CN107872978B

CN107872978B - 具有广泛pH活性范围的酶作为促消化药物的用途

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Publication number: CN107872978B
Application number: CN201680017797.3A
Authority: CN
Inventors: M·W·W·哈特曼; I·阿尔达格
Original assignee: Cilian AG
Current assignee: Cilian AG
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2036-01-22
Also published as: MX2017009419A; US20200071683A1; US20180073001A1; IL253618B; US10590402B2; CA2992918A1; GB201501081D0; JP2018504118A; AU2016208474B9; IL253618A0; US11584920B2; JP7075758B2; CN107872978A; RU2017129598A3; KR102601352B1; EP3247385A1; RU2721708C2; AU2016208474A1; KR20170105104A; BR112017015782A2

Abstract

公开了两种或更多种脂肪酶的组合及其用于治疗脂质消化缺陷和/或消化性疾病的用途。至少一种脂肪酶的最适pH在酸性pH值下，而至少一种其它脂肪酶的最适pH在碱性pH值下。

Description

具有广泛pH活性范围的酶作为促消化药物的用途

本发明涉及包含来自纤毛虫的同源表达的酶的药物，其用于治疗消化性疾病。

消化性疾病在全科医疗实践和内科医疗实践中占据了越来越大的位置。在许多情况下，这种消化性疾病是所谓的胰酶不同程度的明显缺乏的结果。在健康状态下，这些酶在胰腺中的合成通过高度专业化的细胞，即所谓的腺泡细胞(acinic cell)，并通过胞外分泌经胰腺和主胰管分泌到十二指肠中。每日胰腺分泌量约为2升。除消化脂质的脂肪酶外，胰腺分泌物还含有消化蛋白质的酶(胰蛋白酶，糜蛋白酶和羧肽酶)和消化碳水化合物的酶(α-淀粉酶)。胰酶的分泌由内源性控制机制通过激素如胃泌素、胰泌素和促胰酶素等精确控制。这种控制系统可能受到大量因素的干扰，导致胰酶分泌减少或完全减弱胰腺外分泌功能。这反过来又导致食糜在小肠中不被消化，发生消化性疾病。这种也被称为胰腺外分泌功能不全(EPI)的消化道疾病可能有不同的病因。除了由药物引起的消化不良以及经常性由饮酒引起的慢性萎缩性胃炎以及慢性胰腺炎，还有由手术引起的紊乱(例如，Billroth I和II，迷走神经切断术，胰腺切除术)和囊性纤维化也是胰功能不全的病因。无论如何，慢性消化性疾病具有重大的社会医学意义，因此具有重要的经济意义，因为症状常常导致患者变得不可名状，并且缩短预期寿命。

胰源性消化性疾病，尤其是EPI引起患者的大量不适，如腹泻、大量粪便、感觉饱食、上腹部不适、体重减轻等。

无论胰源性消化性疾病或EPI的病因和表现如何，要避免营养不良相关的发病率和死亡率，在诊断出EPI后，尽早开始用酶进行替代治疗至关重要。这意味着缺乏的酶，主要是脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶、还有其他酶，必须从外部提供。在治疗过程中，酶大多数以餐时口服被病人服用，并经过胃进入小肠，在小肠中进行食糜的消化，从而获得所缺乏的内源性胰酶的功能。所用的制剂必须含有足量的酶。此外，酶必须以肠溶制剂提供，具有小的颗粒大小并且在消化道中是可完全生物利用的。

为了治疗基于胰酶缺乏的消化性疾病，通常使用基于主要的酶脂肪酶和蛋白酶的取代/替代的胰酶替代疗法(PERT)。对于PERT，种类繁多的酶制剂已经上市。它们部分基于来自猪的胰酶，例如含有胰酶(所谓的胰酶产物或PEP)的制剂

或Enzym-Lefax

制剂，大多数通过屠宰的猪获得，例如猪的胰脏。制备过程的最终产物是胰酶制剂(pancreatin)。PEP由猪脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶组成，用于继发性囊性纤维化、慢性胰腺炎和胰腺切除术的EPI患者。1938年，PEP被豁免于1938年的“食品、药物和化妆品法案”，从未经过正式的食品和药品管理局(FDA)审查程序(Giuliano CA1，Dehoorne-Smith ML，Kale-Pradhan PB(2011)Pancreatic enzyme products:digesting the changes.AnnPharmacother.45(5):658-66。

来自猪源的PEP不能用于患有猪蛋白过敏的消化性疾病的患者。此外，猪被认为是人类致病性流感病毒以及大量猪源病毒的天然贮存者，因此不能排除胰酶制剂被这些病毒污染。也就是说，作为屠宰废弃物的胰腺组织如果没有进一步处理，可能表现出高度的病毒污染。因此，基于其天然来源，胰腺组织、胰酶制剂和PEP也可能被来自猪源的病毒污染。必须强调的是，人用药品注册技术规范国际协调会(ICH)在ICH Topic Q 5A (R1)的指导中规定了非常高的标准，并要求作为最合理的保证来保证产品没有病毒污染。美国FDA的药物评价与研究中心(CDER)已经要求对含有脂肪酶的PEP(如Creon)进行强化风险缓和策略。

这是因为存在猪细小病毒和猪圆环病毒以及大量已知为人类病原体的猪病毒对PEP造成污染的风险。

然而，迄今为止制造商还没有发现任何病毒灭活方法能够成功地证明可将PEP的病毒清除至可接受的水平，而不会降解或减少胰酶(特别是脂肪酶)至不可接受的水平。由于与诸如胰酶制剂之类的复杂生物材料的分析测试相关的进一步限制，将难以确定作为任何额外的清除病毒步骤的结果，有何种降解物会被引入到产物中。总之，对病毒有效的处理步骤极有可能会改变PEP的特性，因此对药物的质量、安全性和功效具有潜在的重大影响。然而，由于除了PEP脂肪酶市场上几乎没有替代资源，它们仍然是唯一允许用于治疗EPI的药物组合物。

此外，对于特定的患者群体，使用PEP的劣势是来自猪。通常，由于宗教指示犹太教或伊斯兰教的病人不能容忍使用猪的胰脏。此外，胰酶制剂是来自胰腺组织细胞(通常来自猪)的匀浆。由于大量的腺泡细胞的破裂，除了胰酶以外，它还含有多种其他酶和蛋白质以及其他高分子量和低分子量化合物。胰酶制剂的组分取决于其工业制备过程。为了获得胰酶制剂，屠宰后猪的胰腺尽可能快地被机械化深度冷冻、收集和破碎。为了稳定和活化酶，将各种添加剂加入到匀浆中。然后用有机溶剂如丙酮脱脂、去除纤维物质、并通过冻干脱水和干燥。鉴于与有机溶剂的管理相关的问题及其成本，因此仍然需要一种酶制造方法从而最小化有机溶剂的使用或在没有有机溶剂下工作。为了制备特定的剂型，进一步盖仑制剂加工(galenic process)可以产生如微丸、片剂、胶囊、糊剂、霜剂、凝胶剂、油剂或其它制剂。通常将基于胰酶制剂的PEP与各种支持材料和缓冲物质混合。此外，颗粒状胰酶制剂用酸稳定的薄膜或漆(lacquer)包衣以抵抗人胃液的低pH值。后两个处理步骤是确保酸不稳定的PEP可以在靶点十二指肠(小肠)处实现其消化功能，但是防止酶在许多胰腺炎患者的酸性十二指肠上部活化。

含有脂肪酶的新型PEP是

是来自屠宰猪的猪源脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶的组合，适用于治疗由于囊性纤维化或其他状况引起的EPI。与普通市售针对EPI的PEP相反，

在每个胶囊中的酶含量没有表现出很大的变化。普通PEP的变化部分是由于制造商实施过度填充胶囊以解决在产品保质期过程中发生的酶降解。通过提供太多或太少的所需酶，产品的酶内容物的变化可导致不一致的治疗效果，这可能导致对患者EPI的次优治疗。此外，过度填充的产品可能会增加纤维性结肠病的风险，一些报告中这与长期暴露于高剂量的PERT相关。这些问题可以通过应用

来避免。然而，

含有与普通PEP相同的猪胰脂肪酶。因此，

中的猪胰脂肪酶仅在十二指肠中存在猪辅脂酶(colipase)时才有效。因此，

也几乎是来自屠宰的猪的未纯化蛋白质混合物，因为制造过程中的纯化将导致辅脂酶的潜在损失。此外，

还可能含有病毒污染物，并且由于必要的沉淀和脱脂步骤，也含有如PEP所述的残留有机溶剂。因此，对于用于PERT的这些普通PEP，该组合物中的猪胰脂肪酶可能被病毒和/或有机溶剂污染。

为了避免使用猪胰腺组织作为脂肪酶和蛋白酶的来源，一些研究人员建议使用通常在FR No.1015566中描述的鱼或其他海洋动物的酶，以及来自磷虾(来自Euphausiaceae类的甲壳动物)和毛鳞鱼(capelin fish)的胃肠道的酶组合物(美国专利号4,695,457)。然而，这些天然资源难以操作并且难以以工业规模处理表征的酶制剂，因此含有这些来源的脂肪酶的酶制剂从未进入市场。

由于来自于猪胰腺组织的常规酶制剂有病毒和有机溶剂污染问题的特征，使用微生物衍生的酶作为猪源的PEP的替代物已经提出。例如，美国专利号6,051,220描述了包含一种或多种酸稳定脂肪酶和一种或多种酸稳定淀粉酶的组合物，两者优选真菌来源。美国专利申请2004/0057944描述了包含代氏根霉(Rhizopus delemar)脂肪酶、蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)蛋白酶和米曲霉(Aspergillus oryzae)淀粉酶的组合物。

部分地，一些酶制剂因此也含有来自霉菌提取物的微生物酶，例如

和

尽管它们耐酸性并且不依赖于辅脂酶，但是由于其在胃肠道内被胆汁盐和蛋白酶的快速灭活，其临床疗效低。

处于开发中的重组酶制剂是一种以重组人胆汁盐刺激脂肪酶(rhBSSL)、以Kiobrina为商标名的药物，其含有胆汁盐稳定脂肪酶。这种rhBSSL可以改善人类肠道中必需脂肪酸的消化和吸收，如长链多不饱和脂肪酸、还有胆固醇酯。rhBSSL在哺乳动物细胞中表达和产生，并由Sobi开发用于酶疗法以改善接受巴氏消毒母乳和/或配方奶的早产儿的生长和发育。在巴氏消毒母乳或婴儿配方奶中用rhBSSL替代的原理是恢复在巴氏杀菌中失去的或在配方中完全不存在的天然脂肪酶活性水平。缺点是酶仅在初级胆汁盐存在的情况下有活性，该初级胆汁盐通常是不溶的，因此在十二指肠中不可用，特别是在胰腺外分泌功能不全的条件下。此外，研发公司Sobi宣布的临床数据显示，rBSSL不符合其主要终点，因此，rhBSSL不能在人类胃肠道中实现酶替代治疗的功能。

用于治疗胰腺外分泌功能不全的另一种重组脂肪酶是分子量为30kDa的结晶的、纯化的交联假单胞菌/洋葱伯克霍尔德菌(Pseudomonas/Burkholderia cepacia)脂肪酶，其是Anthera Pharmaceuticals开发的并且也在美国专利US7718169中公开的称为

(现在的品牌为

)的酶组合物的部分。

这种微生物脂肪酶是细菌来源的，其在美国专利申请2001/0046493中描述，可以通过重组DNA技术生产。该酶在培养基中分泌，并且需要复杂的生产方法进行纯化和结晶以使在人胃肠系统中给药的酶稳定。结晶后，脂肪酶晶体必须经过化学和共价交联才能达到足够的酸稳定性。体外研究表明，称为交联酶晶体(CLEC)方法的这种修饰增加了脂肪酶的稳定性，并且交联的脂肪酶在代表胃的酸性pH下不溶。然而，已经表明扩散效应已经成为实际使用结晶酶的严重问题(Alter，G.M.，Leussing，D.L.，Neurath，H.Bert L.Vallee，B.L.，1977，Kinetic Properties of carpoxipeptidase B in solution andcrystals.Biochemistry 16(16)：3663-3668)。此外，已经表明，CLEC脂肪酶与可溶性酶相比在某些底物上显示出显著降低的酶活性(Margolin，A.L.(1995)Novel crystallinecatalysts.Trends in Biotechnology 14(7)：223-230)。

此外，假单胞菌/洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶具有广泛的最适pH(pH 4-8)，pH值大于8时活性大幅度下降。然而，假单胞菌/洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶在pH显著大于pH 8的条件下没有活性。因此，该酶不能在强碱性条件(大于pH 8.5或更高)下支持脂质的消化。假单胞菌/洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的另一个问题是酶是来自病原菌的蛋白质。假单胞菌/洋葱伯克霍尔德菌(解释：以前称为洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)，该细菌现在被称为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia))是一种重要的人类病原体，其最常见的是引起免疫受损个体的肺炎以及潜在肺部疾病如囊性纤维化或慢性肉芽肿病。

患有囊性纤维化的患者有发生众所周知的“洋葱伯克霍尔德菌综合征”的风险，因此所谓的“洋葱伯克霍尔德菌综合征”是囊性纤维化患者的一个严重状况，以至于对治疗的反应并不总是很好。

在这种假单胞菌/洋葱伯克霍尔德菌感染的情况下，在感染后通过激活B细胞和T细胞获得长期激活的记忆，而其一些后代变成长期存活的记忆细胞。在人的整个生命周期中，这些记忆细胞作为“获得性免疫系统”的一部分，记住遇到的每种特异性病原体，并且如果再次检测到病原体则可以发起强烈的反应。

在使用假单胞菌/洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶进行口服治疗的条件下，来自假单胞菌/洋葱伯克霍尔德菌的口服摄取作为酶替代治疗的一部分(在囊性纤维化的情况下)，代表着外源抗原的掺入。抗原将被获得性免疫系统检测为病原体，并将导致1.免疫系统的激活(即所谓的免疫记忆)，2.产生针对酶的抗体，以及3.在肠道粘膜中产生过度免疫应答的风险包括潜在的过敏和自身免疫反应和败血症。

在使用假单胞菌/洋葱伯克霍尔德菌酶为囊性纤维化药物的情况下，过度免疫反应的风险对于患者治疗将起反作用，并且将使患者的健康状况恶化。

功效不足和上述有害副作用的风险的组合已经引起了监管机构的严重关切。2011年，美国卫生和公共服务部的食品及药品管理局(FDA)的胃肠药物顾问委员会驳回了以下发现：

(含有假单胞菌/洋葱伯克霍尔德菌的酶制剂)的益处超过了其风险，认为需要额外的功效数据才能得出其在患者中比现有的猪源的胰酶产品更好的结论。

最后，已经显示有实质证据表明

不如猪源的PEP有效，并且似乎将患有EPI的患者暴露于更大的风险中(Carome M.Wolfe S.Testimony to the FDAGastrointestinal Drug Advisory Committee regarding liprotamase–risk:benefitassessment；ethics of further clinical trials.Washington DC:Public CitizenResearch Group.January 12,2011)。

此外，美国专利US5998189公开了在大肠杆菌中产生的重组酸稳定性狗胃脂肪酶，并要求保护在大肠杆菌以及其他原核和真核表达系统中表达酸稳定性狗胃脂肪酶。另外，从转基因玉米中表达和提取这种酸稳定性狗胃脂肪酶已经被证实(Zhong,Q.,GU,Gu,Z.andGlatz,C.E.(2006)Extraction of recombinant dog gastric lipase from transgeniccorn seed.J.Agric.Food Chem.54:8086-8092)。

然而，狗胃脂肪酶显示出非常低的最适pH(pH 4)，以及非常窄的pH谱(从pH 3-pH5)(Carriere,F.,Moreau,H.,Raphel,V.,Laugier,R.,Benicourt,C.,Junien,J.-L.andVerger,R.,(1991)Purification and biochemical characterization of dog gastriclipase.Eur.J.Biochem.202:75–83)。

含有脂肪酶的酶制剂的目标是在最低剂量下显示出最高功效，并且特征在于明确的安全性，这对于所有患胰腺功能不全的患者，包括囊性纤维化患者的群体，仍然是非常重要的。

表1：PERT方法的酶制剂总结

附图说明

图1：TTHERM_00320120基因产物的pH谱(纤毛虫脂肪酶10号)。

图2：TTHERM_00320130基因产物的pH谱(纤毛虫脂肪酶11号)。

图3：TTHERM_00320230基因产物的pH谱(纤毛虫脂肪酶14号)。

图4：脂肪酶10号和脂肪酶14号在胃液中的稳定性。

图5：胆汁酸激活脂肪酶11号。

图6：供体载体。

图7：受体载体。

图8：技术海报。

发明目的

在大多数患者中，脂质消化不能完全通过目前的标准治疗来标准化。此外，用于人体给药的脂肪酶的生产是麻烦的和昂贵的。本发明处理了这些问题。

发明概述

根据本发明的优选实施方案，提供两种或更多种脂肪酶的组合，其中至少一种脂肪酶的最适pH在酸性pH值下，而至少一种其它脂肪酶的最适pH在碱性pH值下。

定义最适pH的一个优选方法是＞50％的脂肪酶峰值活性所在的pH范围，如用尼克松试验(Nixon Test)或滴定试验(titration test)(见下文)测定的。术语“最适pH”与术语“最大脂肪分解活性”同义使用。

术语“酸性pH值”是指pH在≥0和≤7之间，而术语“碱性pH值”是指pH在>和≤14之间。

本文所用的术语“脂肪酶”是指催化脂肪(脂质)水解的酶。脂肪酶是酯酶的亚类，并且在大多数(即使不是全部)生物体中的膳食脂质(例如甘油三酯，脂肪，油)的消化、运输和加工中起重要作用。术语脂肪酶包括以下亚型：胆汁盐依赖性脂肪酶，胰脂肪酶，溶酶体脂肪酶，肝脂肪酶，脂蛋白脂肪酶，激素敏感性脂肪酶，胃脂肪酶，内皮脂肪酶，胰脂肪酶相关蛋白2，胰脂肪酶相关蛋白1和舌脂肪酶。

发明人惊奇地发现，这些两种或多种脂肪酶的组合，其中一种的最适pH在酸性pH值下，而至少另一种的最适pH在碱性pH值下，该组合显著地增加了脂肪酶替代疗法的功效。

根据优选的实施方案，通过尼克松试验或滴定试验测定至少一种脂肪酶的脂肪分解活性。

尼克松试验在Nixon&Chang 1979中公开，其内容被并入本文。该试验的细节在本文其他地方公开。滴定试验在美国药典23，NF18 1095，第1150-1151页中公开，其内容被并入本文。

优选地，至少一种脂肪酶是由纤毛虫目(order ciliates)的生物体编码、表达和/或产生的脂肪酶。

优选地，所述纤毛虫是来自四膜虫科(family Tetrahymenidae)。更优选地，所述纤毛虫是来自四膜虫属(genus Tetrahymena)的。最优选地，所述纤毛虫是来自嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)。

基于纤毛虫的脂肪酶生产系统为生产脂肪酶提供了经济、简单和可靠的方法，与可获得的竞争者相比，其具有大幅增加的比活性，因此具有大大提高的治疗潜力。

由于四膜虫中没有发现任何病毒，以及哺乳动物和纤毛虫之间的巨大进化距离，产品的安全性预计将高得多，同时生产可以以更稳定的方式运行，并且由于病毒感染而导致的失败风险减少。

优选地，至少一种脂肪酶是根据权利要求3的脂肪酶，其已经通过定点或随机突变和随后的选择进行了修饰。

在一个特别优选的实施方案中，一种脂肪酶具有的最适pH是在哺乳动物胃中存在的pH值，而至少一种其它脂肪酶具有的最适pH是在哺乳动物小肠下段中存在的pH值。

包括胃在内的哺乳动物胃肠道腔内pH值在Fallingborg J，Dan Med Bull.1999年6月；46(3)：183-96中被讨论。人类胃肠道的一些典型值如下表所示：

表2

胃	pH 1–4
		十二指肠	pH 6
回肠末端	pH 7.4
		盲肠	pH 5.7

因此，由于其广泛的pH谱，该产品促进整个胃肠道的脂肪分解。

在一个优选实施方案中，组合的一种脂肪酶具有的最适pH在pH值≥1和≤6范围内。

在一个优选的实施方案中，组合的一种脂肪酶具有的最适pH在pH值≥8和≤11范围内。

在特别优选的实施方案中，所述至少两种脂肪酶包含选自以下一组的氨基酸序列

a)SEQ ID No 4-6，和/或其部分，变体，同源物或其衍生物，

b)与SEQ ID No 4-6中任一具有至少70％序列相同性、优选95％序列相同性的氨基酸序列。

这些序列涉及以下所示的三种优选的脂肪酶：

表3

根据本发明的另一个实施方案，提供了包含根据上述的两种或多种脂肪酶的组合的药物制剂。

根据本发明的另一个实施方案，提供根据上述的两种或多种脂肪酶的组合、或包含该脂肪酶的药物制剂在

·治疗脂质消化缺陷和/或消化性疾病中的用途，或

·制造用于治疗脂质消化缺陷和/或消化性疾病的药物中的用途。

优选地，在所述用途中，消化性疾病是胰腺外分泌功能不全(EPI)。可治疗的其他消化性疾病包括脂肪痢、乳糜泻或消化不良。

由于缺乏胰脏制造的消化酶，EPI没能力适当消化食物。EPI被发现在患有囊性纤维化和Shwachman-Diamond综合征的人中，并且是由制造消化酶的胰腺细胞逐渐丧失引起的；消化酶的丧失导致从正常消化过程中营养物质消化不良和吸收不良。慢性胰腺炎是人类EPI最常见的病因。

脂肪痢是粪便中存在多余的脂肪。由于多余的脂质，粪便也可能浮起、有油腻的外观、尤其是恶臭。可能发生油性肛漏或某些程度的大便失禁。增加的脂肪排泄量可以通过确定粪便脂肪水平来测量。构成脂肪痢的粪便脂肪的多少的定义尚未标准化。

乳糜泻是谷蛋白(谷物中发现的蛋白质)损害肠道的状况。症状包括腹痛、腹胀、体重减轻和疲劳。患有乳糜泻的人必须遵循不含谷蛋白的严格饮食。已经研究了脂肪酶作为乳糜泻治疗的一部分，并且其治疗导致适度的体重增加。

消化不良是一种患者在高脂肪膳食后患有腹胀、嗳气和饱感的状况。这些症状通常与肠易激综合征(IBS)相关，因此一些研究人员推测胰酶可能有助于治疗IBS的症状。然而，没有做任何研究。

优选地，在所述用途中，脂质消化缺陷是脂蛋白脂肪酶缺陷，其是由编码脂蛋白脂肪酶的基因突变引起的状况。

根据本发明的还有一个实施方案，提供了根据上述描述的两种或多种脂肪酶的组合、或包含该脂肪酶的药物制剂用于治疗囊性纤维化。

囊性纤维化是导致身体产生异常稠厚粘液的遗传状况。患者经常有营养缺陷，因为粘液阻止胰酶进入肠道。服用脂肪酶有助于改善患者从食物中获得的营养。

根据另一个实施方案，提供了根据上述描述生产两种或多种脂肪酶的组合的方法，该方法包括以下步骤：

a)在一个或多个合适的生产系统中表达两种或更多种脂肪酶，

b)纯化在步骤a)中表达的两种或更多种脂肪酶。

优选地，在所述方法中，至少一种脂肪酶是通过在纤毛虫目的生物体中同源表达产生的。

术语“同源蛋白质表达”涉及表达基因或蛋白质于所述基因或蛋白质起源的生物体中。

优选地，所述纤毛虫是来自四膜虫科。更优选地，所述纤毛虫是来自四膜虫属。最优选地，所述纤毛虫是来自嗜热四膜虫。

此外，如在下列表格中可以看到的，因为纤毛虫具有不同于其他真核生物的密码子使用，基于纤毛虫的脂肪酶生产系统特别适用于生产纤毛虫脂肪酶的情况。

表4

编码GC 32.53％第一个字母GC 38.64％第二个字母GC 31.25％第三个字母GC27.69％

优选地，在所述方法中，至少一种脂肪酶通过过表达产生，优选通过同源过表达产生。

术语“同源过表达”涉及在所述基因或蛋白质起源的生物体中过表达所述基因或蛋白质。

为此，内源基因的表达可以通过外部因子来增强，例如，将其置于直接克隆到基因组中的启动子控制下，或添加转录因子到相应的细胞或生物中。作为替代，所述内源基因拷贝的表达可以通过提供合适的质粒的方法引入该细胞或生物体。这些质粒的实施例显示在图6和7中。

根据本发明的另一个实施方案，提供两种或更多种选自以下一组的核酸分子

a)至少一种核酸分子，其包含如SEQ ID NO 1-3所示的核苷酸序列，

b)至少一种核酸分子，其编码包含SEQ ID NO 4-6所示的氨基酸序列的多肽，

c)至少一种核酸分子，其是a)-b)的核酸分子的部分、变体、同源物或衍生物，

d)至少一种核酸分子，其是a)-c)中任一核酸分子的互补，或能够在严格条件下与其杂交，

e)至少一种核酸分子，其包含，与a)-d)中任一核酸分子相比，至少一个沉默单核苷酸取代；根据a)和c)-e)的核酸分子，其经密码子优化适于原生动物表达宿主，和/或

f)至少一种核酸分子，其与a)-f)的任一核酸分子具有至少70％序列相同性，优选95％序列相同性。

进一步说明

本发明人在四膜虫的基因组中揭示了具有推定的脂肪分解活性的蛋白质的37个开放阅读框。在我们的实验过程中，通过筛选实验选择了三种性能优越的酶。

四膜虫是一种非致病性单细胞真核微生物，其已在几个实验室中建立作为表达宿主。它具有许多优点，使其适合于同源蛋白质表达。四膜虫是一种广泛研究的模式生物，在50多年的基础研究中，没有观察到任何病毒或内寄生虫。检查指示细胞系显示没有内源性感染因子如可以感染高等动物的病毒或支原体。这可能是由于纤毛虫常见的核二形性。另一个原因可能是纤毛虫不寻常的密码子使用和高AT含量的基因组。因此，本发明人设想在大多数纤毛虫中，高等生物的致病病毒不能扩增。事实上，迄今为止所知，纤毛虫不易受病毒感染，这是一个惊人的优势。这意味着在基于纤毛虫的生产过程中，病毒扩增或外源病毒的生长不会发生。此外，可以在无动物培养基中生长纤毛虫。这意味着，如果产生用于治疗用途的蛋白质，则可以跳过在人和动物细胞培养的工业过程中所需的昂贵的病毒清除过程。

首先，与纤毛虫密码子使用有关的上述考虑也适用于四膜虫。此外，高拷贝数质粒可用于四膜虫，其含有来自微小染色体rDNA的复制起点(ori)。这种微小染色体rDNA在每个细胞存在高达9,000个拷贝。除此之外，稳定整合可以发生在大核DNA中，其中所有基因以45倍的拷贝数存在。高基因剂量是有效的蛋白质生物合成的理想前提条件，从而达到高生产率。与细菌相反，四膜虫属的纤毛虫将生物蛋白质非常有效地分泌到上清液中。

建立细胞密度高达2×10⁷个细胞/ml、干重为80g/L的四膜虫的批量、分批补料和连续发酵，并且证明可以扩大产能(逐级提高)至1000L没有任何问题。在报告蛋白的可行性研究中，每天已经可以实现50-90pg/细胞的时空产量。用同源表达的第一次实验导致分泌蛋白质每天超过200mg/L的产量。四膜虫可以在微生物表达系统(细菌或酵母)的常规生产设备中发酵。这意味着对现有生产设备或新建生产设施不需要昂贵的改造。

然而，纤毛虫系统在分泌酶的表达方面还具有一些其他优点。这些将在下面讨论。

尽管具有所述优点，纤毛虫表达系统仍然是相对未知的，并且当被问及潜在的异源/同源表达系统时，本领域技术人员宁可考虑大肠杆菌、酵母、昆虫细胞系统(杆状病毒)和哺乳动物细胞系。

可用于本发明上下文中的纤毛虫转化方法，其中包括显微注射、电穿孔和粒子轰击，并且例如在Tondravi&Yao(1986)，Gaertig&Gorovsky(1992)和Cassidy-Hanley等(1997)中所描述。

转化和异源蛋白质表达的方法已经在针对少数原生生物(WO 00/58483和WO 00/46381)中进行了描述。嗜热四膜虫的有丝分裂稳定转化体可以通过显微注射、电穿孔或通过粒子轰击转染细胞体大核或生殖微核之后实现。

可以进行诸如新霉素抗性的不同选择标记(Weide等，2006，BMC)和通过同源DNA重组的异源基因的整合来进行转化体的选择，其导致稳定的胸苷-营养缺陷型四膜虫细胞(Weide等，2006，BMC)。此外，还考虑了使用杀稻瘟菌素S(Weide等，2007，BMC)或紫杉醇(paclitaxcel)(WO 00/46381)抗性。

适用于纤毛虫脂肪酶表达的启动子例如在WO2007006812A1中公开，其也被注册给本发明的申请人，其内容将通过引用并入本文。其中，公开了一种热诱导型启动子和金属硫蛋白启动子，其也可用于本发明的目的。

此外，提供了用于转染纤毛虫宿主细胞的载体，所述载体包含至少一个编码脂肪酶的核酸分子。

令人惊讶的是，四膜虫脂肪酶和蛋白酶的组合(以下简称“制剂”)可以比市场上或目前正在开发的任何产品都更能满足胰腺功能障碍的治疗要求。首先，在各种从pH值2到pH值高达11的pH条件下的无法匹敌的脂质消化能力使得制剂能够消化酸性肠道、酸性十二指肠上段(由于胰腺功能障碍所致)以及在较中性至碱性的小肠部分中的脂质。其次，即使在中性至碱性条件下，该制剂的比活性令人惊讶地被发现至少比胰酶的比活性高一个数量级。这有助于通过降低日服药负担来促进患者的依从性；第三，预定义的酶混合物忌用于某些形式的病理性消化不良。

在本发明的优选实施方案中，两种或更多种四膜虫脂肪酶覆盖胃肠道的生理pH范围，从而能够从胃到小肠下段分解脂肪。在另一个优选的实施方案中，碱性四膜虫脂肪酶用于消化在十二指肠的碱性环境中的脂质。

脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶活性的模块化装配的可能性允许将制剂适应于具有不同状况和因此需求不同药物的患者。例如高淀粉酶含量对于患有粘液粘稠病的儿童是不期望的。蛋白酶忌用于急性胰腺炎或慢性胰腺炎活动性发作的患者。第四，与真菌源的脂肪酶相比，制剂被生理浓度下的胆汁酸活化。

定义

本文所用的术语“纤毛虫”指的是科学的纤毛亚门(phylum of Ciliophora)，其为单细胞真核生物(“原生动物”或“原生生物”)，其特征在于其相对较大的尺寸(一些物种具有长达2mm的长度)，它们的纤毛细胞表面和两种不同种类的核，即小的二倍体微核和大的多倍体大核(用于蛋白质表达)。后者通过扩增基因组和重度编辑从微核产生。

本文所用的术语“cDNA”是指编码待表达的蛋白质的DNA分子，并且缺乏任何非编码部分，如内含子。在许多情况下，使用逆转录酶和寡聚dT引物从mRNA模板直接合成cDNA。然而，该术语还应包括合成基因和另外获得的编码DNA。

本文所用的术语“启动子”是指通常位于基因或cDNA上游(朝向有义链的5'区域)的DNA的调节区域，其允许或甚至增强基因或cDNA的转录。

本文所用的术语“片段”是指缺乏天然或野生型蛋白的一些部分或结构域的蛋白质的一部分，同时在酶活性、免疫原性、靶标结合等方面保留一些活性。

本文所用的术语“信号序列”是指编码寡核苷酸(“信号肽”)的核酸序列，其将引导在细胞质中合成的蛋白质至某些细胞器如细胞核、线粒体基质、内质网、叶绿体、质外体和过氧化物酶体。在蛋白质转运后，信号肽通过信号肽酶从蛋白质上被切割。在更严格的意义上，信号序列或信号肽对所述蛋白质分泌到外部介质中负有责任。该过程通过粗面内质网、高尔基体和随后的胞吐进行。在许多情况下，信号序列位于要分泌的蛋白质的N末端。

本文所用的术语“可操作地连接”是指可将编码基因产物的核酸序列与启动子连接，使得启动子在合适的条件下调节基因产物的表达。可操作地连接的两个核酸序列含有转录必需的元件，包括例如TATA盒。

术语“核酸分子”旨在表示包含DNA(cDNA和/或基因组DNA)、RNA(优选mRNA)、PNA、LNA和/或吗啉代的任何单链或双链核酸分子。

术语“严格条件”涉及探针优选与其靶子序列杂交并且远小于其它序列的条件。严格条件是序列依赖的，在不同的情况下会有所不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。通常，严格条件选择会比特定序列在规定离子强度和pH下的热力学解链温度(Tm)低约5℃。Tm是在平衡时50％与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。(由于靶序列通常在Tm时过量存在，所以50％的探针在平衡时被占据)。典型地，严格条件将是盐浓度小于约1.0M钠离子，典型在pH 7.0至8.3下为约0.01至1.0M钠离子(或其它盐)、并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30℃且对于较长探针至少约60℃。严格条件也可以通过加入去稳定剂如甲酰胺等获得。

术语“核酸分子的片段”旨在表示包含根据权利要求保护的序列之一的核酸分子的子集的核酸。这同样适用于术语“核酸分子的部分”。

术语“核酸分子的变体”在本文中指的是根据权利要求保护的序列之一的核酸分子的结构和生物学活性基本相似的核酸分子。

术语“核酸分子的同源物”是指与根据权利要求保护的序列之一的核酸分子相比，其序列具有添加、缺失、取代或以其他方式化学修饰的一个或多个核苷酸的核酸分子，提供总是保留与后者基本相同的结合性质的同源物。

本文所用的术语“至少X％序列相同性”是指在通过BLAST算法家族(特别是megablast、不连续megablast、blastn、blastp、PSI-BLAST、PHI-BLAST、blastx、tblastn和tblastx)的序列对比测定的序列相同性，可以在NCBI提供的各自互联网域上访问。

本文所用的术语“载体”是指用于将外来遗传物质转移到另一个细胞中的分子载体。载体本身通常是由插入片段(目的基因)和作为载体“骨架”的较大序列组成的DNA序列。将遗传信息转移给另一个细胞的载体的目的通常是分离、增加或表达靶细胞中的插入片段。称为表达载体(表达构建体)的载体特异地用于靶细胞中转基因的表达，并且通常具有驱动转基因表达的启动子序列。称为转录载体的简单载体仅能够被转录但不能被翻译：与表达载体不同，它们可以在靶细胞中复制但不表达。转录载体用于扩增其插入片段。

本文所用的术语“质粒”是指质粒载体，即能够在宿主细胞中自动复制的环状DNA序列。质粒载体包含允许在宿主细胞中质粒半独立复制的复制起点(“ORI”)。此外，质粒可以包含多克隆位点，其包括用于插入的插入片段的核苷酸突出端，以及插入片段任一侧的多个限制酶共有位点、驱动质粒转基因转录的启动子、可选地至少一个用于确认质粒已经与宿主基因组DNA整合的基因标记物，并且可选地用于鉴定哪些细胞已经被成功转染的报告物。

本文所用的术语“宿主细胞”具有两个不同的含义，根据各自的上下文可以理解。在同源蛋白质表达的上下文中，术语“宿主细胞”是指用作表达宿主的细胞。因此，用包含待表达蛋白质的cDNA的合适载体转染所述细胞或其祖细胞。

如本文所用的术语“纤毛虫宿主细胞”应指来自纤毛亚门(以前称为：纤毛纲(Ciliata))的细胞，例如特征在于存在称为纤毛和核二形性的毛发状细胞器的原生动物。

如本文所用的术语“掺入”应指以下事实：所述核酸以使其准备好进行蛋白质表达的方式进入宿主细胞。这样的掺入可以在纤毛虫中具有不同类型，例如“游离基因掺入”(例如核酸分子如质粒没有进入细胞核，但在细胞质中复制并被翻译)和“整合掺入”(例如核酸分子已经整合到细胞中基因组)。

免责声明

为了提供全面的公开而不会过度地延长说明书，申请人特此通过引用将每个上述专利和专利申请并入。

上述详细实施方案中的元素和特征的特定组合仅是示例性的；这些教导与本文中的其他教导的交换和替代以及通过引用并入的专利/申请也是明确地考虑的。如本领域技术人员将认识到的那样，在不脱离权利要求保护的本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以进行本文所描述的变化、修改和其他实现方式。因此，前面的描述仅作为示例，并不意图作为限制。本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。此外，在说明书和权利要求书中使用的附图标记不限制所要求保护的本发明的范围。

实施例和附图简述

本发明目的的附加细节、特色、特征和优点在从属权利要求和以下各个附图和实施例的描述中被公开，其示例性方式展示出了本发明的优选实施方案。然而，这些附图不应被理解为限制本发明的范围。

实施例和附图

1.表达载体的构建

将不同脂肪酶的基因(SEQ ID No：1、SEQ ID No：2和SEQ ID No：3)克隆到供体载体中(见图6)。使用Cre依赖重组酶系统将所有供体载体的表达盒转移到受体载体(见图7)。序列如下所示。

2.野生型四膜虫的培养以及表达质粒转化(基因枪法)

在SPPR(2.5％月示蛋白胨、1％蛋白胨酸水解物、0.5％酵母提取物、0.1％硫酸亚铁螯合溶液和0.2％葡萄糖)中培养嗜热四膜虫株B 1868/4、B 1868/7和SB 1969。我们用共轭噬热四膜虫株。如之前在Cassidy-Hanley等，1997中描述的那样进行嗜热四膜虫细胞的转化。

3.脂肪酶活性的测定

转化的四膜虫克隆在SPPR培养基中通过在30℃下的500ml多发酵罐中加入400μg/ml巴龙霉素培养。通过在培养开始时或在对数早期或中期阶段加入0.55μM Cd²⁺(MTT1)诱导靶基因表达。

等分诱导培养后约20小时至25小时收获的无细胞SPPR上清液。上清液的脂肪酶活性通过Nixon&Chang(1979)描述的游离脂肪酸的比色测定或滴定测定(美国药典23，NF181095，第1150-1151页)。通过罗丹明荧光检测(Jette&Ziomek，1994)进行了脂肪分解活性克隆的筛选。

4.不同四膜虫脂肪酶的pH谱(图1-3)

使用尼克松试验在不同的pH值下测试三种不同的过表达四膜虫脂肪酶的脂肪分解活性。使用来自Arie Blok(Woerden，NL)的高脂肪猪饮食作为底物，其用胃蛋白酶在低pH下预消化以模拟使用的胃通道。10号和14号脂肪酶(分别为SEQ ID NO 4和6)在低pH下显示活性，而11号脂肪酶表现出相较于胰酶制剂从中性至高pH值的宽pH活性谱。这些脂肪酶的组合可以涵盖2至11的pH值。结果示于图1–3。

5.胃液稳定性(图4)

在人胃液中孵育0.5和3小时后测定pH活性(图4)。与胰酶制剂衍生产品相反，即使在人胃液中孵育3小时后，10号和14号脂肪酶也分别保留38％和30％的活性。结果示于图4。

6.胆汁盐激活(图5)

在各种量的胆汁酸生理混合物存在下测试11号脂肪酶(SEQ ID No 5)的脂肪分解活性(Gargouri等，1986)。像人胰腺脂肪酶一样，11号脂肪酶通过增加胆汁酸的浓度而被活化。结果如图5所示。

序列

SEQ ID No:1:10号脂肪酶核苷酸序列

SEQ ID No:4:10号脂肪酶氨基酸序列

MKLQLLLLVCLSFAACQSFTYTQSLAQDLAGFSLASYCNPKSIE

QWNCGCACDKNPQGLRNVTILFNSTLQASGYLGYSTHHDAIVVVFRGTVPWLIENWIA

DLNTFKTQYPLCQNCYVHQGFYNQFKQLKSQLVTSFTSLRQLYPNAKVFVTGHSLGAA

MSAHSIPVIYQLNGNKPIDAFYNYGCPRVGDQTYANWFNSQNFALEYGRINNAADPVP

HLPPLLYPFSFFHYNHEIFYPSFVLFGNQHNQCQNAETIFGADGVIIAANVLDHLTYF

GWDWSGSILTCQ

SEQ ID No:2:11号脂肪酶核苷酸序列

SEQ ID No:5:11号脂肪酶氨基酸序列

MKSIFLLIISLLLASCSQFQYNETLAQDLAGFSLASYCNPKYLQ

QWNCGSACKKNPNGLTDFSYLYNKTLKASGYIGYSAHHDAIIVVFRGTVPWLIQNWIA

DLNTIKIQYPFCENCYVHKGFYKQFNQLKSQLIQSFTEIRQKYPSSKIFVTGHSLGAA

MSFHSMPIIFELNGNKPIDAFYNYGSPRVGNEAYATWFNLQNFALQYGRINNAADPVP

HLPPILFPFQFYHTNHEIFYTSFIEDGNKYEQCLDAEHKLCANSKIIAASVRDHLSYF

GWNWATSILTCQSEQ ID No:3:14号脂肪酶核苷酸序列

SEQ ID No:6:14号脂肪酶氨基酸序列

MNKLQVLFIAAIVCTIGSTVYLLNKSSSDVQESQLTFPYDENLAE

NLAGFSMASYCKASKIENWNCGASCKKNPEGLQDVYIMKNKTMNAAGFLAYSPAHDAIV

VVFRGTVPWLIKNWISDINTVKTKYSRCEKCYVHLGFFNAFKELQDQILTEFPKLKAKY

PYSKVFVTGHSLGAAMSTHAVPVIYELNGNKPIDAFYNFGSPRVGDENYHQWFDSQNFT

LQYGRINHRADPVPHLPPNYSPFTFTHIDHEVFYQTFKKPYTQCIETESLECADGIKIP

LDIPDHLSYFGWDWATDILACQ

参考文献

Alter GM,Leussing DL,Neurath H,Vallee BL(1977):Kinetic properties ofcarboxypeptidase B in solutions and crystals.Biochemistry.Aug 9；16(16):3663-8.

Tondravi,MM；Yao,M-C(1986):Transformation of Tetrahymena thermophilaby microinjection of ribosomal RNA genes.PNAS 83,4369-4373.

Gaertig,J；Gorovsky,MA(1992):Efficient mass transformation ofTetrahymena thermophila by electroporation of conjugants.PNAS 89,9196-9200.

Cassidy-Hanley,D.；Bowen,J.；Lee,J.；Cole,E.；VerPlank,L.；Gaertig,J.；Gorovsky,M.&Bruns,P.Germline and somatic transformation of mating Tetrahymenathermophila by particle bombardment.Genetics,1997,146,135-47.

Nixon M,Chan SH.Asimple and sensitive colorimetric method for thedetermination of long-chain free fatty acids in subcellular organelles.AnalBiochem.1979Sep 1；97(2):403-409

Weide,T.；Herrmann,L.；Bockau,U.；Niebur,N.；Aldag,I.；Laroy,W.；Contreras,R.；Tiedtke,A.&Hartmann,M.W.W.:Secretion of functional human enzymes byTetrahymena thermophila.BMC Biotechnol,Vol.6,pp.19,2006

Gargouri,Y.；Pieroni,G.；Lowe,P.；Sarda,L.&Verger,R.:Human gastriclipase.The effect of amphiphiles..In:Eur J Biochem 156(1986),Nr.2,S.305-10

Jette J.F.&Ziomek E.(1994):Determination of lipase activity by arhodamine-triglyceride-agarose assay.Anal.Biochem 219,256-260

序列表

<110> 基利安股份公司

<120> 具有广泛pH活性范围的酶作为促消化药物的用途

<130> CD41343

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 867

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Lipase 10

<400> 1

atgaaattgt aattgcttct attggtttgc ttgtcatttg ctgcctgcta atcatttact 60

tatacttaat cacttgctta agacttagct ggtttctctc ttgcttctta ctgtaatcct 120

aaatctatag aacaatggaa ttgtggatgt gcttgtgata aaaaccctta aggacttcga 180

aatgttacta tcttatttaa ctctactcta taagctagtg gatatttagg ctactccact 240

catcatgatg caattgttgt tgtattcaga ggaacagtac cttggttaat cgaaaattgg 300

attgctgact taaacacctt caagacttag tacccactct gccaaaactg ttatgtccat 360

taaggctttt ataaccagtt caaataattg aaatctcagc ttgttactag ctttacttca 420

cttcgttaac tatatcctaa tgcaaaagta tttgttacag gacattctct tggtgctgca 480

atgagtgctc actcaatacc agtaatttac taattaaatg gaaataaacc tattgatgct 540

ttttacaatt atggttgtcc tagagtaggt gactaaactt atgcaaactg gtttaacagt 600

taaaattttg ccttagaata tggtagaatt aataatgctg ctgatccagt tcctcattta 660

cctcctcttc tttacccatt ttcatttttc cactacaacc atgaaatatt ctatccttct 720

tttgttcttt ttggaaacta acataactaa tgttaaaacg cggaaacaat atttggtgca 780

gatggagtaa taatagcagc taatgttcta gaccatctaa cttattttgg atgggattgg 840

tctggttcta tattaacttg ctaatga 867

<210> 2

<211> 986

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Lipase 11

<400> 2

atgaaatcaa tttttttatt aattatttcc ttgcttttag cttcttgctc atagttttaa 60

tataatgaaa cacttgccta agacttagct ggattttctc ttgcttctta ctgtaatcct 120

aaatatttat aataatggaa ttgtggctct gcttgtaaaa aaaacccaaa tggtcttaca 180

gatttctctt atttgtataa caagacttta aaggcaagtg gatatatagg ctattctgct 240

catcatgatg ctattatagt tgtctttaga ggaactgtcc cttggttgat ctaaaattgg 300

attgcagatt taaacactat caaaatttaa tatcctttct gtgaaaattg ttatgttcat 360

aaaggtttct ataaatagtt caattaatta aaatcttaac ttatttaaag ctttacagaa 420

attcgttaaa aatatccttc atcaaaaata tttgtcactg gacattctct tggtgcagct 480

atgagttttc attcaatgcc tattattttt gaattaaatg gaaataagcc tattgatgct 540

ttctataatt atggttcccc aagagttggt aacgaagcat atgcaacttg gtttaattta 600

caaaattttg ctttataata tggcagaata aataatgcag cagatcctgt tcctcattta 660

cctcctattc ttttcccttt ctaattttat catactaatc atgaaatatt ttatacttca 720

tttattgaag atggtaacaa atatgagtaa tgcttagatg cagaacacaa attatgtgca 780

aatagtaaga ttattgctgc aagcgttcgt gaccatctta gttattttgg ctggaattgg 840

gctacttcta ttttaacttg ccaatgaatt aaaaaattaa tttatcaaac aaaaacatta 900

actaaaatta tttttatctg tttaaatttg ttttaaaaca tttatatttt attttaatat 960

ttactacttt ttagaataaa atatct 986

<210> 3

<211> 1267

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Lipase 14

<400> 3

atgaacaaat tgcaagttct tttcattgca gctatagttt gcacaattgg atccactgtt 60

tatttactca ataagagctc ttcagatgtc caagagtctt aactgacttt cccctatgat 120

gaaaatttag ctgaaaattt agctggattt tctatggctt cttattgtaa agcttctaaa 180

attgaaaact ggaattgcgg tgcttcttgc aaaaaaaatc ccgaaggact ttaagatgtc 240

tacattatga aaaataaaac tatgaacgct gctggtttct tagcatattc tcctgctcat 300

gatgctatag tagttgtatt tagaggaact gtcccctggt tgatcaagaa ttggattagt 360

gacattaaca ctgtcaaaac aaaatactct agatgcgaaa aatgctatgt tcatttgggc 420

ttcttcaatg ccttcaagga attgtaagat taaattctta ctgagttccc taaacttaag 480

gccaaatatc cttattcaaa ggtaatttaa cacaaaatat acatatatct ctttataaat 540

aattcatgct atcatatgtt tttctttaga ttattgtgta tttcaaaagc atcaccttag 600

cctttaaata ttgattaagg aaatattaaa tgatttgtaa aatcaattgc aagaatataa 660

attactctaa attaaatcga cgtatgaatc gaatacccaa ctaattatag gcattaataa 720

attttggaaa attatttgtt ttctcaattt tcaatatgaa aatttagctt aacttatttg 780

gcttttaata tttattccac tttttacatc ttattcatca attatattta ttttaaactc 840

atttaaaaat aaataggttt ttgttacagg tcattccctt ggtgctgcaa tgagtactca 900

cgctgttcct gtcatttatg aactcaatgg aaataagcct atcgatgcat tctataattt 960

tggttcccct agggttggtg atgaaaatta ccactaatgg ttcgatagct aaaattttac 1020

tctttaatat ggtagaatta accacagagc tgatccagtt cctcatttac cccctaatta 1080

ctctcctttc acttttactc atattgatca tgaagttttc tattaaacat ttaagaaacc 1140

ttatacataa tgtattgaaa ctgaaagtct tgaatgtgct gatggtataa aaattccctt 1200

agatattcct gaccatcttt cttactttgg ttgggattgg gccactgaca tcttagcttg 1260

ctaatga 1267

<210> 4

<211> 288

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Lipase 10

<400> 4

Met Lys Leu Gln Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Ser Phe Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gln Ser Phe Thr Tyr Thr Gln Ser Leu Ala Gln Asp Leu Ala Gly Phe

20 25 30

Ser Leu Ala Ser Tyr Cys Asn Pro Lys Ser Ile Glu Gln Trp Asn Cys

35 40 45

Gly Cys Ala Cys Asp Lys Asn Pro Gln Gly Leu Arg Asn Val Thr Ile

50 55 60

Leu Phe Asn Ser Thr Leu Gln Ala Ser Gly Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr

65 70 75 80

His His Asp Ala Ile Val Val Val Phe Arg Gly Thr Val Pro Trp Leu

85 90 95

Ile Glu Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asn Thr Phe Lys Thr Gln Tyr Pro

100 105 110

Leu Cys Gln Asn Cys Tyr Val His Gln Gly Phe Tyr Asn Gln Phe Lys

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gln Leu Val Thr Ser Phe Thr Ser Leu Arg Gln Leu

130 135 140

Tyr Pro Asn Ala Lys Val Phe Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ala

145 150 155 160

Met Ser Ala His Ser Ile Pro Val Ile Tyr Gln Leu Asn Gly Asn Lys

165 170 175

Pro Ile Asp Ala Phe Tyr Asn Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asp Gln

180 185 190

Thr Tyr Ala Asn Trp Phe Asn Ser Gln Asn Phe Ala Leu Glu Tyr Gly

195 200 205

Arg Ile Asn Asn Ala Ala Asp Pro Val Pro His Leu Pro Pro Leu Leu

210 215 220

Tyr Pro Phe Ser Phe Phe His Tyr Asn His Glu Ile Phe Tyr Pro Ser

225 230 235 240

Phe Val Leu Phe Gly Asn Gln His Asn Gln Cys Gln Asn Ala Glu Thr

245 250 255

Ile Phe Gly Ala Asp Gly Val Ile Ile Ala Ala Asn Val Leu Asp His

260 265 270

Leu Thr Tyr Phe Gly Trp Asp Trp Ser Gly Ser Ile Leu Thr Cys Gln

275 280 285

<210> 5

<211> 288

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Lipase 11

<400> 5

Met Lys Ser Ile Phe Leu Leu Ile Ile Ser Leu Leu Leu Ala Ser Cys

1 5 10 15

Ser Gln Phe Gln Tyr Asn Glu Thr Leu Ala Gln Asp Leu Ala Gly Phe

20 25 30

Ser Leu Ala Ser Tyr Cys Asn Pro Lys Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Cys

35 40 45

Gly Ser Ala Cys Lys Lys Asn Pro Asn Gly Leu Thr Asp Phe Ser Tyr

50 55 60

Leu Tyr Asn Lys Thr Leu Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Gly Tyr Ser Ala

65 70 75 80

His His Asp Ala Ile Ile Val Val Phe Arg Gly Thr Val Pro Trp Leu

85 90 95

Ile Gln Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asn Thr Ile Lys Ile Gln Tyr Pro

100 105 110

Phe Cys Glu Asn Cys Tyr Val His Lys Gly Phe Tyr Lys Gln Phe Asn

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gln Leu Ile Gln Ser Phe Thr Glu Ile Arg Gln Lys

130 135 140

Tyr Pro Ser Ser Lys Ile Phe Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ala

145 150 155 160

Met Ser Phe His Ser Met Pro Ile Ile Phe Glu Leu Asn Gly Asn Lys

165 170 175

Pro Ile Asp Ala Phe Tyr Asn Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Glu

180 185 190

Ala Tyr Ala Thr Trp Phe Asn Leu Gln Asn Phe Ala Leu Gln Tyr Gly

195 200 205

Arg Ile Asn Asn Ala Ala Asp Pro Val Pro His Leu Pro Pro Ile Leu

210 215 220

Phe Pro Phe Gln Phe Tyr His Thr Asn His Glu Ile Phe Tyr Thr Ser

225 230 235 240

Phe Ile Glu Asp Gly Asn Lys Tyr Glu Gln Cys Leu Asp Ala Glu His

245 250 255

Lys Leu Cys Ala Asn Ser Lys Ile Ile Ala Ala Ser Val Arg Asp His

260 265 270

Leu Ser Tyr Phe Gly Trp Asn Trp Ala Thr Ser Ile Leu Thr Cys Gln

275 280 285

<210> 6

<211> 303

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Lipase 14

<400> 6

Met Asn Lys Leu Gln Val Leu Phe Ile Ala Ala Ile Val Cys Thr Ile

1 5 10 15

Gly Ser Thr Val Tyr Leu Leu Asn Lys Ser Ser Ser Asp Val Gln Glu

20 25 30

Ser Gln Leu Thr Phe Pro Tyr Asp Glu Asn Leu Ala Glu Asn Leu Ala

35 40 45

Gly Phe Ser Met Ala Ser Tyr Cys Lys Ala Ser Lys Ile Glu Asn Trp

50 55 60

Asn Cys Gly Ala Ser Cys Lys Lys Asn Pro Glu Gly Leu Gln Asp Val

65 70 75 80

Tyr Ile Met Lys Asn Lys Thr Met Asn Ala Ala Gly Phe Leu Ala Tyr

85 90 95

Ser Pro Ala His Asp Ala Ile Val Val Val Phe Arg Gly Thr Val Pro

100 105 110

Trp Leu Ile Lys Asn Trp Ile Ser Asp Ile Asn Thr Val Lys Thr Lys

115 120 125

Tyr Ser Arg Cys Glu Lys Cys Tyr Val His Leu Gly Phe Phe Asn Ala

130 135 140

Phe Lys Glu Leu Gln Asp Gln Ile Leu Thr Glu Phe Pro Lys Leu Lys

145 150 155 160

Ala Lys Tyr Pro Tyr Ser Lys Val Phe Val Thr Gly His Ser Leu Gly

165 170 175

Ala Ala Met Ser Thr His Ala Val Pro Val Ile Tyr Glu Leu Asn Gly

180 185 190

Asn Lys Pro Ile Asp Ala Phe Tyr Asn Phe Gly Ser Pro Arg Val Gly

195 200 205

Asp Glu Asn Tyr His Gln Trp Phe Asp Ser Gln Asn Phe Thr Leu Gln

210 215 220

Tyr Gly Arg Ile Asn His Arg Ala Asp Pro Val Pro His Leu Pro Pro

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Pro Phe Thr Phe Thr His Ile Asp His Glu Val Phe Tyr

245 250 255

Gln Thr Phe Lys Lys Pro Tyr Thr Gln Cys Ile Glu Thr Glu Ser Leu

260 265 270

Glu Cys Ala Asp Gly Ile Lys Ile Pro Leu Asp Ile Pro Asp His Leu

275 280 285

Ser Tyr Phe Gly Trp Asp Trp Ala Thr Asp Ile Leu Ala Cys Gln

290 295 300

Claims

1.两种或更多种脂肪酶的组合在制备用于治疗脂质消化缺陷的药物中的用途，其中至少一种脂肪酶在酸性pH值下具有最适pH，而至少一种其它脂肪酶在碱性pH值下具有最适pH，所述在酸性pH值下具有最适pH的至少一种脂肪酶由选自SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6的氨基酸序列组成，并且其中所述在酸性pH值下具有最适pH的至少一种脂肪酶是由纤毛虫目的生物体编码、表达和/或产生的脂肪酶；所述在碱性pH值下具有最适pH的至少一种其它脂肪酶由SEQ ID No. 5的氨基酸序列组成，并且其中所述在碱性pH值下具有最适pH的至少一种其它脂肪酶是由纤毛虫目的生物体编码、表达和/或产生的脂肪酶。

2.根据权利要求1的用途，其中所述脂质消化缺陷是胰腺外分泌功能不全。

3.根据权利要求1的用途，其中至少一种脂肪酶的最适pH是通过尼克松试验或滴定试验测定的。

4.根据权利要求1的用途，其中至少一种脂肪酶已经通过定点或随机突变和随后的选择进行了修饰。

5.根据权利要求1的用途，其中一种脂肪酶具有的最适pH是在哺乳动物的胃中存在的pH值，而至少一种其它脂肪酶具有的最适pH是在哺乳动物小肠下段中存在的pH值。

6.根据权利要求1-5中任一项的用途，其中一种脂肪酶具有的最适pH在pH值≥1和≤6范围内。

7.根据权利要求1-5中任一项的用途，其中一种脂肪酶具有的最适pH在pH值≥8和≤11范围内。

8.一种生产根据权利要求1-7中任一项所述的两种或更多种脂肪酶的组合的方法，其中所述方法包括以下步骤：a) 在一个或多个合适的生产系统中表达所述两种或更多种脂肪酶，以及b) 纯化在步骤a)中表达的所述两种或更多种脂肪酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其中至少一种脂肪酶是通过在纤毛虫目的生物体中同源表达产生的。

10.根据权利要求8或9的方法，其中至少一种脂肪酶是通过过表达产生的，或通过同源过表达产生的。

11.两种或更多种核酸分子的组合，其中一种核酸分子编码选自SEQ ID No. 4或SEQID No. 6的氨基酸序列；且一种其他核酸分子编码SEQ ID No. 5的氨基酸序列。

12.药物制剂，其包含两种或更多种脂肪酶的组合，其中至少一种脂肪酶具有的最适pH在pH值≥1和≤6范围内，且其中至少一种其他的脂肪酶具有的最适pH在pH值≥8和≤11范围内，所述具有的最适pH在pH值≥1和≤6范围内的至少一种脂肪酶由选自SEQ ID No. 4或SEQ ID No. 6的氨基酸序列组成，并且其中所述具有的最适pH在pH值≥1和≤6范围内的至少一种脂肪酶是由纤毛虫目的生物体编码、表达和/或产生的脂肪酶；所述具有的最适pH在pH值≥8和≤11范围内的至少一种其他的脂肪酶由SEQ ID No. 5的氨基酸序列组成，并且其中所述具有的最适pH在pH值≥8和≤11范围内的至少一种其他的脂肪酶是由纤毛虫目的生物体编码、表达和/或产生的脂肪酶。