CN102516363A

CN102516363A - Pl2l60来源的ctl表位肽及其应用

Info

Publication number: CN102516363A
Application number: CN2012100015578A
Authority: CN
Inventors: 翟明霞; 时冉冉; 高艳锋; 祁元明; 刘伟
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou Yuanchuang Gene Technology Co ltd
Priority date: 2012-01-05
Filing date: 2012-01-05
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2032-01-05
Also published as: CN102516363B

Abstract

本发明公开了PL2L60来源的CTL表位肽，氨基酸序列为：a-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a为D-Tyr时，氨基酸序列为：D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a为1-Nal时，氨基酸序列为：1-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a为4-Cl-Phe时，氨基酸序列为：4-Cl-Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a为Phe时，氨基酸序列为：Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；本发明还公开了PL2L60来源的CTL表位肽在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。本发明的优点在于针对低亲和力表位进行改造,筛选出能活化T细胞增殖，更有效的激活体内免疫应答的改造肽，为研制基于抗原PL2L60的肿瘤治疗性多肽疫苗提供了理论基础。

Description

PL2L60来源的CTL表位肽及其应用

技术领域

本发明属于生物化学领域中的多肽技术领域，尤其是涉及一种PL2L60来源的CTL表位肽，本发明还涉及该肽在制备治疗性多肽疫苗中的应用。

背景技术

PIWIL2在正常组织中仅存在于睾丸组织中，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及睾丸癌等肿瘤组织中呈现高表达，尤其是在乳腺癌中表达率高达100%，而在正常乳腺组织中不表达。

PIWIL2与肿瘤的发生、发展密切相关，是一个非常好的肿瘤诊断和治疗的靶点，更重要的是，由于其特殊的组织表达特征以及与乳腺癌发生、发展的关联性，使其成为一个非常理想的乳腺癌免疫治疗靶抗原。

最新研究发现，全长PIWIL2在肿瘤细胞中表达量比较低，在一些凋亡和正在凋亡的细胞中是检测不到的，而在肿瘤细胞中其剪接体PL2L60是显著表达的。

细胞毒性T细胞(CTL)的抗感染与抗肿瘤效应,主要是通过与MHC-Ⅰ类分子高亲和力结合的表位多肽触发细胞免疫应答来实现的。然而在胸腺发育过程中,许多针对高亲和力表位的T细胞克隆由于阴性选择已被清除,导致基于高亲和力表位的多肽疫苗在体试验疗效并不理想。因此,针对低亲和力表位进行适当改造,可最大限度地激活体内免疫应答,有望构建更为有效的多肽疫苗形式。

用CTL表位多肽疫苗免疫病人以诱导抗肿瘤T细胞反应，在早期的临床实验中己取得了初步的疗效，但总体来说反应率很低。主要原因在于表位多肽的低免疫原性及易被蛋白酶分解，通过对表位多肽进行修饰(包括单个氨基酸的替换、多肽的PMRI修饰和脂肽等)或采用多价疫苗则可有效提高其免疫原性，诱导更强的CTL活性。

CTL表位两端锚点残基的替换能够增强表位与MHC-I分子的亲和力。因为这些残基深深地埋藏在MHC-I类分子的口袋中，它不会影响TCR对p/MHC-I复合物的识别。除此之外，TCR和CTL表位主要是通过TCR的互补决定区3(CDR3)环处接触的，而互补决定区3（CDR3）是高度可变的。在TCR识别p/MHC复合物的前两步中，CDR3环对表位的完全包围是极其重要的。不同的TCRs以不同的方式和一个已知的p/MHC-I复合物进行结合。所以替换表位中部TCR识别的残基要依据它与TCR空间结合构象，使表位有效地和DR3结合，这样才能够有效地活化T细胞增殖，并使T细胞在体内保持较长时间的免疫应答能力。改造CTL表位应根据肿瘤病人各自的HLA类型及特点，这样就能有助于CTL表位对肿瘤细胞的特异性免疫反应。由于在中国HLA-A*02阳性人群在我国高达50%。所以本发明选择HLA-A*02限制性CTL表位具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对肿瘤细胞MCF-7具有一定杀伤力的PL2L60来源的CTL表位肽，同时本发明还提供了该肽在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的PL2L60来源的CTL表位肽为九肽，其氨基酸序列为：a -Leu-Gly-Gly-Glu -Leu-Trp-Gly-Val；其中a为D-Tyr、1-Nal、4-Cl-Phe或Phe。

当a为D-Tyr时，记为P281 1-D-Tyr，

其氨基酸序列为：D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。

当a为1-Nal时，记为P281 1-1-Nal，

其氨基酸序列为：1-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。

当a为4-Cl-Phe时，记为P281 1-4-Cl-Phe，

其氨基酸序列为：4-Cl-Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。

当a为Phe时，记为P281 1F。

其氨基酸序列为：Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。

上述的PL2L60来源的CTL表位肽在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。

本发明的优点在于针对低亲和力表位进行改造,筛选出能活化T细胞增殖，更有效的能激活体内免疫应答的改造肽。鉴定的九肽未见文献报道，为研制基于抗原PL2L60的肿瘤治疗性多肽疫苗提供了理论基础，并为后续多价的抗原肽疫苗、长肽疫苗、多表位疫苗等的构建奠定了基础。

附图说明

图1-5依次是表位肽P281、P281 1-D-Tyr、P281 1-1-Nal、1-4-Cl-Phe和P281 1F的质谱分析图。

图6、7是本发明表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞 MCF-7（HLA-A*0201-阳性，PL2L60-阳性）的杀伤作用。

图8是本发明表位肽诱导的特异性CTL分泌IFN-γ的能力。

具体实施方式

本发明所述的PL2L60来源的CTL表位肽为九肽，基础肽为P281，氨基酸序列为：Lys -Leu-Gly-Gly-Glu -Leu-Trp-Gly-Val，分子量为958.1；

当将第一位氨基酸改造为D-Tyr，记为P281 1-D-Tyr，氨基酸序列为：D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量为993.2。

当将第一位氨基酸改造为1-Nal，记为P281 1-1-Nal，氨基酸序列为：1-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量为1026.15。

当将第一位氨基酸改造为4-Cl-Phe，记为P281 1-4-Cl-Phe，氨基酸序列为：4-Cl-Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量为1011.46。

当将第一位氨基酸改造为Phe，记为P281 1F，氨基酸序列为：

Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量为977.1。

所述的PL2L60来源的CTL表位肽在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。

本发明采用理论与实践相结合的方法，根据抗原的一级结构，采用免疫信息学手段,运用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL 1.2和IEDB数据库对PL2L60蛋白抗原的HLA-A*0201限制性CTL表位进行了预测分析。分析预测的筛选，选择相对免疫活性较好的CTL表位P281，然后对P281进行了进一步的改造，得到了CTL表位P281 1-D-Tyr、P281 1-1-Nal、P281 1-4-Cl-Phe和P281 1F。即使用Tyr的类似物来替换抗原肽1位氨基酸残基，在设计Tyr类似物时保留其侧链的芳环，着重研究酚羟基的电荷特性、形成氢键的能力以及芳环大小在增强母体抗原肽结合力和免疫原性中的作用，为以后表位疫苗的构建打下基础。

所述表位肽P281 1-D-Tyr、P281 1-1-Nal、P281 1-4-Cl-Phe和P281 1F采用标准的Fmoc方案进行合成，经HPLC纯化后,其纯度大于90%，质谱分析并证实其分子量符合理论值。表位肽P281及P281 1-D-Tyr、P281 1-1-Nal、P281 1-4-Cl-Phe和P281 1F的质谱鉴定图见图1-5。

上述表位肽的合成及制备：采用固相合成法。基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的肽。经HPLC纯化后，其纯度大于90%，质谱分析并证实其分子量符合理论值。（参见：①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。②.N.休厄德、H.D.贾库布克著，刘克良等译，肽：化学与生物学，科学出版社，2005年）

本发明表位肽的人外周血单个核细胞（PBMCs）的分离与ELISPOT实验检测：

抽取健康供者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加白细胞介素2（IL-2，Peprotech公司）和人β₂微球蛋白诱导分化CTL细胞，进一步在体外LDH和ELISPOT实验进行验证。方法如下：

1、PBMCs的分离与诱导：（1）以40ml PBS（PH 7.2）稀释抗凝处理后的外周血40ml；（2）离心管中加入4ml Lymphoprep 分离液（Axis-Shield 公司）；（3）加8ml步骤（1）中稀释后的外周血于4ml Lymphoprep 分离液液面上；（4）20℃离心（2000rmp×20min）；（5）离心后，分为四层，弃去最上层，用玻璃吸管吸取第二层即白膜层（富含PBMCs）；（6）吸出的白膜层用PBS（pH 7.2）离心洗涤两次；（7）用24孔板铺板，细胞的浓度为1×10⁶/ml，每孔1ml；（8）第二天每孔加入3 μg人β₂微球蛋白和10 μg表位肽，同时设立PBS组（以PBS替代表位肽）作为阴性对照组；（9）第三天每孔加入50u IL-2；每2～3天换液，于七天后进行第二轮荷肽（即每孔补加50u IL-2、10 μg人β₂微球蛋白和10 μg表位肽/PBS），十四天后进行第三轮荷肽。第三轮荷肽后3天，得到效应细胞CTL，然后进行LDH实验和ELISPOT实验检测待测肽的作用。

2、LDH检测：使用CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（细胞毒性检测试剂盒，Promega公司）进行LDH试验检测细胞毒活性。步骤如下（详见试剂盒说明书）：

1）设立检测板（100μl/孔）

（1）设立实验组：以肿瘤细胞EC-9706（ATCC公司）作为靶细胞（最优靶细胞数：5000）按不同效靶比10:1 、20:1、40:1加入上述效应细胞CTL ；

（2）设立效应细胞自发释放组；

（3）设立靶细胞自发释放组；

（4）设立靶细胞最大释放组；

（5）设立体积校正对照组；

（6）设立背景对照组。

2）细胞裂解及收获上清

（1）37℃、5%CO₂孵育检测板（5h）；

（2）靶细胞最大释放组和体积校正对照组中加入裂解液，每100μl培养基中加入10μl裂解液（10×），收获上清前45min加入裂解液；

（3）250g离心4min，收获上清。

3）LDH检测

（1）转移50μl上清至另一孔板；

（2）50μl/孔迅速添加稀释的底物混合液，室温避光孵育30min；

（3）添加50μl终止溶液；

（4）将孔中含有的气泡去除，一小时内检测490nm吸收值OD。

细胞杀伤率计算公式如下：

杀伤率(%) =［(OD_实验组-OD_{效应细胞自发释放组}-OD_{靶细胞自发释放组})/( OD_{靶细胞最大释放组}-OD_{靶细胞自发释放组})］×100%

（注：所有实验组、效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组的吸收值均应减去背景平均吸收值；靶细胞最大释放组吸收值应减去体积校正对照组的平均吸收值）

结果见图6、7，由图6、7可知，表位肽诱导的特异性CTL对肿瘤细胞MCF-7（HLA-A*0201-阳性，PL2L60-阳性）均显示出一定的杀伤率。

3、 ELISPOT实验：具体实验步骤如下：（1）封闭：取出所需板条，用含5% FCS RPMI 1640培养基的培养基封闭，200μL /孔，室温下(25℃)静置5~10 min后将其扣出(FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反应)；（2）细胞上板：诱导的CTL作为效应细胞(1×10⁵/孔)，荷肽的T2A2细胞作为刺激细胞(1×10⁵/孔)铺板。100 μL/孔。细胞在孔中的分布要尽量均匀(加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板)；● 正对照：细胞浓度为1×10⁵/孔、加入10 μL PHA，该浓度能有效刺激 IFN-γ的分泌；● 背景负对照：加入100 μL的含5%FCS的RPMI 1640培养基；（3）加完所有的样品之后，盖上板盖，放入CO₂培养箱，37 ℃培养18h；（4）裂解细胞：倾倒孔内的细胞及培养基，200 μL/孔加入冰冷的去离子水，4 ℃冰浴反应10 min(低渗法裂解细胞)；（5）洗涤：倾倒孔内的液体，1×的Washing Buffer，200 μL/孔，洗涤5~7次，每次停留30~60 s，最后一次，在吸水纸上扣干；（6）加入检测抗体孵育：每孔加入100 μL稀释好的生物素标记检测抗体，37 ℃孵育1h；（7）洗涤：倾倒孔内的液体，1×的Washing Buffer，200 μL/孔，洗涤5次，每次停留时间为30~60 s，最后一次，在吸水纸上扣干；（8）酶联亲和素孵育：将稀释好的酶联亲和素工作液加入到实验孔，100 μL/孔， 37 ℃孵育1h；（9）洗涤：倾倒孔内的液体，1×的Washing Buffer，200uL/孔，洗涤5次，每次停留时间为30~60 s，最后一次，在吸水纸上扣干；（10）显色：解冻已配好的AEC显色液。每孔加入100 μL的显色液，室温静置15-45min(在20 -25°C，显色25min较合适)，注意避光；（11）终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，以去离子水洗涤3~5遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30min，让膜自然晾干；用 ELISPOT 图象分析仪计数96孔板中每孔形成的斑点数。

体外ELISPOT实验结果显示：候选肽P281 1-D-Tyr、P281 1-1-Nal、P281 1-4-Cl-Phe、P281 1F均能够在2名健康供者的外周血中诱导获得CTL，且获得的CTL经刺激后分泌较高量的IFN-γ（如图8）。

本发明鉴定出的肿瘤抗原的表位肽为研制基于抗原PL2L60的肿瘤治疗性多肽疫苗提供了理论基础，通过对表位多肽进行修饰有效提高其免疫原性，诱导出更强的CTL活性，并为后续多价的抗原肽疫苗、长肽疫苗、多表位疫苗等的构建奠定了基础。

Claims

1.PL2L60来源的CTL表位肽，其特征在于：所述的表位肽为九肽，其氨基酸序列为：a -Leu-Gly-Gly-Glu -Leu-Trp-Gly-Val；其中a为D-Tyr、1-Nal、4-Cl-Phe或Phe。

2.根据权利要求1所述的PL2L60来源的CTL表位肽，当a为D-Tyr时，其氨基酸序列为：D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。

3.根据权利要求1所述的PL2L60来源的CTL表位肽，当a为1-Nal时，其氨基酸序列为：1-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。

4.根据权利要求1所述的PL2L60来源的CTL表位肽，当a为4-Cl-Phe时，其氨基酸序列为：4-Cl-Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。

5.根据权利要求1所述的PL2L60来源的CTL表位肽，当a为Phe时，其氨基酸序列为：Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。

6.根据权利要求1-5任一所述的PL2L60来源的CTL表位肽在制备肿瘤治疗性多肽疫苗中的应用。