CN103694333B - Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用 - Google Patents

Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103694333B
CN103694333B CN201310717092.0A CN201310717092A CN103694333B CN 103694333 B CN103694333 B CN 103694333B CN 201310717092 A CN201310717092 A CN 201310717092A CN 103694333 B CN103694333 B CN 103694333B
Authority
CN
China
Prior art keywords
eps8
epitope peptide
ctl
ile
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310717092.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103694333A (zh
Inventor
李玉华
周炜均
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University
Original Assignee
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University filed Critical Southern Medical University
Priority to CN201410857469.7A priority Critical patent/CN104497123B/zh
Priority to CN201310717092.0A priority patent/CN103694333B/zh
Priority to CN201410857491.1A priority patent/CN104497124B/zh
Priority to CN201410857508.3A priority patent/CN104497125B/zh
Publication of CN103694333A publication Critical patent/CN103694333A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103694333B publication Critical patent/CN103694333B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

一种EPS8来源的抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其序列为：Trp-a-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val。本发明还公开了该表位肽在药物中的应用。本发明诱导的特异性CTL均能分泌一定的IFN-γ，并对HLA-A*0201和EPS8表达阳性的MCF-7细胞以及负载EPS8的T2A2细胞均表现出一定的抗原特异性杀伤效应，制成的EPS8表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着巨大的开发应用潜力。

Description

EPS8抗肿瘤CTL表位肽及其应用
技术领域
本发明属于生物化学领域中的多肽技术领域，具体涉及一种EPS8来源的抗肿瘤CTL表位肽及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是新世纪人类的第一杀手。手术、放疗及化疗等传统治疗方法对某些肿瘤尤其是晚期恶性肿瘤的治疗效果尚不理想。近年来，细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL）在抑制肿瘤中的作用受到极大重视，如何有效激发CTL介导的特异性细胞免疫应答，发挥抗肿瘤效能，已经成为当今肿瘤治疗性多肽疫苗研制领域的一个重要课题。
肿瘤抗原的发现及其CTL表位的鉴定是肿瘤特异性免疫治疗以及肿瘤治疗性多肽疫苗研制的重要前提。表皮生长因子受体通路底物No.8（Epidermal Growth Factor Receptor pathway substrate No. 8，EPS8）是表皮生长因子受体（EGFR）重要的激酶活性底物之一。近年研究显示，EPS8在多种实体瘤（如宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌及恶性胶质瘤等）及血液系统肿瘤（如多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、混合系白血病等）的组织及细胞中表达异常升高，而在正常组织表达很低或无表达。进一步的研究显示，EPS8通过调控细胞周期促进肿瘤细胞的增殖，通过参与细胞伪足的形成及与肌动蛋白的相互作用促进肿瘤细胞的转移，通过影响肿瘤细胞对化疗药物的耐受性与患者的预后相关（Li Y*, Xue T, He Y, Du J. A novel oncoprotein Eps8: new target for anti-cancer therapy. Future Oncology. 2013（Accepted））。此外，本课题组在前期的实验研究中发现，重组小鼠rmHis-Eps8蛋白疫苗可有效诱导荷4T1乳腺癌小鼠产生特异性抗肿瘤免疫应答，抑制小鼠体内肿瘤细胞的增殖，延长其生存时间，而对小鼠脑、心、肝、肾、小肠、附睾组织无明显的毒性作用。（He YJ, Zhou J, Li Y*, et al. Eps8 vaccine exerts prophylactic antitumor effects in a murine model: a novel vaccine for breast carcinoma. Mol Med Rep. 2013 Aug;8(2):662-8）。因此，EPS8是肿瘤诊断和抗肿瘤治疗的新靶点，在肿瘤免疫治疗中具有巨大潜力。
免疫原性弱和免疫耐受极大地限制了天然CTL表位在肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用，因此，有效提高天然CTL表位的免疫原性并打破机体的免疫耐受成为肿瘤治疗性多肽疫苗发展的关键。在众多肿瘤治疗性多肽疫苗的增强策略中，对天然CTL表位进行分子改造被认为是最行之有效的方法之一。由于CTL表位与主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅰ类分子的结合是诱导CTL免疫应答的关键因素，而CTL表位与MHC-Ⅰ类分子结合的重要基础是锚定残基，因此，可通过改变锚定残基或其相邻位置的氨基酸残基以达到增强免疫原性而不影响特异性的目的。研究发现，在九肽CTL表位中，第二位及第九位为HLA-A2.1分子的主要锚定位点，二位为Leu或Met，九位为Leu、Val或Ile，能将表位与MHC结合的能力提高10~100倍，而在一位引入Tyr则可依靠其侧链苯环的疏水作用以及酚羟基的氢键作用增强表位肽与HLA分子的相互作用。
本申请主要采用理论和实验相结合的方法，修饰并初步鉴定出与MHC-Ⅰ类分子具有强结合力并有效诱导抗肿瘤免疫应答的EPS8来源的候选CTL表位肽及其类似物。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种肿瘤抗原EPS8来源的HLA-A*0201限制性CTL表位，该表位能够以高亲和力结合HLA-A*0201分子，所形成的复合物稳定，能够诱导肽特异性的CTL免疫应答，表现为刺激肽特异性CTL分泌高水平的IFN-γ并对肿瘤细胞产生特异性杀伤效应。
本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种在肿瘤原EPS8来源的HLA-A*0201限制性CTL表位肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
EPS8抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其序列为：Trp-a-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val，其中，a为Thr或Leu；b-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-c，其中，b为Ile或Tyr，c为Ile或Val；Phe-Leu-Phe-Thr-Pro-Leu-Asn-Met-Val；d-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val，其中，d为Gln或Tyr。
当a为Thr时，序列为Trp-Thr-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val（即WTQDMILQV，记为EPS8-101）；
当a为Leu时，序列为Trp-Leu-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val（WLQDMILQV，记为EPS8-101-2L）；
当b为Ile，c为Ile时，序列为Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Ile（即ILDDIEFFI，记为EPS8-276）；
当b为Ile，c为Val时，序列为Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val（即ILDDIEFFV，记为EPS8-276-9V）；
当b为Tyr，c为Val时，序列为Tyr-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val（即YLDDIEFFV，记为EPS8-276-1Y9V）；
Phe-Leu-Phe-Thr-Pro-Leu-Asn-Met-Val（即FLFTPLNMV，记为EPS8-360）；
当d为Gln时，序列为Gln-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val （即QLAESVANV，记为EPS8-455）；
当d为Tyr时，序列为Tyr-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val（即YLAESVANV，记为EPS8-455-1Y）。
此外，本发明涵盖经过修饰的肽，其中替代或添加了一个、两个或更多个氨基酸而得到的序列，只要经过修饰的肽保留原始的CTL诱导能力。
所述肿瘤抗原EPS8来源的HLA-A*0201限制性CTL表位在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。
其中，所述EPS8阳性肿瘤包括宫颈癌、结直肠癌、垂体瘤、口腔鳞癌、胰腺导管癌、乳腺癌、甲状腺癌、食管癌、恶性胶质瘤、多发性骨髓瘤、急性髓系白血病、混合系白血病等。
本发明的有益效果在于：本发明公开了来源于肿瘤抗原EPS8的天然CTL表位肽及模拟表位肽，该CTL表位能够肽能够诱导肽特异性的CTL免疫应答，表现为可刺激肽特异性CTL分泌高水平IFN-γ并对EPS8阳性肿瘤细胞产生特异性杀伤效应；由于肿瘤抗原EPS8广泛表达于不同类型的肿瘤组织中，因此，本发明的CTL表位肽可作为活性成分，和药学上课接受的载体组成组合物，或者，与其它具有药理活性的提取物和/或合成药物和药学上课接受的载体组成组合物，再按照药学领域的常规方法制备基于抗原EPS8的肿瘤疫苗，用于治疗和/或预防EPS8表达阳性的肿瘤，和/或预防其手术后复发，在肿瘤免疫治疗领域具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明表位肽诱导的特异性CTL分泌IFN-γ能力的检测结果；
图2为本发明表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的检测结果；
图3为本发明表位肽EPS8-101诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201限制性检测结果；
图4为本发明表位肽EPS8-276诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201限制性检测结果；
图5为本发明表位肽EPS8-360诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201限制性检测结果；
图6为本发明表位肽EPS8-455诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201限制性检测结果；
图7为本发明表位肽EPS8-101-1Y诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201限制性检测结果；
图8本发明表位肽为EPS8-276-9V诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201限制性检测结果；
图9为本发明表位肽EPS8-276-1Y9V诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201限制性检测结果；
图10为本发明表位肽EPS8-455-1Y诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的HLA-A*0201限制性检测结果。
具体实施方式
为以下将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
一、EPS8 HLA-A*0201限制性CTL表位的预测
1、生物学软件预测CTL表位
本发明所述的EPS8来源的抗肿瘤CTL表位肽类似物，是根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段，运动在线生物学软件SYFPEITHI、BIMAS和NetMHC 3.2对EPS8抗原结构的HLA-A*0201限制性进行预测分析，筛选WTQDMILQV（记为EPS8-101）、ILDDIEFFI（记为EPS8-276）、FLFTPLNMV（记为EPS8-360）及QLAESVANV（记为EPS8-455）作为候选CTL表位肽，并根据HLA-A*0201限制性表位基序及其它位置上不同氨基酸残基对表位与HLA-A*0201分子亲和力的影响，对上述天然CTL表位的主要锚定残基或其相邻位置的氨基酸残基进行替换，使CTL表位不包含不利于结合的氨基酸残基或有利于结合的氨基酸残基多余不利于结合的氨基酸残基，由此设计出4个模拟CTL表位：WLQDMILQV（记为EPS8-101-2L）、ILDDIEFFV（记为EPS8-276-9V）、YLDDIEFFV（记为EPS8-276-1Y9V）和QLAESVANV（记为EPS8-455）。
二、候选模拟CTL表位的合成
候选模拟CTL表位委托杭州中肽生化有限公司采用标准Fmoc方案进行合成，并采用反相高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，各候选模拟CTL表位的纯度均高于95%，分子量与理论值相符。
所得候选CTL表位肽用二甲基亚砜（DMSO）溶解制成储备液，置温度-70℃保存，临时前用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。固相合成步骤可参考现有的技术。
三、上述制备的CTL 表位肽，可用于制备肿瘤治疗性多肽疫苗，其应用实验如下：
3.1、候选CTL表位肽与HLA-A*0201分子亲和力试验
（1）800rpm离心收集HLA-A2.1表达阳性且缺失内源性抗原加工处理能力的T2细胞（ATCC公司），PBS洗涤3次，无血清RPMI-1640培养基重悬细胞至细胞密度为1×106/ml，接种于24孔板；
（2）每孔加入CTL表位肽、阳性对照肽（流感基质蛋白IMP58-66：GILGFVFTL）或阴性对照肽（Idiotype98-106：AHTKDGFNF）至终浓度为50μg/ml（内含β2微球蛋白3μg/ml），37℃，5%CO2、饱和湿度条件下孵育18h；
（3）冰PBS洗涤3次后，加入FITC标记的HLA-A2.1抗体，4℃避光孵育30min；
（4）冰PBS洗涤3次后，流式细胞仪于波长488nm处测定平均荧光强度，并计算荧光系数FI：FI=（样品平均荧光强度-背景平均荧光强度）/背景平均荧光强度检测。FI＞1.5为高亲和力，1.0＜FI＜1.5为中等亲和力，FI＜1.0为低亲和力。
结果：如表1所示，EPS8-276、EPS8-360及EPS8-455表位肽与HLA-A2.1分子具有高亲和力，EPS8-101表位肽具中等亲和力；且改造肽与HLA-A2.1分子的结合力均高于母体肽。
3.2、候选CTL表位肽/HLA-A2.1分子复合物稳定性分析
（1）800rpm离心收集T2A2细胞，用冰PBS洗涤3次，无血清RPMI 1640培养基（含100ng/ml人β2微球蛋白）重悬至细胞密度为1.0×106/ml，接种于24孔培养板；
（2）每孔加入CTL表位肽至终浓度为100μmol/ml，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下孵育18h；
（3）冰PBS洗涤细胞4次，除去未结合的游离肽；
（4）每孔加入Brefeldin A（BFA，Sigma公司）至终浓度为10μg/ml，37℃、5% CO2及饱和湿度条件下孵育1h；
（5）冰PBS洗涤细胞1次；
（6）加入含0.5μg/ml BFA的无血清1640培养基，于37℃、5% CO2及饱和湿度条件下分别孵育0h、2h、4h、6h、8h；
（7）孵育结束后，冰PBS洗涤3次，加入FITC标记的HLA-A2.1抗体，4℃避光反应30min；
（8）冰PBS洗涤3次后，流式细胞仪于波长488nm处测定平均荧光强度。结果用表位肽/HLA-A2.1分子复合物的半衰期DC50表示。
结果：如表1所示，8条表位肽/HLA-A2.1复合物的半衰期均大于6h。
表1 表位肽与HLA-A2.1分子结合力及稳定性试验结果 
天然表位肽 FI DC50/h 模拟表位肽 FI DC50/h
EPS8-101 1.03 6~8 EPS8-101-2L 2.51 ＞8
EPS8-276 2.10 ＞8 EPS8-276-9V 4.95 ＞8
EPS8-360 1.99 ＞8 EPS8-276-1Y9V 4.54 ＞8
EPS8-455 2.07 ＞8 EPS8-455-1Y 2.75 ＞8
3.3、CTL表位肽诱导的特异性CTL分泌IFN-γ能力检测
1、效应细胞的制备
（1）常规聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度法分离HLA-A*0201阳性健康志愿者的抗凝新鲜全血，获得外周血单个核细胞（PBMC），用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为1.0×106/ml，接种于24孔板，每孔1ml；
（2）次日每组分别加入CTL表位肽至终浓度为10μg/ml，同时设立PBS组（以PBS替代表位肽）作为阴性对照组；
（3）第三天每孔加入IL-2至终浓度为50U/ml，每2~3天半量换液并补充IL-2至终浓度为50U/ml；
（4）分别于第七天、第十四天进行第二轮、第三轮荷肽刺激，即每组分别加入CTL表位肽/PBS至终浓度为10μg/ml，次日加入IL-2至终浓度为50U/ml；
（5）第三轮刺激后3天，得到效应细胞CTL。
2、ELISPOT实验：使用Human IFN-gamma ELISPOT kit（ELISPOT试剂盒， U-Cytech公司）进行IFN-γ分泌的检测，主要步骤如下（详见试剂盒说明书）：
（1）包被：
①向PVDF板加入70%乙醇预湿，15μl/孔；
②加入去离子水洗涤2次，100μl/孔；
③加入PBS稀释好的包被抗体，50μl/孔，4℃包被过夜；
（2）封闭：
①倾倒包被液；
②PBS洗涤3次，100μl/孔，最后一次在灭菌的吸水纸上拍干；
③加入稀释好的封闭液，200μl/孔，37℃封闭1h；
（3）细胞上样：
①倾倒封闭液，PBS洗涤一次，灭菌的吸水纸上拍干；
②细胞上板：上述诱导的CTL作为效应细胞（1×105/孔），荷肽的T2A2细胞作为刺激细胞（1×105/孔）铺板，100μl/孔。设置正对照组：细胞浓度为1×105/孔，加入PHA至终浓度为1~4μl/ml，该浓度能有效刺激IFN-γ的分泌；设置背景负对照组：加入100μl含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基；
③加完所有样品后，盖上板盖，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下孵育18~24h；
（4）培养后操作：
①低渗法裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基，加入冰冷的去离子水，200μl/孔，4℃冰浴10min；
②洗涤：倾倒孔内液体，加入稀释好的washing buffer洗涤5~7次， 200μl/孔，每次停留30~60s，最后一次，在吸水纸上拍干；
③检测抗体孵育：加入稀释好的生物素标记检测抗体，100μl/孔，4℃孵育过夜；
④洗涤：次日倾倒孔内液体，加入稀释好的washing buffer洗涤5~7次， 200μl/孔，每次停留30~60s，最后一次，在吸水纸上拍干；
⑤酶联亲和素孵育：加入稀释好的酶联亲和素工作液，100μl/孔，37℃孵育1h；
⑥洗涤：倾倒孔内液体，加入稀释好的washing buffer洗涤5次， 200μl/孔，每次停留30~60s，最后一次，在吸水纸上拍干；
⑦显色：加入配置好的AEC显色液，100μl/孔，室温避光静置15~30min；
⑧终止显色：倾倒孔内液体，去离子水洗涤3~5次，终止显色过程；
⑨ELSPOT图像分析仪计数每孔形成的斑点数。
结果：如图1所示，天然CTL表位肽EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360、EPS8-455及其模拟表位肽EPS8-101-2L、EPS8-276-9V、EPS8-276-1Y9V、EPS8-455-1Y诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力明显高于阴性对照组（P＜0.001）。
3.4、CTL表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞特异性杀伤效应的检测
（1）实验分组：
①效应细胞：分为9个样品大组：EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360、EPS8-455和EPS8-101-2L、EPS8-276-9V、EPS8-276-1Y9V、EPS8-455-1Y，分别以各表位肽诱导的特异性CTL为效应细胞；
②靶细胞：人乳腺癌细胞MCF-7（HLA-A*0201表达阳性、EPS8表达阳性），荷肽T2A2细胞（HLA-A*0201表达阳性、EPS8表达阳性）、T2细胞（HLA-A*0201表达阳性，EPS8表达阴性）
（2）效应细胞制备：按照前述同样方法制备CTL表位肽诱导的特异性CTL，用含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。
（3）LDH检测：使用CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（细胞毒性检测试剂盒，Promega公司）进行LDH试验检测细胞毒活性，主要步骤如下（详见试剂盒说明书）：
（1）设立检测板（100μl/孔）
①设立实验组：以MCF-7、荷肽T2A2、T2A2细胞作为靶细胞（最优靶细胞数为5×103/孔），按不同的效靶比10:1、20:1、40:1加入上述效应细胞CTL，各种浓度细胞以50μl/孔接种于96孔培养板中，终体积100μl；
②设立效应细胞自发释放组：各组效应细胞以50μl/孔加入96孔板，补充50μl含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基至终体积100μl；
③设立靶细胞自发释放组：各组靶细胞以50μl/孔加入96孔板，补充50μl含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基至终浓度100μl；
④设立靶细胞最大释放组：细胞上样同靶细胞自发释放组；
⑤设立背景对照组：加入含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基100μl；
⑥设立体积校正对照组：加入含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基100μl；
（2）细胞裂解及收获上清
①细胞铺板后，250g离心4min，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下孵育4h；
②收获上清前45min，分别于靶细胞最大释放组和体积校正对照组加入裂解液（10×），10μl/孔；
③250g离心4min，收获上清；
（3）LDH检测
①转移上清至另一96孔板，50μl/孔；
②迅速添加稀释的底物混合液，50μl/孔，室温避光反应30min；
③添加终止液终止显色反应，50μl/孔；
④取出孔中气泡，1h内于酶标仪检测490nm吸光值OD。
（4）计算细胞杀伤率
杀伤率（%）=[（实验组OD值 -效应细胞自发释放组OD值 -靶细胞自发释放组OD值）/（靶细胞最大释放组OD值 -靶细胞自发释放组OD值）]×100%
（注：所有实验组、效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组的OD值均应减去背景平均吸收值；靶细胞最大释放组吸收值应减去体积校正对照组的平均吸收值）
结果：如图2所示，天然CTL表位肽EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360、EPS8-455及其模拟表位肽EPS8-101-2L、EPS8-276-9V、EPS8-276-1Y9V、EPS8-455-1Y对HLA-A*0201和EPS8表达阳性的MCF-7细胞和负载EPS8的T2A2细胞均具有特异性杀伤作用，而对不表达EPS8只表达HLA-A*0201的T2A2细胞未见特异性杀伤作用。如图3至图10所示，用抗HLA-A2.1抗体蜂蜜MCF-7细胞表面的HLA-A2.1分子或沉默MCF-7的EPS8表达后，各EPS8抗肿瘤CTL表位肽诱导的特异性CTL在各效靶比对MCF-7/A2Ab、MCF-7/EPS8-细胞均未见特异性杀伤，表明其诱导的特异性CTL对MCF-7为抗原特异性、MHC限制性杀伤。
基于上述实验结果，可得出如下结论：天然CTL表位肽EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360、EPS8-455及其模拟表位肽EPS8-101-2L、EPS8-276-9V、EPS8-276-1Y9V、EPS8-455-1Y与HLA-A*0201分子具有很好的亲和力和结合稳定性，同时，其诱导的特异性CTL均能分泌一定的IFN-γ，并对HLA-A*0201和EPS8表达阳性的MCF-7细胞以及负载EPS8的T2A2细胞均表现出一定的抗原特异性杀伤效应；由于肿瘤抗原EPS8广泛表达于不同时期不同类型的肿瘤组织中，因此，本发明的EPS8抗肿瘤CTL表位可以作为活性成分，和药学上可接受的载体组成组合物，或者，与其它具有药理活性的提取物和/或合成药物和药学上可接受的载体组成组合物，再按照药学领域的常规方法制成EPS8表达阳性肿瘤的治疗性多肽疫苗，在肿瘤特异性免疫治疗领域有着巨大的开发应用潜力。
SEQUENCE LISTING
<110>
<120>EPS8抗肿瘤CTL表位肽及其应用
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>9
<213>人工合成
<400>1
Trp-Thr-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val
15
<210>1
<211>9
<213>人工合成
<400>1
Trp-Leu-Gln-Asp-Met-Ile-Leu-Gln-Val5
15
<210>1
<211>9
<213>人工合成
<400>1
Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Ile
15
<210>1
<211>9
<213>人工合成
<400>1
Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val
15
<210>1
<211>9
<213>人工合成
<400>1
Tyr-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val
15
<210>1
<211>9
<213>人工合成
<400>1
Phe-Leu-Phe-Thr-Pro-Leu-Asn-Met-Val
15
<210>1
<211>9
<213>人工合成
<400>1
Gln-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val
15
<210>1
<211>9
<213>人工合成
<400>1
Tyr-Leu-Ala-Glu-Ser-Val-Ala-Asn-Val
15

Claims (6)

1.一种EPS8抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其序列为：b-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-c，其中，b为Ile或Tyr，c为Ile或Val。
2.根据权利要求1所述的EPS8抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于：在b为Ile，c为Ile时，其序列为：Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Ile。
3.根据权利要求1所述的EPS8抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于：在b为Ile，c为Val时，其序列为：Ile-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val。
4.根据权利要求1所述的EPS8抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于：在b为Tyr，c为Val时，其序列为：Tyr-Leu-Asp-Asp-Ile-Glu-Phe-Phe-Val。
5.根据权利要求1所述的EPS8抗肿瘤CTL表位肽，其特征在于：采用固相合成法制备CTL表位肽。
6.根据权利要求1～4任意一项权利要求所述的EPS8抗肿瘤CTL表位肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
CN201310717092.0A 2013-12-23 2013-12-23 Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用 Active CN103694333B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410857469.7A CN104497123B (zh) 2013-12-23 2013-12-23 Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用
CN201310717092.0A CN103694333B (zh) 2013-12-23 2013-12-23 Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用
CN201410857491.1A CN104497124B (zh) 2013-12-23 2013-12-23 Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用
CN201410857508.3A CN104497125B (zh) 2013-12-23 2013-12-23 Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310717092.0A CN103694333B (zh) 2013-12-23 2013-12-23 Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410857491.1A Division CN104497124B (zh) 2013-12-23 2013-12-23 Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用
CN201410857508.3A Division CN104497125B (zh) 2013-12-23 2013-12-23 Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用
CN201410857469.7A Division CN104497123B (zh) 2013-12-23 2013-12-23 Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103694333A CN103694333A (zh) 2014-04-02
CN103694333B true CN103694333B (zh) 2015-04-08

Family

ID=50356017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310717092.0A Active CN103694333B (zh) 2013-12-23 2013-12-23 Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103694333B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101563104A (zh) * 2006-02-01 2009-10-21 约翰霍普金斯大学 用于肿瘤或传染性疾病免疫预防或免疫治疗的多肽-核酸结合物
CN101870724A (zh) * 2010-06-22 2010-10-27 郑州大学 Plac1抗肿瘤ctl表位肽及其应用
CN102212113A (zh) * 2011-05-26 2011-10-12 郑州大学 结核耐药相关外排蛋白来源抗结核ctl表位肽及其应用
CN102657854A (zh) * 2012-05-22 2012-09-12 郑州大学 多表位疫苗yl66以及在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101563104A (zh) * 2006-02-01 2009-10-21 约翰霍普金斯大学 用于肿瘤或传染性疾病免疫预防或免疫治疗的多肽-核酸结合物
CN101870724A (zh) * 2010-06-22 2010-10-27 郑州大学 Plac1抗肿瘤ctl表位肽及其应用
CN102212113A (zh) * 2011-05-26 2011-10-12 郑州大学 结核耐药相关外排蛋白来源抗结核ctl表位肽及其应用
CN102657854A (zh) * 2012-05-22 2012-09-12 郑州大学 多表位疫苗yl66以及在制备肿瘤治疗性疫苗中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于SCORE函数估算HLA-A * 0201限制性CTL表位亲和性;朱波等;《免疫学杂志》;20050531;第21卷(第3期);177-181 *
基于高维特征非线性筛选的HLA-A*0201限制性CTL表位预测;韩娜等;《物理化学学报》;20130618;第29卷(第9期);1945-1953 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103694333A (zh) 2014-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1767848B (zh) 存活蛋白衍生肽及其用途
CN104673749B (zh) 一种粒细胞样髓源性抑制细胞来源exosomes及其应用
JP5393144B2 (ja) Ｈｌａ−ａ＊３３０３拘束性ｗｔ１ペプチド、およびそれを含む医薬組成物
JP2021526365A (ja) 改善された標的化ｔ細胞療法
CN106589105A (zh) Hla‑a2限制性ecm1特异性的ctl表位肽及其应用
CN103667189A (zh) 用于治疗肺癌的cd8毒性t淋巴细胞及其制备方法
Zhu et al. In situ generation of biocompatible amorphous calcium carbonate onto cell membrane to block membrane transport protein–A new strategy for cancer therapy via mimicking abnormal mineralization
CN104262459A (zh) 一种急性单核细胞白血病相关抗原mlaa-34 表位多肽及其疫苗和制药应用
CN104497123A (zh) Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用
CN104497124A (zh) Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用
Zhang et al. PINCH protein expression in normal endometrium, atypical endometrial hyperplasia and endometrioid endometrial carcinoma
CN101508721A (zh) 肿瘤抗原Ran HLA-A*0201限制性模拟CTL表位及其应用
CN106892974A (zh) 一种基于肿瘤抗原ecm1的长肽ere1及其在肿瘤免疫治疗中的应用
WO2017084519A1 (zh) 化合物i和化合物ii及其制备方法和应用
CN106589106A (zh) Hla‑a24限制性ecm1特异性的ctl表位肽及其应用
CN103694333B (zh) Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用
ES2970763T3 (es) Método para inducir respuesta de memoria T inicial con vacuna antitumoral de péptidos cortos
CN104497125A (zh) Eps8抗肿瘤ctl表位肽及其应用
CN105859866B (zh) Fap来源的抗肿瘤ctl表位肽p265及其应用
Li et al. Akt promotes irradiation-induced regulatory T-cell survival in hepatocellular carcinoma
CN105859865B (zh) 一种基于Eps8-EGFR结合域的双重抗肿瘤多肽
CN104655849B (zh) 一种肿瘤靶标的筛选方法
CN105968181B (zh) 一种基于Eps8-SH3结构域的双重抗肿瘤多肽
CN102516363A (zh) Pl2l60来源的ctl表位肽及其应用
CN106117337A (zh) 一种特异性肿瘤抗原sf的ctl识别表位肽及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant