RU2721708C2

RU2721708C2 - ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ, АКТИВНЫХ В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ ЗНАЧЕНИЙ pH, В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПИЩЕВАРЕНИЯ

Info

Publication number: RU2721708C2
Application number: RU2017129598A
Authority: RU
Inventors: Маркус Вольф Вильям ХАРТМАНН; Инго АЛЬДАГ
Original assignee: Цилиан Аг
Priority date: 2015-01-22
Filing date: 2016-01-22
Publication date: 2020-05-21
Also published as: KR102601352B1; AU2016208474B9; BR112017015782A2; MX2017009419A; CA2992918A1; KR20170105104A; CN107872978B; JP7075758B2; IL253618A0; RU2017129598A3; AU2016208474A1; US10590402B2; RU2017129598A; JP2018504118A; IL253618B; US20200071683A1; EP3247385A1; CN107872978A; US20180073001A1; US11584920B2

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описана комбинация двух или более ферментов липазы, предназначенная для применения в лечении недостаточности переваривания липидов и/или дисфункции поджелудочной железы, отличающаяся тем, что по меньшей мере один фермент липазы имеет рН-оптимум при кислотном значении рН, тогда как по меньшей мере один другой фермент липазы имеет рН-оптимум при щелочном значении рН. Также представлена фармацевтическая композиция, содержащая описанную композицию. Раскрыт способ получения описанной композиции. Изобретение способствует липолизу по всему желудочно-кишечному тракту. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к лекарственному средству, содержащему гомологичные экспрессированные ферменты из инфузорий для лечения нарушений пищеварения.

Нарушения пищеварения играют все большую роль в общей медицинской и внутренней медицинской практике. Такие нарушения пищеварения во многих случаях являются следствием более или менее выраженного дефицита так называемых панкреатических ферментов. В здоровом состоянии эти ферменты синтезируются в поджелудочной железе высокоспециализированными клетками, так называемыми ациновыми клетками, и секретируются путем экзоцитоза через соковые железы и основной проток поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку. Ежедневное количество секреции поджелудочной железы составляет примерно 2 литра. В дополнение к переваривающей жиры липазе панкреатическая секреция также содержит ферменты для переваривания белков (трипсин, химотрипсин и карбоксипептидазы) и углеводов (α-амилаза). Секреция панкреатических ферментов строго контролируется эндогенными механизмами контроля с помощью гормонов, таких как гастрин, секретин и панкреозимин. Эта система контроля может быть нарушена множеством причин, которые приводят к уменьшению панкреатической секреции или к полному прекращению экзокринной функции поджелудочной железы. Это, в свою очередь, приводит к тому, что химус не переваривается в тонком кишечнике, и возникает нарушение пищеварения. Это заболевание пищеварительного тракта, которое также называется экзокринной недостаточностью поджелудочной железы (EPI), может иметь разные причины. Помимо диспепсии, вызываемой лекарственными средствами, этиологическими факторами недостаточности поджелудочной железы являются хронический атрофический гастрит и хронический панкреатит, часто вызываемый употреблением алкоголя, нарушения в результате хирургического вмешательства (например, ваготомия по Бильрот I и II, резекция поджелудочной железы) и кистозный фиброз. Во всяком случае, хронические нарушения пищеварения имеют значительное социально-медицинское и, следовательно, экономическое значение, поскольку симптомы часто приводят к тому, что пациенты имеют неопределенный вид и более короткую предполагаемую продолжительность жизни.

Панкреатогенные нарушения пищеварения и особенно EPI вызывают много жалоб со стороны пациентов, такие как диарея, обильный стул, ощущения переполнения, жалобы на боль в верхней части живота, потерю веса etc.

Независимо от причин и проявлений панкреатогенных нарушений пищеварения или EPI, чтобы избежать заболеваемости и смертности, связанных с недоеданием, сразу же при диагностировании EPI необходимо начать заместительную терапию ферментами. Это означает, что недостающие ферменты, преимущественно липаза, протеаза и амилаза, но также и другие ферменты, необходимо вводить извне. При лечении пациенты принимают ферменты перорально в основном во время еды, ферменты проходят через желудок и поступают в тонкую кишку, где осуществляют переваривание химуса и, таким образом, принимают функцию отсутствующих эндогенных панкреатических ферментов. Используемые препараты должны содержать достаточное количество ферментов. Кроме того, ферменты должны быть представлены в энтеросолюбильной композиции, иметь небольшой размер частиц и полностью биодоступны в пищеварительном тракте.

Для лечения нарушений пищеварения, основанных на отсутствии панкреатических ферментов, часто применяют заместительную терапию панкреатическими ферментами (PERT), основанную на замещении/замене лидирующего фермента липазы и протеазы. Для PERT на рынке уже существует широкий спектр ферментных препаратов. Они частично основаны на панкреатических ферментах от свиней, таких как препараты Combizym^®, Festal^®, Pankreon^®, Kreon^®, Panzytrat^®, Meteozym^® или Enzym-Lefax N^®, содержащие панкреатические ферменты, так называемые панкреатические ферментные продукты, или PEP, в основном получаемые от свиней после убоя, например, поджелудочной железы свиней. Конечным продуктом процесса приготовления является панкреатин. PEP состоят из свиной липазы, амилазы и протеазы и используются у пациентов с EPI, вторичной по отношению к кистозному фиброзу, хроническому панкреатиту и панкреатэктомии. В 1938 году PEP были освобождены от действия Закона о пищевых продуктах, лекарственных средствах и косметических средствах 1938 года (Food, Drug, and Cosmetic Act of 1938) и никогда не проходили формальный процесс приемки Управлением по контролю продуктов питания и лекарственных средств (Food and Drug Administration (FDA)) (Giuliano CA1, Dehoorne-Smith ML, Kale-Pradhan PB (2011) Pancreatic enzyme products: digesting the changes. Ann Pharmacother. 45(5): 658-66. Ann Pharmacother. 45 (5): 658-66).

Пациентам, страдающим нарушениями пищеварения, у которых аллергия на свиной белок, нельзя принимать панкреатические ферментные продукты (PEP) свиного происхождения. Кроме того, свиньи считаются естественным резервуаром вирусов гриппа, патогенных для человека, и огромным количеством вирусов свиного происхождения, поэтому нельзя исключать заражение панкреатина такими вирусами. Другими словами, в панкреатической ткани, которая будет представлять отходы убоя, без дополнительной обработки может проявиться высокая степень вирусного заражения. Вследствие этого, исходя из ее естественного происхождения, панкреатическая ткань, панкреатин и PEP также могут быть заражены вирусами свиного происхождения. Следует подчеркнуть, что Международная конференция по согласованию технических требований к регистрации фармацевтических препаратов для использования человеком (Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) (ICH) устанавливает очень высокий стандарт в своем руководстве ICH Topic Q 5 A(R1) и требует в качестве наилучшей разумной гарантии отсутствие вирусов в продукте. Центр по оценке лекарств и исследованиям (Center for Drug Evaluation and Research) (CDER) FDA США уже потребовал интенсивных стратегий по снижению риска для содержащих липазу PEP, таких как креон.

Это связано с тем, что существует риск заражения PEP парвовирусом свиней и цирковирусом свиней, а также значительным количеством вирусов свиней, которые являются известными человеческими патогенами.

К сожалению, ни один из производителей до сих пор не нашел никакого способа вирусной инактивации, который может успешно продемонстрировать приемлемое очищение PEP от вирусов без деградации или уменьшения панкреатических ферментов, в частности липазы, до недопустимых уровней. Из-за дополнительных ограничений, связанных с аналитическим тестированием такого сложного биологического материала, как панкреатин, трудно определить, какие деградирующие вещества можно вводить в продукт как результат каких-либо дополнительных этапов очищения от вирусов. В заключение, этапы способа, которые могут быть эффективными против вирусов, имеют большой потенциал по изменению природы PEP, что может потенциально серьезно повлиять на качество, безопасность и эффективность лекарственного средства. Однако, поскольку на рынке липаз практически нет альтернативных вариантов панкреатическим ферментным продуктам (PEP), они по-прежнему остаются единственными разрешенными лекарственными композициями для лечения EPI.

Кроме того, для конкретных групп пациентов недостатком применения PEP является происхождение от свиньи. Обычно используется поджелудочная железа свиней, которую не могут принять пациенты иудейской или исламской религии из-за религиозных предписаний. Кроме того, панкреатин является гомогенатом из клеток панкреатической тканей (обычно от свиней). Из-за разрушения большого количества ациновых клеток он содержит в дополнение к панкреатическим ферментам широкий спектр других ферментов и белков, а также другие соединения с высокой и низкой молекулярной массой. Состав панкреатина обусловлен промышленным процессом его приготовления. Для получения панкреатина поджелудочную железу свиней подвергают глубокой заморозке как можно быстрее после убоя, собирают и разбивают механическим способом. Для стабилизации и активации ферментов к гомогенату добавляют различные добавки. Затем следует обезжиривание органическими растворителями, такими как ацетон, удаление волокнистых веществ, обезвоживание и сушка лиофилизацией. Учитывая проблемы, связанные с работой с органическими растворителями и их стоимостью, таким образом, остается потребность в способе получения ферментов, в котором сводится к минимуму использование органических растворителей или работа осуществляется без органических растворителей. Для приготовления конкретных лекарственных форм с помощью дальнейшей галеновой обработки можно получать в результате микрогранулы, таблетки, капсулы, пасты, кремы, гели, масла или другие составы. Часто PEP на основе панкреатина смешивают с различными материалами-основами и веществами-буферами. Кроме того, гранулированный панкреатин покрывают кислотостойкими пленками или лаками для защиты от действия желудочного сока человека с низким значением pH. Два последних этапа обработки заключаются в том, чтобы обеспечивалась возможность выполнения кислотно-лабильными PEP своей пищеварительной функции на целевом участке, двенадцатиперстной кишке (тонком кишечнике), но не допускалась активация ферментов в кислотном верхнем отделе двенадцатиперстной кишки у многих пациентов с панкреатитом.

Zenpep^® - новый продукт PEP, содержащий липазу. Zenpep^® - это комбинация липаз, протеаз и амилаз свиного происхождения, взятые от свиней для убоя, предписанный для лечения EPI в результате кистозного фиброза или других состояний. В отличие от распространенных на рынке PEP для EPI, Zenpep^® не демонстрирует большой изменчивости количества ферментов, включенных в каждую капсулу. Изменчивость обычных PEP объясняется частично практикой производителя переполнять капсулы с учетом деградации ферментов, которая возникает в течение гарантийного срока хранения продукта. Изменчивость содержания фермента в продукте может приводить к несоответствующим терапевтическим эффектам либо за счет слишком большого, либо слишком малого количества необходимых ферментов, что может привести к неоптимальному лечению EPI у пациента. Кроме того, переполненные продукты могут увеличить риск фиброзной колонопатии, что связано в некоторых сообщениях с длительным воздействием PERT с высокой дозой. При применении Zenpep^® эти проблемы можно избежать. Однако Zenpep^® содержит такую же свиную панкреатическую липазу, как обычные PEP. В результате свиная панкреатическая липаза в Zenpep^® становится эффективной только в присутствии свиной колифазы в двенадцатиперстной кишке. Таким образом, Zenpep^® также представляет собой почти неочищенную белковую смесь от свиней для убоя, поскольку очищение в процессе производства привело бы к потенциальной потере колипазы. Кроме того, Zenpep^® также может иметь вирусное заражение и, как результат необходимых этапов осаждения и обезжиривания, остаточные органические растворители, как описано в отношении обычных PEP. Вследствие этого, как и для обычных PEP для PERT, свиная панкреатическая липаза в этой композиции может быть заражена вирусами и/или органическими растворителями.

Чтобы избежать использования панкреатической ткани свиньи в качестве источника липазы и протеазы, некоторые исследователи предложили использовать ферменты из рыбы или других морских животных, в основном, описанные в патенте FR №1015566, а также композиции ферментов из желудочно-кишечного тракта криля (ракообразные из класса Euphausiaceae) и рыбы мойвы (патент США №4695457). Однако с этими природными ресурсами трудно работать и их трудно обрабатывать для получения характеризуемых ферментных препаратов в промышленном масштабе, и, следовательно, ферментный препарат, содержащий липазы из этих источников, никогда не достигал рынка.

В связи с проблемами загрязнения вирусами и органическими растворителями, свойственными обычному ферментному препарату из панкреатической ткани свиньи, в качестве альтернативы свиным PEP было предложено использовать ферменты, получаемые из микробов. Например, в патенте США №6051220 описаны композиции, содержащие одну или несколько кислотоустойчивых липаз и одну или несколько кислотоустойчивых амилаз, и то, и другое предпочтительно грибкового происхождения. В заявке на патент США 2004/0057944 описаны композиции, содержащие липазу Rhizopus delemar, протеазу Aspergillus melleus и амилазу Aspergillus oryzae.

Отчасти некоторые ферментные препараты, следовательно, также содержат микробные ферменты из экстрактов плесени, такие как Nortase^® и Combizym^®. Несмотря на их устойчивость к кислоте и хотя они не зависят от колипазы, их клиническая эффективность низкая из-за быстрой внутрипросветной инактивации желчными солями и протеазами.

Разрабатываемый рекомбинантный ферментный препарат, который содержит устойчивую к желчным солям липазу, представляет собой препарат под торговой маркой Kiobrina, который является рекомбинантной, стимулированной желчными солями липазой человека, (rhBSSL). Этот rhBSSL должен улучшать переваривание пищи и абсорбцию незаменимых жирных кислот, таких как длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты, а также холестериновые эфиры в кишечнике человека. rhBSSL экспрессируется и продуцируется в клетках млекопитающих и разрабатывается компанией Sobi для ферментной терапии с целью улучшения роста и развития недоношенных детей, получающих пастеризованное грудное молоко и/или детскую смесь. Основной причиной замещения rhBSSL в пастеризованном грудном молоке или детской смеси является восстановление уровня активности природной липазы, который либо теряется при пастеризации, либо полностью отсутствует в детской смеси. Недостатком является то, что фермент активен только в присутствии первичных желчных солей, которые часто нерастворимы и, таким образом, недоступны в двенадцатиперстной кишке, особенно при условии экзокринной недостаточности поджелудочной железы. Кроме того, разрабатывающая компания Sobi объявила, что клинические данные показывают, что rBSSL не отвечала своей главной цели и, таким образом, rhBSSL не выполняет своей функции в отношении ферментной заместительной терапии в желудочно-кишечном тракте человека.

Другой рекомбинантной липазой для лечения экзокринной недостаточности поджелудочной железы является кристаллизованная очищенная сшитая липаза Pseudomonas/Burkholderia cepacia с молекулярной массой 30 кДа, которая является частью ферментной композиции, названной ALTU-135/TheraCLEC^®/Trizytek^®/Liprotamase^®/Sollpura^® (в настоящее время под торговой маркой Sollpura^®), разработанной фирмой Anthera Pharmaceuticals, которая также описана в патенте США US 7718169.

Эта микробная липаза имеет бактериальное происхождение, которая описана в патентной заявке США 2001/0046493, ее можно получить с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Фермент секретируется в культуральной среде и требует применения сложного технологического процесса для очистки и кристаллизации, чтобы стабилизировать фермент для введения в желудочно-кишечную систему человека. После кристаллизации кристаллы липазы должны быть химически и ковалентно сшиты для достижения достаточной кислотоустойчивости. Исследования in vitro показывают, что эта модификация, называемая технологией сшитых кристаллов фермента (CLEC), повышает устойчивость липазы и что сшитая липаза нерастворима при кислотном pH, характерном для желудка. Однако было показано, что для практического применения кристаллических ферментов серьезную проблему представляют диффузионные эффекты (Alter, GM, Leussing, DL, Neurath, H. Bert L. Vallee, BL, 1977). Kinetic Properties of carpoxipeptidase В in solution and crystals. Biochemistry 16 (16): 3663-3668). Кроме того, было показано, что липазы CLEC демонстрируют существенно сниженную активность фермента на некоторых субстратах по сравнению с растворимыми ферментами (Margolin, A.L. (1995) Novel crystalline catalysts. Trends in Biotechnology 14 (7): 223-230).

Кроме того, липаза Pseudomonas/Burkholderia cepacia имеет широкий pH-оптимум от pH 4-8 с существенным снижением активности для значений pH больше 8. Однако липаза Pseudomonas/Burkholderia cepacia не активна в условиях pH, значительно превышающих значение pH 8. Следовательно, этот фермент не может поддерживать переваривание липидов в сильнощелочных условиях (больше, чем pH 8,5 или выше). Еще одна проблема в отношении липазы Pseudomonas/Burkholderia cepacia заключается в том, что фермент представляет собой белок от патогенной бактерии. Бактерии Pseudomonas/Burkholderia cepacia (пояснение: ранее известные как Pseudomonas cepacia, эти бактерии теперь известны как Burkholderia cepacia) являются важным патогеном человека, который чаще всего вызывает пневмонию у лиц, имеющих ослабленный иммунитет, с основным заболеванием легких, таким как кистозный фиброз или хроническое гранулематозное заболевание.

Пациенты с кистозным фиброзом подвержены риску приобретения хорошо известного «синдрома Burkholderia cepacia» и, как следствие так называемого «синдрома Burkholderia cepacia» являются серьезным состянием у пациентов с муковисцидозом, которые не всегда хорошо поддаются лечению.

Что касается такой инфекции Pseudomonas/Burkholderia cepacia, долговременная активная память приобретается после инфицирования активацией клеток В и Т, в то время как некоторые из их потомков становятся долгоживущими клетками памяти. На протяжении всей жизни человека эти клетки памяти как часть «адаптивной иммунной системы» помнят каждый специфический встретившийся патоген и могут создать сильный ответ, если патоген обнаруживается снова.

В условиях перорального лечения с помощью липазы Pseudomonas/Burkholderia cepacia пероральный прием ферментов от Pseudomonas/Burkholderia cepacia как части ферментной заместительной терапии (в случае кистозного фиброза) представляет собой инкорпорирование экзогенных антигенов. Антигены будут обнаружены адаптивной иммунной системой в качестве патогенов и вызовут: 1. активацию иммунной системы (так называемую иммунологическую память), 2. генерацию антител против ферментов и 3. риск преувеличенного иммунного ответа в слизистой оболочке кишечника, включая потенциальные аллергические и аутоиммунные реакции и сепсис.

Этот риск преувеличенного иммунного ответа в случае лечения кистозного фиброза ферментами Pseudomonas/Burkholderia cepacia будет контрпродуктивным для лечения пациентов и обострит ситуацию состояния здоровья пациентов.

Сочетание недостаточной эффективности и риска описанных выше негативных побочных эффектов уже вызвало серьезную обеспокоенность регулирующих органов. В 2011 году Консультативный комитет по желудочно-кишечным препаратам (Gastrointestinal Drugs Advisory Committee) Управления по контролю продуктов питания и лекарственных средств (FDA) Департамента здравоохранения и социальных служб США (US Department of Health and Human Services) отклонил заключение о том, что преимущества Sollpura^® (ферментного препарата с липазой Pseudomonas/Burkholderia cepacia) превосходят его риски, утверждая, что требуются дополнительные данные по эффективности, прежде чем можно будет сделать заключение, что препарат работает у пациентов лучше, чем существующие панкреатические ферментные продукты, полученные от свиньи.

Наконец, было показано, что имеется существенное доказательство того, что Sollpura^® менее эффективен, чем полученные от свиньи PEP, и, похоже, подвергает пациентов с EPI большему риску (Carome М. Wolfe S. Testimony to the FDA Gastrointestinal Drug Advisory Committee regarding liprotamase - risk: benefit assessment; ethics of further clinical trials. Washington DC: Public Citizen Research Group. January 12, 2011)

Кроме того, в патенте США №5998189 описана рекомбинантная кислотоустойчивая желудочная липаза собаки, продуцируемая в E. coli, и заявлена экспрессия кислотоустойчивой желудочной липазы собаки в Е. coli, а также в других прокариотических и эукариотических системах экспрессии. Кроме того, была продемонстрирована экспрессия и экстракция этой кислотоустойчивой желудочной липазы собак в трансгенной кукурузе Zhong, Q., GU, Gu, Z. и Glatz, С.Е. (2006). Extraction of recombinant dog gastric lipase from transgenic corn seed. J. Agric. Food Chem. 54: 8086-8092).

Однако желудочная липаза собак демонстрирует очень низкий pH-оптимум при pH 4 с очень узким профилем pH в диапазоне от pH 3 до pH 5 (Carriere, F., Moreau, Н., Raphel, V., Laugier, R., Benicourt, С., Junien, J.-L. and Verger, R., 1991) Purification and biochemical characterization of dog gastric lipase. Eur. J. Biochem. 202: 75-83)

Цель ферментного препарата, содержащего липазу, демонстрирующего самую высокую эффективность при самой низкой дозе и характеризующегося четко определенным профилем безопасности, остается очень важной для всех пациентов, страдающих панкреатической недостаточностью, в том числе среди группы лиц с кистозным фиброзом.

Цель настоящего изобретения

У большинства пациентов переваривание липидов не может полностью нормализоваться с помощью принятой в настоящее время стандартной терапии. Кроме того, получение липаз для введения человеку является процессом трудоемким и дорогостоящим. Настоящее изобретение направлено на решение этих проблем.

Краткое изложение изобретения

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения предлагается комбинация двух или более ферментов липазы, в которой по меньшей мере один фермент липазы имеет pH-оптимум при кислотном значении pH, тогда как по меньшей мере один другой фермент липазы имеет pH-оптимум при щелочном значении pH.

Одним из предпочтительных способов определения pH-оптимума является диапазон pH, в котором липаза составляет >50% от ее пиковой активности, как определено, например, с помощью теста Никсона (Nixon Test) или титриметрического теста (см. ниже). Термин «pH-оптимум» используется как синоним термина «максимальная липолитическая активность».

Термин «кислотное значение pH» означает pH между ≥ 0 и ≤ 7, тогда как термин «щелочное значение pH» означает pH между > и ≤ 14.

Используемый здесь термин «фермент липазы» относится к ферменту, который катализирует гидролиз жиров (липидов). Липазы являются подклассом эстераз и выполняют важную роль в пищеварении, транспортировке и переработке диетических липидов (например, триглицеридов, жиров, масел) у большинства, если не у всех, живых организмов. Термин «липазы» охватывает следующие подтипы: зависимая от желчных солей липаза, панкреатическая липаза, лизосомальная липаза, печеночная липаза, липопротеиновая липаза, гормон-чувствительная липопаза, желудочная липаза, эндотелиальная липаза, связанный с панкреатической липазой белок 2, связанный с панкреатической липазой белок 1 и лингвальная липаза.

Авторы, как ни удивительно, обнаружили, что комбинация этих двух или более ферментов липазы, в которой один из них имеет pH-оптимум при кислотном значении pH, тогда как по меньшей мере один другой имеет pH-оптимум при щелочном значении pH, значительно повышает эффективность липаза-заместительной терапии.

В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления липолитическая активность по меньшей мере одного фермента липазы определяется с помощью теста Никсона или титриметрического теста.

Тест Никсона описан в Nixon & Chang 1979, содержание которого включено в данный документ. Подробности этого теста описаны в другом месте данного документа. Титриметрический тест описан в United States Pharmacopeia 23, NF18 1095, рр 1150-1151 (Фармакопея США), содержание которой включено в данный документ.

Предпочтительно, по меньшей мере один фермент липазы представляет собой фермент липазы, кодируемый, экспрессируемый и/или продуцируемый организмом, принадлежащим к Типу Инфузории.

Предпочтительно, указанные инфузории относится к семейству Tetrahymenidae. Более предпочтительно, указанные инфузории относится к роду Tetrahymena. Наиболее предпочтительно, указанные инфузории относятся к Tetrahymena thermophile.

Система получения липазы на основе инфузорий обеспечивает экономичный, простой и надежный способ получения липаз, которые обладают существенно увеличенной удельной активностью по сравнению с имеющимися конкурентами и, следовательно, гораздо более сильным терапевтическим потенциалом.

Поскольку вирусы не обнаружены в Tetrahymena, в сочетании с большим эволюционным расстоянием между млекопитающими и инфузориями, безопасность продукта, как ожидается, будет намного выше, в то время как получение может протекать с большей стабильностью и меньшим риском неуспеха из-за вирусных инфекций.

Предпочтительно, по меньшей мере, один фермент липазы представляет собой фермент липазы в соответствии с пунктом 3 патентной формулы, который модифицирован путем направленного или случайного мутагенеза и последующего отбора.

В особенно предпочтительном варианте осуществления один фермент липазы имеет pH-оптимум при значении pH, который возникает в желудке млекопитающего, тогда как по меньшей мере один другой фермент липазы имеет pH-оптимум при значении pH, которое возникает в нижнем отделе тонкого кишечника млекопитающего.

Описание интраламинального pH желудочно-кишечного тракта млекопитающих, включая желудок, приводится в Fallingborg J, Dan Med Bull. 1999 Jun; 46(3): 183-96. Некоторые типичные значения для желудочно-кишечного тракта человека представлены в следующей таблице 2.

Таким образом, благодаря широкому спектру pH продукт способствует липолизу по всему желудочно-кишечному тракту.

В одном предпочтительном варианте осуществления один фермент липазы из указанной комбинации имеет pH-оптимум при значении pH в диапазоне pH ≥ 1 и ≤ 6.

В одном предпочтительном варианте осуществления один фермент липазы из указанной комбинации имеет pH-оптимум при значении pH в диапазоне pH ≥ 8 и ≤ 11.

В особенно предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере две липазы содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из

a) SEQ ID No 4-6 и/или их фракции, варианты, гомологи или производные

b) аминокислотные последовательности, имеющие идентичность последовательностей по меньшей мере 70%, предпочтительно 95% с любой из SEQ ID No 4-6

Эти последовательности относятся к трем предпочтительным липазам, представленным ниже.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения предлагается фармацевтический препарат, содержащий комбинацию двух или более ферментов липазы в соответствии с вышеприведенным описанием.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения предлагается применение комбинации двух или более ферментов липазы в соответствии с вышеприведенным описанием или фармацевтического препарата, содержащего последние, для

- лечения дефицита переваривания липидов и/или нарушения пищеварения, или

- изготовления лекарственного средства для лечения дефицита переваривания липидов и/или нарушения пищеварения.

Предпочтительно, в указанном применении нарушение пищеварения представляет собой экзокринную недостаточность поджелудочной железы (EPI). Другие нарушения пищеварения, которые можно лечить, охватывают стеаторею, целиакию или диспепсию.

EPI (экзокринная недостаточность поджелудочной железы) - это неспособность должным образом переваривать пищу из-за нехватки пищеварительных ферментов, вырабатываемых поджелудочной железой. EPI обнаруживают у людей, страдающих кистозным фиброзом и синдромом Швахмана-Даймонда (Shwachman-Diamond), вызывается она прогрессирующей потерей панкреатических клеток, которые вырабатывают пищеварительные ферменты; потеря пищеварительных ферментов приводит к мальдигестии и мальабсорбции питательных веществ в результате нормальных процессов пищеварения. Хронический панкреатит является наиболее распространенной причиной EPI у людей.

Стеаторея - это наличие избыточного жира в фекалиях. Испражнения также могут плавать из-за избытка липидов, имеют маслянистый вид и могут иметь особенно неприятный запах. Может происходить маслянистое анальное истечение или некоторое недержание фекалия. Увеличивается выделение жира, которое может измеряться путем определения уровня фекального жира. Определение того, сколько фекальных жиров составляют стеаторею, не стандартизировано.

Целиакия является состоянием, при котором глютен (белок, обнаруженный в зерновых культурах) поражает кишечник. Симптомы включают боль в животе, вздутие живота, потерю веса и усталость. Люди с целиакией должны следовать строгой диете, в которой глютен исключается. Липазы исследованы как часть лечения целиакии, и терапия при этом приводит к незначительному увеличению веса.

Расстройство желудка - это состояние, при котором пациенты страдают от вздутия живота, газов и переполнения после приема пищи с высоким содержанием жира. Эти симптомы обычно связаны с синдромом раздраженного кишечника (IBS), поэтому некоторые исследователи предполагают, что панкреатические ферменты могут помочь в лечении симптомов IBS. Однако исследования не проводились.

Предпочтительно, в указанном применении дефицит переваривания липидов представляет собой дефицит липопротеиновой липазы, что является состоянием, вызванным мутацией в гене, который кодирует липопротеиновую липазу.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения предлагается применение комбинации двух или более ферментов липазы в соответствии с вышеприведенным описанием или фармацевтического препарата, содержащего последние, для лечения кистозного фиброза.

Кистозный фиброз является наследственным заболеванием, которое заставляет организм вырабатывать аномально густую липкую слизь. У пациентов часто бывает дефицит питательных веществ, потому что слизь блокирует попадание панкреатических ферментов в кишечник. Прием липазы помогает усвоению питательных веществ, которые эти пациенты получают из пищи.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления предлагается способ получения комбинации двух или более ферментов липазы в соответствии с вышеприведенным описанием, причем этот способ включает этапы:

a) экспрессия двух или более ферментов липазы в одной или более подходящих системах получения и

b) очистка двух или более ферментов липазы, экспрессированных на этапе а).

Предпочтительно, в указанном способе по меньшей мере один фермент липазы получается путем гомологичной экспрессии в организме, принадлежащем к Типу Инфузории.

Термин «гомологичная экспрессия белка» относится к экспрессии гена или белка в организме, из которого взят этот ген или белок.

Предпочтительно, указанные инфузории относятся к семейству Tetrahymenidae. Более предпочтительно, указанные инфузории относятся к роду Tetrahymena. Наиболее предпочтительно, указанные инфузории относятся к Tetrahymena thermophile.

Поскольку вирусы не обнаружены в Tetrahymena, в сочетании с большим эволюционным расстоянием между млекопитающими и инфузориями, безопасность продукта, как ожидается, будет намного выше, в то время как получение может протекать с большей стабильностью и меньшим риском неудачи из-за вирусных инфекций.

Кроме того, система получения липазы на основе инфузорий особенно подходит для случая получения липазы из инфузорий, потому что инфузории имеют использование кодонов, которое отличается от других эукариотов, что видно из следующей таблицы:

Предпочтительно, в указанном способе по меньшей мере один фермент липазы получается путем сверхэкспрессии, предпочтительно путем гомологичной сверхэкспрессии.

Термин «гомологичная сверхэкспрессия» относится к чрезмерной экспрессии гена или белка в организме, из которого взят этот ген или белок.

Для этой цели экспрессия эндогенного гена может быть усилена внешними факторами, например, она попадает под контроль промотора, клонированного непосредственно в геном, или в соответствующую клетку или организм добавляются факторы транскрипций. В качестве альтернативы может быть предложена экспрессия копии указанного эндогенного гена, введенного в эту клетку или организм с помощью подходящей плазмиды. Примеры таких плазмид показаны на Фиг. 6А и 6В.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления изобретения предлагаются две или более молекулы нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из

a) по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID No 1-3

b) по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID No 4-6

c) по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, которая представляет собой фракцию, вариант, гомолог или производное молекул нуклеиновой кислоты из а) - b),

d) по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, которая является дополнением к любой из молекул нуклеиновой кислоты из а) - с) или способна гибридизоваться с ней в жестких условиях,

e) по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит по сравнению с любой из молекул нуклеиновой кислоты из а) - d) по меньшей мере одно молчащее нуклеотидное замещение, молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии с а) и с) - е), которая является кодом, оптимизированным для протозойного хозяина экспрессии и/или

f) по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей идентичность последовательности, по меньшей мере, 70%, предпочтительно 95% с любой из молекул нуклеиновой кислоты из а) - f).

Подробное описание

Авторами обнаружено 37 открытых рамок считывания для белков с предполагаемой липолитической активностью в геноме Tetrahymena. В ходе экспериментов три фермента были выбраны по подходящим свойствам путем скрининга экспериментов.

Tetrahymena представляет собой непатогенный одноклеточный эукариотический микроорганизм, который был определен в ряде лабораторий как хозяин экспрессии. Он обладает рядом преимуществ, которые делают его пригодным для гомологичной экспрессии белка. Tetrahymena - это широко изученный модельный организм, и за более чем 50 лет фундаментальных исследований вирусы или эндопаразиты не наблюдались. Исследования с индикаторными клеточными линиями не выявили эндогенных инфекционных агентов, таких как вирусы или микоплазма, которые могут инфицировать высших животных. Это может быть обусловлено ядерным диморфизмом, который является обычным для инфузорий. Другой причиной этого может быть необычное использование кодонов и обогащенный AT геном в инфузориях. Таким образом, авторы предполагают, что патогенные вирусы высших организмов не могут развиваться в большинстве инфузорий. Тот факт, что, как известно, инфузории не восприимчивы к вирусам, является удивительным преимуществом. Это означает, что в производственных процессах, основанных на инфузориях, развитие или рост адвентивных вирусов не происходит. Кроме того, можно выращивать инфузорий в средах без животных. Это означает, что в случае получения белков для терапевтического использования можно пропустить дорогостоящие процедуры уничтожения вируса, которые требуются в производственных процессах, где используются клеточные культуры человека и животных.

Прежде всего, вышеупомянутые заключения, относящиеся к использованию кодонов в инфузориях, также применимы и к Tetrahymena. Кроме того, для Tetrahymena доступны плазмиды с большим числом копий, содержащие источник репликации (ori) из минихромосомной рДНК. Эта минихромосомная рДНА присутствует в количестве до 9000 копий на клетку. Помимо того, что стабильная интеграция может происходить в макроядерную ДНК, в которой все гены присутствуют в 45-кратном числе копий. Высокая доза гена является идеальной предпосылкой для эффективного биосинтеза белка и, следовательно, для высокой производительности. В отличие от бактерий, инфузории рода Tetrahymena секретируют биологически белки очень эффективно в супернатант.

Установлена полупериодическая, периодическая с подпиткой и непрерывная ферментация Tetrahymena с плотностью клеток до 2×10⁷ клеток/мл и сухой массой до 80 г/л, и без проблем может быть продемонстрировано увеличение производства (укрупнение) до 1000 л. В технико-экономических исследованиях с репортерными белками уже можно было получить выход продукта за один проход в единицу времени 50-90 пг/клетку в день. Первые эксперименты с гомологичной экспрессией дали выход более 200 мг/л в день по секретируемым белкам. Tetrahymena можно ферментировать в обычных производственных установках для микробиологических систем экспрессии (бактерии или дрожжи). Это означает, что не нужно проводить дорогостоящие модификации существующих производственных установок или сооружать новые производственные объекты.

Вместе с тем, цилиатные (инфузориевые) системы имеют некоторые другие преимущества в отношении экспрессии секретируемых ферментов. Они будут рассмотрены далее.

Несмотря на указанные преимущества, цилиатные системы экспрессии все еще мало известны, и специалист в данной области, когда его спрашивают о потенциальных гетерологичных/гомологичных системах экспрессии, скорее подумает о Е. coli, дрожжах, системах клеток насекомых (бакуловирус) и клеточных линиях млекопитающих.

Способы трансформации инфузорий, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, включают, среди прочего, микроинъекцию, электропорацию и бомбардировку частицами и, например, описаны в Tondravi & Yao (1986), Gaertig & Gorovsky (1992) и Cassidy-Hanley et al (1997).

Способы трансформации и экспрессии гетерологичных белков описаны для нескольких протистов (WO 00/58483 и WO 00/46381). Генерация митотически стабильных трансформантов инфузорий Tetrahymena thermophila может быть достигнута после трансфекции либо соматического макроядра, либо генеративного микроядра путем микроинъекции, электропорации или бомбардировки частицами.

Трансформанты можно выбирать с использованием различных селективных маркеров, таких как резистентность к неомицину (Weide et al., 2006, ВМС), и интеграции гетерологичных генов путем гомологичной рекомбинации ДНК, что дает в результате стабильные тимидин-ауксотрофные клетки Tetrahymena (Weide et al. 2006, ВМС). Кроме того, было рассмотрено использование резистентности к бластициду S (Weide et al., 2007, ВМС) или паклитакселу (WO 00/46381).

Промоторы, подходящие для экспрессии липазы в инфузориях, описаны, например, в WO 2007006812 A1, который также зарегистрирован на заявителя настоящего изобретения, содержание которого должно быть включено в данный документ путем ссылки. В нем описан индуцируемый нагреванием промотор и металлотионеин-промотор, который также может быть использован для целей настоящего изобретения.

Кроме того, представлен вектор для трансфекции клетки-хозяина инфузории, причем указанный вектор содержит по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую липазу.

Как ни удивительно, комбинация липаз и протеаз Tetrahymena, именуемая в дальнейшем «препарат», может удовлетворять требованиям, предъявляемым к лечению нарушений поджелудочной железы, лучше, чем любой продукт, имеющийся на рынке или разрабатываемый в настоящее время. Во-первых, не имеющий себе равных способность к перевариванию липидов при различных pH в диапазоне значений pH от 2 до 11 позволяет препарату переваривать липиды в кислотном кишечнике, а в результате дисфункции поджелудочной железы в кислотном верхнем отделе двенадцатиперстной кишки, а также в более нейтральных до основных отделов тонкого кишечника. Во-вторых, неожиданно было обнаружено, что специфическая активность препарата была, по меньшей мере, на один порядок выше, чем удельная активность панкреатина даже в нейтральных до основных условий. Это поможет улучшить комплаентность пациента за счет уменьшения количества принимаемых таблеток в сутки. В-третьих, заранее заданная смесь ферментов противопоказана для определенных форм патологического нарушенного пищеварения.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения две или более липазы Tetrahymena охватывают физиологический диапазон pH желудочно-кишечного тракта, что позволяет осуществлению процесса липолиза от желудка до нижнего отдела тонкого кишечника. В другом предпочтительном варианте осуществления щелочная липаза Tetrahymena используется для переваривания липидов в щелочной среде двенадцатиперстной кишки.

Возможность модульной сборки активности липазы, протеазы и амилазы позволяет обеспечить применимость препарата у пациентов с разными состояниями и, следовательно, с разной потребностью в лекарственных средствах. Например, высокое содержание амилазы нежелательно для детей, больных муковисцидозом. Протеазы противопоказаны пациентам с острым панкреатитом или активными эпизодами хронического панкреатита. И, в-четвертых, препарат, в отличие от липаз из грибов, активируется желчными кислотами в физиологических концентрациях.

Определения

Используемый здесь термин «инфузория» обозначает организм, который относится к Типу Инфузории (Ciliophora), которые являются одноклеточными эукариотами («простейшие» или «протесты»), характеризующимися, среди прочего, своим относительно большим размером (некоторые виды имеют длину до 2 мм), ресничной поверхностью клеток и двумя разными ядрами, т.е. небольшим диплоидным микроядром и большим полиплоидным макроядром (используется для экспрессии белка). Последний образуется из микроядра путем амплификации генома и тяжелого редактирования.

Используемый здесь термин «кДНК» относится к молекуле ДНК, которая кодирует белок, подлежащий экспрессии, и лишена каких-либо некодирующих участков, таких как интроны. Во многих случаях кДНК непосредственно была синтезирована с матрицы мРНК с использованием обратной транскриптазы и олиго-dT-праймера. Однако этот термин также включает синтетические гены и кодирующие ДНК, полученные иным образом.

Используемый здесь термин «промотор» относится к регуляторной области ДНК, обычно расположенной в обратном направлении (к 5'-области смысловой цепи) гена или кДНК, что позволяет или даже усиливает транскрипцию гена, или кДНК.

Используемый здесь термин «фрагмент» относится к части белка, который не содержит некоторых участков или доменов нативного белка или белка дикого типа, сохраняя при этом некоторую активность в смысле ферментативной активности, иммуногенность, связывание с мишенью или тому подобное.

Используемый здесь термин «сигнальная последовательность» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует олигопептид («сигнальный пептид»), который направляет белки, синтезированные в цитозоле, к некоторым органеллам, таким как ядро, митохондриальная матрица, эндоплазматический ретикулум, хлоропласт, апопласт и пероксисома. Некоторые сигнальные пептиды отщепляются от белка сигнальной пептидазой после транспортировки белков. В более строгом смысле сигнальная последовательность или сигнальный пептид учитывает секрецию указанного белка во внешнюю среду. Этот процесс протекает через грубый эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи и последующий экзоцитоз. Во многих случаях сигнальная последовательность расположена на N-конце секретируемого белка.

Используемый здесь термин «функционально связанный» означает, что нуклеотидная последовательность, которая может кодировать генный продукт, связана с промотором, так что промотор регулирует экспрессию генного продукта в соответствующих условиях. Две нуклеотидные последовательности, которые функционально связаны, содержат элементы, необходимые для транскрипции, включая, например, ТАТА-бокс.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты» предназначен для обозначения любой одно- или двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей ДНК (кДНК и/или геномную ДНК), РНК (предпочтительно мРНК), ПНК, «закрытую» нуклеиновую кислоту (LNA) и/или морфолино.

Термин «жесткие условия» относится к условиям, при которых зонд предпочтительно гибридизуется с его целевой подпоследовательностью и намного меньше с другими последовательностями. Жесткие условия зависят от последовательности и будут разными в разных обстоятельствах. Более длинные последовательности гибридизуются специфически при более высоких температурах. Как правило, жесткие условия выбирают примерно на 5°С ниже температуры термического плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенной ионной силе и pH. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных целевой последовательности, гибридизуются с целевой последовательностью в равновесии. (Поскольку целевые последовательности обычно присутствуют в избытке, при Tm, 50% зондов заняты при равновесии). Как правило, жесткими условиями будут условия, в которых концентрация соли составляет менее примерно 1,0 М иона Na, обычно примерно 0,01-1,0 М иона Na (или других солей) при pH от 7,0 до 8,3, а температура составляет по меньшей мере примерно 30°С для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере примерно 60°С для более длинных зондов. Жесткие условия также могут быть достигнуты добавлением дестабилизирующих агентов, таких как формамид и тому подобное.

Термин «фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты» предназначен для обозначения нуклеиновой кислоты, содержащей подмножество молекулы нуклеиновой кислоты в соответствии с одной из заявленных последовательностей. То же самое применимо к термину «фракция молекулы нуклеиновой кислоты».

Термин «вариант молекулы нуклеиновой кислоты» относится в данном документе к молекуле нуклеиновой кислоты, которая по существу сходна по структуре и биологической активности с молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с одной из заявленных последовательностей.

Термин «гомолог молекулы нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, последовательность которой имеет один или несколько нуклеотидов, добавленных, удаленных, замещенных или иначе химически модифицированных, по сравнению с молекулой нуклеиновой кислоты в соответствии с одной из заявленных последовательностей, при постоянном условии, что гомолог сохраняет практически те же свойства связывания, что и последняя.

Термин «идентичность последовательности по меньшей мере Х%», как используется здесь, относится к идентичности последовательностей, определенной после выравнивания последовательностей, выполняемого с помощью семейства алгоритмов BLAST (в частности, megablast, discontiguous megablast, blastn, blastp, PSI-BLAST, PHI-BLAST, blastx, tblastn и tblastx), которые доступны в соответствующем интернет-домене, предоставленном NCBI.

Используемый здесь термин «вектор» относится к молекулярному носителю, используемому для переноса чужеродного генетического материала в другую клетку. Сам вектор, как правило, представляет собой последовательность ДНК, которая состоит из вставки (представляющей интерес ген) и более крупной последовательности, которая служит «остовом» вектора. Цель вектора переноса генетической информации в другую клетку обычно заключается в изоляции, размножении или экспрессии вставки в клетке-мишени. Векторы, называемые экспрессионными векторами (экспрессионные конструкции), специально предназначены для экспрессии трансгена в клетке-мишени и, как правило, имеют промоторную последовательность, которая стимулирует экспрессию трансгена. Более простые векторы, называемые транскрипционными векторами, могут подвергаться только транскрипции, но не трансляции: их можно реплицировать в клетку-мишень, но не экспрессировать, в отличие от экспрессионных векторов. Транскрипционные векторы используются для усиления их вставки.

Используемый здесь термин «плазмида» относится к плазмидным векторам, т.е. к последовательностям кольцевой ДНК, которые способны автоматически реплицироваться в клетке-хозяине. Плазмидные векторы содержат источник репликации («ORI»), который обеспечивает полунезависимую репликацию плазмиды в клетке-хозяине. Кроме того, плазмида может содержать сайт множественного клонирования, который включает в себя нуклеотидные выступы для введения вставки и множественные консенсусные сайты с рестрикционными ферментами с обеих сторон вставки, промотор для переноса транскрипции трансгена плазмиды, необязательно по меньшей мере один генетический маркер для подтверждения того, что плазмида интегрирована с геномной ДНК хозяина и, необязательно, репортер для идентификации, какие клетки были успешно трансфицированы.

Используемый здесь термин «клетка-хозяин» имеет два разных значения, которые могут интерпретироваться согласно соответствующему контексту. В контексте экспрессии гомологичного белка термин «клетка-хозяин» относится к клетке, которая используется в качестве хозяина экспрессии. Таким образом, указанная клетка или ее предшественник трансфицирована подходящим вектором, содержащим кДНК экспрессируемого белка.

Используемый здесь термин «клетка-хозяин инфузории» относится к клетке из типа Ciliophora (ранее: Ciliata), например простейших, которые характеризуются наличием волоскоподобных органелл, называемых ресничками, и ядерным диморфизмом.

Используемый здесь термин «инкорпорированный» относится к тому, что указанная нуклеиновая кислота проникла в клетку-хозяина таким образом, что она готова к экспрессии белка. Такое инкорпорирование может быть различных типов у инфузорий, например, «эписомальное инкорпорирование» (например, молекула нуклеиновой кислоты, как и плазмида, не проникла в клеточное ядро, но реплицируется и транслируется в цитоплазме) и «интегративное инкорпорирование» (например, молекула нуклеиновой кислоты интегрирована в клеточный геном).

Отказ от ответственности

С целью обеспечения полного раскрытия информации без излишне длинного описания заявитель настоящим включает путем ссылки каждый из патентов и заявок на патент, упомянутых выше.

Конкретные комбинации элементов и признаков в приведенных выше подробных вариантах осуществления являются только примерными; взаимозаменяемость и замена этих идей другими идеями в данном описании и патентах/заявках, включенных в данное описание путем ссылки, также специально предусматривается. Как будет понятно специалистам в данной области, изменения, модификации и другие реализации всего описанного в данном документе, могут предприняты специалистами в данной области без отклонения от заявленных сущности и объема изобретения. Соответственно, приведенное выше описание приводится только в качестве примера и не является ограничивающим. Объем изобретения определяется в следующей патентной формуле и ее эквивалентах. Кроме того, ссылочные признаки, используемые в описании и формуле изобретения, не ограничивают заявленного объема изобретения.

Краткое описание примеров и фигур

Дополнительные детали, признаки, характеристики и преимущества цели изобретения приведены в зависимых пунктах и последующем описании соответствующих фигур и примеров, которые в иллюстративной форме демонстрируют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако эти фигуры никоим образом не следует понимать как ограничивающие объем изобретения.

Примеры и фигуры

1. Конструкция векторов экспрессии

Гены для разных липаз (SEQ ID No 1, SEQ ID No 2 и SEQ ID No 3)) были клонированы в донорный вектор (см. Фиг. 6А). Кассеты экспрессии из всех донорных векторов переносили в акцепторный вектор (см. Фиг. 6В) с использованием Cre зависимой рекомбиназной системы. Последовательности приведены ниже.

2. Культивирование Tetrahymena дикого типа и трансформация экспрессионных плазмид (биолистическая бомбардировка)

Штаммы Tetrahymena thermophila В 1868/4, В 1868/7 и SB 1969 были культивированы в SPPR (2,5% протеозопептон, 1% гидролизат пептоновой кислоты, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,1% раствор сульфата железа и хелата и 0,2% глюкоза). Были использованы конъюгирующие штаммы Т. thermophila. Трансформацию клеток Т. thermophila проводили, как описано ранее в Cassidy-Hanley et al. 1997.

3. Определение липазной активности

Трансформированные клоны Tetrahymena были культивированы в среде SPPR добавлением 400 μг/мл паромомицина при 30°С в 500-мл мульти-ферментере. Экспрессию гена-мишени индуцировали добавлением 0,55 μМ Cd²⁺(МТТ1) в начале культивирования или в ранней или средней лог-фазе.

Аликвоты клеточных свободных супернатантов SPPR собирали примерно через 20-25 ч после индукции культуры. Липазную активность супернатантов определяли путем колориметрического определения высвобожденных жирных кислот, описанных Nixon & Chang (1979), или посредством титриметрии (US Pharmacopeia 23, NF18 1095, рр 1150-1151). Скринирование липолитических активных клонов проводили методом флуоресценции родамина (Jette & Ziomek, 1994).

4. Спектры pH различных липаз Tetrahymena (Фиг. 1-3)

Липолитическую активность трех различных сверхэкспрессированных липаз Tetrahymena тестировали при разных значениях pH с помощью теста Никсона. В качестве субстрата использовали диету для свиней с высоким содержанием жира из Arie Blok (Woerden, NL) с предварительной обработкой пепсином при низком pH для имитации прохождения через желудок. Липазы №10 и 14 (SEQ ID No 4 и 6 соответственно) показали активность при низких значениях pH, а липаза №11 продемонстрировала широкий спектр активности pH от нейтральных до высоких значений pH, сравнимых с панкреатином. Комбинация этих липаз может охватывать значения pH от 2 до 11. Результаты приведены на Фиг. 1-3.

5. Устойчивость в желудочном соке (Фиг. 4)

Активность pH определяли после инкубации в течение 0,5 и 3 ч в желудочном соке человека (Фиг. 4). В отличие от панкреатин-производных продуктов, липазы №10 и 14 сохраняют активность 38% и 30% соответственно даже после 3 часов инкубации в желудочном соке человека. Результаты показаны на Фиг. 4.

6. Активация желчными солями (Фиг. 5)

Липолитическую активность липазы №11 (SEQ ID No 5) тестировали в присутствии различных количеств физиологической смеси желчных кислот (Gargouri et al, 1986). Подобно липазе поджелудочной железы человека, липаза №11 активируется за счет увеличения концентрации желчных кислот. Результаты показаны на Фиг. 5.

Последовательности

SEQ ID No 1: Нуклеотид липазы 10

SEQ ID No: 4: Аминокислотная последовательность липазы 10

SEQ ID No: 2: Нуклеотид липазы 11

SEQ ID No: 5: Аминокислотная последовательность липазы 11

SEQ ID No: 3: Нуклеотидная последовательность липазы 14

SEQ ID No: 6: Аминокислотная последовательность липазы 14

Список литературы

Alter GM, Leussing DL, Neurath H, Vallee BL (1977): Kinetic properties of carboxypeptidase В in solutions and crystals. Biochemistry. Aug 9; 16(16): 3663-8.

Tondravi, MM; Yao, M-C (1986): Transformation of Tetrahymena thermophila by microinjection of ribosomal RNA genes. PNAS 83, 4369-4373.

Gaertig, J; Gorovsky, MA (1992): Efficient mass transformation of Tetrahymena thermophila by electroporation of conjugants. PNAS 89, 9196-9200.

Cassidy-Hanley, D.; Bowen, J.; Lee, J.; Cole, E.; VerPlank, L.; Gaertig, J.; Gorovsky, M. & Bruns, P. Germline and somatic transformation of mating Tetrahymena thermophila by particle bombardment. Genetics, 1997, 146, 135-47.

Nixon M, Chan SH. A simple and sensitive colorimetric method for the determination of long-chain free fatty acids in subcellular organelles. Anal Biochem. 1979 Sep 1; 97(2): 403-409

Weide, Т.; Herrmann, L.; Bockau, U.; Niebur, N.; Aldag, I.; Laroy, W; Contreras, R.; Tiedtke, A. & Hartmann, M.W.W.: Secretion of functional human enzymes by Tetrahymena thermophila. BMC Biotechnol, Vol. 6, pp. 19, 2006.

Gargouri, Y.; Pieroni, G.; Lowe, P.; Sarda, L. & Verger, R.: Human gastric lipase. The effect of amphiphiles.. In: Eur J Biochem 156 (1986), Nr. 2, S. 305-10.

Jette J.F. & Ziomek E. (1994): Determination of lipase activity by a rhodamine-triglyceride-agarose assay. Anal. Biochem 219, 256-260.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЦИЛИАН АГ

<120> Использование ферментов, активных в широком диапазоне значений pH, в качестве лекарственных средств для стимуляции пищеварения

<130> CD41343

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 867

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Липаза 10

<400> 1

atgaaattgt aattgcttct attggtttgc ttgtcatttg ctgcctgcta atcatttact 60

tatacttaat cacttgctta agacttagct ggtttctctc ttgcttctta ctgtaatcct 120

aaatctatag aacaatggaa ttgtggatgt gcttgtgata aaaaccctta aggacttcga 180

aatgttacta tcttatttaa ctctactcta taagctagtg gatatttagg ctactccact 240

catcatgatg caattgttgt tgtattcaga ggaacagtac cttggttaat cgaaaattgg 300

attgctgact taaacacctt caagacttag tacccactct gccaaaactg ttatgtccat 360

taaggctttt ataaccagtt caaataattg aaatctcagc ttgttactag ctttacttca 420

cttcgttaac tatatcctaa tgcaaaagta tttgttacag gacattctct tggtgctgca 480

atgagtgctc actcaatacc agtaatttac taattaaatg gaaataaacc tattgatgct 540

ttttacaatt atggttgtcc tagagtaggt gactaaactt atgcaaactg gtttaacagt 600

taaaattttg ccttagaata tggtagaatt aataatgctg ctgatccagt tcctcattta 660

cctcctcttc tttacccatt ttcatttttc cactacaacc atgaaatatt ctatccttct 720

tttgttcttt ttggaaacta acataactaa tgttaaaacg cggaaacaat atttggtgca 780

gatggagtaa taatagcagc taatgttcta gaccatctaa cttattttgg atgggattgg 840

tctggttcta tattaacttg ctaatga 867

<210> 2

<211> 986

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Липаза 11

<400> 2

atgaaatcaa tttttttatt aattatttcc ttgcttttag cttcttgctc atagttttaa 60

tataatgaaa cacttgccta agacttagct ggattttctc ttgcttctta ctgtaatcct 120

aaatatttat aataatggaa ttgtggctct gcttgtaaaa aaaacccaaa tggtcttaca 180

gatttctctt atttgtataa caagacttta aaggcaagtg gatatatagg ctattctgct 240

catcatgatg ctattatagt tgtctttaga ggaactgtcc cttggttgat ctaaaattgg 300

attgcagatt taaacactat caaaatttaa tatcctttct gtgaaaattg ttatgttcat 360

aaaggtttct ataaatagtt caattaatta aaatcttaac ttatttaaag ctttacagaa 420

attcgttaaa aatatccttc atcaaaaata tttgtcactg gacattctct tggtgcagct 480

atgagttttc attcaatgcc tattattttt gaattaaatg gaaataagcc tattgatgct 540

ttctataatt atggttcccc aagagttggt aacgaagcat atgcaacttg gtttaattta 600

caaaattttg ctttataata tggcagaata aataatgcag cagatcctgt tcctcattta 660

cctcctattc ttttcccttt ctaattttat catactaatc atgaaatatt ttatacttca 720

tttattgaag atggtaacaa atatgagtaa tgcttagatg cagaacacaa attatgtgca 780

aatagtaaga ttattgctgc aagcgttcgt gaccatctta gttattttgg ctggaattgg 840

gctacttcta ttttaacttg ccaatgaatt aaaaaattaa tttatcaaac aaaaacatta 900

actaaaatta tttttatctg tttaaatttg ttttaaaaca tttatatttt attttaatat 960

ttactacttt ttagaataaa atatct 986

<210> 3

<211> 1267

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Липаза 14

<400> 3

atgaacaaat tgcaagttct tttcattgca gctatagttt gcacaattgg atccactgtt 60

tatttactca ataagagctc ttcagatgtc caagagtctt aactgacttt cccctatgat 120

gaaaatttag ctgaaaattt agctggattt tctatggctt cttattgtaa agcttctaaa 180

attgaaaact ggaattgcgg tgcttcttgc aaaaaaaatc ccgaaggact ttaagatgtc 240

tacattatga aaaataaaac tatgaacgct gctggtttct tagcatattc tcctgctcat 300

gatgctatag tagttgtatt tagaggaact gtcccctggt tgatcaagaa ttggattagt 360

gacattaaca ctgtcaaaac aaaatactct agatgcgaaa aatgctatgt tcatttgggc 420

ttcttcaatg ccttcaagga attgtaagat taaattctta ctgagttccc taaacttaag 480

gccaaatatc cttattcaaa ggtaatttaa cacaaaatat acatatatct ctttataaat 540

aattcatgct atcatatgtt tttctttaga ttattgtgta tttcaaaagc atcaccttag 600

cctttaaata ttgattaagg aaatattaaa tgatttgtaa aatcaattgc aagaatataa 660

attactctaa attaaatcga cgtatgaatc gaatacccaa ctaattatag gcattaataa 720

attttggaaa attatttgtt ttctcaattt tcaatatgaa aatttagctt aacttatttg 780

gcttttaata tttattccac tttttacatc ttattcatca attatattta ttttaaactc 840

atttaaaaat aaataggttt ttgttacagg tcattccctt ggtgctgcaa tgagtactca 900

cgctgttcct gtcatttatg aactcaatgg aaataagcct atcgatgcat tctataattt 960

tggttcccct agggttggtg atgaaaatta ccactaatgg ttcgatagct aaaattttac 1020

tctttaatat ggtagaatta accacagagc tgatccagtt cctcatttac cccctaatta 1080

ctctcctttc acttttactc atattgatca tgaagttttc tattaaacat ttaagaaacc 1140

ttatacataa tgtattgaaa ctgaaagtct tgaatgtgct gatggtataa aaattccctt 1200

agatattcct gaccatcttt cttactttgg ttgggattgg gccactgaca tcttagcttg 1260

ctaatga 1267

<210> 4

<211> 288

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Липаза 10

<400> 4

Met Lys Leu Gln Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Ser Phe Ala Ala Cys

1 5 10 15

Gln Ser Phe Thr Tyr Thr Gln Ser Leu Ala Gln Asp Leu Ala Gly Phe

20 25 30

Ser Leu Ala Ser Tyr Cys Asn Pro Lys Ser Ile Glu Gln Trp Asn Cys

35 40 45

Gly Cys Ala Cys Asp Lys Asn Pro Gln Gly Leu Arg Asn Val Thr Ile

50 55 60

Leu Phe Asn Ser Thr Leu Gln Ala Ser Gly Tyr Leu Gly Tyr Ser Thr

65 70 75 80

His His Asp Ala Ile Val Val Val Phe Arg Gly Thr Val Pro Trp Leu

85 90 95

Ile Glu Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asn Thr Phe Lys Thr Gln Tyr Pro

100 105 110

Leu Cys Gln Asn Cys Tyr Val His Gln Gly Phe Tyr Asn Gln Phe Lys

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gln Leu Val Thr Ser Phe Thr Ser Leu Arg Gln Leu

130 135 140

Tyr Pro Asn Ala Lys Val Phe Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ala

145 150 155 160

Met Ser Ala His Ser Ile Pro Val Ile Tyr Gln Leu Asn Gly Asn Lys

165 170 175

Pro Ile Asp Ala Phe Tyr Asn Tyr Gly Cys Pro Arg Val Gly Asp Gln

180 185 190

Thr Tyr Ala Asn Trp Phe Asn Ser Gln Asn Phe Ala Leu Glu Tyr Gly

195 200 205

Arg Ile Asn Asn Ala Ala Asp Pro Val Pro His Leu Pro Pro Leu Leu

210 215 220

Tyr Pro Phe Ser Phe Phe His Tyr Asn His Glu Ile Phe Tyr Pro Ser

225 230 235 240

Phe Val Leu Phe Gly Asn Gln His Asn Gln Cys Gln Asn Ala Glu Thr

245 250 255

Ile Phe Gly Ala Asp Gly Val Ile Ile Ala Ala Asn Val Leu Asp His

260 265 270

Leu Thr Tyr Phe Gly Trp Asp Trp Ser Gly Ser Ile Leu Thr Cys Gln

275 280 285

<210> 5

<211> 288

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Липаза 11

<400> 5

Met Lys Ser Ile Phe Leu Leu Ile Ile Ser Leu Leu Leu Ala Ser Cys

1 5 10 15

Ser Gln Phe Gln Tyr Asn Glu Thr Leu Ala Gln Asp Leu Ala Gly Phe

20 25 30

Ser Leu Ala Ser Tyr Cys Asn Pro Lys Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Cys

35 40 45

Gly Ser Ala Cys Lys Lys Asn Pro Asn Gly Leu Thr Asp Phe Ser Tyr

50 55 60

Leu Tyr Asn Lys Thr Leu Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Gly Tyr Ser Ala

65 70 75 80

His His Asp Ala Ile Ile Val Val Phe Arg Gly Thr Val Pro Trp Leu

85 90 95

Ile Gln Asn Trp Ile Ala Asp Leu Asn Thr Ile Lys Ile Gln Tyr Pro

100 105 110

Phe Cys Glu Asn Cys Tyr Val His Lys Gly Phe Tyr Lys Gln Phe Asn

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gln Leu Ile Gln Ser Phe Thr Glu Ile Arg Gln Lys

130 135 140

Tyr Pro Ser Ser Lys Ile Phe Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ala

145 150 155 160

Met Ser Phe His Ser Met Pro Ile Ile Phe Glu Leu Asn Gly Asn Lys

165 170 175

Pro Ile Asp Ala Phe Tyr Asn Tyr Gly Ser Pro Arg Val Gly Asn Glu

180 185 190

Ala Tyr Ala Thr Trp Phe Asn Leu Gln Asn Phe Ala Leu Gln Tyr Gly

195 200 205

Arg Ile Asn Asn Ala Ala Asp Pro Val Pro His Leu Pro Pro Ile Leu

210 215 220

Phe Pro Phe Gln Phe Tyr His Thr Asn His Glu Ile Phe Tyr Thr Ser

225 230 235 240

Phe Ile Glu Asp Gly Asn Lys Tyr Glu Gln Cys Leu Asp Ala Glu His

245 250 255

Lys Leu Cys Ala Asn Ser Lys Ile Ile Ala Ala Ser Val Arg Asp His

260 265 270

Leu Ser Tyr Phe Gly Trp Asn Trp Ala Thr Ser Ile Leu Thr Cys Gln

275 280 285

<210> 6

<211> 303

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Липаза 14

<400> 6

Met Asn Lys Leu Gln Val Leu Phe Ile Ala Ala Ile Val Cys Thr Ile

1 5 10 15

Gly Ser Thr Val Tyr Leu Leu Asn Lys Ser Ser Ser Asp Val Gln Glu

20 25 30

Ser Gln Leu Thr Phe Pro Tyr Asp Glu Asn Leu Ala Glu Asn Leu Ala

35 40 45

Gly Phe Ser Met Ala Ser Tyr Cys Lys Ala Ser Lys Ile Glu Asn Trp

50 55 60

Asn Cys Gly Ala Ser Cys Lys Lys Asn Pro Glu Gly Leu Gln Asp Val

65 70 75 80

Tyr Ile Met Lys Asn Lys Thr Met Asn Ala Ala Gly Phe Leu Ala Tyr

85 90 95

Ser Pro Ala His Asp Ala Ile Val Val Val Phe Arg Gly Thr Val Pro

100 105 110

Trp Leu Ile Lys Asn Trp Ile Ser Asp Ile Asn Thr Val Lys Thr Lys

115 120 125

Tyr Ser Arg Cys Glu Lys Cys Tyr Val His Leu Gly Phe Phe Asn Ala

130 135 140

Phe Lys Glu Leu Gln Asp Gln Ile Leu Thr Glu Phe Pro Lys Leu Lys

145 150 155 160

Ala Lys Tyr Pro Tyr Ser Lys Val Phe Val Thr Gly His Ser Leu Gly

165 170 175

Ala Ala Met Ser Thr His Ala Val Pro Val Ile Tyr Glu Leu Asn Gly

180 185 190

Asn Lys Pro Ile Asp Ala Phe Tyr Asn Phe Gly Ser Pro Arg Val Gly

195 200 205

Asp Glu Asn Tyr His Gln Trp Phe Asp Ser Gln Asn Phe Thr Leu Gln

210 215 220

Tyr Gly Arg Ile Asn His Arg Ala Asp Pro Val Pro His Leu Pro Pro

225 230 235 240

Asn Tyr Ser Pro Phe Thr Phe Thr His Ile Asp His Glu Val Phe Tyr

245 250 255

Gln Thr Phe Lys Lys Pro Tyr Thr Gln Cys Ile Glu Thr Glu Ser Leu

260 265 270

Glu Cys Ala Asp Gly Ile Lys Ile Pro Leu Asp Ile Pro Asp His Leu

275 280 285

Ser Tyr Phe Gly Trp Asp Trp Ala Thr Asp Ile Leu Ala Cys Gln

290 295 300

<---

Claims

1. Комбинация двух или более ферментов липазы, предназначенная для применения в лечении недостаточности переваривания липидов и/или дисфункции поджелудочной железы, отличающаяся тем, что по меньшей мере один фермент липазы имеет рН-оптимум при кислотном значении рН, тогда как по меньшей мере один другой фермент липазы имеет рН-оптимум при щелочном значении рН.

2. Комбинация по п. 1, где дисфункция поджелудочной железы представляет собой экзокринную недостаточность поджелудочной железы.

3. Комбинация двух или более ферментов липазы по любому из пп. 1, 2, отличающаяся тем, что липолитическую активность по меньшей мере одного фермента липазы определяют с помощью теста Никсона или титриметрического теста.

4. Комбинация двух или более ферментов липазы по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что по меньшей мере один фермент липазы представляет собой фермент липазы, кодируемый, экспрессируемый и/или продуцируемый организмом инфузории.

5. Комбинация двух или более ферментов липазы по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что по меньшей мере один фермент липазы представляет собой фермент липазы по п. 3, который модифицирован путем направленного или случайного мутагенеза и последующего отбора.

6. Комбинация двух или более ферментов липазы по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что один фермент липазы имеет рН-оптимум при значении рН, которое возникает в желудке млекопитающего, тогда как по меньшей мере один другой фермент липазы имеет рН-оптимум при значении рН, которое возникает в нижнем отделе тонкого кишечника млекопитающего.

7. Комбинация двух или более ферментов липазы по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что один фермент липазы имеет рН-оптимум при значении рН в диапазоне рН≥1 и ≤6.

8. Комбинация двух или более ферментов липазы по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что один фермент липазы имеет рН-оптимум при значении рН в диапазоне рН≥8 и ≤11.

9. Комбинация двух или более ферментов липазы по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что по меньшей мере две липазы содержат аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из

a) SEQ ID No 4-6 или

b) аминокислотные последовательности, имеющие идентичность последовательности по меньшей мере 70% с любой из SEQ ID No 4-6.

10. Комбинация по п. 9, отличающаяся тем, что аминокислотные последовательности имеют идентичность последовательности по меньшей мере 95% с любой из SEQ ID No 4-6.

11. Фармацевтический препарат для лечения недостаточности переваривания липидов и/или дисфункции поджелудочной железы, содержащий комбинацию двух или более ферментов липазы по любому из пп. 1-10.

12. Фармацевтический препарат по п. 11, отличающийся тем, что один фермент липазы имеет рН-оптимум при значении рН в диапазоне рН≥1 и ≤6.

13. Способ получения комбинации двух или более ферментов липазы по любому из пп. 1-10, который включает этапы

a) экспрессии двух или более ферментов липазы в одной или более системах получения, содержащих организм типа инфузории, и

b) очистки двух или более ферментов липазы, экспрессированных на этапе а).

14. Способ по п. 13, в котором по меньшей мере один фермент липазы получается путем гомологичной экспрессии в организме Tetrahymena.

15. Способ по любому из пп. 13, 14, в котором по меньшей мере один фермент липазы получается путем сверхэкспрессии.

16. Способ по п. 15, в котором сверхэкспрессия представляет собой гомологичную сверхэкспрессию.

17. Способ получения фармацевтического препарата по любому из пп. 11, 12, который включает этапы

18. Способ по п. 17, в котором по меньшей мере один фермент липазы получается путем гомологичной экспрессии в организме Tetrahymena.

19. Способ по любому из пп. 17, 18, в котором по меньшей мере один фермент липазы получается путем сверхэкспрессии.

20. Способ по п. 19, в котором сверхэкспрессия представляет собой гомологичную сверхэкспрессию.