CN110684096A

CN110684096A - 一种组合蛋白及其应用

Info

Publication number: CN110684096A
Application number: CN201911038427.XA
Authority: CN
Inventors: 杨光友; 宋宏宇; 华瑞其
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2039-10-29
Also published as: CN110684096B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种组合蛋白及其应用。本发明所述组合蛋白为包括细粒棘球绦虫EgFABP蛋白和EgA31蛋白的组合蛋白；或为细粒棘球绦虫EgFABP蛋白和EgA31蛋白的融合蛋白。本发明以细粒棘球绦虫EgFABP蛋白和EgA31蛋白作为抗细粒棘球绦虫和/或豆状带绦虫蛋白进行免疫实验，结果显示两个蛋白对犬表现出较好的免疫保护作用，并能够产生稳定的抗体，具备开发犬用带科绦虫通用疫苗的潜力。

Description

一种组合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种组合蛋白及其应用。

背景技术

细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)隶属于带科棘球属，其幼虫(细粒棘球蚴)寄生于人畜肝脏和肺等实质器官引起细粒棘球蚴病(echinococcosis)(又称囊性包虫病cystic echinococcosis，CE)，该病呈世界性分布，严重危害人畜健康，同时造成全球严重的经济损失，带来许多公共卫生问题。我国是该病的高发国家之一，流行区域达368个县。包虫病为我国二类动物疫病，是我国优先防治和重点防范的16种动物疫病之一。

豆状带绦虫(Taenia pisiformis)的中绦期幼虫为豆状囊尾蚴(Cysticercuspisiformis)，寄生于兔体内引起豆状囊尾蚴病。本病呈世界性分布，在我国流行于四川、重庆、山东等23个省区。豆状囊尾蚴在肝脏移行过程中，可引起肝组织的损伤、出血和增生等病变，对肝脏造成严重损伤，除直接造成兔死亡外，还可引起兔生产性能下降和抗病力低下，从而引发其它疾病的发生，造成兔养殖业的利润降低。

犬是细粒棘球绦虫和豆状带绦虫的终末宿主和传染源。目前采用的防控措施是“犬犬驱虫，月月驱虫”。由于长期使用化学药物，出现了耐药性、药物残留、环境污染等一系列问题。而疫苗具有安全、无残留、动物无休药期的优点，免疫终末宿主是防控该病的重要措施之一。在我国农牧区，犬的总数量远小于家畜数量，因此对犬进行疫苗预防更经济且更利于实施。目前，尚未有高效且商业化的细粒棘球绦虫及带科绦虫通用疫苗，因此筛选高效的疫苗抗原是今后重点研究方向之一。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种组合蛋白，使其对犬表现出较好的免疫保护作用，并能够产生稳定的抗体，可作为一种同时针对细粒棘球绦虫和豆状带绦虫的通用候选疫苗；

本发明的另外一个目的在于提供上述组合蛋白或其编码序列在制备预防细粒棘球绦虫和/或豆状带绦虫的疫苗中的应用；

本发明的另外一个目的在于提供利用上述组合蛋白制备的预防细粒棘球绦虫和/或豆状带绦虫的疫苗。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种组合蛋白，其为包括细粒棘球绦虫EgFABP蛋白和EgA31蛋白的组合蛋白；或为细粒棘球绦虫EgFABP蛋白和EgA31蛋白的融合蛋白。

在本发明具体实施方式中，将EgFABP和EgA31片段以酶切位点为连接臂融合形成EgFABP-EgA31基因，全长984bp，编码325个氨基酸，原核表达获得的重组rEgFABP-EgA31融合蛋白；其中，所述细粒棘球绦虫的EgFABP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述细粒棘球绦虫的EgA31蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述融合蛋白中的连接臂为酶切位点，在具体实施方式中，本发明根据所选载体质粒以EcoRⅠ酶切位点(GAATTC)为连接臂。

以所述融合蛋白辅以免疫佐剂免疫土种犬或比格犬，每只犬肌肉注射200μg蛋白免疫复合物，一共免疫2次，每次间隔两周，二免后攻虫，28天后剖检犬进行虫体计数和虫体长宽度测量。在犬的豆状带绦虫和细粒棘球绦虫免疫保护组中，rEgFABP-EgA31组的减虫率分别达65.38％和67.00％，且免疫组的虫体长度和宽度均小于对照组，结果表明rEgFABP-EgA31对犬的豆状带绦虫和细粒棘球绦虫有较好的免疫保护作用。

基于此，本发明提供了所述组合蛋白或其编码序列在制备预防细粒棘球绦虫和/或豆状带绦虫的疫苗中的应用。

同时，根据应用和本发明具体试验结果，还提供了一种预防细粒棘球绦虫和/或豆状带绦虫的疫苗，包括本发明所述组合蛋白和免疫佐剂。

在本发明具体实施方式中，所述免疫佐剂为皂素Quil A或弗式佐剂，所述免疫佐剂的浓度为1mg/mL，所述组合蛋白的浓度为100-200μg/mL。

由以上技术方案可知，本发明以细粒棘球绦虫EgFABP蛋白和EgA31蛋白作为抗细粒棘球绦虫和/或豆状带绦虫蛋白进行免疫实验，结果显示两个蛋白对犬表现出较好的免疫保护作用，并能够产生稳定的抗体，具备开发犬用带科绦虫通用疫苗的潜力。

附图说明

图1所示为抗rEgFABP-EgA31血清特异性IgG水平值(免疫融合蛋白的土种犬，豆状带绦虫攻虫)；横坐标为周数，血清稀释度为1:320；

图2所示为抗rEgFABP-EgA31血清特异性IgG水平值(免疫融合蛋白的比格犬，细粒棘球绦虫攻虫)；横坐标为周数，血清稀释度为1:320。

具体实施方式

本发明公开了一种组合蛋白及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述组合蛋白及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的组合蛋白及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在具体实施方式中，融合蛋白的制备方法如下：

根据GenBank中公布的细粒棘球绦虫FABP的基因序列(GenBank：XM_024494196.1)，去掉其终止密码子后(序列如SEQ ID NO:3所示)利用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性引物：

上游5′-CGCGGATCCATGGAGCCATTCATCGGT-3′，下划线为BamHⅠ酶切位点；下游5′-CCGGAATTCCATCCCTCTTGAGTAGGTTCT-3′，下划线为EcoRⅠ酶切位点。

根据GenBank中公布的细粒棘球绦虫EgA31的基因序列(GenBank：AF067807)，节选其中一段片段(SEQ ID NO:4所示)，利用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性引物：

上游5′-CCGGAATTCAATGCTGAGGTTCTTCGT-3′，下划线为EcoRⅠ酶切位点；下游5′-CCCAAGCTTCTACATGATACTGGTTGCACG-3′，下划线为HindⅢ酶切位点。

从cDNA中扩增出EgFABP和EgA31，将扩增产物EgFABP与EgA31连接到pET32a(+)质粒上并转入大肠杆菌BL21中。含重组质粒pET32a-EgFABP-EgA31的表达宿主菌在1mM IPTG下37℃诱导6h。重组融合蛋白EgFABP-EgA31以Ni²⁺亲和层析的方法进行纯化，蛋白浓度用BCA蛋白试剂盒进行测定。

以细粒棘球绦蚴cDNA为模板扩增出EgFABP、EgA31基因，将EgFABP与EgA31目的片段连接，得到pET32a-EgFABP-EgA31菌液，测序结果与预测长度一致，EgFABP-EgA31全长984bp，编码325个氨基酸。将pET32a-EgFABP-EgA31转化到BL21大肠杆菌中诱导表达。在37℃条件下，pET32a-EgFABP-EgA31用1.0mM IPTG诱导10h时表达量最大，表达的重组蛋白大小约为53kDa，符合预期大小。本发明具体实施方式中融合蛋白的编码基因序列如SEQ IDNO:5所示，即SEQ ID NO:3+酶切位点+SEQ ID NO:4；

本发明原核表达出细粒棘球绦虫EgFABP、EgA31以及EgFABP-EgA31重组融合蛋白，对犬皮下注射免疫两次融合蛋白(对照为PBS溶液)，二免后两周进行攻虫，攻虫感染后28天剖检记录虫体数量、虫体长度和宽度，计算减虫率。在豆状带绦虫免疫保护试验中，EgFABP、EgA31和EgFABP-EgA31组组减虫率分别为42.31％、30.77％、63.58％，各组虫体长宽度均小于对照组虫体长宽度；在细粒棘球绦虫免疫保护试验中，EgFABP组、EgA31组、EgFABP-EgA31组减虫率分别为55.43％、50.96％、67.00％，EgFABP组、EgA31组以及EgFABP-EgA31组的虫体平均长宽度均小于PBS组的虫体平均长宽度。由此表明，在细粒棘球绦虫与豆状带绦虫的免疫保护试验中，rEgFABP-EgA31对犬均具有较好的免疫保护效果，rEgFABP-EgA31效果优于EgFABP组和EgA31组。

以下就本发明所提供的一种组合蛋白及其应用做进一步说明。

实施例1：动物免疫保护试验

1、试验分组

试验共分为2批次，第一批试验为融合蛋白对豆状带绦虫的免疫保护试验，所用试验犬为土种犬，试验分组见表1。第二批试验为融合蛋白对细粒棘球绦虫的免疫保护试验，所用试验犬为比格犬，试验分组见表2。

表1融合蛋白对犬的豆状带绦虫免疫保护试验

表2融合蛋白对犬的细粒棘球绦虫免疫保护试验

2、rEgFABP、rEgA31rEg和rFABP-EgA31疫苗的制备

重组蛋白(rEgFABP、rEgA31rEg和rFABP-EgA31)和皂素Quil A用无菌PBS稀释，稀释后蛋白溶液浓度为400μg/mL，皂素Quil A溶液浓度为2mg/mL，将二者等体积混匀制成每毫升含200μg重组蛋白和1mg Quil A的免疫混合物。

3、免疫程序

每只犬颈部皮下注射1mL的免疫混合物或PBS溶液，免疫两次，首免后间隔两周进行二免。

4、人工感染

二免后两周，每只土种犬口服30枚豆状囊尾蚴，每只比格犬口服70 000枚原头蚴。

5、剖检计数

人工感染后28天对所有组犬进行剖检，记录每组每只犬小肠内的虫体数量，用光学显微镜对细粒棘球绦虫虫体进行观察并测量虫体的长度与宽度。

6、数据处理

减虫率＝(对照组犬荷虫平均数-免疫组犬荷虫平均数)/对照组犬荷虫平均数×100％

用The Mann–Whitney U test进行检验。同时使用SPSS 20.对各组荷虫数进行统计分析。

7、融合蛋白对犬的豆状带绦虫免疫保护试验的人工感染结果

经口感染豆状囊尾蚴后28d，对各组试验犬进行剖检，PBS组平均荷虫数为26条，虫体平均长度为9.71cm，平均宽度为2.51cm；rEgFABP-EgA31组平均荷虫数为9条，虫体平均长度为4.77cm，平均宽度为1.93cm，减虫率为63.58％；rEgFABP组平均荷虫数为15条，虫体平均长度为8.31cm，平均宽度为2.09cm，减虫率为42.31％；rEgA31组平均荷虫数为18条，虫体平均长度为7.25cm，平均宽度为1.94cm，减虫率为30.77％(表3)。

表3各试验组豆状带绦虫回收情况

注：^*The Mann–Whitney U test被用于检验免疫组相对于对照组虫体数量的差异性，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著；

8、融合蛋白对犬的细粒棘球绦虫免疫保护试验的人工感染结果

经口感染原头蚴后28d，对各组试验犬进行剖检，PBS组平均荷虫数为17420条，虫体平均长度为2.19mm，平均宽度为0.33mm；rEgFABP-EgA31组平均荷虫数为5750条，虫体的平均长度为1.50mm，平均宽度为0.24mm，减虫率为67.00％；rEgFABP组平均荷虫数为7765条，虫体平均长度为1.58mm，平均宽度为0.24mm，减虫率为55.43％。rEgA31组平均荷虫数为8543条，虫体平均长度为1.65mm，平均宽度为0.25mm，减虫率为50.96％。免疫组的虫体长宽度均小于PBS组。与rEgFABP组和rEgA31组相比，融合蛋白rEgFABP-EgA31的免疫显著地提高了试验犬对细粒棘球绦虫的抵抗能力(P<0.05)(表4)。

表4各试验组细粒棘球绦虫回收情况

实施例2：血清抗体间接ELISA检测

采用间接ELISA法测定血清中IgG抗体水平，用重组EgFABP-EgA31融合蛋白包被ELISA酶标板，4℃过夜，PBST洗涤三次，用5％脱脂牛奶37℃孵育2h，PBST洗涤拍干三次后，加入各组血清37℃孵育1h，随后加入HRP标记的兔抗犬IgG抗体37℃孵育1h。PBST洗涤后加入可溶性TMB底物进行显色，并以2M H₂SO₄终止显色。用酶标仪在紫外波长450nm处测定吸光度值。

使用rEgFABP-EgA31蛋白作为抗原，用间接ELISA方法对实施例1中融合蛋白组以及PBS对照组试验犬血清特异性抗体进行检测，各组血清抗体的OD_450nm值变化见图1和图2。由图1和图2可知，在免疫后，EgFABP-EgA31组的抗体水平的上升较快缓，攻虫过后抗体水平下降趋势较缓，并保持一定的抗体水平。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种组合蛋白及其应用

<130> MP1925693

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Pro Phe Ile Gly Thr Trp Lys Met Glu Lys Ser Glu Gly Phe

1 5 10 15

Asp Lys Ile Met Glu Arg Leu Gly Val Asp Tyr Phe Thr Arg Lys Met

20 25 30

Gly Asn Met Met Lys Pro Asn Leu Ile Ile Ser Asp Leu Gly Asp Gly

35 40 45

Arg Tyr Asn Met Arg Ser Glu Ser Lys Phe Lys Thr Ser Glu Phe Ser

50 55 60

Phe Lys Leu Gly Glu Gln Phe Lys Glu Val Thr Pro Asp Ser Arg Glu

65 70 75 80

Val Met Ser Met Leu Thr Val Glu Asp Gly Val Leu Lys Gln Glu Gln

85 90 95

Val Gly Lys Asp Lys Thr Thr Tyr Ile Asp Arg Val Val Asp Gly Asn

100 105 110

Glu Leu Arg Ala Thr Val Lys Ala Asp Glu Leu Val Cys Val Arg Thr

115 120 125

Tyr Ser Arg Gly Met

130

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Ala Glu Val Leu Arg Leu Ala Asp Glu Leu Arg Gln Glu Gln Glu

1 5 10 15

Asn Tyr Lys Arg Ala Glu Thr Leu Arg Lys Gln Leu Glu Ile Glu Ile

20 25 30

Arg Glu Ile Thr Val Lys Leu Glu Glu Ala Glu Ala Phe Ala Thr Arg

35 40 45

Glu Gly Arg Arg Met Val Gln Lys Leu Gln Asn Arg Val Arg Glu Leu

50 55 60

Glu Ala Glu Leu Asp Gly Glu Ile Arg Arg Ala Lys Glu Ala Phe Ala

65 70 75 80

Ser Ala Arg Lys Tyr Glu Arg Gln Phe Lys Glu Leu Gln Thr Gln Ser

85 90 95

Glu Asp Asp Lys Arg Met Ile Leu Glu Leu Gln Asp Leu Leu Asp Lys

100 105 110

Thr Gln Ile Lys Met Lys Ala Tyr Lys Arg Gln Leu Glu Glu Gln Glu

115 120 125

Glu Val Ser Gln Leu Thr Met Ser Lys Tyr Arg Lys Ala Gln Gln Gln

130 135 140

Ile Glu Glu Ala Glu His Arg Ala Asp Met Ala Glu Arg Thr Ile Thr

145 150 155 160

Ile Lys Arg Thr Ile Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Val Ser Val Val

165 170 175

Arg Glu Ile Asn Ser Val Ser Arg Gly Asn Arg Ala Thr Ser Ile Met

180 185 190

<210> 3

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagccat tcatcggtac ctggaagatg gagaagagtg agggtttcga caagatcatg 60

gaacgccttg gggtggatta tttcactcgc aagatgggca atatgatgaa gcccaacttg 120

ataatcagcg atctgggtga tggcaggtat aacatgcgat cggagagtaa attcaagacc 180

tccgaatttt ccttcaaact gggagaacag ttcaaggagg tcacaccgga ttcacgcgaa 240

gtcatgtcga tgctcacggt ggaggatggg gtgctgaagc aggagcaagt tggcaaggac 300

aagaccacct acattgatcg tgtggttgat ggcaatgagc tgagggcgac ggtgaaggcg 360

gatgagttgg tttgtgtgag aacctactca agagggatg 399

<210> 4

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatgctgagg ttcttcgtct ggctgatgaa ctgcgacagg aacaggaaaa ttacaagcga 60

gctgagactc tgcgtaagca acttgagatt gagatccgtg agatcacggt caagttggag 120

gaggccgagg ctttcgctac ccgtgagggt cgccgtatgg ttcaaaagct ccagaaccgg 180

gtgagagagc tcgaggcaga gctggacgga gaaattcgtc gtgccaaaga ggcctttgcc 240

agcgcacgca aatatgagcg gcaattcaaa gaattgcaga cacagagcga ggatgataag 300

cgcatgattt tggagcttca ggacctgcta gacaagactc agatcaagat gaaggcctat 360

aaacgtcagc ttgaggaaca ggaagaggtg tctcagttaa cgatgagcaa gtaccgtaag 420

gcacagcaac agattgagga agcagagcat cgtgctgaca tggcggagag gacgatcacc 480

attaagagga ccattggtgg acccggttcc cgtgctgttt cagtggttcg ggagataaac 540

agcgtgtccc gtggtaaccg tgcaaccagt atcatgtag 579

<210> 5

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggagccat tcatcggtac ctggaagatg gagaagagtg agggtttcga caagatcatg 60

gaacgccttg gggtggatta tttcactcgc aagatgggca atatgatgaa gcccaacttg 120

ataatcagcg atctgggtga tggcaggtat aacatgcgat cggagagtaa attcaagacc 180

tccgaatttt ccttcaaact gggagaacag ttcaaggagg tcacaccgga ttcacgcgaa 240

gtcatgtcga tgctcacggt ggaggatggg gtgctgaagc aggagcaagt tggcaaggac 300

aagaccacct acattgatcg tgtggttgat ggcaatgagc tgagggcgac ggtgaaggcg 360

gatgagttgg tttgtgtgag aacctactca agagggatgg aattcaatgc tgaggttctt 420

cgtctggctg atgaactgcg acaggaacag gaaaattaca agcgagctga gactctgcgt 480

aagcaacttg agattgagat ccgtgagatc acggtcaagt tggaggaggc cgaggctttc 540

gctacccgtg agggtcgccg tatggttcaa aagctccaga accgggtgag agagctcgag 600

gcagagctgg acggagaaat tcgtcgtgcc aaagaggcct ttgccagcgc acgcaaatat 660

gggcggcaat tcaaagaatt gcagacacag agcgaggatg ataagcgcat gattttggag 720

cttcaggacc tgctagacaa gactcagatc aagatgaagg cctataaacg tcagcttgag 780

gaacaggaag aggtgtctca gttaacgatg agcaagtacc gtaaggcaca gcaacagatt 840

gaggaagcag agcatcgtgc tgacatggcg gagaggacga tcaccattaa gaggaccatt 900

ggtggacccg gttcccgtgc tgtttcagtg gttcgggaga taaacagcgt gtcccgtggt 960

aaccgtgcaa ccagtatcat gtag 984

Claims

1.一种组合蛋白，其特征在于，为包括细粒棘球绦虫EgFABP蛋白和EgA31蛋白的组合蛋白；或为细粒棘球绦虫EgFABP蛋白和EgA31蛋白的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述组合蛋白，其特征在于，所述细粒棘球绦虫的EgFABP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述组合蛋白，其特征在于，所述细粒棘球绦虫的EgA31蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述组合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白中的连接臂为酶切位点。

5.权利要求1-4任意一项所述组合蛋白或其编码序列在制备预防细粒棘球绦虫和/或豆状带绦虫的疫苗中的应用。

6.一种预防细粒棘球绦虫和/或豆状带绦虫的疫苗，其特征在于，包括权利要求1-4任意一项所述组合蛋白和免疫佐剂。

7.根据权利要求6所述疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为皂素QuilA或弗式佐剂。

8.根据权利要求6或7所述疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂的浓度为1mg/mL。

9.根据权利要求7所述疫苗，其特征在于，所述组合蛋白的浓度为100-200μg/mL。