特定组分作为疫苗，具有较好的免疫原性，但纯化费时、费力，并且价格昂贵；基因工程疫苗是将弓形虫抗原基因在高效表达载体中表达，从而得到大量纯化的单一抗原。综合以上论述可以发现，基因工程疫苗是弓形虫疫苗发展的希望，具有潜在的开发应用价值。

发明内容

针对目前问题，本发明提供一种用于预防羊弓形虫感染的核苷酸序列、载体、蛋白、疫苗和制备方法及其应用，利用基因工程技术，克隆出弓形虫HMG1基因，并将HMG1基因基因转入工程菌进行表达，经诱导后重组抗原获得高效表达，并对重组抗原的特异性和免疫原性进行生理性研究，表现良好的免疫原性。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：

本发明第一个目的是提供一种核苷酸序列，其特征在于，其中所述核苷酸序列为序号（1）或（2）或3中任意一种所述核苷酸序列：

（1）SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列；

（2）与（1）中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

（3）与上述（1）或（2）所述核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

本发明第二个目的是提供一种载体，其特征在于，所述载体包括序号（1）或（2）或（3）所述任意一种核苷酸序列；所述载体为pET28a表达载体。

本发明第三个目的是提供一种可溶性融合蛋白，其特征在于，所述可溶性融合蛋白的氨基酸序列由权利要求2所述的载体编码。

较佳地，所述一种可溶性融合蛋白包括弓形虫VEG株 HMG1蛋白，以及组氨酸纯化标签；其中编码所述弓形虫（VEG株）HMG1蛋白的DNA序列选自SEQ ID NO.1；所述的纯化标签的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

优选，可溶性融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本发明第三个目的是提供一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的载体，或已用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转染。

本发明第四个目的是提供一种制备可溶性融合蛋白的方法，其特征在于，包括通过宿主细胞表达可溶性融合蛋白，并进行分离。

本发明第五个目的是提供一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1中序号（1）或（2）或（3）所述任意一种的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。

优选，所述疫苗是将弓形虫抗原双酶切后连接到pET28a表达载体，转化入BL21(DE3)工程菌，诱导其高效表达，纯化后得到的蛋白为可溶性融合蛋白，再添加206佐剂，制备而成，其疫苗保持其特有的免疫原性，适合于工业化生产。

亚单位灭活疫苗适用于对2-3岁龄成年绵羊或怀孕1个月内的绵羊进行免疫注射。

本发明的优点在于：选用了弓形虫有效地抗原基因进行亚单位灭活疫苗的研制，根据该抗原基因具有与哺乳动物抗原非常相似的“TNF-α信号多肽区”，因此该抗原制备的亚单位灭活疫苗具有较强的细胞免疫和体液免疫效果，能够诱导机体的先天性免疫应答，分泌各种细胞炎性因子，从而有效的预防弓形虫病。

附图说明

图1.弓形虫HMG1基因ORF扩增结果。

附图中：M, DL10000 marker; HMG1，目的基因片段。

图2.弓形虫HMG1 基因重组表达蛋白的可溶性分析SDS-PAGE结果。

附图中：M, 蛋白marker; S+, 菌体经可溶性裂解也裂解后可溶性成分；

S－，菌体经可溶性裂解也裂解后剩余的不可溶性成分。

图3.弓形虫HMG1 基因重组表达蛋白纯化SDS-PAGE结果。

附图中：M, 蛋白marker; r, 重组HMG1蛋白。

图4.弓形虫HMG1重组蛋白刺激小鼠RAW264.7细胞产生TNF-α水平。

图5.弓形虫HMG1重组蛋白刺激小鼠树突状细胞产生IL-12水平。

图6.弓形虫HMG1重组蛋白疫苗对小鼠抗弓形虫感染的保护作用。

图7.弓形虫HMG1重组蛋白疫苗对绵羊抗弓形虫感染导致流产的保护作用。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：弓形虫重组蛋白原核表达载体的构建

参照弓形虫HMG1基因序列开放型阅读框和原核表达载体pET28a物理图谱设计引物并引入酶切位点。

上游：GGAATTCGCACCGAAGAAGGTGACAAAGAAG

下游：CCCTCGAGTTTCTTCTTGTTGTAGAGAGAG

用RNA提取试剂盒提取弓形虫滋养体总RNA， RT-PCR试剂盒扩增HMG1基因（通用RT参数为：37℃ 60min; 65℃ 20min; 4℃ 5min。 PCR参数为： 95℃ 3min；94℃ 1min；59.5℃40s，72℃ 1min，30个循环后于72℃延伸10min），将PCR纯化产物克隆至pGEM-T vectorsystem 经酶切和测序鉴定阳性克隆菌，阳性质粒经EcoRI和XhoI进行双酶切后纯化的目的片段连接到原核表达载体pET28a，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞后筛选重组质粒，用EcoRI和XhoI进行双酶切反应鉴定，获得原核表达质粒pET28a-HMG1。将pET28a-HMG1转化入BL21(DE3)工程菌，挑取单个菌落接种到3ml LB 液体培养基中( 含100μg/ml 卡那霉素) 中,37℃，200rpm 振荡培养过夜，按1：100 转接种到10ml 含相同浓度抗生素LB液体培养基中，37℃，200rpm 振荡培养4h，加入终浓度为1mM 的 IPTG，37℃，200rpm诱导4h，最后通12%SDS-PAGE检测表达情况，其结果见附图1。

实施例2：表达蛋白的纯化

（1）表达蛋白的提取及可溶性验证

以选取的转化了重组质粒pET-28a(+)-HMG1的E.coli BL21(DE3)单菌落为出发菌种接种于8 mL LB液体培养基中，37℃过夜振荡培养。次日将种子液转接到400mL LB液体培养基中37℃扩繁，监测菌液OD600至0.6～0.7时，在最适条件下诱导表达。离心收集菌体，菌体用10mL可溶性蛋白裂解液悬浮，加入100μL 0.1M PMSF，反复冻融3次（-80℃,1h / 37℃,10min）后，经超声处理，或加入100μL DNase和100μL 100× DNase Buffer 及100μLRNase，37℃水浴15min，离心取上清即为可溶性蛋白（具有活性的蛋白）。沉淀用10mL不可溶性蛋白纯化裂解液A悬浮，室温振摇1h，离心取上清即为非可溶性蛋白（变性蛋白）。将上述两种蛋白分别进行SDS-PAGE检测以验证目的蛋白的可溶性，若目的蛋白主要位于可溶性蛋白上清，说明为可溶性表达；若目的蛋白大部分位于非可溶性蛋白性蛋白上清液中，则说明为包涵体形式表达，其结果见附图2。

（2）融合表达蛋白的纯化

向蛋白所在的10mL裂解上清液中加入2mL 50% Ni-NTA 混悬液，在旋转摇床上以转速200rpm缓慢震荡1-2h ；将全部悬液倒入带底盖和帽的柱子中（QIAGEN），打开底盖，用柱帽轻压一下柱子，移去柱帽，使液体靠重力缓慢滴下，收集流出的混悬液，以备SDS-PAGE检测是否还有未被绑定的蛋白。用裂解液清洗灌有Ni-NTA的柱子，每次1mL，用NANODROP 1000spectrophotometer检测蛋白在OD280时的浓度，反复冲洗至检测不到蛋白；换洗液后以同样的方法洗Ni-NTA柱，并用NANODROP检测蛋白浓度；当检测不到蛋白时，用蛋白溶解液溶解蛋白，每次0.5mL上柱，每次流出的溶液收集到新的1.5mL离心管中，此时得到即为纯化后的表达蛋白，溶解至用NANODROP检测不到，通过SDS-PAGE检测蛋白纯度，BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，其结果见附图3。

实施例3：表达产物对小鼠巨噬细胞免疫原性检测

将RAW264.7细胞以0.5x106/mL 接种到24孔培养板上，每孔1mL，5% CO2，37℃培养24h。吸出上清后将制备好的弓形虫重组HMG1蛋白溶于RAW264.7细胞培养液中，并按1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL的浓度，按1mL/孔添加至细胞培养板中，试验中用等体积的空白质粒纯化蛋白NR 作为阴性对照。将细胞培养板置于5% CO2，37℃培养箱中培养48h，收集上清液，通过ELISA实验检测TNF-a水平。结果表明TNF-a的产生程度不同，并且TNF-a的量随蛋白浓度的增高而增加，范围从180pg-520pg不等，结果见附图4；从结果中说明该重组蛋白可以刺激RAW264.7细胞产生TNF-a。

实施例4:表达产物对小鼠树突状细胞免疫原性检测

分离小鼠树突状细胞，调整细胞浓度为0.5x106个/mL，接种至48孔组织细胞培养板中，每孔接种0.5mL。将处理的重组蛋白分别以每孔1μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL的浓度添加至细胞培养板中。将细胞培养板置于5% CO2，37℃培养箱中培养24h，收集培养上清液，通过ELISA实验检测上清液中IL-12水平。结果表明各组产生IL-12含量不同，且呈现蛋白浓度依赖性其结果见附图5，结果说明该重组蛋白可以刺激小鼠树突状免疫细胞产生大量的IL-12。

实施例5: 弓形虫重组亚单位疫苗在实验小鼠应用研究

将100只6～8周龄左右，18～22g的雌SPF级BALB/c小鼠分成4组，每组25只，其中第一组HMG1实验组(佐剂为弗氏佐剂，30 µg/只，皮下注射)，第二组为阳性对照组（30 µg/只弓形虫GRA1重组蛋白，配以弗氏佐剂，皮下注射），第三组为阴性对照组（相等体积量的空白表达载体纯化蛋白，配以弗氏佐剂，皮下注射），第四组为空白对照组（相等体积量的PBS，皮下注射）。各组注射三次，间隔两周。第三次免疫注射一周后腹腔注射纯化的弓形虫滋养体103个/只，每天观察记录小鼠状况。

免疫保护性试验结果显示实验组免疫保护率明显优于阴性对照组和空白对照组，且优于阳性对照组（见图6）。

实施例6:弓形虫重组亚单位疫苗在哺乳动物应用研究

将30只怀孕1个月的绵羊（2~3岁龄），分成2组，第一组20只，为 HMG1实验组(佐剂为206佐剂，200 µg/只，肌肉注射)，第二组10只，为阴性对照组（相等体积量的空白表达载体纯化蛋白，配以206佐剂，肌肉注射），各组注射三次，间隔三周。第10周静脉注射纯化的弓形虫滋养体104个/只，每天观察记录绵羊流产保护状况，其结果见附图7。结果表明实验组的流产保护状况明显高于阴性对照组。

综合上述实验结果，本发明提供的一种弓形虫亚单位灭活疫苗，对弓形虫免疫保护率较高，可以用来作为弓形虫病的预防和治疗性候选疫苗。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 艾堪生物科技（天津）有限公司

<120> 用于预防羊弓形虫感染的核苷酸序列、载体、蛋白、疫苗和制备方法及其应用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcaccga agaaggtgac aaagaaggga acagagggga agaagaagcg cgcaaagaag 60

gaccccaacg ctcccaagaa gcctctttcg tcttacatgt ttttcgcaaa ggacaagcgg 120

gccgaaatcc tcaagaaaca gcctagtctc aagtccgaca tcggcaaggt ggggaagatg 180

atcggcgagg aatgggcaaa gctaagctca tcgcagaaaa tgacttacca aaagaaagct 240

gagcaagaga aaatcagata tcaacgtgaa atgtctctct acaacaagaa gaaatga 297

<210> 2

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工蛋白

<400> 2

Met Ala Pro Lys Lys Val Thr Lys Lys Gly Thr Glu Gly Lys Lys Lys

1 5 10 15

Arg Ala Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Lys Pro Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Phe Phe Ala Lys Asp Lys Arg Ala Glu Ile Leu Lys Lys Gln Pro

35 40 45

Ser Leu Lys Ser Asp Ile Gly Lys Val Gly Lys Met Ile Gly Glu Glu

50 55 60

Trp Ala Lys Leu Ser Ser Ser Gln Lys Met Thr Tyr Gln Lys Lys Ala

65 70 75 80

Glu Gln Glu Lys Ile Arg Tyr Gln Arg Glu Met Ser Leu Tyr Asn Lys

85 90 95

Lys Lys

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 标签蛋白

<400> 3

His Ile Ser His Ile Ser His Ile Ser His Ile Ser His Ile Ser His

1 5 10 15

Ile Ser。

Claims (10)

1.一种核苷酸序列，其特征在于，其中所述核苷酸序列为序号(1)或(2)或(3)中任意一种所述核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列；

(2)与(1)中所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(3)与上述(1)或(2)所述核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列。

2.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求1中任意所述的一种核苷酸序列。

3.一种可溶性融合蛋白，其特征在于，所述可溶性融合蛋白的氨基酸序列由权利要求2所述的载体编码。

4.根据权利要求3所述的一种可溶性融合蛋白，其特征在于，包括弓形虫VEG株HMG1蛋白，以及组氨酸纯化标签；其中编码所述弓形虫VEG株HMG1蛋白的DNA序列选自SEQ IDNO.1；所述的纯化标签的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。

5.根据权利要求4所述的一种可溶性融合蛋白，其特征在于，可溶性融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

6.一种可溶性融合蛋白在制备预防羊弓形虫感染的灭活疫苗中的应用。

7.一种亚单位灭活疫苗在制备预防羊弓形虫感染的药物中的应用，其特征在于，所述疫苗包括权利要求1中任意所述一种的核苷酸序列，以及医学上可接受的载体。

8.根据权利要求7所述的一种亚单位灭活疫苗在制备预防羊弓形虫感染的药物中的应用，其特征在于，所述亚单位灭活疫苗适用于对2-3岁龄成年绵羊或怀孕1个月内的绵羊进行免疫注射。

9.一种制备权利要求3、4或5任一所述的可溶性融合蛋白的方法，其特征在于，所述的可溶性融合蛋白通过宿主细胞表达，并进行分离得到；其中 所述宿主细胞含有权利要求2所述的载体，或已用权利要求1所述的核苷酸序列转化或转染。

10.一种制备权利要求7或8任一所述的亚单位灭活疫苗的方法，其特征在于，所述亚单位灭活疫苗将弓形虫抗原双酶切后连接到pET28a表达载体，转化入BL21(DE3)工程菌，诱导其高效表达，纯化后得到可溶性融合蛋白，最后添加206佐剂制备而成。