CN108929868B

CN108929868B - 抗肿瘤的组合多肽链及其制备方法和应用

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Publication number: CN108929868B
Application number: CN201710386423.5A
Authority: CN
Inventors: 林李家宓; 王晓梅; 林桂淼; 蒋文晓
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2037-05-26
Also published as: CN108929868A

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤的组合多肽链及其制备方法和应用，该抗肿瘤的组合多肽链包括依次连接的依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C‑末端多肽TERT‑C27，第一连接片段和第二连接片段均包括至少三个连接氨基酸，连接氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种。该组合多肽链能够有效的抑制肿瘤的生长，体内抗肿瘤效果好。

Description

抗肿瘤的组合多肽链及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗肿瘤的组合多肽链及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤极大地危害人类的健康，是全球性的公共卫生问题之一。肿瘤的免疫治疗可以刺激机体免疫系统对肿瘤的攻击，端粒酶逆转录酶(telomerase reversetranscriptase，TERT)是端粒酶的催化肽亚基，它在超过85％的人类肿瘤细胞内高表达，但在正常体细胞中却表达极低或完全不表达，这使得它成为了肿瘤免疫治疗的理想靶标。用TERT特异性细胞毒T淋细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫小鼠可以触发抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞反应，并且能够杀死TERT阳性的多种组织内的肿瘤细胞。通过计算机程序筛选TERT氨基酸序列中能够结合人类白细胞抗原Ⅰ类或Ⅱ类蛋白质，并引发TERT特异性免疫应答的表位，发现了许多TERT肽，包括P540、P572、P672和P973等等，单个的抗原表位肽在体外能够使得TERT特异性CTL或辅助T细胞应答，但这些TERT肽在体内抗肿瘤效果不够理想。

发明内容

基于此，有必要提供一种体内抗肿瘤效果较好的抗肿瘤的组合多肽链及其制备方法和应用。

一种抗肿瘤的组合多肽链，包括依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27，所述第一连接片段和所述第二连接片段均包括至少三个连接氨基酸，每个所述连接氨基酸独立地选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种。

在一个实施方式中，所述TERT抗原表位肽P572的N-末端、所述TERT抗原表位肽P672的N-末端和所述TERT抗原表位肽P540的N-末端分别设有起始密码子。

在一个实施方式中，所述TERT-C27的N-末端设有起始密码子，所述TERT抗原表位肽P540直接与所述TERT-C27的起始密码子连接。

在一个实施方式中，所述TERT-C27的为：

(a)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)、与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽，或

(c)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。

在一个实施方式中，所述TERT-C27的为：

(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；

(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或

(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。

在一个实施方式中，所述组合多肽链为：

(a)、由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)、与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽，或

(c)、由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。

在一个实施方式中，所述组合多肽链为：

(a)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；

(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或

(c)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。

一种上述的抗肿瘤的组合多肽链的制备方法，包括如下步骤：

提供基因表达载体，所述基因表达载体中含有目的基因表达片段，所述目的基因表达片段用于表达抗肿瘤的组合多肽链，所述组合多肽链包括依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27，所述第一连接片段和所述第二连接片段均包括至少三个连接氨基酸，所述连接氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种；

将所述目的基因表达载体转染到宿主细胞中，并对转染后的所述宿主细胞进行诱导表达，得到所述抗肿瘤的组合多肽链。

上述抗肿瘤的组合多肽链在制备抗肿瘤的药物中的应用。

上述抗肿瘤的组合多肽链在制备抗黑素瘤的药物中的应用。

上述抗肿瘤的组合多肽链包括依次连接的依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27，第一连接片段和第二连接片段均包括至少三个连接氨基酸，每个连接氨基酸独立地选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种。发明人在TERT抗原表位肽的选择、抗原表位肽的连接顺序、连接片段的序列以及组合的多肽等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将TERT抗原表位肽P572、TERT抗原表位肽P672、TERT抗原表位肽P540和TERT的C-末端多肽TERT-C27连接形成的组合多肽链，与对照组相比能够更加有效的抑制肿瘤的生长，体内抗肿瘤效果好。

附图说明

图1为一实施方式的抗肿瘤的组合多肽链的示意图；

图2为人源的端粒酶逆转录酶(hTERT)的示意图；

图3为人源的端粒酶逆转录酶(hTERT)的C-末端多肽TERT-C27的示意图；

图4为一实施方式的抗肿瘤的组合多肽链的制备方法的流程图；

图5为实施例1中所用的载体pcDNA3.1骨架载体的图谱；

图6为实施例1中获得的重组载体pSAg8的图谱；

图7为实施例1中获得的融合质粒pSAg8-C27载体的图谱；

图8为对比例1的多肽链SAg7-C27的示意图；

图9为小鼠体内注射实验组和对照组的腺病毒载体后肿瘤体积的统计图；

图10为小鼠体内注射实验组和对照组的腺病毒载体后小鼠的生存率的统计图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

请参阅图1，一实施方式的抗肿瘤的组合多肽链的示意图，该组合多肽链包括依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27。第一连接片段和第二连接片段均包括至少三个连接氨基酸，连接氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种。

具体地，第一连接片段(Linker-1)和第二连接片段(Linker-2)均包括至少三个连接氨基酸，连接氨基酸选自甘氨酸(缩写为G)、丝氨酸(缩写为S)和丙氨酸(缩写为A)中的一种。本实施方式中，第一连接片段包括三个连接氨基酸，依次为丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸(A-G-G)。第二连接片段包括三个连接氨基酸，依次为甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸(G-S-G)。其他实施方式中，第一连接片段和第二连接片段的氨基酸还可以是其他的组合方式，例如甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸(G-A-G)等等。甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸的氨基酸残基片段较小，既能将抗原表位肽P572、抗原表位肽P672以及抗原表位肽P540有效的连接，进而表达形成组合的多肽链，又能将抗原表位肽的三个表位之间进行分割，不影响相互的免疫性能。

具体地，TERT抗原表位肽P572的N-末端、TERT抗原表位肽P672的N-末端和TERT抗原表位肽P540的N-末端分别设有起始密码子，促进下游基因的表达，从而容易表达获得该抗肿瘤的组合多肽链。起始密码子的碱基例如可以为ATG(编码后形成的Met氨基酸)等。

具体地，当通过载体表达该抗肿瘤的组合多肽链时，该组合多肽链的表达序列上还设有酶切位点例如Hindll酶切位点、BamHI酶切位点以及Kpnl酶切位点等，以及表达的终止片段(Stop codons)。

具体地，TERT的C-末端多肽TERT-C27为人源的端粒酶逆转录酶(hTERT)C-端27Kda的肽段。请参阅图2和图3，人源的端粒酶逆转录酶(hTERT)的完整序列示意图以及TERT-C27的示意图。结构上，hTERT-C27多肽包含hTERT的C-端251个碱基(882-1132)，还包含了核输出信号(残基970-981)以及14-3-3结合两性分子螺旋(残基1030-1047)负责hTERT核转位。但是所有的端粒酶RNA结合结构域和大多数的保守的逆转录酶结构域被删除。有研究表明TERT的C-末端多肽对于肝癌和恶性黑色素瘤均有治疗作用。除了直接的肿瘤杀伤作用以外，TERT-C27可以激活机体的免疫系统进行肿瘤杀伤，并强烈激活NK细胞，进而提高机体对肿瘤细胞的杀伤能力。这一新发现有别于TERT肽激活细胞毒性T细胞(CTL)或者辅助T细胞而发挥抑瘤作用的机制。

本实施方式中，TERT-C27的N-末端连接有起始密码子，TERT抗原表位肽P540直接与TERT-C27的起始密码子连接。研究结果表明，本发明中将TERT抗原表位肽P572、TERT抗原表位肽P672、TERT抗原表位肽P540与TERT-C27连接组合形成的抗肿瘤的组合多肽链对黑色素瘤的抑制作用要好于抗原表位肽P572、抗原表位肽P672、抗原表位肽P540以及TERT-C27单独作用的总和，具有预料不到的技术效果。

本实施方式中，TERT-C27的为：(a)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽，或(c)、由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。

进一步地，TERT-C27的为：(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。

具体地，TERT抗原表位肽P572、TERT抗原表位肽P672、TERT抗原表位肽P540以及TERT-C27在连接片段的作用下连接组合形成的抗肿瘤的组合多肽链为：(a)、由SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)、与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽，或(c)、由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的多肽，其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽。

进一步地，该组合多肽链为：(a)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。

本实施方式中，TERT抗原表位肽P572、TERT抗原表位肽P672、TERT抗原表位肽P540以及TERT-C27在连接片段的作用下连接组合形成的抗肿瘤的组合多肽链为由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的多肽，该抗肿瘤的多肽由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到。可以理解，由于编码同一种氨基酸的密码子有多种，多肽的编码序列具有多态性及变异的特点。因此与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的多肽具有至少98％同源性的多肽或至少一种改变(如其中一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加得到的多肽)，或与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列具有至少98％同源性的核苷酸序列或至少一种改变(如编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代，或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)对应的核苷酸序列，如果构建到表达载体中，得到的多肽与本申请中包括TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27依次连接的形成的组合多肽链没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

上述抗肿瘤的组合多肽链将TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27依次连接形成的组合多肽链，能够刺激树突细胞并引发TERT特异性CTL或辅助T细胞应答，有效的抑制肿瘤的生长，体内抗肿瘤效果好。

请参阅图4，本申请还提供一种上述的抗肿瘤的组合多肽链的制备方法，包括如下步骤S110～S120。

S110、提供基因表达载体，该基因表达载体中含有目的基因表达片段，所述目的基因表达片段用于表达抗肿瘤的组合多肽链，组合多肽链包括依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27，所述第一连接片段和所述第二连接片段均包括至少三个连接氨基酸，连接氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸中的一种。

具体地，S110中的基因表达载体通过以下方法构建：

S111、设计表达TERT的C-末端多肽TERT-C27的TERT-C27基因表达片段，具体地，TERT-C27基因表达片段参见SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。上述设计的基因表达片段通过DNA合成完成，合成的基因表达片段采用Invitrogen公司的Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒转化进入pCR-Blunt II-TOPO载体中克隆。然后克隆的基因表达片通过限制性内切酶(例如KpnI)酶切后连接到pcDNA3.1载体中得到pcDNA3.1-TERT-C27重组载体。

S112、进一步设计TERT抗原表位肽基因片段，具体地，TERT抗原表位肽基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。该TERT抗原表位肽基因片段包括用于编码TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段和TERT抗原表位肽P540的序列，此外，还在基因表达片段的前端增加酶切位点，使得基因表达片段能够顺利表达。将该TERT抗原表位肽基因片段连接到S110中得到的pcDNA3.1-TERT-C27重组载体内，获得融合质粒。

S113、采用融合质粒对目的基因表达片段进行扩增，获得大量的目的基因表达片段。目的基因片段包括编码依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27的序列。具体扩增方法为将扩增的融合质粒进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将约为0.83kb片段大小的目的基因片段进行纯化回收。

S114、将目的基因片段连接到腺病毒表达载体pAd/CMV/DEST中，得到基因表达载体。该基因表达载体能够用于表达抗肿瘤的组合多肽链。具体地，该基因表达载体能够表达获得如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的多肽。

S120、将S110中的基因表达载体转染到宿主细胞中，并对转染后的宿主细胞进行诱导表达，得到抗肿瘤的组合多肽链。

具体地，宿主细胞例如为293A细胞，腺病毒表达载体pAd/CMV/DEST转染进入宿主细胞后，表达载体中的目的基因表达片段得以扩增，形成抗肿瘤的多肽。

具体地，对宿主细胞诱导表达后，收集宿主细胞的裂解液，获得含有抗肿瘤的组合多肽链的腺病毒，并将腺病毒脱盐纯化。具体纯化过程如下：向收集的腺病毒中添加固体氯化铯(CsCl)，离心形成密度梯度，按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定，收集富集有腺病毒的组分。将腺病毒装入透析袋，在4℃下透析脱盐过夜纯化，获得纯化的腺病毒。该腺病毒中含有抗肿瘤的多肽，抗肿瘤多肽的序列在前文已经给出，在此不再重复。

进一步的，还包括测试纯化的腺病毒的病毒滴度，具体为通过组织培养感染剂量50方法(AdEasy Vector System Application Manual；Qbiogene,Carlsbad,CA)进行测定。

纯化后的腺病毒可储存在病毒储存缓冲液中，置于-80℃冰箱中储存，病毒储存缓冲液具体包括：10mM Tris，2mM氯化镁,4％蔗糖，pH 8.0。

可以理解，上述操作不限于采用上述次序执行，比如基因表达载体可通过购买的方式获得，或根据本发明的构思提前构建好了基因表达载体。

上述抗肿瘤的组合多肽链的制备方法，步骤简单，通过制备高效、稳定地表达抗肿瘤的组合多肽链的腺病毒，从而获得抗肿瘤的组合多肽链。

此外，本文还提供一实施方式的抗肿瘤的组合多肽链在制备抗肿瘤的药物中的应用。

进一步地，该抗肿瘤的组合多肽链在制备抗黑素瘤的药物中的应用。

上述抗肿瘤的组合多肽链可作为药物，药物中包括上述的抗肿瘤的组合多肽链。抗肿瘤的组合多肽链的序列在前文已经给出，在此不再重复。

具体地，该抗肿瘤的药物可以是用于预防肿瘤的疫苗，也可以是用于治疗已经确诊为肿瘤甚至癌症的药物。

进一步地，该抗肿瘤的药物具体为抗黑素瘤的药物。

实验结果表明，上述抗肿瘤的组合多肽链能够刺激树突细胞并引发TERT特异性CTL或辅助T细胞应答，有效的抑制肿瘤的生长，体内抗肿瘤效果好。因此，该抗肿瘤的组合多肽链可开发成为一种抗肿瘤的药物，在制备治疗肿瘤的药物中具有良好的应用前景。

下面为具体实施例部分

以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。所有操作均采用本领域标准操作过程，所采用的试剂或载体等均为常规试剂或常规载体。

实施例1

设计与合成包括TERT抗原表位肽和TERT的C-末端多肽TERT-C27的新型组合多肽链SAg8-C27

SAg8-C27的示意图请参阅图1，包括依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27。SAg8-C27的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，SAg8-C27的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。根据要表达的SAg8-C27设计基因表达片段，设计时在基因表达片段的前端增加酶切位点，每一个抗原表位之间由编码三个自然和小的氨基酸残基的碱基序列进行分割(第一连接片段与第二连接片段)，为促进下游基因的表达，分别在开始的每个抗原表位肽的序列之前加入一个起始密码子ATG，在最后的基因表达片段的后面添加了两个终止密码子，使得基因表达片段能够顺利表达。

设计C27的基因表达片段，具体地C27基因表达片段含有927对碱基，具体碱基序列参见SEQ ID No.2。设计的基因表达片段通过DNA合成服务公司完成。将TERT-C27基因表达片段用Invitrogen公司的Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒克隆进入pCR-Blunt II-TOPO载体中。将克隆后的基因表达片段通过KpnI酶切位点克隆到pcDNA3.1载体CMV启动子的下游，得到pcDNA3.1-TERT-C27重组载体。pcDNA3.1骨架载体的图谱如图5所示。

进一步设计表达TERT抗原表位肽(SAg8)的基因片段，该SAg8基因表达片段用于编码依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段和TERT抗原表位肽P540。具体设计的SAg8基因表达片段含有162对碱基，具体碱基序列如SEQID No.5所示。将设计的SAg8基因表达片段通过HindIII/EcoRI双酶切位点克隆到pcDNA3.1载体CMV启动子的下游，获得重组载体pSAg8(重组载体pSAg8的结构请参阅图6)，将重组载体pSAg8表达的产物进行双酶切，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将0.16kb的片段大小的基因产物进行纯化回收，回收的产物用HindIII/KpnI进行双酶切。酶切后的基因表达片段别连接至pcDNA3.1-TERT-C27重组载体相应的酶切位点，从而获得融合质粒pSAg8-C27。获得融合质粒的连接位点经自动测序仪确认没有终止密码而且是在同一个阅读框里。融合质粒pSAg8-C27载体结构请参阅图7。将融合质粒pSAg8-C27表达的产物进行双酶切，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将0.83kb的片段大小的基因产物进行纯化回收，获得目的基因片段(表达SAg8-C27S的cDNA)。将目的基因片段分别克隆进入腺病毒表达载体pAd/CMV/DEST(Invitrogen)中，从而获得pAdv质粒(基因表达载体)。将该重组的腺病毒pAdv质粒转染293A细胞中。随后，对转染后的腺病毒进行诱导表达，收集腺病毒。并将收集的腺病毒浓缩液中添加固体氯化铯(CsCl)，离心形成密度梯度，按顺序分步收集不同密度的样品，取样进行滴度测定。收集富集有腺病毒的组分。将腺病毒装入透析袋，在4℃下透析脱盐过夜纯化，纯化后获得表达SAg8-C27的腺病毒(rAdv-SAg8-C27)，该腺病毒中含有抗肿瘤的多肽。纯化后的腺病毒储存在病毒储存缓冲液中，置于-80℃冰箱中储存，病毒储存缓冲液具体包括：10mM Tris，2mM氯化镁,4％蔗糖，pH 8.0。并通过组织培养感染剂量50方法(AdEasyVector System Application Manual；Qbiogene,Carlsbad,CA)测试纯化的腺病毒的病毒滴度。

对比例1

设计与合成包括TERT抗原表位肽和TERT的C-末端多肽TERT-C27的新型组合多肽链SAg7-C27

SAg7-C27的示意图请参阅图8，包括依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27。SAg7-C27的氨基酸序列如SEQID No.6所示，SAg7-C27的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。设计以及合成SAg7-C27的方法与实施例1相似，不同的是设计表达TERT抗原表位肽(SAg7)的基因片段用于编码依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、和TERT抗原表位肽P540。具体设计的SAg7基因表达片段含有105对碱基，具体碱基序列如SEQ ID No.7所示。将设计的SAg7基因表达片段通过HindIII/EcoRI双酶切位点克隆到pcDNA3.1载体CMV启动子的下游，获得重组载体pSAg7，将重组载体pSAg7表达的产物进行双酶切，并将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将0.10kb的片段大小的基因产物进行纯化回收，回收的产物用HindIII/KpnI进行双酶切。酶切后的基因表达片段别连接至pcDNA3.1-TERT-C27重组载体相应的酶切位点，从而获得融合质粒pSAg7-C27。融合质粒pSAg7-C27参见实施例1操作转染进入293A细胞中，纯化后获得表达SAg7-C27的腺病毒(rAdv-SAg7-C27)。

对比例2

设计与合成TERT的C-末端多肽TERT-C27

按照实施例1的方法构建pcDNA3.1-TERT-C27重组载体，将pcDNA3.1-TERT-C27重组载体表达的产物克隆进入腺病毒表达载体pAd/CMV/DEST(Invitrogen)中，并按实施例1的方法转染到293A细胞，纯化后获得表达C27的腺病毒(rAdv-C27)。

抗肿瘤的组合多肽链对小鼠黑素瘤抗肿瘤免疫治疗

1)动物、细胞、抗体和试剂

雌性C57BL/6小鼠(6～8周龄)在无菌条件下饲养，并根据深圳实验动物单位发布的指南进行饲养。小鼠黑素瘤B16-F1(ATCC，CRL-6323)在37℃、5％CO₂环境中培养，培养液DMEM中需添加10％热灭活的FBS，培养基中添加100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)。

2)制备携带SAg8-C27的重组腺病毒载体(rAdv-SAg8-C27)、携带SAg7-C27的重组腺病毒载体(rAdv-SAg7-C27)以及携带TERT-C27的重组腺病毒载体(rAdv-C27)的制备

参见实施例1的方法制备携带组合多肽链SAg8-C27的重组腺病毒载体(rAdv-SAg8-C27)。

参见对比例1的方法制备携带组合多肽链SAg7-C27的重组腺病毒载体(rAdv-SAg7-C27)。

参见对比例2的方法制备携带C27的重组腺病毒载体(rAdv-C27)。

同样参见实施例1的方法制备携带EGFP的重组腺病毒载体(rAdv-EGFP)作为对照重组病毒，使用前-80℃保存。

3)皮下肿瘤接种

在黑素瘤B16细胞指数生长期用胰蛋白酶消化收获，随后用冰冷的PBS洗涤两次，最后以2×10⁶个/mL的细胞浓度重悬于冰冷的PBS中。在C57BL/6小鼠皮下注射B16细胞(2×10⁶个/只)。7天后，将每只肿瘤约0.2cm³～0.4cm³的小鼠每3天接受1回皮下肿瘤内注射腺病毒载体rAdv-SAg8-C27、rAdv-SAg7-C27、rAdv-C27或rAdv-EGFP，腺病毒载体的病毒滴度为2.5×10⁹pfu。

4)统计分析

通过公式V＝1/2×S×L计算肿瘤体积(V)，其中S和L分别是肿瘤的最短和最长直径。用Student-T检验用于比较实验组之间的肿瘤体积，P＜0.05认为具有统计学显著性差异。结果见图9所示，具体的数据如下表1所示。

表1：实验组和对照组的小鼠肿瘤体积

Group

Day1

Day2

Day3

Day4

Day5

Day6

Day7

Day8

Day9

EGFP

78±16

200±35

250±35

325±50

475±60

650±55

845±60

975±75

1050±80

C27

56±17

190±26

210±30

280±35

325±35

570±40

675±50

780±30

805±65

SAg7-C27

92±26

180±28

205±42

268±32

380±45

450±56

521±80

660±150

709±85

SAg8-C27

49±14

105±18

120±40

149±30

190±30

190±40

190±35

200±50

205±65

此外，还统计了实验组和对照组小鼠的生存时间，具体的数据如下表2所示，生存率作图结果见图10所示。

表2：实验组和对照组的小鼠的生存时间

Group(n＝5)	Survial(days)	Median survival(days)
			EGFP	15，26，32，32，56	32
C27	35，39，53，61，75	53
			SAg7-C27	40，45，55，65，76	55
SAg8-C27	43，62，72，99，119	72

实验结果表明，实验组多肽链SAg8-C27与对照组EGFP、C27以及SAg7-C27相比能够更有效地抑制C57BL/6小鼠中B16黑素瘤的生长(图9，表1)，并延长小鼠的生存时间(图10，表2)。说明包括依次连接的TERT抗原表位肽P572、第一连接片段、TERT抗原表位肽P672、第二连接片段、TERT抗原表位肽P540以及TERT的C-末端多肽TERT-C27的组合多肽链体内抗肿瘤效果好。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳大学

<120> 抗肿瘤的组合多肽链及其制备方法和应用

<130> sdf

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala Leu Gly Gly Thr

1 5 10 15

Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro Trp Cys Gly Leu

20 25 30

Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp Tyr Ser Ser Tyr

35 40 45

Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn Arg Gly Phe Lys

50 55 60

Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val Leu Arg Leu Lys

65 70 75 80

Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val

85 90 95

Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala Tyr Arg Phe His

100 105 110

Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val Trp Lys Asn Pro

115 120 125

Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser

130 135 140

Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala

145 150 155 160

Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala

165 170 175

Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu

180 185 190

Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly

195 200 205

Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser

210 215 220

Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp

225 230

<210> 2

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgacagtgg tgaacttccc tgtagaagac gaggccctgg gtggcacggc ttttgttcag 60

atgccggccc acggcctatt cccctggtgc ggcctgctgc tggatacccg gaccctggag 120

gtgcagagcg actactccag ctatgcccgg acctccatca gagccagtct caccttcaac 180

cgcggcttca aggctgggag gaacatgcgt cgcaaactct ttggggtctt gcggctgaag 240

tgtcacagcc tgtttctgga tttgcaggtg aacagcctcc agacggtgtg caccaacatc 300

tacaagatcc tcctgctgca ggcgtacagg tttcacgcat gtgtgctgca gctcccattt 360

catcagcaag tttggaagaa ccccacattt ttcctgcgcg tcatctctga cacggcctcc 420

ctctgctact ccatcctgaa agccaagaac gcagggatgt cgctgggggc caagggcgcc 480

gccggccctc tgccctccga ggccgtgcag tggctgtgcc accaagcatt cctgctcaag 540

ctgactcgac accgtgtcac ctacgtgcca ctcctggggt cactcaggac agcccagacg 600

cagctgagtc ggaagctccc ggggacgacg ctgactgccc tggaggccgc agccaacccg 660

gcactgccct cagacttcaa gaccatcctg gac 693

<210> 3

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Tyr Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Ala Gly Gly Met Arg Pro

1 5 10 15

Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile Gly Ser Gly

20 25 30

Met Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu Gly Ser Gly Thr Met Thr

35 40 45

Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe

50 55 60

Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu

65 70 75 80

Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg

85 90 95

Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly

100 105 110

Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val Leu Arg Leu Lys Cys His

115 120 125

Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr

130 135 140

Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys

145 150 155 160

Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe

165 170 175

Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu

180 185 190

Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly

195 200 205

Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu

210 215 220

Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser

225 230 235 240

Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr

245 250 255

Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe

260 265 270

Lys Thr Ile Leu Asp

275

<210> 4

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtacctct ttttctaccg gaagagtgtc gccggcggaa tgcgacccgg cctcctgggc 60

gcctctgtgc tgggcctgga cgatatcgga tccggtatga tcctggccaa gttcctgcac 120

tggctgggat ccggtaccat gacagtggtg aacttccctg tagaagacga ggccctgggt 180

ggcacggctt ttgttcagat gccggcccac ggcctattcc cctggtgcgg cctgctgctg 240

gatacccgga ccctggaggt gcagagcgac tactccagct atgcccggac ctccatcaga 300

gccagtctca ccttcaaccg cggcttcaag gctgggagga acatgcgtcg caaactcttt 360

ggggtcttgc ggctgaagtg tcacagcctg tttctggatt tgcaggtgaa cagcctccag 420

acggtgtgca ccaacatcta caagatcctc ctgctgcagg cgtacaggtt tcacgcatgt 480

gtgctgcagc tcccatttca tcagcaagtt tggaagaacc ccacattttt cctgcgcgtc 540

atctctgaca cggcctccct ctgctactcc atcctgaaag ccaagaacgc agggatgtcg 600

ctgggggcca agggcgccgc cggccctctg ccctccgagg ccgtgcagtg gctgtgccac 660

caagcattcc tgctcaagct gactcgacac cgtgtcacct acgtgccact cctggggtca 720

ctcaggacag cccagacgca gctgagtcgg aagctcccgg ggacgacgct gactgccctg 780

gaggccgcag ccaacccggc actgccctca gacttcaaga ccatcctgga c 831

<210> 5

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtaaagctta tgtacctctt tttctaccgg aagagtgtcg ccggcggaat gcgacccggc 60

ctcctgggcg cctctgtgct gggcctggac gatatcggat ccggtatgat cctggccaag 120

ttcctgcact ggctgggatc cggtacctga tgaggtaccg ta 162

<210> 6

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Tyr Leu Phe Phe Tyr Arg Lys Ser Val Ala Gly Gly Met Ile Leu

1 5 10 15

Ala Lys Phe Leu His Trp Leu Gly Ser Gly Thr Met Thr Val Val Asn

20 25 30

Phe Pro Val Glu Asp Glu Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met

35 40 45

Pro Ala His Gly Leu Phe Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg

50 55 60

Thr Leu Glu Val Gln Ser Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile

65 70 75 80

Arg Ala Ser Leu Thr Phe Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met

85 90 95

Arg Arg Lys Leu Phe Gly Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe

100 105 110

Leu Asp Leu Gln Val Asn Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr

115 120 125

Lys Ile Leu Leu Leu Gln Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln

130 135 140

Leu Pro Phe His Gln Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg

145 150 155 160

Val Ile Ser Asp Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys

165 170 175

Asn Ala Gly Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro

180 185 190

Ser Glu Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu

195 200 205

Thr Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr

210 215 220

Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala

225 230 235 240

Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile

245 250 255

Leu Asp

<210> 7

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgtacctct ttttctaccg gaagagtgtc gccggcggaa tgatcctggc caagttcctg 60

cactggctgg gatccggtac catgacagtg gtgaacttcc ctgtagaaga cgaggccctg 120

ggtggcacgg cttttgttca gatgccggcc cacggcctat tcccctggtg cggcctgctg 180

ctggataccc ggaccctgga ggtgcagagc gactactcca gctatgcccg gacctccatc 240

agagccagtc tcaccttcaa ccgcggcttc aaggctggga ggaacatgcg tcgcaaactc 300

tttggggtct tgcggctgaa gtgtcacagc ctgtttctgg atttgcaggt gaacagcctc 360

cagacggtgt gcaccaacat ctacaagatc ctcctgctgc aggcgtacag gtttcacgca 420

tgtgtgctgc agctcccatt tcatcagcaa gtttggaaga accccacatt tttcctgcgc 480

gtcatctctg acacggcctc cctctgctac tccatcctga aagccaagaa cgcagggatg 540

tcgctggggg ccaagggcgc cgccggccct ctgccctccg aggccgtgca gtggctgtgc 600

caccaagcat tcctgctcaa gctgactcga caccgtgtca cctacgtgcc actcctgggg 660

tcactcagga cagcccagac gcagctgagt cggaagctcc cggggacgac gctgactgcc 720

ctggaggccg cagccaaccc ggcactgccc tcagacttca agaccatcct ggac 774

Claims

1.一种抗肿瘤的组合多肽，其特征在于，所述组合多肽为由SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.分离的核酸，其特征在于，其编码权利要求1所述的组合多肽，所述核酸的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。

3.一种如权利要求1所述的抗肿瘤的组合多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

提供基因表达载体，所述基因表达载体中含有目的基因表达片段，所述目的基因表达片段用于表达抗肿瘤的组合多肽；

将所述目的基因表达载体转染到宿主细胞中，并对转染后的所述宿主细胞进行诱导表达，得到所述抗肿瘤的组合多肽。

4.如权利要求1所述的抗肿瘤的组合多肽在制备抗肿瘤的药物中的应用。

5.如权利要求1所述的抗肿瘤的组合多肽在制备抗黑素瘤的药物中的应用。