CN113336862A - 一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途，属于生物药学技术领域。本发明的重组蛋白包括结核分枝杆菌热休克蛋白65与6段串联重复的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白第33‑55位的具有多发性硬化自身免疫抗原特征的抗原表位多肽。上述的抗多发性硬化的重组蛋白用于制备多发性硬化疫苗和/或制备多发性硬化药物的用途。本发明能起到预防多发性硬化的作用且可以避免当前的大多数疾病修正治疗药物(DMTs)所带来的副作用。

Description

一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物药学技术领域，尤其涉及一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种以中枢神经系统脱髓鞘为特征的自身免疫性炎症性神经退行性疾病。临床表现有感觉丧失、肌肉无力、言语困难、头晕、运动障碍甚至瘫痪等症状，不同症状取决于脑和脊髓的病变部位，MS至今尚无有效的治愈方法。临床常用疾病修正治疗药物(disease modifying therapies,DMTs)治疗MS，目前已有的DMTs药物包括：一线药物有干扰素(IFN-β1b，IFN-β1a)、醋酸盐格拉替雷(GA)；二线药物有富马酸二甲酯、芬戈莫德、特立氟胺、米托蒽醌、那他珠单抗、阿伦单抗等，但这种治疗方法只是降低疾病的复发率，延缓疾病的发展，另外，这些药物对MS的重症患者通常无效，并且会带来很大的副作用。
MS是中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫性疾病，诱发髓鞘特异性免疫耐受的抗原特异性疫苗有望成为安全有效的MS治疗药物。自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。在预防自身免疫性疾病的研究中，利用自身抗原开发疫苗是目前备受关注的方法。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)是诱发MS的主要自身抗原之一，其胞膜外区有三个致脑炎抗原表位，其中MOG35-55(35MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK55)是MOG中的一段21个氨基酸组成多肽，是关键的抗原表位，它可以诱导C57BL/6小鼠出现典型的慢性-非缓解性实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)症状，MOG35-55抗原肽诱发的C57BL/6小鼠EAE模型是目前普遍使用的经典MS动物模型。自身抗原在自身免疫性疾病中扮演着双刃剑的角色，一方面，自身抗原是介导疾病发生的诱因，在疾病的发生发展过程中起到关键性的作用；另一方面，如果采用合适的免疫策略如可通过适当的免疫途径、剂量和周期来免疫自身抗原，有针对性地调节对自身抗原的免疫应答，进而诱发机体产生免疫耐受或者良性的调节性免疫应答，从而起到预防自身免疫性疾病的作用。
有鉴于此，有必要研究一种能代替现有DMTs药物的含有MOG35-55抗原肽，通过改变免疫方式及诱导针对性地免疫调节，可以对自身抗原产生免疫耐受的药物成分，用于抗多发性硬化。
发明内容
本发明的目的在于提出一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途，该重组蛋白由HSP65蛋白和MOG35-55蛋白组成，其能起到预防多发性硬化的作用。
本发明的另一个目的在于提出上述抗多发性硬化的重组蛋白的制备方法，该制备方法可靠性强。
本发明的又一个目的在于提出上述抗多发性硬化的重组蛋白的用途，该蛋白用于制备多发性硬化疫苗和/或用于制备多发性硬化药物，可达到较好的效果。
本发明的再一个目的在于提出上述多发性硬化疫苗或多发性硬化药物的施用方法，以滴鼻方式施用，该途径安全有效。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种抗多发性硬化的重组蛋白，该重组蛋白包括HSP65蛋白和抗原表位多肽MOG35-55蛋白。
进一步的，该重组蛋白包括一个HSP65蛋白和六段串联重复的抗原表位多肽MOG35-55蛋白，即所述重组蛋白包括HSP65和6MOG35-55。
进一步的，所述HSP65蛋白和六段串联重复的抗原表位多肽MOG35-55蛋白之间，通过柔性接头连接。
进一步的，所述HSP65蛋白和六段串联重复的抗原表位多肽MOG35-55蛋白之间以Ala-Ser-Ala柔性接头连接。
进一步的，所述重组蛋白序列为SEQ ID NO.1。
一种抗多发性硬化的重组蛋白的制备方法，该方法用于制备上述的抗多发性硬化的重组蛋白；该方法包括以下步骤：
(1)构建重组质粒pET28a-His-HSP65-6MOG35-55，获得具有该重组质粒的工程菌；
(2)对以LB培养基工程菌进行培养，当菌体达到对数生长期时，培养基中加入无菌0.5mol/L乳糖溶液至终浓度为5mmol/L，继续培养7小时后收集菌体；
(3)以收集的菌体分离融合蛋白和对融合蛋白纯化，得到所述的抗多发性硬化的重组蛋白。
进一步的，所述步骤(1)包括以下步骤：
将6MOG35-55的密码子插入pET-28a(+)，获得质粒pET28a-6MOG35-55；
以为质粒pET28a-6MOG35-55模板进行PCR，扩增获得编码6MOG35-55序列的目的基因片段；
将pET28a-His-HSP65-6P277载体经NheI、HindIII双酶切，得到线性化克隆载体；
将编码6MOG35-55序列的目的基因片段和线性化克隆载体重组，得到重组质粒，将重组质粒转化到感受态细胞并以PCR进行阳性克隆的筛选，对筛选所得阳性克隆体进行验证，最终得到具有该重组质粒的工程菌。
进一步的，所述步骤(3)中：
取收集的菌体裂解和冰上超声破碎，分别取上清液和沉淀进行分析，确定融合蛋白为包涵体；
以含有尿素的包涵体溶解液处理包涵体，收集上清液，用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化目的蛋白，得到重组蛋白His-HSP65-6MOG35-55。
上述的抗多发性硬化的重组蛋白用于制备多发性硬化疫苗和/或制备多发性硬化药物的用途。
进一步的，所述多发性硬化疫苗或多发性硬化药物以滴鼻方式施用。
本发明实施例的有益效果为：
该重组蛋白包括HSP65蛋白和MOG35-55蛋白。EAE小鼠模型可以很好地反应出结核杆菌HSP65和人HSP60的免疫反应性。HSP65在这里作为分子伴侣，也可作为分子载体起辅助T细胞表位的作用，并被抗原提呈细胞的MHCII分子所识别，从而激发机体内CD4+细胞的分化增殖。热休克蛋白还具有佐剂作用，如HSP作为一个免疫危险信号激活天然免疫，刺激DC上调MHC(class I and II)和共刺激分子水平。另外，巨噬细胞、DC和NK细胞等表面均存在HSP受体，HSP可与APC上的受体结合，经MHC-I途径将抗原肽递呈在APC表面，诱导特异的免疫应答，并在细胞介导的免疫反应中发挥免疫调节功能。
为了提高MOG35-55的免疫原性，在本发明中将MOG35-55进行6次重复串联，可以充分发挥氨基酸片段的免疫效力。HSP65与6MOG35-55之间加入柔性接头Ala-Ser-Ala确保HSP65能正确折叠。
附图说明
图1为pET28a-His-HSP65-6MOG35-55重组蛋白载体质粒构建示意图。
图2为pET28a-His-HSP65-6MOG35-55阳性质粒PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；
图3为重组质粒pET28a-His-HSP65-6MOG35-55中目的蛋白编码基因测序图；
图4为12％SDS-PAGE电泳显示不同浓度乳糖诱导后目的蛋白His-HSP65-6MOG35-55表达水平图；
图5为12％SDS-PAGE电泳显示目的蛋白His-HSP65-6MOG35-55在不同诱导时间点的表达水平图；
图6为12％SDS-PAGE电泳显示载荷蛋白His-HSP65-6MOG35-55质粒的大肠杆菌蛋白表达分析图及蛋白镍柱纯化后Western blot鉴定图；
图7为免疫流程图；
图8为小鼠EAE发病率的变化图；
图9为小鼠EAE临床评分的变化图；
图10为EAE小鼠HE、LFB染色结果图；
图11为EAE小鼠炎症、脱髓鞘评分图；
图12为EAE小鼠炎性细胞因子IFN-γ和IL-17A分泌水平图。
具体实施方式
研究报道热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65)也为自身免疫性疾病EAE的自身抗原之一。热休克蛋白HSP60/65家族高度保守，结核杆菌HSP65(MT-HSP65)和人HSP60有大约50％的同源性，鼠源HSP60分子和人HSP60分子在氨基酸水平上有97％的同源性，因此，本发明提供一种抗多发性硬化的重组蛋白，该重组蛋白包括HSP65蛋白和抗原表位多肽MOG35-55。EAE小鼠模型可以很好地反应出MT-HSP65和人HSP60的免疫反应性。
HSP65在还作为分子伴侣，也可作为分子载体起辅助T细胞表位的作用，并被抗原提呈细胞的MHCII分子所识别，从而激发机体内CD4+细胞的分化增殖。热休克蛋白还具有佐剂作用，如HSP作为一个免疫危险信号激活天然免疫，刺激DC上调MHC(class I and II)和共刺激分子水平。另外，巨噬细胞、DC和NK细胞等表面均存在HSP受体，HSP可与APC上的受体结合，经MHC-I途径将抗原肽递呈在APC表面，诱导特异的免疫应答，并在细胞介导的免疫反应中发挥免疫调节功能。
进一步的，该重组蛋白包括一个HSP65蛋白和六段串联重复的抗原表位多肽MOG35-55，即所述重组蛋白包括HSP65和6MOG35-55。为了提高MOG35-55的免疫原性，在本发明中将MOG35-55进行6次重复串联，可以充分发挥氨基酸片段的免疫效力。
进一步的，所述HSP65蛋白和六段串联重复的抗原表位多肽MOG35-55之间，通过柔性接头连接。具体的，相邻MOG35-55之间以两个丝氨酸(Ser-Ser)隔开连接。再与HSP65羧基端融合，中间加入柔性接头Ala-Ser-Ala确保HSP65能正确折叠。
进一步的，所述重组蛋白序列为SEQ ID NO.1。
相应的，本发明还提供一种抗多发性硬化的重组蛋白的制备方法，该方法用于制备上述的抗多发性硬化的重组蛋白；该方法包括以下步骤：
(1)构建重组质粒pET28a-His-HSP65-6MOG35-55，获得具有该重组质粒的工程菌；
(2)对以LB培养基工程菌进行培养，当菌体达到对数生长期时，培养基中加入无菌0.5mol/L乳糖溶液至终浓度为5mmol/L，继续培养7小时后收集菌体；
(3)以收集的菌体分离融合蛋白和对融合蛋白纯化，得到所述的抗多发性硬化的重组蛋白。
上述方法中以5mmol/L乳糖浓度诱导和诱导后继续培养7小时，达到很好的增殖效果和目的蛋白较大量的表达。
进一步的，所述步骤(1)包括以下步骤：
将6MOG35-55的密码子插入pET-28a(+)，获得质粒pET28a-6MOG35-55；
以为质粒pET28a-6MOG35-55模板进行PCR，扩增获得编码6MOG35-55序列的目的基因片段；
将pET28a-His-HSP65-6P277载体经NheI、HindIII双酶切，得到线性化克隆载体；
将编码6MOG35-55序列的目的基因片段和线性化克隆载体重组，得到重组质粒，将重组质粒转化到感受态细胞并以PCR进行阳性克隆的筛选，对筛选所得阳性克隆体进行验证，最终得到具有该重组质粒的工程菌。
通过上述的制备具有重组质粒工程菌的方法，可准确获得具有重组质粒pET28a-His-HSP65-6MOG35-55的工程菌，降低操作难度。
进一步的，所述步骤(3)中：
取收集的菌体裂解和冰上超声破碎，分别取上清液和沉淀进行分析，确定融合蛋白为包涵体；
以含有尿素的包涵体溶解液处理包涵体，收集上清液，用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化目的蛋白，得到重组蛋白His-HSP65-6MOG35-55。
通过上述的裂解方法和纯化方法，在保证蛋白构象的同时得到较高纯度的重组蛋白。
上述的抗多发性硬化的重组蛋白用于制备多发性硬化疫苗和/或制备多发性硬化药物的用途。
大量研究证明MOG及相关抗原肽通过皮下注射免疫能诱导加重小鼠EAE病征。进一步的，所述多发性硬化疫苗或多发性硬化药物以滴鼻方式施用。
黏膜给予自身抗原诱发免疫耐受是预防自身免疫性疾病的有效途径。鼻黏膜是黏膜免疫系统的重要部分,鼻黏膜免疫是一种很有吸引力的途径,因为鼻腔内含有丰富的血管,鼻腔接种黏膜免疫和系统免疫均可产生；鼻腔含有的蛋白水解酶较少,相同的小剂量抗原能更有效地传送刺激黏膜免疫系统；且接种操作简单,不需要注射器等专门器械,易于被大量人群接受,并可避免由于注射而带来的交叉感染；另外，滴鼻免疫可显著降低免疫原用量,是一个安全、有效的免疫途径。本研究通过鼻黏膜免疫诱发特异性免疫耐受反应，从而实现有效预防EAE/MS的目的。
下面结合图1至图12，描述本发明实施例的抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法。
一、材料：
1.菌种、质粒与动物
宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)是基因工程常用工具菌种，质粒pET28a是基因工程常用的克隆载体，购自天根生化科技(北京)有限公司。C57BL/6小鼠，6-8周龄，雌性，体重16-20g，购自广东省医学实验动物中心。
小鼠EAE/MS疾病模型制备所用MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRWHLYRNGK)由吉尔生化(上海)有限公司合成，合成纯度大于99.39％。
2.酶和主要试剂
分子克隆工具酶购自TaKaRa，PCR纯化试剂盒来自Promega公司，百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)购自美国Enzo公司，完全弗氏佐剂(complete Freund'sadjuvant,CFA)购自Sigma。
3.质粒载体
6MOG35-55的合成，由上海捷瑞生物工程有限公司对6MOG35-55基因序列密码子按大肠杆菌的优势密码子进行优化、合成并反向插入pET-28a(+)的克隆载体上，得到pET28a-6MOG35-55。pET28a-HSP65-6p277来自中国药科大学微基因实验室保存赠送。
二、构建重组质粒pET28a-His-HSP65-6MOG35-55及相应重组工程菌
重组质粒pET28a-His-HSP65-6MOG35-55构建思路根据需要选择合适的酶切位点，具体构建流程参见图1。
首先，质粒pET28a-6MOG35-55的获得：由上海捷瑞生物工程有限公司对6MOG35-55基因序列两侧设计酶切位点分别是NheI、HindIII，密码子按大肠杆菌的优势密码子进行优化、合成并反向插入pET-28a(+)的克隆载体上，获得质粒pET28a-6MOG35-55。
用生工的质粒提取试剂盒提取pET28a-His-HSP65-6P277质粒，质粒经NheI、HindIII双酶切、切胶回收得到质粒大片段(线性化克隆载体)，琼脂糖凝胶电泳验证。
插入小片段6MOG35-55PCR扩增获得：在引物5'端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物两末端分别带有和线性化克隆载体两末端完全一致的序列(15-20bp)。上海生工生物工程有限公司合成引物，两条引物寡核苷酸序列如下(黑色加粗处为NheI和HindIII酶切位点)：
P1：
Figure BDA0003148797170000091
P2：
Figure BDA0003148797170000101
以P1为上游引物，P2为下游引物，以pET28a-6MOG35-55质粒为模板进行PCR，获得了目的基因小片段编码序列6MOG35-55。将获得的大、小片段进行连接重组、转化后，PCR检测验证阳性克隆。PCR筛选阳性克隆的上、下游引物分别是：上游引物V1：CAGAATGCGGCGTCCAT下游引物V2：CCTTTCGGGCTTTGTTAGCAG。
将菌落PCR验证正确的阳性克隆菌液过夜培养，提取质粒进行双酶切验证。选取正确的阳性克隆送至上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果如图3所示，经比对后序列完全正确，成功构建了携带有重组质粒pET28a-His-HSP65-6MOG35-55的大肠杆菌BL21表达菌(具有重组质粒的工程菌)。
在插入酶切位点上下游各100bp左右设计合适的鉴定引物V1、V2，如图2A所示，阳性单克隆1，2的PCR产物与其实际大小605bp相符，可用于下一步酶切鉴定。如图2B所示，pET28a-His-Hsp65-6MOG35-55质粒大小为7322bp，经HindIII单酶切后在6000-8000kb之间有单一条带，与实际大小相符；经NheI、HindIII双酶切后，有418bp的片段被切下，在500bp处隐约可看到该条带，且双酶切后的线性质粒明显比单切的质粒跑在更前的位置，说明目的基因已连入载体。其中，图2A泳道1-2为阳性克隆质粒PCR产物；图2B泳道1为pET28a-His-HSP65-6MOG35-55完整质粒；泳道2为pET28a-His-Hsp65-6MOG35-55质粒Hind III单酶切产物；泳道3为pET28a-His-Hsp65-6MOG35-55质粒Nhe I和Hind III双酶切产物。
三、确定目的蛋白最适乳糖诱导浓度
将具有重组质粒的工程菌接种到新鲜的LB培养基中(含50μg/mL Kan)，于37℃恒温振荡培养。当菌体长到对数生长期时(约接3-4h后，OD600nm为0.6左右)，分别加入无菌0.5mol/L的乳糖溶液，使各瓶乳糖终浓度分别为1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、7mmol/L、9mmol/L，诱导6h后取样1ml离心收集菌体，进行12％SDS-PAGE蛋白电泳确定最适乳糖诱导浓度。用BandScan5.0图像分析软件分析电泳图，图4中泳道1-5分别为用1mM,3mM,5mM,7mM,9mM乳糖诱导后目的蛋白的表达水平。如图4所示，终浓度5mM乳糖(泳道3，75.9％)与9mM乳糖(泳道5，76.3％)诱导量无明显差别，故将5mM乳糖终浓度确定为乳糖最适诱导浓度。
四、确定目的蛋白最适诱导时间
在步骤三的工程菌增殖进入对数生长期时加入无菌0.5mol/L乳糖溶液至终浓度为5mmol/L，37℃诱导培养，乳糖诱导前与诱导后1、2、3、4、5、6、7、8h各取样1mL，12％SDS-PAGE电泳分析。图5中泳道1为未经乳糖诱导pET28a质粒转染大肠杆菌BL21表达的总蛋白；泳道2为未经乳糖诱导的His-HSP65-6MOG35-55质粒转染大肠杆菌BL21的总蛋白；泳道3-10为由His-HSP65-6MOG35-55转染大肠杆菌BL21经乳糖诱导后1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h总蛋白表达水平。如图5所示，前7h随着培养时间的增加，重组蛋白的表达量随之增加，后面表达量不再有明显增加。因此，我们选择加入诱导剂后继续培养7h(泳道9)收菌提蛋白。
五、重组工程菌发酵培养及融合蛋白His-HSP65-6MOG35-55的分离纯化和复性
菌种活化与转接后，在对数生长期加入无菌0.5mol/L乳糖溶液至终浓度5mM/L进行诱导，继续培养7小时后，4℃，6000rpm离心20分钟，收集菌体，每1L培养物得湿菌重量12g左右，菌体冻存于-80℃。
将上述所得湿菌按每1g湿菌体悬浮于20ml菌体裂解缓冲液(20mmol/L Tris-Hcl缓冲液，5mmol/L EDTA,pH8.0)中充分混匀后加入Triton X-100至终浓度为0.5％，冰上超声(功率900W×60％，超声3s、间歇3s)破碎20min，超声裂解液4℃，12000rpm，离心20min，分别取上清和沉淀12％SDS-PAGE蛋白电泳分析，确定融合蛋白的表达形式。如图6A所示，目的蛋白主要在沉淀里(泳道4)，即以包涵体的形式表达。
再将包涵体洗涤、尿素变性处理。每克包涵体湿重依次用20ml洗涤液I(20mmol/LTris-HCl缓冲液，pH8.0)、洗涤液II(溶解在20mmol/L Tris-HCl缓冲液中的2mol/L的尿素)和洗涤液III(溶解在20mmol/L Tris-HCl缓冲液中的1％Triton X-100)洗涤，再按每克包涵体湿重加入40ml包涵体溶解液(8mol/L尿素，20mmol/L Tris-HCl缓冲液，500mmol/LNacl，5mmol/L咪唑，pH8.0)，4℃搅拌6h以上，沉淀变性溶解。尿素变性处理后目的蛋白大部分溶解到上清(图6A中泳道6)。12000rpm离心20min，收集上清，用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化目的蛋白。
用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化目的蛋白：用ddH2O充分洗涤，洗去20％的乙醇和基质中的空气，再5倍柱体积的50mM NiSO4充电，5倍柱体积的ddH2O洗涤后，5-10倍柱体积的Binding Buffer(8M尿素，20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0)平衡；目的蛋白上清用0.45μm滤膜过滤后，加入Ni-NTA，依次用5倍柱体积的平衡液(Binding Buffer)、10mM咪唑溶液彻底洗去杂蛋白，再用100mM咪唑洗脱目的蛋白，获所需目的蛋白溶液。将上述收集的含高纯度目的蛋白的蛋白溶液进一步稀释复性、4℃条件下蒸馏水透析除盐。除盐后的蛋白溶液在-20℃过夜预冻，再置于冻干机中冻干成粉末。重组蛋白His-HSP65-6MOG35-55经镍柱纯化后，通过Western Blot鉴定目的蛋白，如图6B所示。
其中，图6A为目的蛋白His-HSP65-6MOG35-55表达形式的确定：泳道1是包含蛋白载体质粒pET28a-His-HSP65-6MOG35-55的大肠杆菌BL21乳糖诱导前总蛋白；泳道2是包含蛋白载体质粒pET28a-His-HSP65-6MOG35-55的大肠杆菌BL21乳糖诱导后总蛋白；泳道3是pET28a-His-HSP65-6MOG35-55转化大肠杆菌BL21裂解液上清；泳道4是pET28a-His-HSP65-6MOG35-55转化大肠杆菌BL21裂解液沉淀；泳道5是尿素变性后沉淀物沉淀；泳道6是尿素变性后沉积物上清。图6B是重组蛋白His-HSP65-6MOG35-55的Westernblot分析：泳道1是包含质粒pET28a的大肠杆菌BL21(DE3)总蛋白；泳道2是经Ni-NAT柱纯化后的重组蛋白His-HSP65-6MOG35-55；泳道3是复性后His-HSP65-6MOG35-55蛋白冻干粉。
六、对以上获得的重组蛋白HSP65-6MOG35-55进行药效学研究
选用6-8周龄，体重16-20g的雌性C57BL/6小鼠，随机分为A、B、C、D四组，每组10只，其中A、B组分别为低剂量、高剂量融合蛋白疫苗HSP65-6MOG35-55给药组，C组为HSP65对照组，HSP65做为对照组给药剂量和方法与A组一样，D组为PBS对照组，PBS做为对照组给药剂量和方法与A组一样。黏膜给药，每隔1天免疫1次，共5次，具体免疫时间见图7。A组低剂量组(100μg)：将重组蛋白用灭菌PBS配制成5mg/ml浓度，从鼻腔滴入，20μl/只，两侧鼻孔各10μl，共100μg蛋白；B组高剂量组(200μg)：将重组蛋白用灭菌的PBS配制成10mg/ml浓度，给药步骤同上；C组为HSP65对照组，给药剂量同A组；D组只滴加PBS溶液20μl，每鼻孔10μl。
给药后对小鼠进行MS/EAE模型构建：
含MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRWHLYRNGK)的PBS溶液(3mg/ml)，与等体积CFA经三通阀充分混合乳化，制备成乳剂。通过腋窝腹股沟四点皮下注射，每只小鼠注射乳化产物200μl(MOG35-55含量为300μg/只)，制备EAE/MS动物模型。造模当天记为第0天(d0)。免疫当天(第0h)和第2天(第48h)分别给予各组小鼠腹腔注射百日咳毒素(PTX)200ng/只。百日咳毒素用于增强MOG35-55的免疫原性，得到疾病模型。
不同组小鼠免疫后的药效学结果如下：HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗降低EAE小鼠发病率，如图8所示，PBS对照组发病较快，在week2-week7发病率缓慢上升，与典型的慢性进展型EAE的临床表现一致。与PBS对照组相比，各给药组发病时间较晚，发病上升趋势较缓和。HSP65-6MOG35-55(100μg)组在week5发病，week9发病率为10％(1只)。HSP65-6MOG35-55(200μg)组在week7发病，发病率为20％(2只)。HSP65组在week4发病，week9发病率为44.4％(4只)。实验结果表明，与PBS组相比，HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗、HSP65组均可显著延迟小鼠EAE发病，降低发病率，但HSP65-6MOG35-55组效果优于HSP65组，且低剂量100μg组效果最好。
HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗降低EAE小鼠临床评分，如图9所示，PBS对照组d14开始出现临床症状，并呈现缓慢上升趋势，符合慢性进展型MS的临床表现，最高临床评分为2.33±0.21。HSP65组d21开始出现临床症状，最高临床评分为1.58±0.15，与PBS对照组没有显著性差异。HSP65-6MOG35-55(100μg)组d20开始出现临床症状，最高临床评分为0.33±0.21，与PBS对照组有极显著性差异(P＜0.001)，与HSP65组有极显著性差异(P＜0.01)。其中，图9中***P＜0.001表示与PBS组比较；#P＜0.05表示与HSP65给药组比较；##P＜0.01表示与HSP65给药组比较。HSP65-6MOG35-55(200μg))组d17开始出现临床症状，最高临床评分为0.67±0.33，与PBS对照组有极显著性差异(P＜0.001)，与HSP65组有显著性差异(P＜0.05)。实验结果表明，HSP65-6MOG35-55(100μg)、HSP65-6MOG35-55(200μg)均可显著降低小鼠EAE评分，两组之间临床评分均值无统计学差异，但低剂量HSP65-6MOG35-55(100μg)组临床评分最低。
HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗减少EAE小鼠炎症和脱髓鞘程度，如图10所示，实验结束时，PBS对照组小鼠脑组织HE染色可见多处炎性损伤，炎性细胞浸润形成广泛的血管套，LFB染色可见明显脱髓鞘病变，蓝色髓鞘区域大面积缺失；HSP65对照组炎性脱髓鞘损伤比PBS对照组减轻，但仍形成多处血管套；HSP65-6MOG35-55(200μg)、HSP65-6MOG35-55(100μg)炎性及脱髓鞘损伤程度逐级递减，但二者之间无统计学差异。说明HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗可显著减少EAE小鼠脑炎症损伤和脊髓脱髓鞘程度，低剂量(100μg)效果更好。各组小鼠炎症、脱髓鞘评分汇总见图11所示，图11中*P＜0.05表示与PBS组比较；**P＜0.01表示与PBS组比较。。
HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗降低血清炎性细胞因子IFN-γ和IL-17A水平。如图12A所示，PBS对照组IFN-γ水平各时期都明显高于其它给药组，d15时无显著性差异，d27、d60时与各组有极显著性差异(P<0.01)，d37时与HSP65-6MOG35-55(100μg)组有显著性差异(P<0.05)，d48时与HSP65-6MOG35-55(100μg)组、HSP65-6MOG35-55(200μg)组、HSP65组有显著性差异(P<0.05)。结果表明，与PBS对照组相比，各给药组都可降低IFN-γ水平，其中以HSP65-6MOG35-55(100μg)组效果最好。图12中*P＜0.05，**P＜0.01表示与PBS组比较；##P＜0.01表示与HSP65组比较。
IL-17A水平如图12B所示，d15时，HSP65-6MOG35-55(100μg)组、HSP65-6MOG35-55(200μg)组与HSP65组、PBS对照组都有极显著性差异(P<0.01)，各时期HSP65组与PBS对照组之间无显著性差异。d27时，HSP65-6MOG35-55(100μg)组、HSP65-6MOG35-55(200μg)组与PBS对照组有显著性差异(P<0.05)。d60时，HSP65-6MOG35-55(100μg)组与PBS对照组有显著性差异(P<0.05)。结果表明，HSP65组不能显著降低IL-17A水平，HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗组IL-17A在各个时期都处于最低水平，且HSP65-6MOG35-55(100μg)组效果最好。
综上所述，HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗能够降低EAE小鼠发病率，其中以低剂量100μg的降低EAE小鼠发病率的效果最好；HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗可显著降低EAE小鼠临床评分，低剂量HSP65-6MOG35-55(100μg)的临床评分最低；HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗减少EAE小鼠炎症和脱髓鞘，以低剂量(100μg)对EAE小鼠炎症和脱髓鞘降低程度更好；HSP65-6MOG35-55融合蛋白疫苗能降低血清炎性细胞因子IFN-γ和IL-17A水平，其中以HSP65-6MOG35-55(100μg)组效果最好。综上可见，本发明的HSP65-6MOG35-55重组蛋白通过滴鼻粘膜免疫的给药方式能很好的起到预防多发性硬化的作用。
根据本发明实施例的抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法的其他构成等以及操作对于本领域普通技术人员而言都是已知的，这里不再详细描述。
在本说明书的描述中，参考术语“实施例”、“示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
序列表
< 1 1 0 >广东省科学院动物研究所
< 1 20 >一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途
< 1 6 0 > 1
< 2 1 0 > 1
< 2 1 1 > 1 0 9
< 2 1 2 > PRT
< 2 1 3 >人工序列
< 4 0 0 > 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ala Lys
1 5 10 15
Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu Arg Gly
20 25 30
Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro Lys
35 40 45
Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile
50 55 60
Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp
65 70 75
Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys
80 85 90
Lys Thr Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val
95 100 105
Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala
110 115 120
Gly Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val
125 130 135
Glu Lys Val Thr Glu Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu
140 145 150
Thr Lys Glu Gln Ile Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp
155 160 165
Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly
170 175 180
Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu
185 190 195
Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys Gly Tyr Ile
200 205 210
Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg Gln Glu Ala Val Leu
215 220 225
Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val
230 235 240
Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly Ala Gly Lys
245 250 255
Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val Ala
275 280 285
Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln
290 295 300
Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val
305 310 315
Gly Leu Thr Leu Glu Asn Ala Asp Leu Ser Leu Leu Gly Lys Ala
320 325 330
Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly
335 340 345
Ala Gly Asp Thr Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg
350 355 360
Gln Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu
365 370 375
Gln Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys
380 385 390
Ala Gly Ala Ala Thr Glu Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg
395 400 405
Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly
410 415 420
Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Thr Leu Leu Gln Ala Ala Pro Thr
425 430 435
Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly Ala Asn
440 445 450
Ile Val Lys Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Phe
455 460 465
Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys Val Arg Asn
470 475 480
Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly Val Tyr Glu
485 490 495
Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val Thr Arg
500 505 510
Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu Thr
515 520 525
Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser
530 535 540
Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe Ala Ser Ala
545 550 555
Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His
560 565 570
Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Ser Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg
575 580 585
Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Ser
590 595 600
Ser Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val
605 610 615
His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Ser Met Glu Val Gly Trp Tyr
620 625 630
Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys
635 640 645
Ser Ser Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val
650 655 660
Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Ser Met Glu Val Gly Trp
665 670 675
Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly
680 685 690
Lys
691

Claims (10)

1.一种抗多发性硬化的重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白包括HSP65蛋白和抗原表位多肽MOG35-55。
2.根据权利要求1所述的抗多发性硬化的重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白包括一个HSP65蛋白和六段串联重复的抗原表位多肽MOG35-55，即所述重组蛋白包括HSP65和6MOG35-55。
3.根据权利要求2所述的抗多发性硬化的重组蛋白，其特征在于，所述HSP65蛋白和六段抗原表位多肽MOG35-55之间，通过柔性接头连接。
4.根据权利要求3所述的抗多发性硬化的重组蛋白，其特征在于，所述HSP65蛋白和六段抗原表位多肽MOG35-55之间以Ala-Ser-Ala柔性接头连接。
5.根据权利要求4所述的抗多发性硬化的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白序列为SEQ ID NO.1。
6.一种抗多发性硬化的重组蛋白的制备方法，其特征在于，该方法用于制备权利要求2-5任一项所述的抗多发性硬化的重组蛋白；该方法包括以下步骤：
(1)构建重组质粒pET28a-His-HSP65-6MOG35-55，获得具有该重组质粒的工程菌；
(2)对以LB培养基工程菌进行培养，当菌体达到对数生长期时，培养基中加入无菌0.5mol/L乳糖溶液至终浓度为5mmol/L，继续培养7小时后收集菌体；
(3)以收集的菌体分离融合蛋白和对融合蛋白纯化，得到所述的抗多发性硬化的重组蛋白。
7.根据权利要求6所述的抗多发性硬化的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：
将6MOG35-55的密码子插入pET-28a(+)，获得质粒pET28a-6MOG35-55；
以为质粒pET28a-6MOG35-55模板进行PCR，扩增获得编码6MOG35-55序列的目的基因片段；
将pET28a-His-HSP65-6P277载体经NheI、HindIII双酶切，得到线性化克隆载体；
将编码6MOG35-55序列的目的基因片段和线性化克隆载体重组，得到重组质粒，将重组质粒转化到感受态细胞并以PCR进行阳性克隆的筛选，对筛选所得阳性克隆体进行验证，最终得到具有该重组质粒的工程菌。
8.根据权利6所述的抗多发性硬化的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中：
取收集的菌体裂解和冰上超声破碎，分别取上清液和沉淀进行分析，确定融合蛋白为包涵体；
以含有尿素的包涵体溶解液处理包涵体，收集上清液，用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化目的蛋白，得到重组蛋白His-HSP65-6MOG35-55。
9.权利要求1-5任一项所述的抗多发性硬化的重组蛋白用于制备多发性硬化疫苗和/或用于制备多发性硬化药物的用途。
10.权利要求9所述的抗多发性硬化的重组蛋白的用途，所述多发性硬化疫苗或多发性硬化药物以滴鼻方式施用。
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