JP2018504118A - 活性pH範囲が広い酵素の消化促進用薬物としての使用 - Google Patents
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Abstract
Description
a)配列番号4〜6、および/またはそれらの一部、変異体、相同体、もしくは誘導体
b)配列番号4〜6のいずれかと少なくとも70%、好ましくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
・脂質消化不全および/または消化器疾患の治療のための、または
・脂質消化不全および/または消化器疾患の治療のための医薬品を製造するための、前述した2種以上のリパーゼ酵素の組み合わせの使用、または後者を含む医薬調製物の使用を提供する。
a)1つ以上の好適な産生系において2種以上のリパーゼ酵素を発現させる工程、および
b)工程(a)で発現した2種以上のリパーゼ酵素を精製する工程、
を含む製造方法を提供する。
a)配列番号1〜3に示すヌクレオチド配列を含む、少なくとも1つの核酸分子、
b)配列番号4〜6に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、少なくとも1つの核酸分子、
c)a)〜b)の核酸分子の一部、変異体、相同体または誘導体である、少なくとも1つの核酸分子、
d)a)〜c)いずれかの核酸分子の相補体であるか、またはストリンジェントな条件下でこれらとハイブリダイズすることができる、少なくとも1つの核酸分子、
e)a)〜d)いずれかの核酸分子と比較して、少なくとも1つのサイレントな一塩基置換を含んでいる、少なくとも1つの核酸分子;原生動物発現宿主での発現用にコード最適化されたa)およびc)〜e)の少なくとも1つの核酸分子、および/または、
f)a)〜f)の核酸分子のいずれかと、少なくとも70%、好ましくは95%の配列同一性を有する、少なくとも1つの核酸分子、
からなる群より選択される、2つ以上の核酸分子を提供する。
さらなる説明
定義
免責条項
実施例および図面
1.発現ベクターの構築
種々のリパーゼ(配列番号1、配列番号2および配列番号3)の遺伝子をドナーベクターにクローニングした(図7参照)。すべてのドナーベクター由来の発現カセットをCre依存性リコンビナーゼ系を用いてアクセプターベクター(図8参照)に移した。配列は以下に示す。
テトラヒメナ・サーモフィル(Tetrahymena thermophila)B1868/4、B1868/7およびSB1969株を、SPPR(2.5% プロテオースペプトン、1% ペプトン酸加水分解物、0.5% 酵母抽出物、0.1% 硫酸第一鉄キレート溶液および0.2% グルコース)中で培養した。本発明者らは、T.サーモフィラ株を接合することを利用した。T.サーモフィラ細胞の形質転換は、カシディ・ヘンリー(Cassidy−Hanley)ら(1997)に既に記載のあるとおりに実施した。
形質転換したテトラヒメナのクローンを、500mlのマルチフェルメンター(Multifermenter)に400μg/mlのパロモマイシンを添加したSPPR培地を入れたものを使い、30℃で培養した。標的遺伝子発現は、培養開始時または、培養に初期もしくは途中の対数増殖期に0.55μMのCd2+(MTT1)を添加することで誘導した。
過剰発現させた3つの異なるテトラヒメナリパーゼの脂肪分解活性を、ニクソン試験により、様々なpH値で試験した。基質としては、胃の通過をシミュレートするために、ペプシンを使い、低pH値で予め消化したておいた、アリエブロック社(Arie Blok)(ウールデン、オランダ)の高脂肪ブタ食餌を使用した。リパーゼの10と14(それぞれ配列番号4および6)は低pH値で活性を示したが、リパーゼ11は、パンクレアチンに匹敵する、中性から高いpH値までの広いpH活性スペクトルを示した。これらのリパーゼを組み合わせることで、2〜11のpH値をカバーすることができる。結果を図1〜3に示した。
ヒト胃液中で0.5時間および3時間インキュベートした後、pH活性を測定した(図4)。パンクレアチン由来の製品とは対照的に、リパーゼ10および14は、ヒト胃液中で3時間インキュベーションした後でさえ、それぞれ38%および30%の活性を保持する。結果を図4に示す。
種々の量の胆汁酸の生理学的混合物の存在下でリパーゼ11(配列番号5)の脂肪分解活性を試験した(ガルゴウリ(Gargouri)ら、1986)。ヒト膵リパーゼと同様に、リパーゼ11は、高濃度の胆汁酸によって活性化される。結果を図5に示す。
配列番号1:リパーゼ10のヌクレオチド
1 atgaaattgt aattgcttct attggtttgc ttgtcatttg ctgcctgcta atcatttact
61 tatacttaat cacttgctta agacttagct ggtttctctc ttgcttctta ctgtaatcct
121 aaatctatag aacaatggaa ttgtggatgt gcttgtgata aaaaccctta aggacttcga
181 aatgttacta tcttatttaa ctctactcta taagctagtg gatatttagg ctactccact
241 catcatgatg caattgttgt tgtattcaga ggaacagtac cttggttaat cgaaaattgg
301 attgctgact taaacacctt caagacttag tacccactct gccaaaactg ttatgtccat
361 taaggctttt ataaccagtt caaataattg aaatctcagc ttgttactag ctttacttca
421 cttcgttaac tatatcctaa tgcaaaagta tttgttacag gacattctct tggtgctgca
481 atgagtgctc actcaatacc agtaatttac taattaaatg gaaataaacc tattgatgct
541 ttttacaatt atggttgtcc tagagtaggt gactaaactt atgcaaactg gtttaacagt
601 taaaattttg ccttagaata tggtagaatt aataatgctg ctgatccagt tcctcattta
661 cctcctcttc tttacccatt ttcatttttc cactacaacc atgaaatatt ctatccttct
721 tttgttcttt ttggaaacta acataactaa tgttaaaacg cggaaacaat atttggtgca
781 gatggagtaa taatagcagc taatgttcta gaccatctaa cttattttgg atgggattgg
841 tctggttcta tattaacttg ctaatga
配列番号4:リパーゼ10のアミノ酸配列
MKLQLLLLVCLSFAACQSFTYTQSLAQDLAGFSLASYCNPKSIE
QWNCGCACDKNPQGLRNVTILFNSTLQASGYLGYSTHHDAIVVVFRGTVPWLIENWIA
DLNTFKTQYPLCQNCYVHQGFYNQFKQLKSQLVTSFTSLRQLYPNAKVFVTGHSLGAA
MSAHSIPVIYQLNGNKPIDAFYNYGCPRVGDQTYANWFNSQNFALEYGRINNAADPVP
HLPPLLYPFSFFHYNHEIFYPSFVLFGNQHNQCQNAETIFGADGVIIAANVLDHLTYF
GWDWSGSILTCQ
配列番号2:リパーゼ11のヌクレオチド
1 atgaaatcaa tttttttatt aattatttcc ttgcttttag cttcttgctc atagttttaa
61 tataatgaaa cacttgccta agacttagct ggattttctc ttgcttctta ctgtaatcct
121 aaatatttat aataatggaa ttgtggctct gcttgtaaaa aaaacccaaa tggtcttaca
181 gatttctctt atttgtataa caagacttta aaggcaagtg gatatatagg ctattctgct
241 catcatgatg ctattatagt tgtctttaga ggaactgtcc cttggttgat ctaaaattgg
301 attgcagatt taaacactat caaaatttaa tatcctttct gtgaaaattg ttatgttcat
361 aaaggtttct ataaatagtt caattaatta aaatcttaac ttatttaaag ctttacagaa
421 attcgttaaa aatatccttc atcaaaaata tttgtcactg gacattctct tggtgcagct
481 atgagttttc attcaatgcc tattattttt gaattaaatg gaaataagcc tattgatgct
541 ttctataatt atggttcccc aagagttggt aacgaagcat atgcaacttg gtttaattta
601 caaaattttg ctttataata tggcagaata aataatgcag cagatcctgt tcctcattta
661 cctcctattc ttttcccttt ctaattttat catactaatc atgaaatatt ttatacttca
721 tttattgaag atggtaacaa atatgagtaa tgcttagatg cagaacacaa attatgtgca
781 aatagtaaga ttattgctgc aagcgttcgt gaccatctta gttattttgg ctggaattgg
841 gctacttcta ttttaacttg ccaatgaatt aaaaaattaa tttatcaaac aaaaacatta
901 actaaaatta tttttatctg tttaaatttg ttttaaaaca tttatatttt attttaatat
961 ttactacttt ttagaataaa atatct
配列番号5:リパーゼ11のアミノ酸配列
MKSIFLLIISLLLASCSQFQYNETLAQDLAGFSLASYCNPKYLQ
QWNCGSACKKNPNGLTDFSYLYNKTLKASGYIGYSAHHDAIIVVFRGTVPWLIQNWIA
DLNTIKIQYPFCENCYVHKGFYKQFNQLKSQLIQSFTEIRQKYPSSKIFVTGHSLGAA
MSFHSMPIIFELNGNKPIDAFYNYGSPRVGNEAYATWFNLQNFALQYGRINNAADPVP
HLPPILFPFQFYHTNHEIFYTSFIEDGNKYEQCLDAEHKLCANSKIIAASVRDHLSYF
GWNWATSILTCQ
配列番号3:リパーゼ14の核酸配列
1 ATGAACAAAT TGCAAGTTCT TTTCATTGCA GCTATAGTTT GCACAATTGG ATCCACTGTT
61 TATTTACTCA ATAAGAGCTC TTCAGATGTC CAAGAGTCTT AACTGACTTT CCCCTATGAT
121 GAAAATTTAG CTGAAAATTT AGCTGGATTT TCTATGGCTT CTTATTGTAA AGCTTCTAAA
181 ATTGAAAACT GGAATTGCGG TGCTTCTTGC AAAAAAAATC CCGAAGGACT TTAAGATGTC
241 TACATTATGA AAAATAAAAC TATGAACGCT GCTGGTTTCT TAGCATATTC TCCTGCTCAT
301 GATGCTATAG TAGTTGTATT TAGAGGAACT GTCCCCTGGT TGATCAAGAA TTGGATTAGT
361 GACATTAACA CTGTCAAAAC AAAATACTCT AGATGCGAAA AATGCTATGT TCATTTGGGC
421 TTCTTCAATG CCTTCAAGGA ATTGTAAGAT TAAATTCTTA CTGAGTTCCC TAAACTTAAG
481 GCCAAATATC CTTATTCAAA GGTAATTTAA CACAAAATAT ACATATATCT CTTTATAAAT
541 AATTCATGCT ATCATATGTT TTTCTTTAGA TTATTGTGTA TTTCAAAAGC ATCACCTTAG
601 CCTTTAAATA TTGATTAAGG AAATATTAAA TGATTTGTAA AATCAATTGC AAGAATATAA
661 ATTACTCTAA ATTAAATCGA CGTATGAATC GAATACCCAA CTAATTATAG GCATTAATAA
721 ATTTTGGAAA ATTATTTGTT TTCTCAATTT TCAATATGAA AATTTAGCTT AACTTATTTG
781 GCTTTTAATA TTTATTCCAC TTTTTACATC TTATTCATCA ATTATATTTA TTTTAAACTC
841 ATTTAAAAAT AAATAGGTTT TTGTTACAGG TCATTCCCTT GGTGCTGCAA TGAGTACTCA
901 CGCTGTTCCT GTCATTTATG AACTCAATGG AAATAAGCCT ATCGATGCAT TCTATAATTT
961 TGGTTCCCCT AGGGTTGGTG ATGAAAATTA CCACTAATGG TTCGATAGCT AAAATTTTAC
1021 TCTTTAATAT GGTAGAATTA ACCACAGAGC TGATCCAGTT CCTCATTTAC CCCCTAATTA
1081 CTCTCCTTTC ACTTTTACTC ATATTGATCA TGAAGTTTTC TATTAAACAT TTAAGAAACC
1141 TTATACATAA TGTATTGAAA CTGAAAGTCT TGAATGTGCT GATGGTATAA AAATTCCCTT
1201 AGATATTCCT GACCATCTTT CTTACTTTGG TTGGGATTGG GCCACTGACA TCTTAGCTTG
1261 CTAATGA
配列番号6:リパーゼ14のアミノ酸配列
MNKLQVLFIAAIVCTIGSTVYLLNKSSSDVQESQLTFPYDENLAE
NLAGFSMASYCKASKIENWNCGASCKKNPEGLQDVYIMKNKTMNAAGFLAYSPAHDAIV
VVFRGTVPWLIKNWISDINTVKTKYSRCEKCYVHLGFFNAFKELQDQILTEFPKLKAKY
PYSKVFVTGHSLGAAMSTHAVPVIYELNGNKPIDAFYNFGSPRVGDENYHQWFDSQNFT
LQYGRINHRADPVPHLPPNYSPFTFTHIDHEVFYQTFKKPYTQCIETESLECADGIKIP
LDIPDHLSYFGWDWATDILACQ
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Claims (15)
- 2種以上のリパーゼ酵素の組み合わせであって、ここで、少なくとも1種のリパーゼ酵素の至適pHが酸性のpH値の範囲にあり、少なくとも1種の他のリパーゼ酵素の至適pHがアルカリ性のpH値の範囲にある、組み合わせ。
- 少なくとも1種のリパーゼ酵素の脂肪分解活性が、ニクソン試験または滴定試験によって決定される、請求項1に記載の2種以上のリパーゼ酵素の組み合わせ。
- 少なくとも1種のリパーゼ酵素が繊毛虫門の生物によってコードされ、発現され、および/または産生されたリパーゼ酵素である、請求項1〜2のいずれかに記載の2種以上のリパーゼ酵素の組み合わせ。
- 少なくとも1種のリパーゼ酵素が、部位特異的突然変異生成またはランダム突然変異生成および続く選択によって改変された請求項3に記載のリパーゼ酵素である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の2種以上のリパーゼ酵素の組み合せ。
- 1種のリパーゼ酵素の至適pHが哺乳動物の胃のpH値の範囲にあり、少なくとも1つの他のリパーゼ酵素の至適pHが哺乳動物の下部小腸のpH値の範囲にある、請求項1〜4のいずれか1項に記載の2種以上のリパーゼ酵素の組み合せ。
- 1種のリパーゼ酵素の至適pHが1以上6以下の範囲である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の2種以上のリパーゼ酵素の組み合せ。
- 1種のリパーゼ酵素の至適pHが8以上11以下の範囲である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の2種以上のリパーゼ酵素の組み合せ。
- 少なくとも2種のリパーゼが、
c)配列番号4〜6、および/またはそれらの一部、変異体、相同体、もしくは誘導体、
d)配列番号4〜6のいずれかと少なくとも70%、好ましくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の2種以上のリパーゼ酵素の組み合せ。 - 請求項1〜8のいずれか1項に記載の2種以上のリパーゼ酵素の組み合せを含む医薬調製物。
- ・脂質消化不全および/または消化器疾患の治療のための、または
・脂質消化不全および/または消化器疾患の治療のための医薬品を製造するための、
請求項1〜8のいずれか1項に記載の2種以上のリパーゼ酵素の組み合せの使用、または請求項9に記載の医薬調製物の使用。 - 前記消化器疾患が膵外分泌機能不全である、請求項10に記載の使用。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の2種以上のリパーゼ酵素の組み合せ、または請求項9に記載の医薬調製物の製造方法であって、
c)1つ以上の好適な産生系において2種以上のリパーゼ酵素を発現させる工程、および
d)工程(a)で発現した2種以上のリパーゼ酵素を精製する工程、
を含む、製造方法。 - 少なくとも1種のリパーゼ酵素が、繊毛虫門の生物における相同発現によって産生される、請求項12に記載の方法。
- 少なくとも1種のリパーゼ酵素が、過剰発現、好ましくは相同過剰発現によって産生される、請求項12または13のいずれかに記載の方法。
- 2つ以上の核酸分子であって、
a)配列番号1〜3に示すヌクレオチド配列を含む、少なくとも1つの核酸分子、
b)配列番号4〜6に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、少なくとも1つの核酸分子、
c)a)〜b)の核酸分子の一部、変異体、相同体または誘導体である、少なくとも1つの核酸分子、
d)a)〜c)いずれかの核酸分子の相補体であるか、またはストリンジェントな条件下でこれらとハイブリダイズすることができる、少なくとも1つの核酸分子、
e)a)〜d)いずれかの核酸分子と比較して、少なくとも1つのサイレントな一塩基置換を含んでいる、少なくとも1つの核酸分子;
f)原生動物発現宿主での発現用にコード最適化されたa)およびc)〜e)の少なくとも1つの核酸分子、および/または、
g)a)〜f)の核酸分子のいずれかと、少なくとも70%、好ましくは95%の配列同一性を有する、少なくとも1つの核酸分子、
からなる群より選択される、2つ以上の核酸分子。
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