ES2915100T3

ES2915100T3 - Lisozima microbiana para su uso en el tratamiento del síndrome del intestino irritable o de la enfermedad inflamatoria intestinal

Info

Publication number: ES2915100T3
Application number: ES18701104T
Authority: ES
Inventors: Soeren Kjaerulff; Marianne Thorup Cohn; Nanna Ny Kristensen
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2017-01-04
Filing date: 2018-01-04
Publication date: 2022-06-20
Anticipated expiration: 2038-01-04
Also published as: JP2020513771A; BR112019013574A2; IL267767A; MY191930A; KR20190103234A; EP3565582B1; JP7319920B2; EP3565582A1; US20190351032A1; CN110267676A; US11179447B2; CA3048773A1; MX2019007902A; US20220118061A1; WO2018127532A1; AU2018205999A1; EP4052722A1

Abstract

Lisozima microbiana o una composición que comprende lisozima microbiana para su uso en un método para prevenir, aliviar o tratar el síndrome del intestino irritable (SII) o la enfermedad inflamatoria intestinal (EII).

Description

DESCRIPCIÓN

Lisozima microbiana para su uso en el tratamiento del síndrome del intestino irritable o de la enfermedad inflamatoria intestinal

Referencia a la lista de secuencias

[0001] Esta solicitud contiene una lista de secuencias en formato legible por ordenador.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se refiere a la lisozima microbiana y a composiciones que la comprenden para estabilizar la microbiota y suprimir el crecimiento y/o la colonización intestinal de patógenos bacterianos en el tubo digestivo(TD) para su uso en la prevención, el alivio o el tratamiento del síndrome del intestino irritable (SII) o la enfermedad inflamatoria intestinal (EII).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] La flora intestinal de los seres humanos contiene una gran cantidad de bacterias que juegan un papel importante en la salud intestinal de los seres humanos. El íleon distal contiene 10e7 a 10e8 bacterias principalmente anaeróbicas/gramo de contenido luminal, mientras que el colon tiene 10e11 a 10e12 colonias bacterianas/gramo, con predominio de las especies Bacteroides, Clostridium y Bifidobacterium. La inflamación intestinal crónica es la consecuencia de una respuesta inmune mediada por células demasiado agresivas a las bacterias entéricas comensales (endógeno normal) en un huésped genéticamente susceptible. La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad debilitante caracterizada por una inflamación intestinal crónica que a menudo muestra un curso intermitente con ataques agudos seguidos de periodos de remisión. Los síntomas clínicos durante los ataques agudos incluyen diarrea, sangrado, dolor abdominal, fiebre, dolor articular y pérdida de peso. La EII puede manifestarse en una variedad de formas, donde la más común es la enfermedad de Crohn (una inflamación transmural crónica del intestino, que puede afectar a todo el tubo digestivo) y la colitis ulcerosa (una enfermedad inflamatoria intestinal crónica que afecta al colon). La colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn se producen en áreas del tubo digestivocon las concentraciones más altas de bacterias luminales.

[0004] La lisozima es un o-glicosil hidrolasa producida como mecanismo defensivo contra las bacterias por muchos organismos. La enzima provoca la hidrólisis de las paredes celulares bacterianas al romper los enlaces glicosídicos del peptidoglicano. Después de que sus paredes celulares se debiliten por la acción de la lisozima, las células bacterianas se lisan como resultado de una presión osmótica desequilibrada. Además, la lisozima puede degradar el peptidoglicano extracelular en fragmentos solubles, lo que parece limitar la inflamación. La lisozima se ha clasificado en cinco familias diferentes de glicósidos hidrolasas (GH) (CAZy, www.cazi.org): lisozima de clara de huevo de gallina (GH22), lisozima de clara de huevo de ganso (GH23), lisozima de bacteriófago T4 (GH24), proteína flagelar de Sphingomonas (GH73) y lisozimas de Chalaropsis (GH25). Las lisozimas de las familias GH23 y GH24 se conocen principalmente a partir de bacteriófagos y solo recientemente se han identificado en hongos. Se ha descubierto que la familia de lisozimas GH25 no está estructuralmente relacionada con las otras familias de lisozimas.

[0005] La lisozima se ha extraído tradicionalmente de la clara de huevo de gallina debido a su abundancia natural. La lisozima extraída de la clara de huevo de gallina es el principal producto disponible en el mercado comercial, pero no adhiere el ácido N,6-O-diacetilmurámico, por ejemplo, en las paredes celulares de Staphylococcus aureus son incapaces de lisar este importante patógeno humano, entre otros (Masschalck B, Deckers D, Michiels CW (2002), "Lytic and nonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by lysozyme under atmospheric and high hydrostatic pressure", J Food Prot. 65(12):1916-23).

[0006] La WO2000/21381, la GB2379166 y la WO2004/026334 divulgan cada una una composición que comprende una lisozima GH22 de clara de huevo de gallina. La secuencia de aminoácidos madura de una lisozima GH25 de tipo salvaje de Acremonium alcalophilum se describe en la WO 2013/076253. La WO 2017/001703 divulga un alimento para animales o un aditivo de alimentos para animales, que comprende una lisozima GH25 de Acremonium alcalophilum o una lisozima GH24 de Trichophaea saccata para mejorar la producción del factor de eficiencia de producción europeo (EPEF) y/o la tasa de conversión alimenticia (FCR) de un animal monogástrico.

[0007] La US 2010/003235 A1 describe el uso de lisozima humana producida de forma recombinante contra la enfermedad inflamatoria intestinal. Maggie Lee et al. divulga en Journal of Agricultural and Food Chemistry (vol.

57(6), 2009, págs. 2233-2240) suplementos de lisozima de clara de huevo de gallina en un modelo porcino que prueba la colitis inducida por dextrano sulfato de sodio (DSS) en la inflamación intestinal. Existe la necesidad de una composición que, tras la administración, cambie la microbiota en beneficio de los seres humanos que tienen una microbiota indeseable, como los pacientes que padecen, por ejemplo, EII y/o SII. La presente invención proporciona un método para obtener dichos cambios.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0008] La invención proporciona lisozimas microbianas y composiciones que las comprenden para su uso en un método para prevenir, aliviar o tratar el síndrome del intestino irritable (SII) o la enfermedad inflamatoria intestinal (EII).

[0009] En un aspecto, la lisozima microbiana o la composición que la comprende estabiliza la microbiota sana en el tubo digestivo(TD) y suprime el crecimiento y/o la colonización intestinal de patógenos bacterianos. En otro o más aspectos, la lisozima microbiana o la composición que la comprende previene, alivia o trata la inflamación y, en otro o aspecto adicional, la lisozima microbiana o la composición que la comprende reduce la deposición de lípidos ectópicos asociada con la obesidad, como, por ejemplo, obesidad inducida por la dieta.

[0010] En otro o más aspectos adicionales, la lisozima microbiana reduce la cantidad de células muertas de Lactobacillus johnsonii, o restos de pared celular de las mismas en el tubo digestivo.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA LISTA DE SECUENCIAS

[0011]

SEQ ID N.°: 1 es la secuencia de aminoácidos madura de una lisozima GH25 de tipo salvaje de Acremonium alcalophilum, como se describe en la WO 2013/076253.

SEQ ID N.°: 2 es la secuencia genética de la lisozima GH24 aislada de Trichophaea saccata.

SEQ ID N.°: 3 es la secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID N.°: 2.

SEQ ID N.°: 4 es la secuencia de aminoácidos madura de una lisozima GH24 de tipo salvaje de Trichophaea saccata.

SEQ ID N.°: 5 es la secuencia de aminoácido madura de una lisozima GH22 de tipo salvaje de Gallus gallus (lisozima de clara de huevo de gallina).

SEQ ID N.°: 6 es el cebador F-80470.

SEQ ID N.°: 7 es el cebador R-80470.

SEQ ID N.°: 8 es el cebador 8643.

SEQ ID N.°: 9 es el cebador 8654.

SEQ ID N.°: 10 es el cebador directo 27F.

SEQ ID N.°: 11 es el cebador inverso 534R.

SEQ ID N.°: 12 es una secuencia que representa el gen 16S ARNr clasificado como Faecalibacterium prausnitzii, como se describe en Duncan, S.H. et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52 (PT 6), 2141-2146 (2002) y presentado el 19 de septiembre de 2021 por Hold G.L. a Gut Microbiology and Immunology.

SEQ ID N.°: 13 es la secuencia de ADN genómico de una lisozima GH25 aislada de Myceliophthora fergusii. SEQ ID N.°: 14 es la secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID N.°: 13.

SEQ ID N.°: 15 es la secuencia de aminoácido de la lisozima GH25 madura de Myceliophthora fergusii. SEQ ID N.°: 16 es la secuencia de ADNc de una lisozima GH25 aislada de la especie Lecanicillium WMM742. SEQ ID N.°: 17 es la secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID N.°: 16.

SEQ ID N.°: 18 es la secuencia de aminoácido de la lisozima GH25 madura de la especie Lecanicillium WMM742.

SEQ ID N.°: 19 es la secuencia de ADNc de una lisozima GH25 aislada de la especie Zygomycetes XZ2655. SEQ ID N.°: 20 es la secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID N.°: 19.

SEQ ID N.°: 21 es la secuencia de aminoácidos de la lisozima GH25 madura de la especie Zygomycetes XZ2655.

SEQ ID N.°: 22 es la secuencia de ADNc de una lisozima GH25 aislada de Malbranchea flava.

SEQ ID N.°: 23 es la secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID N.°: 22.

SEQ ID N.°: 24 es la secuencia de aminoácidos de la lisozima GH25 madura de Malbranchea flava. SEQ ID N.°: 25 es el ADN de codones optimizados de la lisozima GH25 aislada de Hypholoma politrichi. SEQ ID N.°: 26 es la secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID N.°: 25.

SEQ ID N.°: 27 es la secuencia de aminoácido de la lisozima GH25 madura de Hypholoma politrichi. SEQ ID N.°: 28 es la secuencia de ADNc de una lisozima GH25 aislada de Engyodontium album.

SEQ ID N.°: 29 es la secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID N.°: 28.

SEQ ID N.°: 30 es la secuencia de aminoácido de la lisozima GH25 madura de Engyodontium album.

FIGURAS

[0012]

La figura 1 muestra, por ejemplo 6, las puntuaciones brutas del daño colónico (A), la longitud del colon (B) y el peso húmedo del colon (C) de ratones tratados con dosis alta, media o baja de la SEQ ID N.°: 1, la SEQ ID N.°: 15 o la SEQ ID N.°: 5, seguido de un tratamiento con dextrano sulfato de sodio (DSS, 3 %), en comparación con el control de vehículos, un tratamiento con la SEQ ID N.°: 1 sin DSS y un control de la enfermedad (tratamiento con DSS sin tratamiento con lisozima). Cada columna representa la media de n=10-12.

La Figura 2 muestra una comparación del desarrollo de peso del ejemplo 6 después del tratamiento con una dosis alta de la SEQ ID N.°: 1, la SEQ ID N.°: 15 y la S^eQ ID N.°: 5 en comparación con los controles. El gráfico de líneas que representa los cambios en el peso corporal de cada grupo en relación con el peso en el día -3 (cuando comenzó el tratamiento profiláctico). La exposición a DSS se inició el día 0. Cada línea corresponde a cada uno de los tratamientos indicados a lo largo del experimento (n=10-12).

La figura 3 muestra, para el ejemplo 6, una comparación del desarrollo del peso después del tratamiento con dosis alta, media y baja de la SeQ ID N.°: 1 (A), la SEQ ID N.°: 15 (B) o la SeQ ID N.°: 5 (C) en comparación con los controles. El gráfico de líneas representa los cambios en el peso corporal de cada grupo con respecto al peso en el día 3. Cada línea corresponde a cada uno de los tratamientos indicados a lo largo del experimento (n=10-12).

La figura 4 muestra, para el ejemplo 6, el efecto de la SEQ ID N.°: 1, la SEQ ID N.°: 15 y la SEQ ID N.°: 5 sobre los niveles de citoquinas en el tejido de colon en el día 5 después del inicio de la exposición a DSS. Las concentraciones de TNFa (A), IL-1P (B), IL-6 (C), IL-10 (D), IL-12 (E), IL-17a (F) & IL-25 (G) pr. mg de tejido de colon se muestran en respuesta a cada compuesto de prueba dosificado en concentración alta, media o baja en comparación con los controles. Cada columna representa la medida de n=10-12 ratones.

La figura 5 muestra, para el ejemplo 6, el efecto de la SEQ ID N.°: 1, la SEQ ID N.°: 15 y la SEQ ID N.°: 5 sobre los niveles de citoquinas en el tejido del colon el día 5 después del inicio de la exposición a DSS. Las concentraciones de TNFa (A), IL-1P (B), IL-6 (C), IL-10 (D), IL-12 (E), IL-17a (F) y IL-25 (G) pr. mg de tejido de colon se muestran en respuesta a cada compuesto de prueba dosificado en mol/día. Cada punto representa la medida de n=10-12.

La Figura 6 muestra el desarrollo del peso de los ratones del ejemplo 7 desde una semana antes del inicio de la dieta y durante todo el estudio (A), la masa grasa analizada en los puntos de tiempo indicados (B) y el peso del tejido al final (C). Cada columna/punto representa la media de n = 10-12.

La figura 7 muestra los ratones tratados, como se describe en el ejemplo 7: 5h de glucosa en sangre en ayunas (A), 5h de insulina en ayunas (B), niveles de glucosa en sangre en los puntos de tiempo indicados después de la exposición oral con 2 gramos de glucosa por kilo de masa magra (C), niveles plasmáticos de la respuesta de insulina endógena a la exposición de glucosa (D) y permeabilidad intestinal (E). Todas las medidas se realizaron después de 10 semanas de alimentación con dieta alta en grasas (HFD) y tratamientos de alimentación forzada diarios. Cada columna/punto representa la media de n = 10-12.

DEFINICIONES

[0013] Obesidad inducida por la dieta: la obesidad inducida por la dieta (DIO) es la obesidad causada por comer (seres humanos) o ser alimentados (modelo animal) con dietas ricas en grasa y/o de alta densidad.

[0014] Deposición de lípidos ectópicos: El término "deposición de lípidos" se usa para la deposición de grasa corporal. La grasa ectópica es el almacenamiento de triglicéridos dentro de las células del tejido no adiposo que contienen normalmente solo cantidades pequeñas de grasa, como el hígado, el músculo esquelético, el corazón y el páncreas. Por lo tanto, el término "deposición de lípidos ectópicos" significa grasa almacenada en tejidos, como el hígado, el músculo esquelético, el corazón y el páncreas.

[0015] Faecalibacterium: se conoce (Vétrovsky, Baldrian P (2013) The Variability of the 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses. PLoS ONE 8(2): e57923. Doi: 10.1371/journal.pone.0057923) que la identidad de la secuencia genética 16S ARNr varía dentro de un género. Se ha demostrado que la identidad media es 95,56 con una desviación típica de 3,68. También se descubrió que el 12,2 % de los géneros contienen especies con una similitud media del gen 16S rRNA por pares inferior al 90 %.

[0016] La SEQ ID N.°: 12 contiene secuencias genéticas 16S ARNr clasificadas como género Faecalibacterium prausnitzii, como se describe en Duncan, S.H. et al., Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52 (PT 6), 2141-2146 (2002) y presentado el 19 de diciembre de 2001 por Hold G.L. a Gut Microbiology and Immunology. Por lo tanto, las cepas se definen aquí como Faecalibacterium, en las que la identidad de secuencia de la región V1-V3 del gen 16S ARNr de dicha cepa tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 12.

[0017] Composición alimenticia: una "composición alimenticia" es cualquier composición que se pueda administrar a un ser humano como alimento. Como se utiliza en este caso, una composición alimenticia es lo mismo que una "composición dietética".

[0018] Fragmento: el término "fragmento" significa un polipéptido o un dominio catalítico, que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del extremo amino y/o carboxilo terminal de un polipéptido o dominio maduro; donde el fragmento tiene lisozima. En un aspecto, un fragmento comprende al menos 170 aminoácidos, como al menos 175 aminoácidos, al menos 177 aminoácidos, al menos 180 aminoácidos, al menos 185 aminoácidos, al menos 190 aminoácidos, al menos 195 aminoácidos o al menos 200 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 1 y tiene actividad de lisozima.

[0019] En otro aspecto, un fragmento comprende al menos 210 aminoácidos, como al menos 215 aminoácidos, al menos 220 aminoácidos, al menos 225 aminoácidos, al menos 230 aminoácidos, al menos 235 aminoácidos o al menos 240 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 4 y tiene actividad de lisozima.

[0020] En otro aspecto, un fragmento comprende al menos 170 aminoácidos, como al menos 175 aminoácidos, al menos 177 aminoácidos, al menos 180 aminoácidos, al menos 185 aminoácidos, al menos 190 aminoácidos, al menos 195 aminoácidos o al menos 200 aminoácidos de la SEQ ID N.°: 15 y tiene actividad de lisozima.

[0021] Desregulación de glucosa: el término "desregulación de glucosa" es un trastorno en el metabolismo y la regulación de los niveles de glucosa en sangre. Los ejemplos de afecciones causadas principalmente por la desregulación de la glucosa incluyen hipoglucemia, hiperglucemia, resistencia a la insulina, hiperinsulinemia, síndrome X, síndrome metabólico y diabetes.

[0022] Aumenta la proporción de bacterias de x en la microbiota del tubo digestivo: el término "aumenta la proporción de bacterias de x en la microbiota del tubo digestivo" significa que la cantidad de bacterias de un taxonómico específico (por ejemplo, orden o género) ha aumentado en comparación con una muestra de control. Las muestras de microbiota se pueden tomar del intestino (es decir, el tubo digestivo) y analizar examinando las secuencias (lecturas) de los genes 16S ARNr en la muestra. Las lecturas de los genes 16S ARNr se pueden reagrupar según la identidad de la secuencia y cada clúster se puede comparar con una base de datos de secuencias conocidas del gen 16S ARNr para identificar el tipo de bacterias en ese clúster. Los clústeres se pueden mezclar diferentes niveles taxonómicos (filo, clase, orden, familia, género o especie) para brindar un análisis cuantitativo de la cantidad de bacterias dentro de cada nivel de taxonomía en toda la muestra.

[0023] Al comparar los clústeres a partir de una persona de control a una persona a la que se le administró una lisozima de la invención, se pueden determinar diferencias en la microbiota. Los ejemplos de dicha determinación incluyen diferencias, por ejemplo, en la proporción de bacterias del género Faecalibacterium en la microbiota extraída de animales o seres humanos administrada con una lisozima en comparación con un control no administrado con una lisozima o la proporción de bacterias del orden Clostridiales en la microbiota extraída de animales o seres humanos administrada con una lisozima en comparación con el control.

[0024] Aislado: el término "aislado" significa una sustancia en una forma o un entorno que no se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia de origen no natural, (2) cualquier sustancia que incluya, pero no de forma limitada, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que se elimina al menos parcialmente de uno o más o todos los componentes de origen natural con los que se asocia en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre con respecto a la sustancia encontrada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada al aumentar la cantidad de la sustancia con respecto a otros componentes con los que se asocia naturalmente (por ejemplo, copias múltiples de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor naturalmente asociado al gen que codifica la sustancia). Una sustancia aislada puede estar presente en una muestra de caldo de fermentación.

[0025] Actividad de lisozima: el término "actividad de lisozima" significa la hidrólisis enzimática de los enlaces 1,4-beta entre el ácido W-acetilmurámico y los residuos de W-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano o entre los residuos de W-acetil-D-glucosamina en quitodextrinas, lo que da como resultado bacteriólisis debido a la presión osmótica. La lisozima pertenece a la clase de enzima EC 3.2.1.17. La actividad de lisozima se mide típicamente mediante determinación turbidimétrica. El método se basa en los cambios en turbidez de una suspensión de Micrococcus luteus ATCC 4698 inducidos por la acción lítica de la lisozima. En condiciones experimentales apropiadas, estos cambios son proporcionales a la cantidad de lisozima en el medio (c.f. SNI 1105 del compendio combinado de especificaciones de aditivos de alimentos de la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (www.fao.org)). Para los fines de la presente invención, la actividad de lisozima se determina según el ensayo de turbidez descrito en el ejemplo 5 ("Determinación de la actividad de lisozima"). En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención tienen una actividad de lisozima de al menos 20 %, como al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 100 % de la SEQ ID N.°: 1. En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención tienen una actividad de lisozima de al menos 20 %, por ejemplo, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 100 % de la SEQ ID N.°: 4. En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención tienen una la actividad de lisozima de al menos 20 %, por ejemplo, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 100 % de la SEQ ID N.°: 15. Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final después de la traducción y cualquier modificación posterior a la traducción, como procesamiento N-terminal, truncamiento C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc.

[0026] Dispositivo médico: un dispositivo médico se entiende aquí como un producto que cumple con la definición de un dispositivo médico en la sección 201 (h) de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos de Estados Unidos (FD&C), que incluye un instrumento, un aparato, un implemento, una máquina, un artificio, un implante, un reactivo in vitro, u otro artículo similar o relacionado, que incluye una parte de componente o un accesorio que esté reconocido en el Formulario Nacional Oficial, o en la Farmacopea de los Estados Unidos, o cualquier suplemento de los mismos, destinado a la cura, la mitigación, al tratamiento o la prevención de enfermedades, en el hombre o en otros animales, o destinado a afectar a la estructura o cualquier función del cuerpo del hombre u otros animales, que no logra sus propósitos primarios previstos a través de la acción química dentro o sobre el cuerpo del hombre o de otros animales y que no depende de ser metabolizado para el logro de cualquiera de sus propósitos primarios previstos”.

[0027] Lisozima microbiana: El término "lisozima microbiana" significa un polipéptido que tiene actividad de lisozima que se obtiene o puede obtenerse a partir de una fuente microbiana. Los ejemplos de fuentes microbianas son los hongos; es decir, la lisozima se obtiene o se puede obtener del reino Fungi, donde el término reino es el rango taxonómico. En particular, la lisozima microbiana se obtiene o se puede obtener del phylum Ascomycota, como el sub-phylum Pezizomycotina, donde los términos phylum y sub-phylum son los rangos taxonómicos.

[0028] Si no se conoce el rango taxonómico de un polipéptido, un experto en la técnica puede determinarlo fácilmente realizando una búsqueda BLASTP del polipéptido (por ejemplo, usando la página web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCIB) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y comparándolo con los homólogos más cercanos. Un polipéptido desconocido, que es un fragmento de un polipéptido conocido, se considera que pertenece a la misma especie taxonómica. Un polipéptido natural desconocido o una variante artificial que comprende una sustitución, deleción y/o inserción en hasta 10 posiciones se considera que pertenece a la misma especie taxonómica que el polipéptido conocido.

[0029] Se obtiene o se puede obtener de: el término "se obtiene o se puede obtener de" significa que el polipéptido se puede encontrar en un organismo de un rango taxonómico específico. En una forma de realización, el polipéptido se obtiene o puede obtenerse del reino Fungi, donde el término reino es el rango taxonómico. En una forma de realización preferida, el polipéptido se obtiene o se puede obtener del phylum Ascomycota, donde el término phylum es el rango taxonómico. En otra forma de realización preferida, el polipéptido se obtiene o se puede obtener del subphylum Pezizomycotina, donde el término subphylum es el rango taxonómico. En otra forma de realización preferida, el polipéptido se obtiene o se puede obtener de la clase Eurotiomycetes, donde el término clase es el rango taxonómico.

[0030] Si no se conoce el rango taxonómico de un polipéptido, un experto en la técnica puede determinarlo fácilmente realizando una búsqueda BLASTP del polipéptido (usando, por ejemplo, la página web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCIB) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y comparándolo con los homólogos más cercanos. Un polipéptido desconocido, que es un fragmento de un polipéptido conocido, se considera que pertenece a la misma especie taxonómica. Un polipéptido natural desconocido o una variante artificial que comprende una sustitución, deleción y/o inserción en hasta 10 posiciones se considera que pertenece a la misma especie taxonómica que el polipéptido conocido.

[0031] Unidad taxonómica operativa (OTU): el término "unidad taxonómica operativa" significa un clúster de secuencias con un cierto grado de similitud. En este caso, se elige el 97 por ciento como el umbral para asignar secuencias del gen 16S ARNr a diferentes OTUs, lo que significa que todas secuencias dentro de una única OTU tienen una identidad de secuencia de al menos 97 por ciento. En este nivel de identidad, a menudo se considera (o asume) que cada OTU representa una única especie bacteriana.

[0032] Brote posquirúrgico: significa la intensificación de una enfermedad o afección después de la cirugía. Por lo tanto, con la expresión "prevenir, aliviar o tratar los brotes de SII y/o EII postquirúrquicos" se entiende que se previene, alivia o trata el riesgo de que aparezca SII y/o EII tras la cirugía.

[0033] Prevención: significa detener o dificultar una enfermedad, un trastorno o síntoma de una enfermedad o afección a través de alguna acción.

[0034] Remisión (de una afección): significa un periodo en el curso de una enfermedad en el que los síntomas se vuelven menos severos. Por lo tanto, con la expresión "mantener la remisión de SII y/o EII" se entiende que se previene o alivia el riesgo de reaparición de SII y/o EII.

[0035] Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad de secuencia".

[0036] Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 453), como se implementa en el programa de agujas del paquete EMBOSs (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son la penalización de 10 por apertura de huecos, la penalización de 0,5 por extensión de huecos de y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de aguja etiquetada como "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:

(Residuos idénticos x 100)/(Longitud de la alineación - Número total de huecos en la alineación)

[0037] Polipéptido sustancialmente puro: el término "polipéptido sustancialmente puro" significa una preparación que contiene como mucho el 10 %, como mucho el 8 %, como mucho el 6 %, como mucho el 5 %, como mucho el 4 %, como mucho el 3 %, como mucho el 2 %, como mucho el 1 %, y como mucho el 0,5% en peso de otro material de polipéptido con el que se asocia de forma nativa o recombinante. Preferiblemente, el polipéptido es al menos 92 % puro, por ejemplo, al menos 94 % puro, al menos 95 % puro, al menos 96 % puro, al menos 97 % puro, al menos 98 % puro, al menos 99 %, al menos 99,5 % puro y 100 % puro en peso del material de polipéptido total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. Esto se puede lograr, por ejemplo, preparando el polipéptido mediante métodos recombinantes bien conocidos o mediante métodos de purificación clásicos.

[0038] Composición terapéutica: Una "composición terapéutica" es cualquier composición no alimenticia que comprende un ingrediente farmacéuticamente activo para la administración a un ser humano, que se usa para prevenir, aliviar o tratar una enfermedad. Los ejemplos de las composiciones terapéuticas incluyen, pero de forma no limitativa, un polvo, una pastilla, como una gragea o una pastilla efervescente, una cápsula, un componente de una emulsión o una pasta, una bolsita individual, goma de mascar o, en composiciones más generales, como gotas de aceite o en cualquier otro vehículo adecuado determinado por los expertos en la técnica como un vehículo eficaz para microorganismos.

[0039] Variante: el término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad de lisozima, que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción, y/o deleción de uno o más (varios) residuos de aminoácidos en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución significa el reemplazo del aminoácido que ocupa una posición con un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa añadir 1, 2 o 3 aminoácidos adyacentes e inmediatamente después del aminoácido que ocupa la posición.

[0040] En un aspecto, una variante de lisozima según la invención puede comprender de 1 a 5; de 1 a 10; de 1 a 15; de 1 a 20; de 1 a 25; de 1 a 30; de 1 a 35; de 1 a 40; de 1 a 45; o de 1 a 50, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 alteraciones y tienen una actividad de lisozima de al menos 20 %, por ejemplo, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 100 % de la lisozima protegitora, como la SEQ ID N.°: 1, la SEQ ID N.°: 4 o la SEQ ID N.°: 15.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0041] Se ha descubierto que una composición, como una composición alimenticia o farmacéutica o un dispositivo médico, que comprende una lisozima microbiana, cuando se proporciona a un ser humano, da como resultado un cambio en la microbiota, lo que puede ser beneficioso para mejorar la salud de los seres humanos.

[0042] En una forma de realización, una lisozima microbiana o una composición que comprende una lisozima microbiana se describe aquí para su uso en un método para prevenir, aliviar o tratar el síndrome del intestino irritable de (SII) y/o la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). En una forma de realización, el método comprende proporcionar y administrar una composición, como, por ejemplo, una composición alimenticia o farmacéutica, que comprende una o más lisozimas microbianas. En una forma de realización, la lisozima microbiana se obtiene o se puede obtener del reino Fungi.

[0043] Por lo tanto, los inventores han descubierto que la lisozima microbiana es adecuada para administrar a pacientes que padecen el síndrome del intestino irritable (SII) y/o la enfermedad inflamatoria intestinal (EII).

[0044] En una forma de realización, el método es prevenir, aliviar o tratar a pacientes que padecen el síndrome del intestino irritable (SII) y/o la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) durante un periodo de remisión, donde el periodo de remisión es un periodo en el que la gravedad de los síntomas del SII y/o de la EII disminuye temporalmente. Una forma de realización es para prevenir, aliviar o tratar a pacientes que padecen la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa durante un periodo de remisión, donde el periodo de remisión es un periodo en el que la gravedad de los síntomas del SII y/o de la EII disminuye temporalmente.

[0045] La lisozima microbiana descrita aquí también se puede administrar para obtener un aumento de peso de, por ejemplo, personas, como ancianos hospitalizados. En una forma de realización, el método comprende administrar una o más lisozimas microbianas a pacientes después de la operación. En una forma de realización, el método sirve para controlar el peso, como, por ejemplo, para retener el peso a un nivel deseado. En una forma de realización, el método sirve para controlar el peso de pacientes hospitalizados con riesgo de pérdida de peso después de la cirugía o durante la hospitalización en general.

[0046] En una forma de realización, la invención se refiere a la una composición que comprende lisozima microbiana para su uso en la obtención del aumento de peso de una persona, donde el alimento o el aditivo alimentario comprende una o más lisozimas microbianas.

[0047] En una forma de realización, el peso aumenta al menos un 1 %, por ejemplo, al menos un 1,5 %, al menos un 2,0 %, al menos un 2,5 %, al menos un 3 %, al menos un 3,5 %, al menos un 4 % o al menos un 5 % en comparación con un control que no recibió una composición que comprendiera lisozima microbiana. En otra forma de realización, el peso aumenta entre un 1 % y un 15 %, por ejemplo, entre un 1 % y un 12 %, entre un 1% y un 10 %, un 1,5 % y un 8 %, un 2,0 % y un 7 % en comparación con el control, o cualquier combinación de estos intervalos. La invención, además, se refiere a polipéptidos que tienen actividad de lisozima para su uso contra Lactobacillus johnsonii. Lactobacillus johnsonii es una bacteria importante de la flora intestinal de los seres humanos. Sin estar ligado a una teoría particular, se cree que la eliminación de células muertas de Lactobacillus johnsonii de la flora intestinal, por medio de lisis enzimática de la pared celular bacteriana parcialmente degradada, es un contribuyente importante a la salud intestinal de un ser humano.

[0048] En una forma de realización de la invención, los polipéptidos para su uso según la invención tienen una actividad de lisozima mejorada en comparación con la actividad de lisozima de la lisozima de clara de huevo de gallina (SEQ ID N.°: 5) según lo determinado por el método para la determinación de la actividad de lisozima contra Lactobacillus johnsonii.

[0049] Z Se divulga un método para mejorar la salud intestinal en seres humanos, que comprende reducir la cantidad de células muertas de Lactobacillus johnsonii, o restos de la pared celular de las mismas, en el tubo digestivo, que comprende proporcionar un polipéptido, como se define por la invención a un ser humano.

[0050] Se describe un método para mejorar la salud intestinal en seres humanos, que comprende reducir la cantidad de células muertas de Lactobacillus johnsonii, o restos de la pared celular de las mismas, en el tubo digestivo, que comprende proporcionar un polipéptido seleccionado del grupo que consta de un polipéptido, que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98%, al menos 99 % o 100 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 1.

[0051] Se describe un método para promover la eliminación de células muertas de Lactobacillus johnsonii, o restos de la pared celular de las mismas, del tubo digestivo que comprende proporcionar a un ser humano un polipéptido o una fuente de un polipéptido seleccionado del grupo que consta de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 15, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 18, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 21, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 24, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 27 y un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 30 o un polipéptido o una fuente de un polipéptido seleccionado del grupo que consta de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 1.

[0052] En los últimos años, un número cada vez mayor de estudios ha descrito claramente la importancia de Faecalibacterium, como un componente de la microbiota humana saludable. Por ejemplo, F. Prausnitzii, tiene una baja prevalencia en muchos trastornos intestinales, particularmente en pacientes con EII (Current Opinión in Microbiology 16(3), págs 1-7, julio 2013).

[0053] También se describen aquí composiciones, métodos y usos que son muy eficientes en el tratamiento o la prevención de afecciones asociadas con una baja abundancia de Faecalibacterium en el tubo digestivo. Además, se describen composiciones, métodos y usos que proporcionan un aumento de Faecalibacterium en el tubo digestivo.

[0054] En un aspecto, la lisozima microbiana es de la familia glicosil hidroliasa 24 (GH24) o de la familia glicosil hidroliasa 25 (GH25) y se obtiene o se puede obtener del reino Fungi.

[0055] En una forma de realización, la composición para su uso según la invención, como, por ejemplo, una composición alimenticia o farmacéutica, que comprende una o más lisozimas microbianas, puede usarse, por ejemplo, para estabilizar la microbiota saludable de los seres humanos mediante la supresión del crecimiento/la colonización intestinal de patógenos bacterianos, tales como Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Escherichia coli, Campylobacter coli y Campylobacter jejuni, especies Yersinia, especies Shigella y especies Salmonella, tales como Salmonella enterica y salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, especies Enterococcus y Helicobacter pylori. En otra forma de realización, una lisozima de la presente invención proporciona un efecto positivo sobre el equilibrio microbiano del tubo digestivo.

[0056] En una forma de realización, la composición para su uso según la invención aumenta la proporción de bacterias del orden Clostridiales en la microbiota del tubo digestivo. En una forma de realización, la proporción de bacterias del orden Clostridiales se incrementa en al menos un 1 %, por ejemplo, al menos un 1,5 %, al menos un 2 %, al menos un 2,5 %, al menos un 5 % o al menos un 7,5 %. En una forma de realización alternativa, la proporción de bacterias del orden Clostridiales se incrementa en un factor de al menos 1,25, como al menos 1,50, al menos 1,75, al menos 2,0, al menos 2,5 o al menos 3,0.

[0057] En una forma de realización, la lisozima microbiana es de origen fúngico. En una forma de realización, la lisozima microbiana se obtiene o se puede obtener del reino Fungi. En una forma de realización, la lisozima microbiana se obtiene o se puede obtener del phylum Ascomycota, como el sub-phylum Pezizomycotina. En una forma de realización, la lisozima microbiana se obtiene o se puede obtener de la clase Eurotiomycetes. En otra forma de realización, la lisozima microbiana se obtiene o se puede obtener del orden Eurotiales. En otra forma de realización más, la lisozima microbiana se obtiene o se puede obtener de la familia Aspergillaceae. En otra forma de realización mas, la lisozima microbiana se obtiene o se puede obtener del género Aspergillus.

[0058] En una forma de realización, la lisozima microbiana comprende uno o más dominios seleccionados de la lista que consta de GH24 y GH25. En una forma de realización, la lisozima microbiana comprende uno o más dominios de GH24. En una forma de realización, la lisozima microbiana comprende uno o más dominios de GH25.

[0059] También se describe aquí un método para aumentar la proporción de bacterias del género Faecalibacterium en la microbiota del tubo digestivo, donde el método comprende la administración de una composición, como una composición alimenticia o farmacéutica o un dispositivo médico, que comprende una lisozima microbiana. En una forma de realización, la lisozima microbiana se administra a un nivel de 8 a 250 ppm de proteína enzimática por kg de composición. En una forma de realización, la proporción de bacterias del género Faecalibacterium se incrementa en al menos un 1 %, por ejemplo, al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 15 % o al menos un 20 %. En una forma de realización alternativa, la proporción de bacterias del género Faecalibacterium aumenta en un factor de al menos 1,25, por ejemplo, al menos 1,50, al menos 1,75, al menos 2,0, al menos 2,5 o al menos 3,0.

[0060] En una forma de realización, el método aumenta la proporción de bacterias del género Faecalibacterium en la microbiota del tubo digestivo, donde las bacterias del género Faecalibacterium comprenden 16S ARNr, que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 %, por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 12. En una forma de realización, la proporción de bacterias del género Faecalibacterium se incrementa en al menos un 1 %, por ejemplo, al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 % o al menos un 5 %. En una forma de realización alternativa, la proporción de bacterias del género Faecalibacterium se incrementa en un factor de al menos 1,25, por ejemplo, de al menos 1,50, al menos 1,75, al menos 2,0, al menos 2,5 o al menos 3,0.

[0061] En una forma de realización preferida, la invención se refiere a una lisozima microbiana o una composición que la comprende para su uso en un método para prevenir, aliviar o tratar el síndrome del intestino irritable (SII) y/o la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que comprende administrar una composición, como, por ejemplo, una composición alimenticia o farmacéutica, que comprende una o más lisozimas microbianas para un paciente, donde:

(a) la lisozima microbiana es una lisozima microbiana que comprende uno o más dominios seleccionados de la lista que consta de GH24 y GH25; y

(b) opcionalmente, la lisozima microbiana se administra a diario durante al menos 5 días.

[0062] En otra forma de realización preferida, la invención se refiere a una lisozima microbiana o una composición, que la comprende para su uso en un método para prevenir, aliviar o tratar el síndrome del intestino irritable (SII) y/o la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), que comprende administrar una composición, como, por ejemplo, una composición alimenticia o farmacéutica, que comprende una o más lisozimas microbianas para un paciente, donde:

(b) la lisozima microbiana se administra durante un periodo de remisión

(c) opcionalmente, la lisozima microbiana se administra a diario durante al menos 5 días, donde el periodo de remisión es un periodo en el que la gravedad de los síntomas del SII y/o de la EII disminuye temporalmente.

[0063] También se describe un método para aumentar la proporción de bacterias del género Faecalibacterium en la microbioma del tubo digestivo, que comprende administrar una composición, como, por ejemplo una composición alimenticia o farmacéutica o un dispositivo médico, que comprende una o más lisozimas microbianas, donde:

(a) la lisozima microbiana es una lisozima GH24, que se obtiene o se puede obtener del phylum Ascomycota, preferiblemente del sub-phylum Pezizomycotina; y

(b) la proporción de bacterias del género Faecalibacterium en la microbiota del tubo digestivo de un animal se incrementa en al menos un 1 %.

[0064] En otra forma de realización preferida, la divulgación se refiere a un método para aumentar la proporción de bacterias del género Faecalibacterium en el microbiota del tubo digestivo, que comprende administrar una composición, como, por ejemplo, una composición alimenticia o farmacéutica o un dispositivo médico que comprende una o más lisozimas microbianas, donde:

(a) la lisozima microbiana es una lisozima GH25 que se obtiene o se puede obtener del phylum Ascomycota, preferiblemente del sub-phylum Pezizomycotina;

(b) la proporción de bacterias del género Faecalibacterium en la microbiota del tubo digestivo de un animal se incrementa en al menos 1 %.

[0065] En otra forma de realización preferida, la divulgación se refiere a un método para aumentar la proporción de bacterias del género Faecalibacterium en la microbioma del tubo digestivo, que comprende administrar una composición, como, por ejemplo, una composición alimenticia o farmacéutica o un dispositivo médico, que comprende una o más lisozimas microbianas, donde:

(a) la lisozima microbiana es una lisozima GH24, que se obtiene o se puede obtener del phylum Ascomycota, preferiblemente del sub-phylum Pezizomycotina;

(b) la proporción de bacterias de género Faecalibacterium en la microbiota del tubo digestivo de un animal se incrementa en al menos un 1 %; y

(c) las bacterias de género Faecalibacterium comprenden 16S ARNr, que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 %, por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o 100 % con la SEQ ID N.°: 12.

[0066] En otra forma de realización preferida, la divulgación se refiere a un método para aumentar la proporción de bacterias del género Faecalibacterium en la microbioma del tubo digestivo, que comprende administrar una composición, como, por ejemplo, una composición alimenticia o farmacéutica o un dispositivo médico que comprende una o más lisozimas microbianas, donde:

(a) la lisozima microbiana es una lisozima GH25, que se obtiene o se puede obtener del phylum Ascomycota, preferiblemente del sub-phylum Pezizomycotina;

(b) la proporción de bacterias del género Faecalibacterium en la microbiota del tubo digestivo de un animal se incrementa en al menos 1 %; y

(c) las bacterias del género Faecalibacterium comprenden 16S ARNr, que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 %, por ejemplo, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 12.

[0067] En una forma de realización, la lisozima microbiana para su uso según la invención se dosifica a un nivel de 0,1 a 1000 ppm de proteína enzimática por kg de alimento, como de 1 a 1000 ppm o de 0,1 a 500 ppm, de 1 a 500 ppm, de 10 a 500 ppm, de 10 a 300 ppm o de 10 a 200 ppm de proteína enzimática por kg de alimento, o cualquier combinación de estos intervalos. En una forma de realización, la lisozima microbiana se dosifica a un nivel de 11 a 125 ppm de proteína enzimática por kg de alimento, como de 12 a 100 ppm, de 13 a 75 ppm, de 15 a 50 ppm, de 17,5 a 40 ppm, de 25 a 75 ppm o de 30 a 60 ppm de proteína enzimática por kg de alimento, o cualquier combinación de estos intervalos.

[0068] En una forma de realización, la lisozima microbiana es de origen fúngico. En una forma de realización, la lisozima microbiana se obtiene o se puede obtener del phylum Ascomycota, como el sub-phylum Pezizomycotina.

[0069] En una forma de realización, la lisozima microbiana tiene una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 1.

[0070] En una forma de realización, la lisozima microbiana comprende o consta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 1 o una variante alélica de la misma; o es un fragmento de la misma que tiene actividad de lisozima, donde el fragmento comprende al menos 170 aminoácidos, por ejemplo, al menos 175 aminoácidos, al menos 177 aminoácidos, al menos 180 aminoácidos, al menos 185 aminoácidos, al menos 190 aminoácidos, al menos 195 aminoácidos o al menos 200 aminoácidos. En otra forma de realización, la lisozima microbiana comprende o consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 1 o una variante alélica de la misma y una etiqueta His y/o etiqueta HQ N-terminal y/o C-terminal. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consta de aminoácidos de 1 a 208 de la SEQ ID N.°: 1.

[0071] En otra forma de realización, la lisozima microbiana es una variante de la SEQ ID N.°: 1, donde la variante tiene actividad de lisozima y comprende una o más sustituciones y/o una o más deleciones y/o una o más inserciones o cualquier combinación de las mismas en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 posiciones. En otra forma de realización, el número de posiciones que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos y/o una o más deleciones de aminoácido y/o una o más inserciones de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas en la SEQ ID N.°: 1 está entre 1 y 45, como 1-40,1-35,1 30,1-25,1-20,1-15,1-10 o 1-5 posiciones. En una forma de realización, el número de posiciones que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos y/o una o más deleciones de aminoácidos y/o una o más inserciones de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas en la SEQ ID N.°: 1 no es más de 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En otra forma de realización, el número de sustituciones, deleciones y/o inserciones en la SEQ ID N.°: 1 no es más de 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En otra forma de realización, el número de sustituciones, preferiblemente sustituciones conservadoras, en la SEQ ID N.°: 1 no es más de 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En otra forma de realización, el número de sustituciones conservadoras en la SEQ ID N.°: 1 no es más de 10, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

[0072] Los cambios de aminoácidos pueden ser de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservativas que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; pequeñas deleciones, típicamente de 1-30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino- o carboxilo terminales, como un residuo de metionina aminoterminal; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

[0073] Los ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran en los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, Nueva York. Las sustituciones comúnes son Ala/Ser, Val/IIe, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/IIe, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly. Otros ejemplos de sustituciones conservadoras son G a A; A a G, S; V a I, L, A, T, S; I a V, L, M; L a I, M, V; M a L, I, V; P a A, S, N; F a Y, W, H; Y a F, W, H; W a Y, F, H; R a K, E, D; K a R, E, D; H a Q, N, S; D a N, E, K, R, Q; E a Q, D, K, R, N; S a T, A; T a S, V, A; C a S, T, A; N a D, Q, H, S; Q a E, N, H, K, R.

[0074] Los aminoácidos esenciales en un polipéptido se pueden identificar según los procedimientos conocidos en la técnica, como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis por barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la técnica anterior, se introducen mutaciones individuales de alanina en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se analizan en cuanto a la actividad de lisozima para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante análisis físico de la estructura, determinado por técnicas, tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones, o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también se puede deducir de un alineamiento con un polipéptido relacionado.

[0075] La estructura cristalina de la lisozima de Acremonium alcalophilum CBS114.92 se resolvió en una resolución de 1.3 A, como se describe en la WO 2013/076253. Estas coordenadas atómicas se pueden usar para generar un modelo tridimensional que represente la estructura de la lisozima de Acremonium alcalophilum CBS114.92 o estructuras homólogas (como las variantes de la presente invención). Usando la estructura de rayos X, los residuos de aminoácidos D95 y E97 (usando la SEQ ID N.°: 1 para la numeración) se identificaron como residuos catalíticos.

[0076] En una forma de realización, la lisozima microbiana tiene una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 4.

[0077] En una forma de realización, la lisozima microbiana usada en la invención comprende o consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 4 o una variante alélica de la misma; o es un fragmento de la misma, que tiene actividad de lisozima, donde el fragmento comprende al menos 210 aminoácidos, por ejemplo, al menos 215 aminoácidos, al menos 220 aminoácidos, al menos 225 aminoácidos, al menos 230 aminoácidos, al menos 235 aminoácidos o al menos 240 aminoácidos. En otra forma de realización, la lisozima microbiana comprende o consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.°: 4 o una variante alélica de la misma y una etiqueta His y/o etiqueta HQ N-terminal y/o C-terminal. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consta de los aminoácidos 1 a 245 de la SEQ ID N.°: 4.

[0078] En otra forma de realización, la lisozima microbiana es una variante de la SEQ ID N.°: 4, donde la variante tiene actividad de lisozima y comprende una o más sustituciones y/o una o más deleciones y/o una o más inserciones o cualquier combinación de las mismas en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 posiciones. En otra forma de realización, el número de posiciones que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos y/o una o más deleciones de aminoácidos y/o una o más inserciones de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas en la SEQ ID N.°: 4 está entre 1 y 45, como 1-40, 1-35, 1 30, 1-25, 1-20, 1-15, 1-10 o 1-5 posiciones. En una forma de realización, el número de posiciones que comprenden una o más sustituciones de aminoácidos y/o una o más deleciones de aminoácidos y/o una o más inserciones de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas en la SEQ ID N.°: 4 no es más de 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En otra realización, el número de sustituciones, deleciones y/o inserciones en la SEQ ID N.°: 4 no es más de 10, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En otra forma de realización, el número de sustituciones, preferiblemente sustituciones conservadoras, en la SEQ ID N.°: 4 no es más de 10, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En otra forma de realización más, el número de sustituciones conservadoras en la SEQ ID N.°: 4 no es más de 10, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

[0079] Los cambios de aminoácidos pueden ser de naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservativas, que no afectan significativamente al plegamiento y/o a la actividad de la proteína; pequeñas deleciones, típicamente de 1-30 aminoácidos; extensiones amino- o carboxi terminales pequeñas, como un residuo de metionina aminoterminal; un péptido conector pequeño hasta 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.

[0080] Los ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran en los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y están descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en The Proteins, Academic Press, Nueva York. Las sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/IIe, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg , Asp/Asn, Leu/IIe, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly. Otros ejemplos de sustituciones conservadoras son G a A; A a G, S; V a I, L, A, T, S; I a V, L, M; L a I, M, V; M a L, I, V; P a A, S, N; F a Y, W, H; Y a F, W, H; W a Y, F, H; R a K, E, D; K a R, E, D; H a Q, N, S; D a N, E, K, R, Q; E a Q, D, K, R, N; S a T, A; T a S, V, A; C a S, T, A; N a D, Q, H, S; Q a E, N, H, K, R.

[0081] Los aminoácidos esenciales en un polipéptido se pueden identificar según los procedimientos conocidos en la técnica, como mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis por barrido de alanina (Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En la técnica anterior, se introducen mutaciones individuales de alanina en cada residuo de la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se analizan en cuanto a la actividad de lisozima para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también se puede determinar mediante análisis físico de la estructura, determinado por técnicas, tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones, o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos del sitio de contacto putativo. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también se puede deducir de un alineamiento con un polipéptido relacionado.

[0082] La estructura cristalina de la lisozima de Acremonium alcalophilum CBS114.92 se resolvió en una resolución de 1.3 A, como se describe en la WO 2013/076253. Estas coordenadas atómicas se pueden usar para generar un modelo tridimensional que represente la estructura de la lisozima de Acremonium alcalophilum CBS114.92 o estructuras homólogas (como las variantes de la presente invención). Uso la estructura de rayos X, los residuos de aminoácidos D95 y E97 (usando la SEQ ID N.°: 1 para la numeración) se identificaron como residuos catalíticos.

[0083] En una forma de realización, los polipéptidos que tienen actividad de lisozima tienen una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 15.

[0084] En una forma de realización, los polipéptidos que tienen actividad de lisozima tienen una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 18.

[0085] En una forma de realización, los polipéptidos que tienen actividad de lisozima tienen una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 21.

[0086] En una forma de realización, los polipéptidos que tienen actividad de lisozima tienen una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 24.

[0087] En una forma de realización, los polipéptidos que tienen actividad de lisozima tienen una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 27.

[0088] En una forma de realización, los polipéptidos que tienen actividad de lisozima tienen una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 30.

[0089] Anteriormente se describen ejemplos de cambios de aminoácidos, sustituciones conservadoras y conectores N- y/o C-terminales.

[0090] La administración de probióticos, definidos por la Organización Mundial de la Salud como "organismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, confieren un beneficio al huésped", es una intervención nutricional segura en la población generalmente sana. Los probióticos se encuentran en el tracto intestinal humano y comúnmente están presentes en el yogur y otros artículos dietéticos y/o alimenticios (por ejemplo, bebidas, cereales y barritas de dulces).

Composición:

[0091] Las composiciones para su uso según la invención se pueden administrar en forma de alimentos o de suplementos dietéticos y pueden estar en cualquier forma líquida, sólida o semisólida. Pueden ser, por ejemplo, productos lácteos, tales como, por ejemplo, productos lácteos fermentados, que comprenden al menos dicha lisozima microbiana, opcionalmente combinada con otras bacterias, por ejemplo, con fermentos de yogur o queso, u otros productos alimenticios, tales como una barrita de snack, chocolate, o bebidas, como el zumo. Los ejemplos no limitativos de las composiciones alimenticias incluyen leche entera, desnatada, con sabor, yogur, que incluye yogur natural, con sabor, congelado o bebible, tónicos y bebidas deportivas, otros productos lácteos, tales como natillas, formulaciones de queso y requesón y helados.

[0092] Las composiciones alimenticias semisólidas se pueden seleccionar de pastas y productos para untar. Las cmposiciones sólidas pueden incluir barras alimenticias, galletas, cereales, fibras alimenticias, o cualquier otro alimento.

[0093] La lisozima microbiana también se puede proporcionar como un suplemento dietético en forma de un polvo, pastilla, como una gragea o pastilla efervescente, en forma capsular, como un componente de una emulsión o pasta, o en cualquier otro vehículo adecuado determinado por los expertos en la técnica como un vehículo eficaz para microorganismos vivos. Las composiciones que comprenden una lisozima microbiana pueden estar en sobres individuales, cápsulas, goma de mascar, o en composiciones más generales, como gotas de aceite.

[0094] En una forma de realización, la composición alimenticia es un producto final, que está listo ser consumido por parte de un consumidor. Por lo tanto, el consumidor puede comprarlo u obtenerlo de otro modo. Sin embargo, la composición alimenticia también puede ser un componente básico para la producción de otros alimentos.

[0095] La composición alimenticia, como se describe en este caso, puede comprender un vehículo. El término "vehículo" sugiere que la lisozima microbiana se distribuya por todo el vehículo y es conocida por el experto en la técnica. Los vehículos para su uso en la invención incluyen, sin limitación, por ejemplo, harina natural, harina predesidratada, almidón, almidón modificado, proteínas vegetales, proteínas de leche, proteínas desnaturalizadas y alcohol de azúcar, como, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, dulcitol, xilitol o arabitol. Por lo tanto, el vehículo es el componente principal de la composición alimenticia. Preferiblemente, la cantidad total de lisozima microbiana en el vehículo es inferior al 5 % (p/p), más preferiblemente inferior al 2 % (p/p) o inferior al 0,5 % (p/p), en base a la cantidad combinada de vehículo y lisozima microbiana. En una forma de realización específica, la composición alimenticia consta de la lisozima microbiana y el vehículo. Sin embargo, la composición puede comprender aditivos. Preferiblemente, dichos aditivos también se distribuyen por todo el vehículo.

EJEMPLOS

Cepas

[0096] Trichophaea saccata CBS804.70 se adquirió de Centraalbureau voor Schimmelcultures (Utrecht, Países Bajos). Según la Oficina Central de Cultivos de Hongos (Central Bureau vor Schnimmelkulture), Trichophaea saccata CBS804.70 se aisló del suelo de la punta de residuos de carbón de Staffordshire, Inglaterra, en mayo de 1968.

[0097] Según la Oficina Central de Cultivos de Hongos, Acremonium alcalophilum CBS 114.92 fue aislado por A. Yoneda en 1984 del lodo de compost de heces de cerdo cerca del lago Tsukui, Japón.

Medios y soluciones

[0098] El medio YP glucosa al 2 % estaba compuesto por extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 % y glucosa al 2%

[0099] El medio YP maltodextrina al 2 % estaba compuesto por extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 % y maltodextrina al 2 %.

[0100] Las placas de agar PDA estaban compuestas por infusión de patata (la infusión de patata se hizo hirviendo 300 g de patatas en rodajas (lavadas, pero sin pelar) en agua durante 30 minutos y luego decantando o filtrando el caldo a través de una estopilla. Luego se añadió agua destilada hasta que el volumen total de la suspensión fue de un litro, seguido de 20 g de dextrosa y 20 g de agar en polvo. El medio se esterilizó en autoclave a 15 psi durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a edición, Revisión A, 1998).

[0101] Las placas LB estaban compuestas por 10 g de triptona Bacto, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio, 15 g de agar Bacto y agua desionizada hasta 1 litro.

[0102] El medio LB estaba compuesto por 10 g de triptona Bacto, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro de sodio y agua desionizada hasta 1 litro.

[0103] Las placas de sacarosa de COVE estaban compuestas por 342 g de sacarosa, 20 g de polvo de agar, 20 ml de solución de sales de COVE y agua desionizada hasta 1 litro. El medio se esterilizó en autoclave a 15 psi durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a edición, Revisión A, 1998). El medio se enfrió a 60 °C y se añadieron 10 mM de acetamida, 15 mM de CsCl, TRITON® X-100 (50 |_il/500 ml).

[0104] La solución de sales de COVE estaba compuesta por 26 g de MgSO47H2O, 26 g de KCL, 26 g de KH2PO4, 50 ml de solución de metales traza de COV^ey agua desionizada hasta 1 litro.

[0105] La solución de metales traza de COVE estaba compuesta por 0,04 g de Na2B4O710H2O, 0,4 g de CuSO4-5H2O, 1,2 g de FeSO47H2O, 0,7 g de MnSO4H2O, 0,8 g de Na2MoO42H2O, 10 g de ZnSO47H2O y agua desionizada hasta 1 litro.

Ejemplo 1: Clonación, Expresión y Purificación de la lisozima GH25 de Acremonium alcalophilum CBS 114.92

[0106] La lisozima GH25 de Acremonium alcalophilum CBS 114.92 (SEQ ID N.°: 1) se clonó y expresó como se describe en el ejemplo 2 y se purificó, como se describe en el ejemplo 5 de la WO 2013/076253.

Ejemplo 2: Expresión de la lisozima GH24 de Trichophaea saccata

[0107] La cepa fúngica se cultivó en 100 ml de medio de glucosa YP glucosa al 2 % en matraces de agitación Erlenmeyer de 1000 ml durante 5 días a 20 °C. Los micelios se recogieron de los matraces mediante filtración del medio a través de un embudo de vacío Buchner revestido con MIRACLOTH® (EMD Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). Los micelios se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior uso. El ADN genómico se aisló usando un kit DNEASY® Plant Maxi (QIAGEN GMBH, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0108] La información de la secuencia genómica fue generada por Illumina MySeq (Illumina Inc., San Diego, CA). Se usaron 5 pgs del ADN genómico de Trichophaea saccata aislado para la preparación y el análisis de la biblioteca según las instrucciones del fabricante. Se empleó una estrategia de extremos emparejados de 100 pb con un tamaño de inserto de biblioteca de 200-500 pb. Se utilizó una mitad de una ejecución de HiSeq para obtener un total de 95.744.298, lecturas sin procesar de 100 pb. Posteriormente, las lecturas se fraccionaron al 25 % y luego se recortaron (se extrajeron las subsecuencias más largas con puntuaciones de Phred de 10 o más). Estas lecturas se ensamblaron usando la versión 0,19 de Idba. Se descartaron los contigs de menos de 400 pb, lo que dio como resultado 8.954.791.030 pb de bases con un N-50 de 10.035. Los genes se llamaron usando GeneMark.hmm ES versión 2.3c y la identificación del dominio catalítico se realizó usando el modelo oculto de Márkov "Phage lysozyme PF00959" proporcionado por Pfam. La secuencia de codificación del polipéptido para toda la región de codificación se clonó a partir de ADN genómico de Trichophaea saccata CBS804.70 mediante PCR usando los cebadores F-80470 y R-80470 (SEQ ID N.°: 6 y SEQ ID N.°: 7 respectivamente), como se describe a continuación.

5'- ACACAACTGGGGATCCACCATGCACGCTCTCACCCTTCT -3 (SEQ ID N.°: 6)

5'- CTAGATCTCGAGAAGCTTTTAGCACTTGGGAGGGTGGG -3 (SEQ ID N.°: 7)

[0109] Las letras en negrita representan la secuencia codificante de la enzima Trichophaea saccata. Los sitios de restricción están subrayados. La secuencia a la izquierda de los sitios de restricción es homóloga a los sitios de inserción de pDau109 (WO 2005/042735).

[0110] Se utilizó una mezcla de PCR extensora HIFI, concentración 2x (Thermo Scientific, n.° de catálogo AB-0795) para el experimento.

[0111] La reacción de amplificación (25 jl) se realizó según las instrucciones del fabricante (Thermo Scientific n.° de catálogo AB-0795) con las siguientes concentraciones finales:

Mezcla de PCR:

0,5 |^jM de cebador F-80470

0,5 j M de cebador R-80470

12, 5 j l de mezcla de PCR extensora HIFI, concentración 2x

11, 0 j l de H2O

10 ng de ADN genómico de Trichophaea saccata CBS804.70.

[0112] La reacción de PCR se incubó en un ciclador térmico de bloque dual DYAD® (BioRad, EE. UU) programado para 1 ciclo a 94 °C durante 30 segundos; 30 ciclos cada a 94 °C durante 30 segundos, 52 °C durante 30 segundos y 68 °C durante 60 segundos seguidos de 1 ciclo a 68 °C durante 6 minutos. Las muestras se enfriaron a 10° C antes de retirarlas y procesarlas más.

[0113] Tres j l de la reacción de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% usando 40 mM de Tris base, 20 de mM acetato de sodio, 1 mM de tampón EDTA disódico (TAE). La reacción de PCR restante se purificó directamente con un kit de purificación de bandas de gel y ADN de PCR ILLUSTRA™ GFX™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0114] Dos jg del plásmido pDau109 se digirieron con Bam HI y Hind III y el plásmido digerido discurrió en un gel de agarosa al 1%, tampón 50 mM de Tris base, 50 mM de ácido bórico, 1 mM de EDTA disódico (TBE) para eliminar el fragmento de relleno del plásmido restringido. Las bandas se visualizaron mediante la adición de tinción de gel de ADN seguro de SYBR® (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY, EE. UU.) y el uso de un transiluminador de longitud de onda de 470 nm. La banda correspondiente al plásmido restringido se sacó y purificó usando un kit de purificación de bandas de gel y ADN de PCR ILLUSTRA™ GFX™. El plásmido se eluyó en 10 mM de Tris, pH 8,0 y su concentración se ajustó a 20 ng por jl. Se usó un kit de clonación de PCR IN FUSION® (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EE. UU.) para clonar el fragmento de PCR de 983 pb en pDau109 digerido con Bam HI y Hind III (20 ng). El volumen de reacción total de IN-FUSION® fue de 10 jl. El volumen de reacción total de IN-FUSION® fue de 10 jl. La reacción de IN-FUSION® se transformó en células de E. coli FUSION-BLUE™ (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se colocó en placas de agar LB suplementadas con 50 jg de ampicilina por ml. Tras la incubación durante toda la noche a 37 °C, se observó el crecimiento de colonias transformantes bajo selección en las placas LB suplementadas con 50 jg de ampicilina por ml.

[0115] Se seleccionaron varias colonias para el análisis mediante PCR de colonias usando los cebadores del vector pDau109, que se describen a continuación. Se transfirieron cuatro colonias de las placas LB suplementadas con 50 jg de ampicilina por ml con un alfiler de inoculación amarillo (Nunc A/S, Dinamarca) a nuevas placas LB suplementadas con 50 jg de ampicilina por ml y se incubaron durante la noche a 37 °C Cebador 8653: 5'-GCAAGGGATGCCATGCTTGG-3' (SEQ ID N.°: 8)

Cebador 8654: 5'-CATATAACCAATTGCCCTC-3' (SEQ ID N.°: 9)

[0116] Cada una de las tres colonias se transfirió directamente a tubos de PCR de 200 j l compuestos por 5 j l de mezcla de PCR extensora HIFI 2X (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE. UU.), 0,5 j l de cebador 8653 (10 pm/jl), 0,5 j l de cebador 8654 (10 pm/jl) y 4 j l de agua desionizada. Cada PCR de colonia se incubó en un termociclador de bloque dual DYAD® programado para 1 ciclo a 94 °C durante 60 segundos; 30 ciclos cada uno a 95 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 60 segundos, 68 °C durante 10 minutos y 10 °C durante 10 minutos.

[0117] Tres j l de cada reacción de PCR completada se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1 % usando tampón TAE. Los cuatros transformantes de E. Coli mostraron una banda de PCR de aproximadamente 980 pb. El ADN del plásmido se aisló de cada una de las cuatro colonias usando un kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN GMBH, Hilden, Alemania). El ADN del plásmido resultante se secuenció con los cebadores 8653 y 8654 (SEQ ID N.°: 8 y 9) usando un secuenciador de ADN automatizado modelo 3730 de Applied Biosystems usando la química de terminación BIG-DYE™ versión 3.1 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, EE. UU). Se eligió un plásmido, denominado pKKSC0312-2, para transfomar Aspergillus oryzae MT3568. A. oryzae MT3568 es un derivado del gen alterado amdS (acetamidasa) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694), en el que se restauró la auxotrofia de pyrG inactivando el gen amdS de A. oryzae. Se prepararon rotoplastos de A. oryzae MT3568 según el método descrito en la patente europea EP0238023, páginas 14-15.

[0118] Se cultivó E. coli 3701, que contiene pKKSC0312-2, durante toda la noche según las instrucciones del fabricante (Genomed) y ADN del plásmido de pKKSC0312-2 usando un kit Plasmid Midi (Genomed JETquick kit, n.° de catálogo 400250, GENOMED GmbH, Alemania) según las instrucciones del fabricante. El ADN del plásmido purificado se transformó en Aspergillus oryzae MT3568. Se prepararon protoplastos de A. oryzae MT3568 de acuerdo con el método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Las placas de selección consistían en sacarosa de COVE con 10 mM de acetamida 15 mM de CsCI TRITON® X-100 (50 |jl/500 ml). Las placas se incubaron a 37 °C. Brevemente, se añadieron 8 j l de ADN de plásmido que representaban 3 jg de ADN a 100 j l de protoplastos MT3568. Se añadieron 250 j l de solución de PEG al 60 % y los tubos se mezclaron suavemente y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. La mezcla se añadió a 10 ml de agarosa superior de Cove prefundida (la agarosa superior se fundió y luego la temperatura se equilibró a 40 °C en un baño de agua caliente antes de añadirse a la mezcla de protoplastos). A continuación, la mezcla combinada se sembró en dos placas de Petri de selección de sacarosa de Cove con 10 mM de acetamida. Las placas se incubaron a 37 °C durante 4 días. Se identificaron colonias individuales transformadas de Aspergillus mediante crecimiento en placas utilizando la selección Acetimida como fuente de carbono. Cada uno de los cuatro transformantes de A. oryzae se inoculó en 750 j l de medio YP suplementado con glucosa al 2 % y también 750 j l de maltodextrina al 2 % y también DAP4C en placas profundas de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C estacionarios durante 4 días. Al mismo tiempo, los cuatro transformantes se volvieron a sembrar en medio de agar sacarosa de COVE-2.

[0119] Luego se analizó el caldo de cultivo de los transformantes de Aspergillus oryzae para la producción del polipéptido GH24 mediante SDS-PAGE usando geles NUPAGE® al 10 % Bis-Tris SDS (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se observó una banda de proteína de aproximadamente 27 kDa para cada uno de los transformantes de Aspergillus oryzae. Se cultivó un transformante de A. oryzae en matraces de agitación Erlenmeyer de 1000 ml que contenían 100 ml del medio DAP4C a 26 °C durante 4 días con agitación a 85 rpm.

Ejemplo 3: Purificación de la lisozima GH24 de Trichophaea saccata

[0120] El sobrenadante de fermentación con la lisozima GH24 del ejemplo 3 se filtró a través de un filtro superior de botella de Fast PES con un corte de 0,22 jm . La solución resultante se diafiltró con 5 mM de acetato de sodio, pH 4,5 y se concentró (volumen reducido por un factor de 10) en una unidad de ultrafiltración (Sartorius) con una membrana de corte de 10 kDa.

[0121] Después del pretratamiento, se purificaron aproximadamente 275 mL de la solución que contenía lisozima mediante cromatografía en SP Sepharose (aproximadamente 60 ml) en una columna XK26, eluyendo la lisozima unida con un gradiente de 0 a 100 % de tampón A (50 mM de acetato de Na, pH 4,5) y tampón B (50 mM de acetato de sodio 1 M de NaCl y pH 4,5) en 10 volúmenes de columna. Las fracciones de la columna se combinaron según el cromatograma (absorción a 280 y 254 nm) y el análisis SDS-PAGE.

[0122] El peso molecular, estimado a partir de SDS-PAGE, fue de aproximadamente 27 kDa y la pureza fue > 90 %.

Ejemplo 4: Otras características para la lisozima GH24 de Trichophaea saccata

[0123] La determinación de la secuencia N-terminal fue: YPVKTDL.

[0124] El peso molecular calculado a partir de esta secuencia madura es de 26205,5 Da (M+H)+.

[0125] El peso molecular determinado por análisis de peso molecular intacto fue de 26205,3 Da. (M+H)+.

[0126] La secuencia madura (a partir de datos de secuenciación N-terminal EDMAN, análisis de peso molecular intacto y análisis proteómico):

YPVKTDLHCRSSPSTSASIVRTYSSGTEVQIQCQTT-

GTSVQGSNVWDKTQHGCYVADYYVKTGHSGIFTTKCGSSSGGGSCKPPPINAAT-

VALIKEFEGFVPKPAPDPIGLPTVGYGHLCKTKGCKEVPYSFPLTQETATKLLQSDIKTFTSCVSNYVKDSVKLNDNQYGALASWAFNVGCGNVQTSS-

LIKRLNAGENPNTVAAQELPKWKYAGGKVMPGLVRRRNAEVALFKKPSSVQAHPPKC (SEQ

ID NO: 4).

Ejemplo 5: Determinación de la actividad de lisozima

[0127] La actividad de lisozima se determinó midiendo la disminución (caída) en la densidad de absorbencia/óptica de una solución de Micrococcus lysodeikticus ATTC n° 4698 (Sigma-Aldrich M3770) o Exiguobacterium undea (DSM14481) resuspendidos medidos en un espectrofotómetro a 540 nm.

Preparación de sustrato de Micrococcus lysodeikticus

[0128] Antes de su uso, las células se resuspendieron en ácido cítrico - tampón de fosfato pH 6,5 a una concentración de 0,5 mg de células/ml y se midió la densidad óptica (DO) a 540 nm. A continuación, la suspensión celular se ajustó de forma que la concentración celular fuera igual a una DO540 = 1,0. A continuación, la suspensión celular ajustada se almacenó en frío antes de su uso. Las células resuspendidas se usaron dentro de las 4 horas.

Preparación de células secas del sustrato Exiguobacterium undae

[0129] Se cultivó un cultivo de E. undae (DSM14481) en 100 mL de medio LB (Fluka 51208,25 g/L) en un matraz de agitación de 500 ml a 30 °C, 250 rpm durante la noche. A continuación, el cultivo durante toda la noche se centrifugó a 20 °C y 5000 g durante 10 minutos, y el sedimento se lavó dos veces con agua MilliQ estéril y se resuspendió en agua Milli-Q. Las células lavadas se centrifugaron durante 1 minuto a 13000 rpm y se decantó la mayor cantidad posible de sobrenadante. Las células lavadas se secaron en una centrífuga de vacío durante 1 hora. El sedimento celular se resuspendió en ácido cítrico - tampón de fosfato pH 4, 5 o 6 para que la densidad óptica (DO) a 540nm = 1.

Medición de la actividad antimicrobiana de la lisozima en el ensayo de turbidez

[0130] La muestra de lisozima que se va a medir se diluyó a una concentración de 100-200 mg de proteína enzimática/L en ácido cítrico - tampón de fosfato pH 4, 5 o 6, y se mantuvo en hielo hasta su uso. En una placa de microtitulación de 96 pocillos (Nunc) se añadieron 200 |_iL del sustrato a cada pocillo, y la placa se incubó a 37 °C durante 5 minutos en un lector de microplacas VERSAmax (Molecular Devices). Después de la incubación, la absorbancia de cada pocillo se midió a 540 nm (valor inicial). Para iniciar la medición de la actividad, se añadieron 20 |_iL de la muestra de lisozima diluida a cada sustrato (200 |_iL) y se inició la medición cinética de la absorbancia a 540 nm durante un mínimo de 30 minutos hasta 24 horas a 37 °C. La absorbancia medida a 540 nm se monitoreó para cada pocillo y a lo largo del tiempo se observa una caída en la absorbancia si la lisozima tiene actividad de lisozima. Los resultados se presentan en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1: Actividad de lisozima contra Micrococcus lysodeikticus y Exiguobacterium undea medida por la caída de densidad ó tica

[0131] Los datos confirman que la lisozima GH22 de Gallus gallus, la lisozima GH24 de Trichophaea saccata y la lisozima GH25 de A. Alcalophilum tienen actividad de lisozima.

Ejemplo 6 Ensayo in vivo en ratones: propiedades inmunomoduladoras en el modelo de ratón con colitis Animales y alojamiento

[0132] Se alojaron aleatoriamente ratones hembra BalbC (6 semanas de edad al llegar, Charles Rivers UK Limited) en jaulas de 3 al llegar en función del peso con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas.

[0133] Se permitió un periodo de aclimatación de 14 días antes del inicio de los procedimientos experimentales. Alimentación y tratamiento

[0134] Los ratones tenían acceso a comida estándar (dieta de mantenimiento RM1P, Special Diet Services, Reino Unido) ad libitum. El agua estaba disponible en botellas ad libitum.

[0135] Los ratones se reagruparon en números de 12. Los animales fueron tratados con alimentación forzada oral (< 20 mL/Kg) una vez al día con compuestos de prueba o vehículo según la tabla 2. La primera administración fue 2 días antes del tratamiento con dextrano sulfato de sodio (DSS) y continuó hasta el día anterior a la finalización del estudio (un total de 7 días de tratamiento).

Tabla 2: Diseño del estudio

Grupo Tratamiento DSS (+/-) Dosis diaria

Inducción de colitis con dextrano sulfato de sodio (DSS)

[0136] Para inducir la colitis, se añadió dextrano sulfato de sodio (DSS) al agua potable (3 % p/v). 5 días después de la administración de DSS, los animales se sacrificaron y se realizó un análisis de punto final, como se detalla a continuación. Se añadió DSS al agua potable inmediatamente después de la dosificación con los compuestos de prueba el día 0.

Parámetros y análisis experimentales

[0137] Se llevaron a cabo exámenes clínicos cuidadosos diariamente y se incluyeron observaciones de cambios en la piel, el pelaje, los ojos, las membranas mucosas, la aparición de secreciones y excreciones (por ejemplo, diarrea) y la actividad autónoma (por ejemplo, lacrimeo, salivación, piloerección, tamaño de la pupila, patrón respiratorio inusual). También se observaron cambios en la marcha, la postura y la respuesta al manejo, así como la presencia de comportamientos extraños, temblores, convulsiones, sueño y coma. Además, se registró diariamente el peso de cada animal.

[0138] Se tomaron muestreas de heces de todos los ratones el día -3 (antes del primer tratamiento con los compuestos de prueba) y el día 0 (justo antes de añadir DSS al agua potable). Las muestras se recogieron recientemente a través de la defecación natural de ratones individuales. Estas se recogieron en tubos Eppendorf estériles/sin ADNasa y se almacenaron a -80 °C.

[0139] 5 días después de añadir DSS al agua potable, los animales fueron sacrificados y se llevaron a cabo procedimientos de punto final descritos a continuación.

[0140] El colon se extrajo, lavó y abrió. La clasificación de la inflamación del colon se realizó de forma macroscópica usando un microscopio ligero y fue realizada por 2 observadores ciegos basados en el método de puntuación de Wallace. Los criterios para la puntuación del daño colónico fueron:

0 - Sin daños.

1 - Hiperemia. Sin úlceras.

2 - Hiperemia y engrasamiento de la pared intestinal. Sin úlceras.

3 - Una úlcera sin engrasamiento de la pared intestinal.

4 - Dos o más sitios de ulceración o inflamación.

5 - Dos o más sitios importantes de ulceración e inflamación o un sitio de ulceración/inflamación que se extiende > 1 cm a lo largo de la longitud del colon.

6-10 - Si el daño cubre > 2 cm a lo largo de la longitud del colon, la puntuación se incrementó en 1 para cada centímetro adicional.

[0141] El contenido del intestino ciego y el colon se extrajo en el momento del sacrificio, se congeló instantáneamente en tubos separados y se almacenó a -80 °C hasta su envío.

[0142] La mitad proximal del colon se extrajo siguiendo la puntuación de Wallace y se pesó. Cada muestra se colocó en un tubo Eppendorf y se congeló instantáneamente antes de almacenarse a -80 °C hasta que se usara para el análisis de citoquinas.

[0143] Se colocó una sección del colon proximal en un tubo de lisis que contenía solución de lisis (inhibidor de proteasa y reactivo de extracción de proteínas tisulares en una proporción de 1g de tejido de colon hasta 5 mL de solución de lisis). El tejido se homogeneizó 3 veces a 6800 rpm durante 30 s. Las muestras homogeneizadas luego se centrifugaron (1000 rpm durante 5 min a 4 °C) para extraer la proteína y el sobrenadante resultante se dividió en partes alícuotas para el análisis de citoquinas.

[0144] Se evaluó el sobrenadante de secciones de colon homogeneizadas para determinar los niveles de citoquinas usando un ensayo multiplex (Merck Millipore) para un rango de citoquinas específicas de Th1 y Th17 (IL-10, TNF-a, IL-1P, IL-6, lL-12 , IL-17a, IL-25) utilizando un sistema Magpix (Luminex).

Resultados:

[0145] El tratamiento con DSS (3 % p/v) en el agua potable durante 5 días provocó un efecto inflamatorio en el colon de ratones en comparación con los animales de control expuestos a agua potable normal, como lo indica un aumento en la puntuación media de Wallace (figura 1A).

[0146] El tratamiento con la SEQ ID N.°: 1 inhibió de forma dependiente el efecto inflamatorio inducido por DSS. Se observó un efecto similar en la puntuación de Wallace después del tratamiento con la SEQ ID N.°: 5. La SEQ ID N.°: 15 también inhibió la inflamación inducida por DSS, aunque no tan eficaz como la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID N.°: 5 (Figura 1A).

[0147] La longitud del colon es un indicador de la gravedad de la lesión, ya que la colitis aumenta el edema y acorta la longitud total del colon. En el estudio actual, la longitud del colon en todos los grupos fue comparable, lo que confirma que solo se indujo una inflamación leve con DSS (figura 1B).

[0148] Debido a la inflamación, los pesos del colon en animales expuestos a DSS (3 % p/v) y tratados con tampón de vehículo aumentaron en comparación con los animales de control expuestos a agua potable normal. Sin embargo, el tratamiento con la SEQ ID N.°: 1 en animales expuestos a DSS provocó una reducción dependiente de la dosis en el aumento del peso del colon, que se observó en el grupo de control de la enfermedad. También se observó una tendencia dependiente de la dosis para reducir el peso del colon después del tratamiento con la SEQ ID N.°: 5; sin embargo, esto no fue tan pronunciado como para la SEQ ID N.°: 1, lo que indica un mejor rendimiento de la SEQ ID N.°: 1 en comparación con la SEQ ID N.°: 5. El tratamiento con la SEQ ID N.°: 15 no afectó al aumento de peso húmedo del colon inducido por DSS (figura 1C).

[0149] El peso de los ratones se monitoreó desde el día -3 cuando se inició el tratamiento profiláctico con controles o la SEQ ID N.°: 1, la SEQ ID N.°: 15 o la SEQ ID N.°: 5. La ganancia de peso (día -3 - 0) fue comparable entre los grupos (figuras 2 y 3), el peso corporal continuó aumentando en todos los grupos durante este periodo, como se esperaba de ratones de esta edad. Desde el día 0, cuando se inició la exposición a DSS, hubo una aparente reducción leve en el peso corporal en todos los grupos de animales que recibieron DSS en su agua potable de aproximadamente 2 o 3 g de peso corporal para el día 4 (figuras 2 y 3). Se puede observar una inhibición dependiente de la dosis de esta pérdida de peso asociada con la colitis después del tratamiento con la SEQ ID N.°: 1, la SEQ ID N.°: 15 o la SEQ ID N.°: 5 (figura 3), donde la SEQ ID N.°: 1 es la más eficaz de todas a la dosis más alta evaluada (figura 5).

[0150] El factor de necrosis tumoral a (TNF-a) es una citoquina proinflamatoria multifuncional secretada por una amplia variedad de células que incluyen monocitos/macrófagos, neutrófilos y linfocitos T.

[0151] Como era de esperar, el grupo de control de la enfermedad expresa un alto nivel de citoquinas proinflamatorias (TNF-a, IL-1p, IL-6, lL-17a e IL-25) en el colon en comparación con los animales de control sanos. Además, la citoquina proinflamatoria IL-12, así como la citocina reguladora IL-10, se inducen, aunque en menor grado, después de la exposición a DSS (figura 4).

[0152] El tratamiento con la SEQ ID N.°: 1, la SEQ ID N.°: 15 y la SEQ ID N.°: 5 reduce los niveles de citoquinas inducidos por DSS de una manera dependiente de la dosis. La SEQ ID N.°: 15 solo tuvo un pequeño efecto sobre los niveles de citoquinas en el colon en comparación con la SEQ ID N.°: 1 y la SEQ ID N.°: 5. Sorprendentemente, la SEQ ID N.°: 1 fue generalmente más eficaz para reducir los niveles de citoquinas. En particular, para los impulsores claves de la inflamación TNF-a, IL-1b e IL-6 (figura 4).

[0153] La superioridad de la SEQ ID N.°: 1 sobre la SEQ ID N.°: 5 se ve aun más claramente cuando se tiene en cuenta el tamaño diferente de las proteínas, por lo tanto, la SEQ ID N.°: 1, la SEQ ID N.°: 15 y la SEQ ID N.°: 5 tienen un tamaño de molécula de 23,0, 24,0 y 14,3 kDa, respectivamente. En la figura 5 se muestran los niveles de citoquinas en el colon como una función de mol de compuestos de prueba/ratón/día. Se puede ver claramente que la SEQ ID N.°: 1 en general no reduce los niveles de citoquinas de manera más efectiva que la SEQ ID N.°: 5.

[0154] En el estudio actual, a los ratones se les administro una concentración similar (mg/ratón/día) de cada uno de los compuestos de prueba; sin embargo, debido al diferente tamaño de las moléculas, esto significa que aproximadamente un 40 % menos de moléculas se dosificaron con la SEQ ID N.°: 1 y la SEQ ID N.°: 15 en comparación con la SEQ ID N.°: 5; sorprendentemente, a pesar de esto, el rendimiento inmunomodulador de la SEQ ID N.°: 1 fue mejor que el de la SEQ ID N.°: 5.

[0155] En resumen, el DSS (3 % p/v.) añadido al agua potable durante 5 días provocó un efecto inflamatorio en el colon, como se esperaba. Esto fue evidente con respecto a la puntuación de Wallace como índice de inflamación y el aumento del peso del colon. Las citoquinas Th1 y Th17 evaluadas también respaldaron un efecto inflamatorio inducido por DSS.

[0156] El tratamiento (del día 3 al día 5) con la SEQ ID N.°: 1, la SEQ ID N.°: 15 o la SEQ ID N.°: 5 provocó un efecto inhibidor consistente en la reducción del efecto inflamatorio inducido por DSS en el colon. Esto se observó tanto con una reducción en los niveles de citoquinas proinflamatorias como la inflamación resultante observada (según lo indicado por la puntuación de Wallace). La SEQ ID N.°: 1 fue el compuesto más eficaz para reducir la inflamación y mejorar la salud de los animales, lo que indica que el tratamiento con la SEQ ID N.°: 1 tiene un efecto protector potencial para prevenir la colitis en el hombre.

Ejemplo 7 Ensayo in vivo en ratones: Eficacia de la modulación microbiana intestinal sobre la obesidad inducida por la dieta y la tolerancia a la glucosa

Animales y alojamiento

[0157] 36 ratones macho C57BL/6J (Jackson Lab, Bar Harbor, Maine, EE. UU.), de 6 semanas de edad al llegar, se asignaron aleatoriamente a grupos experimentales en función de su peso corporal en el momento de la inscripción, lo que garantiza la misma desviación estándar y peso corporal promedio en todos los grupos. Se alojaron 3 ratones por jaula con 12 ratones/4 jaulas por grupo y se aclimataron a una dieta de referencia baja en grasas (LFD) durante 12 días antes del comienzo del experimento.

Alimentación y tratamiento

[0158] Los ratones fueron alimentados con alimento peletizado sin teñir ad libitum cambiado tres veces por semana con medición del consumo de alimentos. Los ratones fueron alimentados con una dieta rica en grasas y sacarosa (HFD, D12451, Research Diet) o una dieta de referencia baja en grasas (LFD, D12450H, Research Diet). El alimento fue almacenado a 4 °C hasta su uso (según las instrucciones del fabricante).

[0159] El agua estéril estaba disponible en botellas ad libitum y se cambiaba semanalmente.

Parámetros y análisis experimentales

[0160] Los compuestos de prueba o el vehículo (PBS pH 7,4, Ref: 10010-023, Gibco) se administraron por alimentación forzada oral diaria (aguja 25G) de 100 pL a las 10:00. La SEQ ID N.°: 1 de ~5 mg/mL se almacenó a -20 grados hasta su uso.

[0161] La composición corporal de los ratones individuales se evaluó mediante el promedio de tres medidas de exploraciones de resonancia magnética (RM) (Minispec LF90, Bruker, calibrado diariamente cuando está en uso) en las semanas 0, 4, 8, y 12 del protocolo experimental. Las heces frescas se recolectaron al mismo tiempo que las exploraciones por RM al comienzo del ciclo de luz (8 :00 ± 1 hora) antes de la alimentación forzada diaria. Las muestras se congelaron inmediatamente en hielo seco y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior procesamiento.

[0162] Se evaluó una prueba de tolerancia oral a la glucosa junto con la secreción de insulina estimulada por glucosa y la permeabilidad intestinal en la semana 10 del protocolo experimental. Los ratones se mantuvieron en ayunas a las 8:00 durante 5 h y fueron alimentados de manera forzosa a las 10:00. Se realizaron mediciones de glucosa en sangre en ayunas durante 5 h (OneTouch Vario Flex, LifeScan) y muestras de sangre de la vena caudal antes de la alimentación forzada oral con 4 pl/g de masa magra de solución de dextrosa al 50 % y 150 pl de solución de ácido sulfónico. La solución de ácido sulfónico consistió en 1,5 mg de fluoresceína-5 y (6)-ácido sulfónico (Invitrogen) disuelto en 150 pL de suspensión de sal de sodio de carboximetilcelulosas (CMC) al 0,5 % (viscosidad media, Sigma) en agua destilada. La glucosa en sangre se midió a partir de la punción de la vena caudal en los puntos de tiempo 0, 15, 30, 60, 90, y 120 min después de la exposición a la dextrosa y se tomaron muestras de sangre para la insulina y la permeabilidad intestinal en tubos capilares preparados con EDTA (Microvette CB300, Sarstedt) en puntos de tiempo 0, 15, 30, 60 y 120 min después de la exposición. Los ratones recibieron 0,5 mL de solución salina (cloruro de sodio al 0,9 %, Hospira) después del procedimiento, lo que les permitió a los ratones rehidratarse. Las muestras de sangre se centrifugaron durante 10 min a 1000 rcf a temperatura ambiente. Para las mediciones de insulina, los primeros 5 pL de plasma se transfirieron a placas de PCR de 96 pocillos en hielo seco y se mantuvieron a -80 °C hasta el posterior procesamiento. Los siguientes 5 pL de plasma, usados para la prueba de permeabilidad intestinal, se transfirieron a placas negras de botón óptico de 96 pocillos (Nunc) y se mantuvieron en hielo húmedo hasta que se añadieron 150 pL de CMC al 0,5 % en agua destilada y se mezclaron íntegramente. La placa se leyó en un lector de microplacas Synergy HT (BioTek) a una longitud de onda de excitación/emisión de 485/528 nm. Los niveles de insulina se midieron mediante ELISA de insulina ultrasensible de ratón (Ref: 80-INDMSU-E10, Lote: 06489, Alpco) siguiendo el protocolo del fabricante y se cuantificaron en el lector de etiquetas múltiples EnSpire 2300 (PerkinElmer).

[0163] La necropsia se realizó en la semana 12 del protocolo experimental. Los ratones se mantuvieron en ayunas desde las 7:15 ± 15 min y fueron alimentados de manera forzosa a las 10:00. La eutanasia se realizó en orden alterno. Los ratones se anestesiaron con isoflurano (3 % en 65 % N2, 35 % 02, Fresenius Kabi). Al primer y último ratón de cada jaula de 3 se les inyectó por vía intravenosa 2 pl/g de insulina de peso corporal (Humulin 100 mU/mL diluida a 1,9 mU/pL, Lilly) 5 min antes de la eutanasia. A uno de los tres (segundo ratón) se le inyectó una solución salida de 2 pl/g de peso corporal (cloruro de sodio al 0,9 %, Hospira). La punción cardíaca se realizó usando una aguja 25G y una jeringa de 1 mL recubierta con EDTA. La sangre se transfirió a tubos Eppendorf que contenían 1 pL de inhibidor DPP IV (Millipore) y 1 pL de un cóctel inhibidor de proteasa (P8340, Sigma). Las muestras se centrifugaron a 1000 rcf durante 10 min y el plasma se dividió en partes alícuotas por triplicado, se colocó en hielo seco y se transfirió a almacenamiento a -80 °C hasta su posterior procesamiento.

[0164] Recolección de tejido: Se midió el peso del hígado, páncreas, TABe, TABi, TABr, TAMI, corazón, cuádriceps, gastrocnemio, cerebro y colon y los tejidos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C. Los tejidos fueron seccionados por el mismo operador y tomados en el mismo orden para todos los ratones. El cerebro se congeló en nitrógeno líquido < 60 seg. post mortem. Se midió la longitud del intestino delgado (desde el estómago hasta el intestino ciego) y el colon (desde el intestino ciego hasta el recto) y se mantuvo en una placa de plexiglás enfriada con hielo húmedo subyacente durante todo el tiempo de manipulación. El duodeno se consideró los primeros 5 cm del intestino delgado y el resto del tejido del intestino delgado se dividió en 3 partes de igual longitud. Se descartaron los primeros 3 y los restantes 2/3 proximales del intestino delgado se categorizaron como yeyuno. Se descartaron los primeros 3 cm del 1/3 distal del intestino delgado y el tejido restante se categorizó como íleon. El cm más proximal de duodeno, yeyuno, íleon y colon se guardó para histología en solución de Carnoy (para preservar la integridad de la capa mucosa), que constaba de 60 % de metanol, 30 % de cloroformo y 10 % de ácido acético glacial antes de vaciar los tejidos intestinales. El contenido del intestino delgado, intestino ciego y colon se aisló mediante presión mecánica, se congeló en hielo seco y posteriormente se almacenó a -80 °C. El tejido del duodeno, yeyuno, íleon, colon e intestino ciego se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C. Los tejidos metabólicos para histología de hígado, TABe, TABi, y TAMI se conservaron en una solución de paraformaldehído al 4 % durante 72 horas, seguido de conservación en etanol al 70 %. El tejido hepático se conservó adicionalmente en Tissue-Tek O.C.T Compound (Sakura Finetek) para permitir la tinción histológica de lípidos Oil Red O.

Resultados

[0165] La alimentación con HFD indujo obesidad severa inducida por dieta desde la semana 2 y durante todo el experimento. El tratamiento con la SEQ ID N.°: 1 no protegió contra el aumento del peso corporal (figura 1A). Sin embargo, cuando se analizó la composición corporal mediante exploración por resonancia magnética, los ratones tratados con la SEQ ID N.°: 1 parecían haber disminuido la masa grasa en la semana 12, pero no en ninguna de las semanas anteriores (figura 1B), lo que sugiere que el tratamiento con la SEQ ID N.°: 1 puede mejorar la acumulación de grasa en ratones obesos inducidos por dieta (figura 1C) sin afectar al desarrollo del peso corporal (figura 1A).

[0166] La alteración de la regulación de la glucosa está estrechamente relacionada con una variedad de enfermedades mediadas por el estilo de vida. Por lo tanto, probamos si el tratamiento con la SEQ ID N.°: 1 podría mejorar las anomalías glucorregulatorias inducidas por HFD independientemente de la obesidad inducida por la dieta. El aumento de la insulina en ayunas (hiperinsulinemia) y la glucosa en sangre en ayunas (hiperglucemia) son marcadores biológicos de la resistencia a la insulina y ambos parámetros mejoraron en los ratones tratados con la SEQ ID N.°: 1 en comparación con los ratones de control alimentados con HFD (figura 2A-B). La regulación de la glucosa mejorada se vio reforzada por la prueba de tolerancia a la glucosa, donde los ratones tratados con la SEQ ID N.°: 1 eliminaron la exposición a la glucosa de manera más eficiente que los ratones de control alimentados con HFD (figura 2C). La tolerancia a la glucosa mejorada no se explicó por la mayor capacidad de secreción de insulina de las células beta (figura 2D), lo que sugiere una sensibilidad a la insulina mejorada en los tejidos metabólicos de los ratones tratados con la ^sE^qID N.°: 1. Combinados, estos datos indican que la SEQ ID N.°: 1 protege contra la resistencia a la insulina relacionada con la obesidad; un denominador común de la diabetes tipo 2 y las enfermedades cardiovasculares.

[0167] La inflamación metabólica inducida por HFD es causada con mayor frecuencia por una función de barrera intestinal disminuida (intestino permeable), que permite un aumento de los niveles circulantes del componente de la pared celular bacteriana, el lipopolisacárido (LPS). Para probar la función de barrera intestinal, exponemos a los ratones por vía oral con 150|_il de sal de sodio de carboximetilcelulosa (CMC) al 0,5 %, solución de ácido (6)-sulfónico de fluoresceína-5 al 1 % y medimos la fluorescencia en muestras de plasma extraídas de la vena caudal en 0, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la exposición. Los ratones tratados con la SEQ ID N.°: 1 mostraron una mayor función de barrera, lo que indica que la SEQ ID N.°: 1 alivia la inflamación metabólica inducida por HFD.

Ejemplo 8 Método para la determinación de la actividad de lisozima contra Lactobacillus johnsonii (A). Extracción de PGN:

[0168] Cultivo de Lactobacillus johnsonii:

Materiales

[0169]

Caldo MRS, número de producto BD 288130, pH 6,3-6,7.

Placas de agar MRS, BD 288130; Agar Oxoid LP0011; pH 6,3-6,7.

NaCl al 0,9 %, Merck 106404, Cas n.°: 7647145

Jars, proveedor Merck 116387, frasco anaeróbico Anaerocult 2,5 L

Anaerogen 2,5 L, ThermoScientific, catálogo n.°: AN0025A

Lactobacillus johnsonii, DSM10533

Procedimiento

[0170] L. johnsonii se sembró a partir de stock congelado a una placa de agar MRS y se incubó en condiciones anaeróbicas durante 2 días, frasco anaeróbico con Anaerogen 2,5 L, 30 °C. Algunas colonias se inocularon de 500 ml de caldo MRS en una botella de tapa azul de 500 ml y se colocaron en un frasco anaeróbico con Anaerogen 2,5 L durante 72 horas a 30 °C.

[0171] Se centrifugó el cultivo (6000 rpm, 10 minutos) y el se vertió el sobrenadante antes de realizar otra ronda de centrifugación. El sedimento se lavó en 100 ml de NaCl al 0,9 % y la suspensión se mezcló bien y se centrifugó a 6000 rpm durante 10 minutos. Se vertió el sobrenadante y se repitió el procedimiento de lavado en NaCl al 0, 9% hasta un total de tres lavados. Se añadieron al sedimento aproximadamente 40 ml de NaCl al 0,9 % y la solución se transfirió a un tubo falcon de 50 ml. La solución se centrifugó a 6000 rpm durante 10 minutos y se vertió el sobrenadante. El sedimento se almacenó a -18 °C hasta que se realizó la extracción del peptidoglicano.

Procedimiento de extracción:

Materiales

[0172] Proteasa de Streptomyces griseus, Sigma-Aldrich P5147, CAS 9036-06-0

PBS pH 7,3:

• NaCl: 8 g, Sigma-Aldrich 31434, CAS 7647-14-5

• KCI: 0,2 g, Sigma-Aldrich P9333, CAS 7447-40-7

• KH2PO4: 0,24 g, Sigma-Aldrich P5655, CAS 7778-77-0

• Na2HPO4. 2 H2O: 1,44 g, Sigma-Aldrich 30412, CAS 10028-24-7

• Añadir agua Milli-Q a 1000 mL

Solución Triton-X 100 al 1%:

• 1 mL de Tritón X100, Sigma-Aldrich X100, CAS 9002-93-1

• Añadir agua Milli Q a 100 mL

500 mM de tampón de carbonato de sodio, pH 9,3:

• 500 mM de carbonato de sodio se elabora a partir de 21 g de Na2CO3 (Sigma-Aldrich S7795, CAS 497 19-8). Los 500 mM de bicarbonato de sodio de agua MQ se elaboran a partir de 72 g de NaHCO3 (Sigma-Aldrich S6014, CAS 144-55-8) en 500 mL de agua PM

• El tampón de pH 9,3 se elabora a partir de 320 mL de NaHCO3 y 80 mL de Na2CO3 y ajustando el pH con HCI

Solución de fenol con 10 mM de Tris HCl, pH 8,0, 1 mM de EDTA, Sigma-Aldrich P4557, CAS 108-95-2 Acetona, Sigma-Aldrich 32201-M, CAS 67-64-1

Etanol, 96%, CCS cuidado de la salud 1680643, CAS 64-17-5

Procedimiento

[0173] El material celular de L. Johnsonii se liofilizó. El material liofilizado (525 mg) se suspendió en PBS (40 mL) en un tubo falcon de 50 mL. La suspensión se agitó durante 2 h a 700 rpm en un termoagitador a temperatura ambiente. A continuación, se añadió proteasa de Streptomyces griseus (55 mg) y la suspensión se incubó 6 h a 37 °C en el termoagitador. Luego se centrifugó 20 min a 1900 g a temperatura ambiente y se decantó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en Tritón X-100 al 1 % (40 mL) y se agitó durante toda la noche a 37 °C. Después de otra centrifugación y decantación, el sedimento se resuspendió en PBS (40 mL) y se añadió nuevamente proteasa (55 mg). La suspensión se incubó de nuevo 6 h a 37 °C, se centrifugó y se decantó. El sedimento se resuspendió en PBS (40 mL) y se agitó durante toda la noche a 37 °C. Este procedimiento de lavado se repitió una vez más con PBS (40 mL, 30 min de agitación), luego con etanol/agua al 50 % (40 mL, 30 min de agitación). A continuación, el sedimento se dividió en dos tubos Falcon. A cada tubo se le añadió solución de fenol (15 mL) precalentada a 40 °C. Las suspensiones se agitaron 10 min a 40 °C y luego se añadió etanol al 96 % (25 mL a cada tubo), se centrifugaron y se decantaron. Los sedimentos se lavaron adicionalmente con acetona (40 mL en cada tubo) y etanol al 96 % (40 mL en cada tubo), antes de liofilizarse. La combinación de los sedimentos de dos tubos produjo 80 mg de peptidoglicano purificado como un polvo blanco.

Ensayo final reductor

[0174] La lisozima se diluyó en tampón de dilución de fosfato (5 mM de citrato, 5 mM de K²HPO⁴, TritonX-100 al 0,01%, pH 5,0) hasta 50 pg/mL en tubos de polipropileno, dependiendo de la fuerza de las soluciones madre disponibles. La lisozima diluida se diluyó aun más en una placa de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos mediante la preparación de una serie de diluciones dobles hasta una concentración de 6,3 pg/mL en tampón de dilución de fosfato (5 mM de citrato, 5 mM de K²HPO⁴, TritonX-100 al 0,01 %, pH 5,0). Se preparó una solución madre de 50 mg/ml de sustrato de L. Johnsonii en MillQ y se diluyó en tampón de fosfato (50 mM de citrato, 50 mM de K²HPO⁴, pH 5,0) hasta 250 pg/ml. En una placa deepwell de polipropileno se mezclaron 50 pL de la dilución de lisozima con 450 pL de solución de L. Johnsonii y se incubaron a 40 °C con agitación (500 rpm) durante 45 min. Tras la incubación, la placa deepwell se centrifugó (3200 rpm, 7 min) para sedimentar el material insoluble y se mezclaron 100 pL del sobrenadante con 50 pL de 3,2 M de HCI en una placa PCR de 96 pocillos y se incubó a 95 °C durante 80 min. Se añadieron 50 pL de 3,5 M de NaO a cada pocillo de la placa PCR y se transfirieron 150 pL de cada muestra a una nueva placa PCR que contenía 75 pl/pocillo de solución 4 hidroxibenzhidrazida (PAHBAH) en tampón K-Na tartrato/NaOH (50 g/L de K-Na tartrato 20 g/L de NaOH). La placa se incubó a 95 °C durante 10 min antes de transferir 100 pl/muestra a una placa de microtitulación transparente de fondo plano para medir la densidad óptica (DO) a 405 nm. Las mediciones de DO se realizaron en muestras diluidas de tres veces (50 pL de muestra diluida en 100 pL en agua Milli-Q). Los valores de medición de DO representan la diferencia después de restar la lectura original (de fondo) y representan el promedio de dos valores de medición de DO.

[0175] Los resultados se muestran en la tabla 3.

T l : M i i n r m i D 4 f n rr i n l n fin l r ctor

[0176] Los resultados muestran que las lisozimas con la SEQ ID N.°: 1, 18, 21, 24, 27 y 30 tienen una actividad de lisozima excelente contra los peptidoglicanos que se encuentran en las paredes celulares de Lactobacillus johnsonii, mientras que no se mostró actividad de la lisozima con la SEQ ID N.°: 5 hacia este peptidoglicano. Ejemplo 9 método para la determinación de la actividad de lisozima contra Lactobacillus johnsonii (B). Extracción de PGN:

[0177] Cultivo de Lactobacillus johnsonii:

Materiales

[0178]

Caldo MRS, número de producto BD 288130, pH 6,3-6,7.

Placas de agar MRS, BD 288130; Agar Oxoid LP0011; pH 6,3-6,7.

NaCl al 0,9 %, Merck 106404, Cas n.°: 7647145

Jars, proveedor Merck 116387, frasco anaeróbico Anaerocult 2,5 L

Anaerogen 2,5 L, ThermoScientific, catálogo n.°: AN0025A

Lactobacillus johnsonii, DSM10533

Procedimiento

[0179] L. johnsonii se sembró a partir de stock congelado a una placa de agar MRS y se incubó en condiciones anaeróbicas durante 2 días, frasco anaeróbico con Anaerogen 2,5 L, 30 °C. Algunas colonias se inocularon en 500 mL de caldo MRS en una botella de tapa azul de 500 mL y se colocaron en un frasco anaeróbico con Anaerogen 2,5 L durante 72 horas a 30 °C.

[0180] Se centrifugó el cultivo (6000 rpm, 10 minutos) y se vertió el sobrenadante antes de realizar otra ronda de centrifugación. El sedimento se lavó en 100 mL de NaCl al 0,9 % y la suspensión se mezcló bien y se centrifugó a 6000 rpm durante 10 minutos. Se vertió el sobrenadante y se repitió el procedimiento de lavado en NaCl al 0,9 % hasta un total de tres lavados. Se añadieron aproximadamente 40 mL de NaCl al 0,9 % al sedimento y la solución se transfirió a un tubo falcon de 50 mL. La solución se centrifugó a 6000 rpm durante 10 minutos y se vertió el sobrenadante. El sedimento se almacenó a -18 °C hasta que se realizó la extracción del peptidoglicano.

Procedimiento de extracción:

Materiales

[0181] Proteasa de Streptomyces griseus, Sigma-Aldrich P5147, CAS 9036-06-0

PBS pH 7,3:

• NaCl: 8 g, Sigma-Aldrich 31434, CAS 7647-14-5

• KCI: 0,2 g, Sigma-Aldrich P9333, CAS 7447-40-7

• KH²PO⁴: 0,24 g, Sigma-Aldrich P5655, CAS 7778-77-0

• Na²HPO⁴.2 H²O: 1,44 g, Sigma-Aldrich 30412, CAS 10028-24-7

• Añadir agua Milli-Q a 1000 mL

Solución Triton-X 100 al 1%:

• 1 mL de Tritón X100, Sigma-Aldrich X100, CAS 9002-93-1

• Añadir agua Milli Q a 100 mL

500 mM de tampón de carbonato de sodio, pH 9,3:

• 500 mM de carbonato de sodio se elabora a partir de 21 g de Na²CO³(Sigma-Aldrich S7795, CAS 497 19-8) en 500 mL de agua MQ

• 500 mM de bicarbonato de sodio se elabora a partir de 72 g NaHCO³(Sigma-Aldrich S6014, CAS 144 55-8) en 500 mL de agua PM

• El tampón de pH 9,3 se elabora a partir de 320 mL de NaHCO³y 80 mL de Na²CO³y ajustando el pH con HCI

Etanol, 96 %, CCS Healthcare 1680643, CAS 64-17-5

Procedimiento

[0182] El material celular de L. Johnsonii se liofilizó. El material liofilizado (525 mg) se suspendió en PBS (40 mL) en un tubo Falcon de 50 mL. La suspensión se agitó durante 2 h a700 rpm en un termoagitador a temperatura ambiente. A continuación, se añadió la proteasa de Streptomyces griseus (55 mg) y la suspensión se incubó 6 h a 37 °C en el termoagitador. Luego se centrifugó 20 min a 1900 g a temperatura ambiente y se decantó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en Tritón X-100 al 1 % (40 mL) y se agitó durante toda la noche a 37 °C. Después de otra centrifugación y decantación, el sedimento se resuspendió en PBS (40 mL) y se añadió nuevamente proteasa (55 mg). La suspensión se incubó de nuevo 6 h a 37 °C, se centrifugó y se decantó. El sedimento se resuspendió en PBS (40 mL) y se agitó durante toda la noche a 37 °C. Este procedimiento de lavado se repitió una vez más con PBS (40 mL, 30 min de agitación), luego con etanol/agua al 50 % (40 mL, 30 min de agitación). A continuación, el sedimento se dividió en dos tubos Falcon. A cada tubo se le añadió solución de fenol (15 mL) precalentada a 40 °C. Las suspensiones se agitaron 10 min a 40 °C y luego se añadió etanol al 96 % (25 mL a cada tubo), se centrifugaron y se decantaron. Los sedimentos se lavaron adicionalmente con acetona (40 mL en cada tubo) y etanol al 96 % (40 mL en cada tubo), antes de liofilizarse. La combinación de los sedimentos de dos tubos produjo 80 mg de peptidoglicano purificado como un polvo blanco.

Ensayo final reductor

[0183] La lisozima se diluyó en tampón de dilución de fosfato (5 mM de citrato, 5 mM de K2HPO4, TritonX-100 al 0,01 %, pH 5,0) hasta 200 pg/mL en tubos de polipropileno. La lisozima diluida se diluyó aun más en una placa de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos mediante la preparación de una serie de diluciones dobles hasta una concentración de 6,3 pg/mL en tampón de dilución de fosfato (5 mM de citrato, 5 mM de K²HPO⁴, TritonX-100 al 0,01 %, pH 5,0). Se preparó una solución madre de 50 mg/ml de sustrato de L. Johnsonii en MillQ y se diluyó en tampón de fosfato (50 mM de citrato, 50 mM de K²HPO⁴, pH 5,0) hasta 250 pg/ml. En una placa deepwell de polipropileno, se mezclaron 50 pL de la dilución de lisozima con 450 pL de solución de L. Johnsonii y

Claims

REIVINDICACIONES

1. Lisozima microbiana o una composición que comprende lisozima microbiana para su uso en un método para prevenir, aliviar o tratar el síndrome del intestino irritable (SII) o la enfermedad inflamatoria intestinal (EII).

2. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según la reivindicación 1, donde la lisozima microbiana estabiliza la microbiota sana en el tubo digestivo y suprime el crecimiento y/o la colonización intestinal de patógenos bacterianos.

3. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde la lisozima microbiana previene, alivia o trata la inflamación.

4. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la lisozima microbiana reduce la deposición de lípidos ectópicos asociada con la obesidad, como, por ejemplo, la obesidad inducida por la dieta.

5. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde una composición que comprende una lisozima se administra a un nivel de 0,1 a 1000 ppm de proteína enzimática por kg de composición.

6. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la lisozima microbiana comprende uno o más dominios seleccionados de la lista que consta de GH24 y GH25.

7. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la lisozima microbiana se selecciona del grupo que consta de:

(a) un polipéptido, que tiene una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88

%, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos

95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 1;

(b) una variante de la SEQ ID N.°: 1, donde la variante tiene actividad de lisozima y comprende una o más sustituciones de aminoácidos y/o una o más deleciones de aminoácidos y/o una o más inserciones de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13 .14, 15, 16, 17,

18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46,

47, 48, 49 o 50 posiciones;

(c) un fragmento del polipéptido de (a) o (b), que tiene actividad de lisozima, donde el fragmento comprende al menos 170 aminoácidos, como al menos 175 aminoácidos, al menos 177 aminoácidos, al menos 180 aminoácidos, al menos 185 aminoácidos, al menos 190 aminoácidos, al menos 195 aminoácidos o al menos

200 aminoácidos;

(d) un polipéptido, que tiene una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88

95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 4;

(e) una variante de la SEQ ID N.°: 4, donde la variante tiene actividad de lisozima y comprende una o más sustituciones de aminoácidos y/o una o más deleciones de aminoácidos y/o una o más inserciones de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13 .14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,

35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 posiciones;

(f) un fragmento del polipéptido de (d) o (e), que tiene actividad de lisozima, donde el fragmento comprende al menos 210 aminoácidos, como al menos 215 aminoácidos, al menos 220 aminoácidos, al menos 225 aminoácidos, al menos 230 aminoácidos, al menos 235 aminoácidos o al menos 240 aminoácidos;

(g) un polipéptido, que tiene una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88

95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % con la SEQ ID N.°: 15;

(h) una variante de la SEQ ID N.°: 15, donde la variante tiene actividad de lisozima y comprende una o más sustituciones de aminoácidos y/o una o más deleciones de aminoácidos y/o una o más inserciones de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,

35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 posiciones; y

(i) un fragmento del polipéptido de (g) o (h), que tiene actividad de lisozima, donde el fragmento comprende al menos 170 aminoácidos, como al menos 175 aminoácidos, al menos 177 aminoácidos, al menos 180 aminoácidos, al menos 185 aminoácidos, al menos 190 aminoácidos, al menos 195 aminoácidos o al menos

200 aminoácidos.

8. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para usarse en el tratamiento de un ser humano.

9. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la composición es una composición alimenticia o farmacéutica.

10. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la composición se encuentra en forma de polvo, pastilla, gragea, pastilla efervescente, cápsula, emulsión, pasta, bolsita individual, goma de mascar o gotas de aceite.

11. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la lisozima o la composición microbiana que la comprende se usa en el tratamiento de la enfermedad de Crohn y/o la colitis ulcerosa.

12. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la lisozima microbiana reduce la cantidad de células muertas de Lactobacillus johnsonii o los restos de la pared celular de las mismas, en el tubo digestivo.

13. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la lisozima microbiana promueve la eliminación de células muertas de Lactobacillus johnsonii, o los restos de la pared celular de las mismas, del tubo digestivo de los seres humanos.

14. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la lisozima microbiana tiene actividad de lisozima contra Lactobacillus johnsonii determinada por el método para la determinación de la actividad de lisozima contra Lactobacillus johnsonii.

15. Lisozima o composición microbiana que la comprende para su uso según la reivindicación 14, donde la lisozima microbiana se selecciona del grupo que consta de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 1, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 15, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 18, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 21, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 24, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 27 y un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 30, seleccionada preferiblemente del grupo que consta de un polipéptido que tiene al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 1, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 15, un polipéptido que tiene al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 18, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 21, un polipéptido que tiene al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 27 y un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 30, seleccionada más preferiblemente del grupo que consta de un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 18, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 21, un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 27 y un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 30, aun más preferiblemente un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 21 o un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos 90 % con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 27.