CN116003571A - 一种分泌Fc-IL-2m融合蛋白的改良型CAR-T细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌Fc‑IL‑2m融合蛋白的改良型CAR‑T细胞及其应用。本发明通过将构建的IgG1Fc‑IL‑2m融合蛋白串联于CAR结构的末端制备了表达Fc‑IL‑2m融合蛋白的CAR‑T细胞，制得的CAR‑T细胞对HER2阳性肿瘤细胞具有强杀伤作用，且与肿瘤特异性抗原接触会引发IL‑2m大量分泌；IL‑2m能够减弱野生型IL‑2免疫抑制作用，增加效应T细胞的免疫激活作用，具有强烈的免疫调节优势。本发明提供的改良型CAR‑T细胞对临床实体肿瘤CAR‑T治疗具有指导意义和应用价值。

Description

一种分泌Fc-IL-2m融合蛋白的改良型CAR-T细胞及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种分泌Fc-IL-2m融合蛋白的改良型CAR-T细胞及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞，是利用基因工程技术将患者自体T细胞在经过体外基因改造并大量扩增后回输体内的过继性免疫细胞疗法，是近年来癌症免疫治疗的重大突破之一，尤其在血液肿瘤治疗领域效果显著。CAR-T细胞通常表达的CAR结构包括负责识别、结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段(scFv)、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域，在与特异性肿瘤抗原识别、结合后启动T细胞特异性杀伤肿瘤细胞的作用。2017年至今，已有六种靶向CD19或BCMA的CAR-T细胞经美国FDA批准上市，但是尚无针对实体瘤的CAR-T疗法获批上市，因此，探索治疗实体瘤的CAR-T细胞改造策略，是当前的研究热点和难点。

CAR-T疗法在实体瘤治疗领域中的主要障碍包括，肿瘤异质性、致密的物理屏障、缺氧、酸性等造成CAR-T细胞活性障碍以及免疫抑制性肿瘤微环境(tumormicroenvironment，TME)。近年来研究表明，通过工程化改造CAR-T细胞以表达具有免疫调节作用的细胞因子如IL-7、IL-15、IL-18、IL-23等，在增强CAR-T细胞扩增、杀伤活性、调节TME、提高抗实体瘤疗效等方面显示了良好的潜力。

白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)主要由次级淋巴器官中活化的CD4⁺T细胞产生，少部分由活化的CD8⁺T细胞、NK细胞、NKT细胞和DC细胞产生的细胞因子，是首个用于治疗转移性黑色素瘤和肾癌的细胞因子。IL-2的半衰期短，全身给药需要持续多次、高剂量输注，然而由于IL-2在体内循环过程造成实际作用浓度降低，导致运输至肿瘤局部的IL-2浓度欠佳，而系统高剂量给药也带来了严重的副作用，这使IL-2的直接注射治疗受到限制。同时，由于白细胞介素-2受体(interleukin-2receptor，IL-2R)在多种类型免疫细胞表面均有表达，这些免疫细胞包括Tregs细胞、ILC2细胞、NK细胞、效应T细胞、活化的B细胞、单核细胞等，因此IL-2在免疫系统中具有多重免疫调节作用。

CAR-T细胞是临床治疗血液肿瘤的突破性细胞药物或免疫疗法，有望成为治愈实体肿瘤的免疫技术，但是目前在实体瘤应用领域仍面临很多困难，如T细胞体内扩增水平低，这使得实际攻击实体瘤的T细胞数量远远低于血液瘤治疗中体内CAR-T细胞数量。如何提高CAR-T细胞增殖能力，增强CAR-T细胞杀伤实体瘤效果，是CAR-T细胞治疗需要解决的问题。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种分泌Fc-IL-2m融合蛋白的改良型CAR-T细胞及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种分离的IL-2变体多肽，所述分离的IL-2变体多肽包含与SEQ ID NO.1至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。

进一步，所述相同的氨基酸序列与由SEQ ID NO.1代表的多肽相比，具有增强对IL-2Rβ的结合亲和力或降低对IL-2Rγc受体的结合亲和力的能力、具有去除O-连接的糖基化位点的能力或具有抑制二硫键形成的能力。

进一步，所述增强对IL-2Rβ的结合亲和力或降低对IL-2Rγc受体的结合亲和力的氨基酸取代包含氨基酸残基位置L19、D20、L21、Q22、K35、R38、T41、F42、F44、Y45、E62、P65、E68、L72、L80、R81、L85、I86、N88、I92、Y107或Q126中的一个或更多个氨基酸取代。

进一步，所述增强对IL-2Rβ的结合亲和力或降低对IL-2Rγc受体的结合亲和力的氨基酸取代包含氨基酸残基位置L80、R81、L85、I86和/或I92的氨基酸取代。

进一步，所述增强对IL-2Rβ的结合亲和力或降低对IL-2Rγc受体的结合亲和力的氨基酸取代包含具有氨基酸残基位置L80、R81、L85、I86和I92的氨基酸取代。

进一步，所述氨基酸残基位置L80、R81、L85、I86和I92的氨基酸取代选自：

在SEQ ID NO.1的位置L80氨基酸取代包括L80F、L80V；

在SEQ ID NO.1的位置R81氨基酸取代包括R81A、R81D、R81G、R81I、R81S、R81T；

在SEQ ID NO.1的位置L85氨基酸取代包括L85V、L85T；

在SEQ ID NO.1的位置I86氨基酸取代包括I86V、I86T；

在SEQ ID NO.1的位置I92氨基酸取代包括I92F、I92K、I92R；或

以上这些氨基酸取代的任何组合。

进一步，所述氨基酸残基位置L80、R81、L85、I86和I92的氨基酸取代为L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。

进一步，所述去除O-连接的糖基化位点的氨基酸取代包括氨基酸残基位置T3的氨基酸取代。

进一步，所述T3的氨基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K或T3P。

进一步，所述T3的氨基酸取代为T3A。

进一步，所述抑制二硫键形成的氨基酸取代包括氨基酸残基位置C58、C105或C125的氨基酸取代。

进一步，所述抑制二硫键形成的氨基酸取代为氨基酸残基位置C125的氨基酸取代。

进一步，所述C125的氨基酸取代包括C125A、C125S、C125T、C125L或C125V。

进一步，所述C125的氨基酸取代为C125A。

进一步，所述IL-2变体多肽包含SEQ ID NO.4中列出的氨基酸序列。

本发明的第二方面提供了一种分离的融合蛋白，所述融合蛋白包含1)本发明的第一方面所述的IL-2变体多肽和2)异源蛋白；

进一步，所述融合蛋白是由所述的IL-2变体多肽与所述的异源蛋白融合构成的，任选地通过肽接头。

进一步，所述融合蛋白是由所述的IL-2变体多肽在其N末端氨基酸处与所述的异源蛋白的C末端氨基酸通过肽接头融合构成的或由所述的IL-2变体多肽在其C末端氨基酸处与所述的异源蛋白的N末端氨基酸通过肽接头融合构成的。

进一步，所述异源蛋白增加所述的IL-2变体多肽的循环半衰期。

进一步，所述异源蛋白选自有提供半衰期延长的全长无效抗体或抗体片段组成的组。

进一步，所述异源蛋白增强所述的IL-2变体多肽的表达水平和/或减弱野生型IL-2免疫抑制作用。

进一步，所述异源蛋白用作标志物或标签或靶向部分。

进一步，所述异源蛋白包括具有沉默的效应子功能和/或具有半衰期延长功能的Fc结构域或其变体。

进一步，所述Fc结构域或其变体选自由以下组成的组：IgAFc结构域或其变体、IgDFc结构域或其变体、IgE Fc结构域或其变体、IgG Fc结构域或其变体和IgM Fc结构域或其变体。

进一步，所述Fc结构域或其变体为IgG Fc结构域或其变体。

进一步，所述IgG Fc结构域或其变体包括IgG1 Fc结构域或其变体、IgG2 Fc结构域或其变体、IgG3 Fc结构域或其变体、IgG4 Fc结构域或其变体。

进一步，所述Fc结构域或其变体为IgG1 Fc结构域或其变体。

进一步，所述IgG1 Fc结构域包含具有氨基酸残基位置L4、L5、P99中的一个或更多个氨基酸取代的SEQ ID NO.5的氨基酸序列。

进一步，所述氨基酸残基位置L4、L5、P99的氨基酸取代选自：

在SEQ ID NO.5的位置L4氨基酸取代包括L4A；

在SEQ ID NO.5的位置L5氨基酸取代包括L5A；

在SEQ ID NO.5的位置P99氨基酸取代包括P99G；或

以上这些氨基酸取代的任何组合。

进一步，所述氨基酸残基位置L4、L5、P99的氨基酸取代为L4A、L5A和P99G。

进一步，所述人类IgG1 Fc结构域包含SEQ ID NO.6中列出的氨基酸序列。

进一步，所述融合蛋白呈多聚体、二聚体或单体的形式。

本发明的第三方面提供了一种改良型的CAR，所述改良型的CAR包含1)本发明的第一方面所述的IL-2变体多肽或本发明的第二方面所述的融合蛋白和2)CAR结构；

进一步，所述改良型的CAR是由所述的融合蛋白通过多顺反子结构与CAR结构的末端连接。

进一步，所述多顺反子结构为自剪切多肽或内部核糖体进入位点IRES，所述自剪切多肽包括T2A、P2A、E2A或F2A。

进一步，所述自剪切多肽为T2A。

进一步，所述CAR结构包括抗体或其抗原结合片段、铰链区、跨膜域、胞内共刺激结构域、胞内信号转导结构域。

进一步，所述抗体或其抗原结合片段的来源包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B 2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HER2、IL-11Ra、IL-13R-a2、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、NCAM、NY-ESO-1、FLT3、B7-H3、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2D ligands、瘤胎、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF、ROR1、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(Fra)、VEGF-R2、GPC3、Wnt1、ROBO1、Mesothelin scFv。

进一步，所述抗体或其抗原结合片段的来源为HER2 scFv。

进一步，所述铰链区和和跨膜区包括以下分子的铰链区和和跨膜区：IgG1、IgG4、CD8、CD28、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体、PD-1、CD34。

进一步，所述铰链区和和跨膜区为CD28的铰链区和跨膜区。

进一步，所述胞内共刺激结构包括以下分子的胞内信号传导结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD-2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。

进一步，所述胞内共刺激结构域为CD28的胞内共刺激结构域。

进一步，所述胞内信号转导结构域包括以下分子的胞内信号传导结构域：FcγR、FcεR、FcαR、FcRn、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d、Zap70。

进一步，所述胞内信号转导结构域为CD3ζ胞内信号转导结构域。

本发明的第四方面提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据本发明的第一方面所述的IL-2变体多肽、本发明的第二方面所述的融合蛋白或本发明的第三方面所述的CAR。

本发明的第五方面提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明的第四方面所述的核酸分子。

进一步，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、病毒载体。

进一步，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体。

进一步，所述病毒载体为逆转录病毒载体。

本发明的第六方面提供了一种经工程改造的免疫细胞，所述免疫细胞包含本发明的第一方面所述的IL-2变体多肽、本发明的第二方面所述的融合蛋白、本发明的第三方面所述的CAR、本发明的第四方面所述的核酸分子或本发明的第五方面所述的表达载体。

进一步，所述CAR的靶向抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B 2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HER2、IL-11Ra、IL-13R-a2、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、NCAM、NY-ESO-1、FLT3、B7-H3、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2D ligands、瘤胎、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF、ROR1、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGEA3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(Fra)、VEGF-R2、GPC3、Wnt1、ROBO1、Mesothelin。

进一步，所述CAR的靶向抗原为HER2。

进一步，所述免疫细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及其任意组合。

进一步，所述免疫细胞为T细胞。

本发明的第七方面提供了一种药物组合物或试剂盒，所述药物组合物或试剂盒包含本发明的第一方面所述的IL-2变体多肽、本发明的第二方面所述的融合蛋白、本发明的第三方面所述的CAR、本发明的第四方面所述的核酸分子、本发明的第五方面所述的载体、本发明的第六方面所述的免疫细胞。

进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

本发明的第八方面提供了如下任一种方法：

1)一种制备IL-2变体多肽的方法，所述方法包括在促进本发明的第一方面所述的IL-2变体多肽或本发明的第二方面所述的融合蛋白表达的条件下培养本发明的第六方面所述的免疫细胞，使得所述免疫细胞分泌IL-2变体多肽；

2)一种制备本发明的第二方面所述融合蛋白的方法，所述方法包括在促进本发明的第一方面所述的IL-2变体多肽或本发明的第二方面所述的融合蛋白表达的条件下培养本发明的第六方面所述的免疫细胞，使得所述免疫细胞分泌融合蛋白；

3)一种制备本发明的第六方面所述经工程改造的免疫细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明的第四方面所述的核酸分子或本发明的第五方面所述的表达载体引入到所述的免疫细胞中。

进一步，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及其任意组合。

进一步，所述免疫细胞为T细胞。

本发明的第九方面提供了如下任一种应用：

1)本发明的第一方面所述的IL-2变体多肽在制备本发明的第二方面所述的融合蛋白、本发明的第三方面所述的CAR、本发明的第四方面所述的核酸分子、本发明的第五方面所述的表达载体、本发明的第六方面所述的免疫细胞、本发明的第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

2)本发明的第二方面所述的融合蛋白在制备本发明的第三方面所述的CAR、本发明的第四方面所述的核酸分子、本发明的第五方面所述的载体、本发明的第六方面所述的免疫细胞、本发明的第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

3)本发明的第三方面所述的CAR在制备本发明的第四方面所述的核酸分子、本发明的第五方面所述的载体、本发明的第六方面所述的免疫细胞、本发明的第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

4)本发明的第四方面所述的核酸分子在制备本发明的第五方面所述的载体、本发明的第六方面所述的免疫细胞、本发明的第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

5)本发明的第五方面所述的载体在制备本发明的第六方面所述的免疫细胞、本发明的第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

6)本发明的第六方面所述的免疫细胞在制备本发明的第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用。

7)本发明的第六方面所述的免疫细胞在制备分泌本发明的第一方面所述的IL-2变体多肽的产品中的应用；

8)本发明的第六方面所述的免疫细胞在制备分泌本发明的第二方面所述的融合蛋白的产品中的应用；

9)本发明的第一方面所述的IL-2变体多肽、本发明的第二方面所述的融合蛋白、本发明的第三方面所述的CAR、本发明的第四方面所述的核酸分子、本发明的第五方面所述的表达载体、本发明的第六方面所述的免疫细胞、本发明的第七方面所述的药物组合物或试剂盒在制备诊断或治疗肿瘤的产品中的应用。

进一步，所述肿瘤包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B 2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HER2、IL-11Ra、IL-13R-a2、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、NCAM、NY-ESO-1、FLT3、B7-H3、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2D ligands、瘤胎、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF、ROR1、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGEA3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(Fra)、VEGF-R2、GPC3、Wnt1、ROBO1、Mesothelin阳性肿瘤。

进一步，所述肿瘤为HER2阳性肿瘤。

进一步，所述HER2阳性肿瘤包括HER2阳性胃癌、HER2阳性乳腺癌、HER2阳性食管癌、HER2阳性结肠癌、HER2阳性直肠癌、HER2阳性胰腺癌、HER2阳性肺癌、HER2阳性子宫颈癌、HER2阳性子宫体癌、HER2阳性卵巢癌、HER2阳性膀胱癌、HER2阳性头颈癌、HER2阳性子宫内膜癌、HER2阳性骨肉瘤、HER2阳性前列腺癌、HER2阳性神经母细胞瘤。

进一步，所述HER2阳性肿瘤为HER2阳性乳腺癌。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种分泌Fc-IL-2m融合蛋白的改良型CAR-T细胞(IL-2m-CAR-T)及其应用，制备得到的改良型CAR-T细胞对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，且与肿瘤特异性抗原接触会引发IL-2m大量分泌；IL-2m能够减弱野生型IL-2免疫抑制作用，增加效应T细胞的免疫激活作用，具有强烈的免疫调节优势。该IL-2m-CAR-T细胞对治疗乳腺癌肿瘤的生长及转移有良好的治疗效果，是一种有望应用于临床实体瘤CAR-T疗法的新型CAR-T细胞。

附图说明

图1为CAR结构示意图；

图2为ELISA检测IL-2表达含量的效果图；

图3为Western blot检测IL-2分泌情况效果图；

图4为流式细胞检测CAR-T细胞的体外杀伤肿瘤细胞的效率图，其中4A是流式细胞检测结果分析图，4B是肿瘤细胞的统计图；

图5为流式细胞检测T细胞中CD8⁺颗粒酶B⁺细胞百分比占比的结果图；

图6为CAR-T细胞的体内抗肿瘤效果图，其中6A是实验终点时代表性的小鼠肿瘤组织拍照图，6B为实验终点时小鼠肿瘤重量统计图；

图7为小鼠存活率曲线图；

图8为流式细胞检测CAR-T细胞数量的统计图；

图9为验证CAR-T细胞的体内抗肿瘤效果图，其中10A是小鼠肿瘤生长曲线图，10B是流式细胞检测小鼠外周血中的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞比例结果图；

图10为小鼠肺、肝HE染色的效果图。

具体实施方式

本发明通过广泛而深入的研究，通过将构建的IgG1 Fc-IL-2m融合蛋白串联于CAR结构的末端制备了表达Fc-IL-2m融合蛋白的CAR-T细胞(IL-2m-CAR-T)，制得的IL-2m-CAR-T细胞杀伤效率显著高于CAR-T细胞，与肿瘤特异性抗原接触会引发IL-2m的大量分泌，还可以显著提高CAR-T细胞体外、体内的增殖水平及显著增强对小鼠皮下、原位乳腺癌的生长抑制作用；IL-2m-CAR-T细胞相较于IL-2-CAR-T细胞安全性较高，不引发小鼠肺、肝严重性炎症反应。

在本发明中，术语“分离的”是指已经与通常在自然界中发现或产生的至少一些组分分离的分子。例如，当多肽与产生它的细胞的至少一些组分分离时，称其为“分离的”。当多肽或融合蛋白在表达后由细胞分泌时，将含有所述多肽或融合蛋白的上清液与产生它的细胞物理分离，认为是“分离”所述多肽或融合蛋白。术语“分离的分子”(其中分子是例如多肽或融合蛋白或多核苷酸)是这样的分子：该分子凭借其起源或衍生的来源(1)不与在其天然状态中伴随其的、天然地缔合的组分缔合，(2)基本上不含来自相同物种的其他分子，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不存在于自然界中。

在本发明中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物。在各种实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白”是其α碳通过肽键连接的氨基酸链。因此链的一个末尾(氨基末端)处的末端氨基酸具有游离氨基基团，而链的另一个末尾(羧基末端)处的末端氨基酸具有游离羧基基团。如本发明使用的，术语“氨基末端”(缩写为N末端)是指在肽的氨基末端处的氨基酸上的游离α-氨基基团，或指在肽中的任何其他位置处的氨基酸的α-氨基基团(参与肽键时的氨基基团)。类似地，术语“羧基末端”(缩写为C末端)是指肽的羧基末端上的游离羧基基团，或肽中任何其他位置处的氨基酸的羧基基团。肽还包括基本上任何多氨基酸，包括但不限于肽模拟物(peptide mimetic)，诸如通过醚键而非酰胺键连接的氨基酸。

本公开内容的多肽包括已经以任何方式和出于任何原因被修饰的多肽，例如，以：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改变其他物理化学特性或功能特性。

本发明中使用的术语“变体多肽”是指包含这样的氨基酸序列的多肽，其中相对于另一个多肽序列，一个或更多个氨基酸残基被插入到该氨基酸序列中、从该氨基酸序列中缺失和/或被取代到该氨基酸序列中。在各种实施方案中，待被插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目可以是例如，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个氨基酸的长度。

如本发明使用的“氨基酸取代”是指用不同的氨基酸替换多肽中亲本多肽序列的特定位置处的一个氨基酸。氨基酸取代可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法来产生。例如，单氨基酸取代或多氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列中进行(例如，在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分中)。

术语“保守氨基酸取代”是指多肽中的氨基酸被功能上相似的氨基酸取代。以下六组各自包含互相为保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。

术语“非保守氨基酸取代”是指这些类别之一的成员取代为来自另一类别的成员。在进行这样的改变时，根据各种实施方案，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)。基于氨基酸的疏水性和电荷特征，每种氨基酸已经被指定了亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。

本领域理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物功能中的重要性。已知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍保持相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，在各种实施方案中，包括了其亲水指数在±2内的氨基酸的取代。在各种实施方案中，包括在±1内的那些，并且在各种实施方案中，包括在±0.5内的那些。

本领域还理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代，特别是当从而产生的生物功能蛋白或肽被意图用于在免疫学实施方案中使用时，如本发明所公开的。在各种实施方案中，蛋白的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性决定的)与其免疫原性和抗原性，即，与蛋白的生物学特性相关。

以下亲水性值(hydrophilicity values)被指定至这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。

“多肽”还包括“多肽的衍生物”，是指已经被化学修饰的多肽，所述化学修饰例如，缀合至另一个化学部分(诸如例如，聚乙二醇、白蛋白(例如，人类血清白蛋白))、磷酸化和糖基化。

术语“相同的氨基酸序列”指当使用序列比对或程序比对时，在两个或更多个肽序列之间的氨基酸序列同一性的水平或在两个或更多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同一性的水平。例如，如本发明使用的，通过定义的算法确定的80％同一性与80％序列同一性意指相同的意思，并且意指给定序列与另一长度的另一序列至少80％相同。在各种实施方案中，％同一性选自例如，与给定序列至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％或更大的序列同一性。在各种实施方案中，％同一性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95％至约99％的范围内。

在本发明中，术语“IL-2”或“白介素-2(interleukin-2)”是指从任何脊椎动物来源获得的任何野生型IL-2，包括源自哺乳动物例如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。IL-2可以获自动物细胞，并且还包括获自能够产生IL-2的重组细胞的IL-2。另外，IL-2可以是野生型IL-2或其变体。

IL-2的一个实施方案可以具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。这里，IL-2可以是成熟的形式。具体地，成熟的IL-2可以不包含信号序列。在此，IL-2可以在包含野生型IL-2的片段的概念下使用。野生型IL-2的N端或C端的一部分被截短。

此外，IL-2的片段可以是从具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质的N端截短的具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续氨基酸的形式。IL-2的片段可以为从具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白质的C端截短的具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续氨基酸的形式。

在本发明中，术语“IL-2变体”或“IL-2变体多肽”是指全长IL-2或上述IL-2片段中的一部分氨基酸被取代的形式。即，IL-2变体可以具有与野生型IL-2或其片段不同的氨基酸序列。但是，IL-2变体可能具有与野生型IL-2相同或相似的活性。在此，“IL-2活性”可以例如是指与IL-2受体的特异性结合，该特异性结合可以通过本领域技术人员已知的方法来检测。

在本发明的实施方案中，IL-2变体多肽具有更大的对IL-2Rβ的结合亲和力和降低的对IL-2Rγc受体的结合亲和力、去除O-连接的糖基化位点和抑制二硫键形成的能力、减弱野生型IL-2免疫抑制的作用和增加效应T细胞的免疫激活作用及强烈的免疫调节优势。在一个实施方案中，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个10个或多个氨基酸可以被取代，只要这种IL-2变体维持IL-2活性即可。具体地，可以通过取代野生型IL-2中的一部分氨基酸来获得IL-2变体。通过氨基酸取代获得的IL-2变体的一个实施方案可以通过取代如SEQ IDNO.1所示氨基酸序列中的第3、19、20、21、22、35、38、41、42、44、45、62、65、68、72、80、81、85、86、88、92、107、125或126位氨基酸中的至少一个来获得。具体地，可以通过将如SEQID NO.1所示氨基酸序列中的第3、80、81、85、86、92或125位氨基酸中的至少一个取代为另一种氨基酸来获得IL-2变体。在本发明的具体实施方案中，所述IL-2变体多肽包含具有氨基酸残基位置L80、R81、L85、I86和I92氨基酸取代的SEQ ID NO.1的氨基酸序列，优选地，所述氨基酸取代包括但不限于L80F、L80V、R81A、R81D、R81G、R81I、R81S、R81T、L85V、L85T、I86V、I86T、I92F、I92K、I92R或以上这些取代的任何组合；在本发明的具体实施方案中，所述氨基酸取代为L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。优选地，所述IL-2变体多肽包含具有氨基酸残基位置T3和C125氨基酸取代的SEQ ID NO.1的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸残基位置T3的氨基酸取代具有去除O-连接的糖基化位点的能力；优选地，所述氨基酸残基位置T3的氨基酸取代包括但不限于T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K或T3P；更优选地，所述氨基酸残基位置T3的氨基酸取代为T3A；优选地，所述氨基酸残基位置C58、C105、C125的氨基酸取代具有抑制二硫键形成的能力；优选地，所述氨基酸残基位置C125的氨基酸取代包括但不限于C125A、C125S、C125T、C125L或C125V；更优选地，所述氨基酸残基位置C125的氨基酸取代为C125A。

术语“糖基化”是指存在与生物分子(例如蛋白质或脂质)连接的碳水化合物(例如寡糖或多糖，也称为“聚糖”)。在特定实施方案中，糖基化是指存在与蛋白质(例如，IL-2Fc融合蛋白)或目的蛋白的一部分(例如，IL-2Fc融合蛋白的多肽部分)连接的聚糖。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺，半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸(最常见的是丝氨酸或苏氨酸)的连接，尽管5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸也可以参与O-连接的糖基化。N-连接的糖基化是指碳水化合物部分连接天冬酰胺残基的侧链。三肽序列，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸，是用于碳水化合物部分酶促连接天冬酰胺侧链的识别序列。在本发明的具体实施例中，IL-2变体多肽具有去除O-连接的糖基化位点的能力。

本发明使用的术语“二硫键”包括2个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二个巯基形成二硫键或桥的巯基。

在本发明中，术语“融合蛋白”是指包含两个或更多个最初编码不同蛋白的基因的融合多肽分子，其中融合蛋白的组分通过肽键直接彼此连接或通过肽接头彼此连接。如本发明使用的术语“融合”是指通过肽键直接连接的组分或经由一个或更多个肽接头连接的组分。

术语“接头”是指共价地或通过离子键、范德华力或氢键连接两个其他分子的分子，例如在5'末端处与一个互补序列杂交并且在3'末端处与另一个互补序列杂交从而连接两个非互补序列的核酸分子。“可裂解的接头”是指可以被降解或以其他方式切断以使通过该可裂解的接头连接的两个组分分开的接头。可裂解的接头通常被酶，通常是肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等裂解。可裂解的接头还可以通过环境因素，诸如例如温度、pH、盐浓度等的改变来裂解。如本发明使用的术语“肽接头”是指包含一个或更多个氨基酸，通常为约1-40个氨基酸的肽或2-20个氨基酸的肽。肽接头是本领域已知的或在本发明中被描述。合适的非免疫原性接头肽包括，例如，(G4S)n、(SG4)n或G4(SG4)n肽接头。“n”通常是1和10之间，通常2和4之间的数字。

术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白。每条重链由重链可变区(本发明中缩写为VH)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(本发明中缩写为VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(complementarity determining region，CDR)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(framework region，FR)。每个VH和VL由从氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。抗体与抗原结合，优选与抗原特异性结合。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分或片段。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab')2，以及单链抗体和人源化抗体。

术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且通常包含完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的一些实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。本发明中使用的“抗体重链”是指抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中较大的一者。本发明中使用的“抗体轻链”是指抗体分子中以其天然存在的构象存在的两种类型的多肽链中较小的一者，κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“Fc”是指包含完整抗体的非抗原结合片段的序列的分子或序列，无论是单体形式还是多聚体形式。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选地为人类来源，并且可以是本领域公开的任何免疫球蛋白。天然Fc由单体多肽组成，单体多肽可以通过共价(即二硫键)和非共价缔合连接成二聚体或多聚体形式。天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目取决于类别(例如IgG、IgA、IgE)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)而在从1至4的范围内。天然Fc的一种实例是由木瓜蛋白酶消化IgG产生的二硫键合的二聚体。如本发明使用的术语“天然Fc”是单体、二聚体和多聚体形式的总称。Fc结构域包含蛋白A、蛋白G、各种Fc受体和补体蛋白的结合位点。

在各种实施方案中，术语“Fc变体”是指从天然Fc修饰、但仍然包含补救受体FcRn的结合位点的分子或序列。国际申请WO 97/34631(1997年9月25日公布)和WO 96/32458描述了示例性的Fc变体以及与补救受体的相互作用，并特此通过引用并入。此外，天然Fc包含可被去除的位点，因为它们提供本发明的融合分子不需要的结构特征或生物活性。因此，在各种实施方案中，术语“Fc变体”包括缺乏一个或更多个天然Fc位点或残基的分子或序列，所述天然Fc位点或残基影响或参与(1)二硫键形成，(2)与所选宿主细胞的不相容性，(3)在所选宿主细胞中表达时的N末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)与补救受体以外的Fc受体的结合，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，如SEQ IDNO.5所示氨基酸序列的FC变体的氨基酸取代包括但不限于第4、5、99位的氨基酸取代。优选地，所述FC变体的氨基酸取代包括但不限于L4A、L5A、P99G。

如本发明使用的术语“效应子功能”是指可归因于免疫球蛋白的Fc区的那些生物活性，所述Fc区随免疫球蛋白亚型而不同。免疫球蛋白效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞活化。

术语“半衰期”是指目标分子的体内浓度降低50％所消耗的时间。如果与适当的对照相比，目标分子在生物基质(血液，血清，血浆，组织)中体内存留更长的时间，则其半衰期将增加。与适当的对照相比，半衰期可以增加10％、20％、30％、40％、50％或更多。

在一些实施例中，使用双顺反子或多顺反子表达载体在T细胞中表达多个CAR单位。有几种策略可用于构建双顺反子或多顺反子载体，包括但不限于(1)与CAR的开放阅读框融合的多个启动子；(2)在CAR单元之间插入剪接信号；CAR的融合，其表达由单个启动子驱动；(3)在CAR单元之间插入蛋白水解切割位点(自切割肽)；(iv)插入内部核糖体进入位点(IRES)。

在优选的实施例中，多个CAR单元在单个开放阅读框(ORF)中表达，从而产生具有多个CAR单元的单个多肽。在该实施例中，在每个CAR单元之间设置含有高效切割位点的氨基酸序列或接头(也称为“自剪切多肽”)。如本发明所用，高切割效率定义为超过50％，超过70％，超过80％或超过90％的转化蛋白质被切割。自剪切多肽的实例包括猪teschovirus-21A(P2A)，FMDV 2A(本文缩写为F2A)；马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)；和那些甲病毒2A(T2A)，细胞质多角体病毒2A(BmCPV2A)和flacherie病毒2A(BmIFV2A)，或其组合。在优选的实施例中，自剪切多肽是T2A。

术语“多顺反子结构”是指将被转录成单个mRNA分子的重组DNA构建体，并且该单个mRNA分子编码两个或更多个转基因。如果多顺反子构建体编码两个转基因，则将其称为双顺反子构建体，并且如果其编码三个基因，则将其称为三顺反子构建体，并且如果其编码四个基因，则将其称为四顺反子构建体，等等。

本发明中使用的术语“嵌合抗原受体”和“CAR”可互换使用。本发明所述CAR(嵌合抗原受体)是一种受体蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR通常包括三个主要部分：胞外域(抗原结合域(ABD))、跨膜结构域(TD)和胞内域。胞外域负责识别抗原，其亲和力特征是一个特别重要的抗原结合结构域参数，它解释了多种受体－配体相互作用，从根本上决定了CAR分子的功能，胞外域通常还可以包含铰链区(hinge)。跨膜结构域的主要功能在于将CAR分子锚定在细胞膜上，将CAR分子的细胞外结构域与细胞内结构域连接起来，从而将配体识别信号转导至细胞内，其对CAR分子表达的稳定性具有重要作用。胞内域可以包括信号转导结构域(CSD)和共刺激结构域。用于实施本发明的CAR根据本领域公知的原理制备。

在本发明中，“CAR”包括但不限于第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR或第四代CAR。术语“第一代CAR”是指CAR，其中细胞质结构域仅通过单个信号传导结构域传递来自抗原结合的信号，例如衍生自IgE FcεRIγ或Cd3ζ链的高亲和力受体的信号传导结构域。所述单信号传导结构域含有一个或三个用于抗原依赖性T细胞活化的基于免疫受体酪氨酸的活化基序[ITAM]。基于ITAM的活化信号赋予T细胞裂解靶肿瘤细胞和分泌细胞因子以响应抗原结合的能力。除CD3ζ-.结构域外，第二代CAR还包括共刺激信号。传递递送共刺激信号，增强了由CAR-T转导的T细胞诱导的持久性、细胞因子分泌和抗肿瘤活性。共刺激结构域相对于CD3ζ结构域通常位于近膜端。第三代CAR包括三方信号传导结构域，其包含例如CD28、CD3ζ和OX40或4-1BB信号传导区域。第四代CAR或“装甲车”CAR-T细胞被进一步基因修饰以表达或阻断分子和/或受体，从而增强免疫活性。

可以掺入本发明的CAR中的示例性细胞内信号传导结构域包含(氨基到羧基)：CD3ζ；CD28-CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；CD28-OX40-CD3ζ；CD28-41BB-CD3ζ；41BB-CD28-CD3ζ和41BB–CD3ζ。

本发明中使用的术语“抗原结合域(ABD)”是指特异性结合靶细胞表面上表达的抗原的多肽。ABD可以是特异性结合靶细胞表面上表达的一种或更多种抗原的任何多肽。在某些实施例中，靶细胞抗原是肿瘤抗原。可被CAR靶向的肿瘤抗原的非限制性示例包括选自所述群组的一种或更多种抗原，包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B 2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HER2、IL-11Ra、IL-13R-a2、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、NCAM、NY-ESO-1、FLT3、B7-H3、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2D ligands、瘤胎抗原、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF、ROR1、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGE A3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(Fra)、VEGF-R2、GPC3、Wnt1、ROBO1、Mesothelin抗原。本发明具体实施例以靶向HER2的CAR为例进行了实验验证。

用于实施本发明的CAR进一步包含将ABD连接到CAR的细胞内胞质结构域的跨膜结构域(也称为“跨膜域”)。跨膜结构域由在真核细胞膜中热力学稳定的任何多肽序列组成。所述跨膜结构域可以衍生自天然存在的跨膜蛋白的所述跨膜结构域，也可以是合成的。在设计合成跨膜结构域时，优选有利于α-螺旋结构的氨基酸。用于构建CAR的跨膜结构域由大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、23或24个氨基酸组成，有利于形成具有α-螺旋二级结构。有利于α-螺旋构象的氨基酸在本领域中是众所周知的。在α螺旋构象中特别受青睐的氨基酸包括蛋氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸。在一些实施例中，所述CAR跨膜结构域可以源自I型跨膜蛋白的跨膜结构域，例如CD3ζ、CD4、CD8、CD28等。优选地，所述跨膜域包括CD28的跨膜区。

CAR多肽的细胞质结构域包含一个或多个细胞内信号结构域。在一实施例中，所述细胞内信号结构域包含T细胞受体(TCR)的细胞质序列和在抗原受体接合后启动信号转导的共受体及其功能性衍生物及其亚片段。细胞质信号传导结构域(例如，源自T细胞受体ζ-链的结构域)用作CAR的一部分，以便在嵌合受体与靶抗原结合后产生T淋巴细胞增殖和效应子功能的刺激信号。细胞质信号传导结构域的示例包括但不限于CD27的细胞质结构域，CD28的细胞质结构域，CD137的细胞质结构域(也称为4-1BB和TNFRSF9)，CD278的细胞质结构域(也称为ICOS)，PI3激酶的p110α、β或δ催化亚基，人Cd3ζ-链，CD134胞浆区(也称为OX40和TNFRSF4)，FcεR1γ和β链，MB1(Igα)链，B29(Igβ)链等)，CD3多肽(δ、Δ和ε)，syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)，src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)以及其他参与T细胞转导的分子，如CD2、CD5和CD28。

在一些实施例中，CAR还可以提供共刺激结构域。术语“共刺激结构域”是指CAR的信号传导内结构域，其提供次级非特异性活化机制，通过该机制传播初级特异性刺激。共刺激结构域是指增强记忆细胞增殖，存活或发育的CAR部分。共刺激的示例包括通过T细胞受体的抗原特异性信号传导后的抗原非特异性T细胞共刺激和通过抗原特异性B细胞受体的信号传导后的抗原非特异性B细胞共刺激。在本发明的一些实施例中，共刺激结构域包含肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的一个或更多个成员CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。

分子生物学领域的技术人员已知许多合适的载体，其选择取决于所期望的功能。载体的非限制性实例包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、病毒载体、黏粒、噬菌体和其他常规用于例如遗传工程的载体。本领域技术人员众所周知的方法可以用于构建各种质粒和载体。

作为本发明的一种可选方式，载体是病毒。病毒载体用于引入编码靶标特异性多肽的非内源性核酸序列。病毒载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在本发明的具体实施例中，载体是逆转录病毒。病毒载体还可以包括编码转导标记的核酸序列。适合与本发明的组合物一起使用的病毒载体包括已鉴定用于人类基因治疗应用的那些。合适的病毒载体包括基于RNA病毒的载体，例如逆转录病毒来源的载体，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)来源的载体，并且包括更复杂的逆转录病毒来源的载体，例如慢病毒来源的载体。HIV-1衍生的载体属于这一类。病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒，细小病毒(如腺相关病毒)，冠状病毒，负链RNA病毒(如正粘病毒(如流感病毒)，弹状病毒(如狂犬病和水疱性口炎病毒)，副粘病毒(如，麻疹和仙台病毒)，正链RNA病毒(例如小核糖核酸病毒和甲型病毒)以及双链DNA病毒，包括腺病毒，疱疹病毒(例如1型和2型单纯疱疹病毒和爱泼斯坦-巴尔病毒和巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘，鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括但不限于诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳头瘤病毒、肝炎病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的例子包括禽类白血病肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒和泡沫病毒。

作为本发明的一种可选方式，载体是表达载体。根据本发明的表达载体能够指导本发明的核酸分子在宿主中的复制和表达。载体的非限制性实例包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO(Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027pCAG Kosak-Cherry(L45a)载体系统、pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pcDNA3.1、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)pTriEx-Hygro(Novagen)和pCINeo(Promega)。适合于巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)的质粒载体的非限制性实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K(全部为Invitrogen)。适合于在爪蟾属(Xenopus)胚胎、斑马鱼胚胎以及各种各样的哺乳动物和禽类细胞中表达蛋白质的另一种载体是多用途表达载体pCS2+。在一些实施例中，本发明公开的任何工程改造细胞可以在转座子系统中构建，没有用病毒载体将CARDNA整合到宿主基因组中。适合用于本发明载体中的转座子系统的非限制性示例是Mariner型转座子如睡美人(Sleeping Beauty)转座子、piggyBac样转座子(piggyBac-like transposase)或hAT转座子如TcBuster转座子。

在本发明中，术语“药物组合物”指的是一种制剂，其存在形式允许活性成分的生物学活性是有效的，并且不含有对接受施用该组合物/制剂的受试者具有不可接受的毒性的附加成分。这种制剂可以是无菌的。药物组合物可以仅包含根据本发明的T细胞，或者与一种或多种药学上或生理上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可以包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂和稳定剂。

“药学上可接受的载体”是指用于与治疗剂一起使用的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料、配制助剂或本领域常规的载体，它们共同构成用于向受试者施用的“药物组合物”。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与所述配制品的其他成分相容。药学上可接受的载体适用于所采用的配制品。

在本发明中，术语“诊断”是指确定疾病或病症的存在。在本发明的一些实施例中，提供了进行诊断的方法，其允许确定特定疾病或病症的存在。术语“治疗”指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，缓解症状，削弱疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减缓疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，及免除或改善预后。

在本发明中，术语“肿瘤”在本发明中，术语“癌症”和“肿瘤”是可互换的术语，是指动物中任何异常细胞或组织的生长或增殖。如本发明所用，术语“癌症”和“肿瘤”涵盖实体肿瘤和血液肿瘤，并且还涵盖恶性、恶性前和良性生长，。诸如发育异常。肿瘤包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B 2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HER2、IL-11Ra、IL-13R-a2、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、NCAM、NY-ESO-1、FLT3、B7-H3、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2D ligands、瘤胎、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF、ROR1、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGEA3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(Fra)、VEGF-R2、GPC3、Wnt1、ROBO1或Mesothelin阳性肿瘤。本发明中所使用的“肿瘤”为HER2阳性肿瘤。HER2阳性肿瘤包括但不限于HER2阳性胃癌、HER2阳性乳腺癌、HER2阳性食管癌、HER2阳性结肠癌、HER2阳性直肠癌、HER2阳性胰腺癌、HER2阳性肺癌、HER2阳性子宫颈癌、HER2阳性子宫体癌、HER2阳性卵巢癌、HER2阳性膀胱癌、HER2阳性头颈癌、HER2阳性子宫内膜癌、HER2阳性骨肉瘤、HER2阳性前列腺癌、HER2阳性神经母细胞瘤；优选地，所述HER2阳性肿瘤为HER2阳性乳腺癌。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1CAR-T细胞的制备

在以人HER2为靶点的HER2 scFv，鼠源CD28铰链区、跨膜区、胞内共刺激结构域，CD3ζ胞内信号转导结构域的CAR结构基础上，利用非翻译区T2A串联了人IgG1 Fc-IL-2m融合蛋白的核苷酸序列，构建了负载IL-2m-CAR的逆转录病毒的穿梭质粒，同时构建了负载野生型IL-2的CAR(IL-2-CAR)与负载L80F、R81D、L85V、I86V和I92F突变的IL-2的CAR(IL-2superkine-CAR)的对照质粒，并利用PEI将该穿梭质粒与辅助质粒pCL-Eco在293T细胞中进行逆转录病毒的包装。通过感染小鼠来源的T细胞，制备Mock-T(非转导外源基因的T细胞)、CAR-T细胞、表达IgG1 Fc-IL-2融合蛋白的CAR-T细胞(IL-2-CAR-T)、表达IgG1 Fc-IL-2superkine融合蛋白的CAR-T细胞(IL-2superkine-CAR-T)、表达IgG1 Fc-IL-2(T3A与C125A)融合蛋白的CAR-T细胞(IL-2(T3A+C125A)-CAR-T)以及表达IgG1 Fc-IL-2m融合蛋白的CAR-T细胞(IL-2m-CAR-T)。

野生型IL-2氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATEL

KHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT；

IL-2superkine氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATEL

KHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT；

IL-2(T3A+C125A)氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：

APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATEL

KHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT；

IL-2m氨基酸序列(SEQ ID NO.4)：

APASSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATEL

KHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFAQSIISTLT；

野生型IgG1 Fc氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK

DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYAST

YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL

PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLEGGSGTM；

IgG1 Fc变体氨基酸序列(SEQ ID NO.6)：

METDTLLLWVLLLWVPGSTGEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPK

DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYAST

YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL

PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLEGGSGTM。

实施例2体外实验

1、实验方法

1)ELISA：CAR-T细胞在逆转录病毒转染后48h，收集细胞上清，ELISA检测细胞上清中的IL-2的表达含量。

2)Western Blot：Mock-T、hHER2-CAR-T、IL-2-hHER2-CAR-T、IL-2m-hHER2-CAR-T细胞分别与4T1-HER2细胞共培养48h后收集细胞上清，使用Western Blot验证IL-2的分泌情况。

3)流式细胞检测：Mock-T、CAR-T、IL-2-CAR-T、IL-2m-CAR-T细胞分别与4T1-HER2细胞共培养，按照T细胞与肿瘤细胞比例(效靶比/E:T)为1:1和1:5，共培养48h后，将T细胞与肿瘤细胞全部收集，流式细胞检测剩余的肿瘤细胞(GFP⁺标记)和T细胞(CD3⁺标记)。共培养实验共进行三次独立重复实验。Mock-T、CAR-T、CAR-T细胞组额外添加重组细胞因子IL-2(CAR-T+IL-2)、IL-2-CAR-T、IL-2m-CAR-T细胞与4T1-HER2细胞按照T细胞与肿瘤细胞比例(效靶比/E:T)为1:1共培养48h后，流式细胞检测T细胞中CD8⁺颗粒酶B⁺细胞百分占比。

2、实验结果

ELISA检测实验结果如图2所示，结果表明，IL-2m-CAR-T细胞培养上清中IL-2含量高于IL-2superkine-CAR-T细胞的培养上清，差异有统计学意义，IL-2superkine-CAR-T细胞培养上清中IL-2含量显著高于CAR-T细胞上清中分泌的IL-2，差异具有统计学意义。

Western Blot验证结果如图3所示，结果表明，IL-2-hHER2-CAR-T、IL-2m-hHER2-CAR-T组在抗原暴露后可分泌IL-2，Mock-T、hHER2-CAR-T组无IL-2分泌。

流式细胞检测结果如图4、图5所示，结果表明，在效靶比为1:1和1:5的情况下，IL-2m-CAR-T组剩余肿瘤细胞比例均最少，IL-2-CAR-T细胞次之，表明IL-2m-CAR-T细胞具有更优越的体外杀伤能力；在效靶比为1:1和1:5的情况下，IL-2m-CAR-T细胞组剩余肿瘤细胞比例显著低于IL-2-CAR-T和CAR-T组，差异有统计学意义；表明IL-2m-CAR-T细胞具有相较于IL-2-CAR-T细胞、CAR-T细胞更优越的体外杀伤效果。IL-2m-CAR-T组、IL-2-CAR-T组的CD8⁺颗粒酶B⁺细胞占比均显著高于CAR-T组、CAR-T+IL-2组；IL-2m-CAR-T组的CD8⁺颗粒酶B⁺细胞占比高于IL-2-CAR-T组。

实施例3体内实验

1、实验方法

1)建立Balb/c小鼠4T1-HER2细胞原位瘤模型

将1×10⁵个4T1-HER2细胞经胰酶消化、PBS洗涤后，重悬于50μl PBS中，注射至小鼠右侧第四乳腺脂肪垫的位置，即建立Balb/c小鼠4T1-HER2细胞原位乳腺癌模型。在小鼠肿瘤体积生长至大约70mm³时，腹腔注射环磷酰胺(150mg/kg小鼠)进行预处理，两天后荷瘤鼠分为五组，分别尾静脉回输2×10⁶个Mock-T细胞、CAR-T细胞、IL-2-CAR-T细胞、IL-2m-CAR-T细胞，以及对照组仅回输PBS，每隔2-3天利用游标卡尺测量小鼠肿瘤最长直径、最短直径，按照肿瘤大小(mm³)＝0.5×肿瘤最短直径²×肿瘤最长直径，同时监测小鼠存活情况。在T细胞回输26天后，安乐死处死小鼠，剥离小鼠肿瘤组织并称重拍照。

2)建立雌性Balb/c小鼠4T1-HER2细胞皮下瘤模型

将4T1-HER2细胞经胰酶消化、PBS洗涤后，以2×10⁵个细胞重悬于50μlPBS中，注射至小鼠右侧腹皮下，即建立Balb/c小鼠4T1-HER2细胞皮下瘤模型。在小鼠肿瘤体积生长至大约200mm³时，腹腔注射环磷酰胺(150mg/kg/小鼠)进行预处理，两天后荷瘤鼠分为五组，分别尾静脉回输5×10⁶个Mock-T细胞、CAR-T细胞、IL-2-CAR-T细胞、IL-2m-CAR-T细胞，以及对照组仅回输PBS，每隔2天监测小鼠存活情况。在T细胞回输40天时，流式检测小鼠外周血中的CAR⁺细胞含量。

3)比较IL-2m-CAR-T细胞、IL-2superkine-CAR-T细胞以及IL-2-CAR-T细胞(T3A+C125A)的体内抗肿瘤效果

将1×10⁵个4T1-HER2细胞重悬于50μl PBS中，局部注射至小鼠右侧第四乳腺脂肪垫，建立原位乳腺癌肿瘤模型。在小鼠肿瘤大小生长至约70mm³时，荷瘤鼠分组为Mock-T组、CAR-T组、IL-2superkine-CAR-T组、IL-2-CAR-T(T3A+C125A)和IL-2m-CAR-T组，分别腹腔注射环磷酰胺(150mg/kg/小鼠)进行预处理，两天后小鼠尾静脉分别回输2×10⁶个T细胞，每隔2-3天测量小鼠肿瘤大小，绘制小鼠肿瘤生长曲线。同时在T细胞回输后3天，流式细胞检测小鼠外周血中的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞比例。

2、实验结果

Balb/c小鼠4T1-HER2细胞原位瘤模型的建立结果如图6所示，结果表明IL-2m-HER2-CAR-T细胞对小鼠4T1-HER2细胞原位乳腺癌具有更优越的体内抗肿瘤效果。

雌性Balb/c小鼠4T1-HER2细胞皮下瘤模型的实验结果如图7、图8所示，结果表明，IL-2m-CAR-T组的小鼠存活率显著优于IL-2-CAR-T组和Mock-T组，差异具有统计学意义；IL-2m-CAR-T组小鼠外周血中CAR-T细胞的占比多于CAR-T组，差异具有统计学意义，表明IL-2m-CAR-T细胞抗肿瘤效果以及体内持久性均显著优于CAR-T细胞、IL-2-CAR-T细胞。

验证IL-2m-CAR-T细胞的体内抗肿瘤效果优于IL-2superkine-CAR-T细胞、IL-2-CAR-T(T3A+C125A)的实验结果如图9所示，结果表明，IL-2m-CAR-T组小鼠肿瘤大小相较于其他组最小，相较于Mock-T组、CAR-T组、IL-2-superkine-CAR组以及IL-2-CAR-T(T3A+C125A)组，差异均具有统计学意义；IL-2m-CAR-T组小鼠外周血中的CD4⁺、CD8⁺T细胞百分比高于IL-2-superkine-CAR-T组，差异具有统计学意义。

实施例4安全性实验

1、建立NCG小鼠E0771-HER2皮下瘤模型

将2.5×10⁶个的E0771-HER2细胞重悬于50μl PBS中，在小鼠右侧腹皮下局部注射，建立NCG小鼠E0771-HER2细胞皮下瘤模型。待小鼠肿瘤大小生长至约300mm³，将荷瘤鼠分为四组，分别尾静脉回输5×10⁶个Mock-T细胞、CAR-T细胞、IL-2-CAR-T细胞、IL-2m-CAR-T细胞，在T细胞回输12天后，安乐死处死小鼠，收集小鼠肝脏、肺脏组织，经多聚甲醛固定，使用苏木精-伊红染色(HE染色)后观察组织形态变化。

2、实验结果

实验结果如图10所示，结果表明，IL-2m-CAR-T细胞回输后并未对小鼠的肝和肺造成严重的组织损伤及炎症反应，安全性较高。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种分离的IL-2变体多肽，其特征在于，所述分离的IL-2变体多肽包含与SEQ IDNO.1至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列；

优选地，所述相同的氨基酸序列与由SEQ ID NO.1代表的多肽相比，具有增强对IL-2Rβ的结合亲和力或降低对IL-2Rγc受体的结合亲和力的能力、具有去除O-连接的糖基化位点的能力或具有抑制二硫键形成的能力；

优选地，所述增强对IL-2Rβ的结合亲和力或降低对IL-2Rγc受体的结合亲和力的氨基酸取代包含氨基酸残基位置L19、D20、L21、Q22、K35、R38、T41、F42、F44、Y45、E62、P65、E68、L72、L80、R81、L85、I86、N88、I92、Y107或Q126中的一个或更多个氨基酸取代；

优选地，所述增强对IL-2Rβ的结合亲和力或降低对IL-2Rγc受体的结合亲和力的氨基酸取代包含氨基酸残基位置L80、R81、L85、I86和/或I92的氨基酸取代；

优选地，所述增强对IL-2Rβ的结合亲和力或降低对IL-2Rγc受体的结合亲和力的氨基酸取代包含氨基酸残基位置L80、R81、L85、I86和I92的氨基酸取代；

优选地，所述氨基酸残基位置L80、R81、L85、I86和I92的氨基酸取代选自：

在SEQ ID NO.1的位置L80氨基酸取代包括L80F、L80V；

在SEQ ID NO.1的位置R81氨基酸取代包括R81A、R81D、R81G、R81I、R81S、R81T；

在SEQ ID NO.1的位置L85氨基酸取代包括L85V、L85T；

在SEQ ID NO.1的位置I86氨基酸取代包括I86V、I86T；

在SEQ ID NO.1的位置I92氨基酸取代包括I92F、I92K、I92R；或

以上这些氨基酸取代的任何组合；

优选地，所述氨基酸残基位置L80、R81、L85、I86和I92的氨基酸取代为L80F、R81D、L85V、I86V和I92F；

优选地，所述去除O-连接的糖基化位点的氨基酸取代包括氨基酸残基位置T3的氨基酸取代；

优选地，所述T3的氨基酸取代包括T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K或T3P；

优选地，所述T3的氨基酸取代为T3A；

优选地，所述抑制二硫键形成的氨基酸取代包括氨基酸残基位置C58、C105或C125的氨基酸取代；

优选地，所述抑制二硫键形成的氨基酸取代为氨基酸残基位置C125的氨基酸取代；

优选地，所述C125的氨基酸取代包括C125A、C125S、C125T、C125L或C125V；

优选地，所述C125的氨基酸取代为C125A；

优选地，所述IL-2变体多肽包含SEQ ID NO.4中列出的氨基酸序列。

2.一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含1)权利要求1所述的IL-2变体多肽和2)异源蛋白；

优选地，所述融合蛋白是由所述的IL-2变体多肽与所述的异源蛋白融合构成的，任选地通过肽接头；

优选地，所述融合蛋白是由所述的IL-2变体多肽在其N末端氨基酸处与所述的异源蛋白的C末端氨基酸通过肽接头融合构成的或由所述的IL-2变体多肽在其C末端氨基酸处与所述的异源蛋白的N末端氨基酸通过肽接头融合构成的；

优选地，所述异源蛋白增加所述的IL-2变体多肽的循环半衰期；

优选地，所述异源蛋白选自有提供半衰期延长的全长无效抗体或抗体片段组成的组；

优选地，所述异源蛋白增强所述的IL-2变体多肽的表达水平和/或减弱野生型IL-2免疫抑制作用；

优选地，所述异源蛋白用作标志物或标签或靶向部分；

优选地，所述异源蛋白包括具有沉默的效应子功能和/或具有半衰期延长功能的Fc结构域或其变体；

优选地，所述Fc结构域或其变体选自由以下组成的组：IgAFc结构域或其变体、IgDFc结构域或其变体、IgEFc结构域或其变体、IgGFc结构域或其变体和IgMFc结构域或其变体；

优选地，所述Fc结构域或其变体为IgGFc结构域或其变体；

优选地，所述IgGFc结构域或其变体包括IgG1Fc结构域或其变体、IgG2Fc结构域或其变体、IgG3Fc结构域或其变体、IgG4Fc结构域或其变体；

优选地，所述Fc结构域或其变体为IgG1Fc结构域或其变体；

优选地，IgG1Fc变体包含具有氨基酸残基位置L4、L5、P99中的一个或更多个氨基酸取代的SEQ ID NO.5的氨基酸序列；

优选地，所述氨基酸残基位置L4、L5、P99的氨基酸取代选自：

在SEQ ID NO.5的位置L4氨基酸取代包括L4A；

在SEQ ID NO.5的位置L5氨基酸取代包括L5A；

在SEQ ID NO.5的位置P99氨基酸取代包括P99G；或

以上这些氨基酸取代的任何组合；

优选地，所述氨基酸残基位置L4、L5、P99的氨基酸取代为L4A、L5A和P99G；

优选地，所述IgG1Fc结构域包含SEQ ID NO.6中列出的氨基酸序列；

优选地，所述融合蛋白呈多聚体、二聚体或单体的形式。

3.一种改良型的CAR，其特征在于，所述改良型的CAR包含1)权利要求1所述的IL-2变体多肽或权利要求2所述的融合蛋白和2)CAR结构；

优选地，所述改良型的CAR是由所述的融合蛋白通过多顺反子结构与CAR结构的末端连接；

优选地，所述多顺反子结构为自剪切多肽或内部核糖体进入位点IRES，所述自剪切多肽包括T2A、P2A、E2A或F2A；

优选地，所述自剪切多肽为T2A；

优选地，所述CAR结构包括抗体或其抗原结合片段、铰链区、跨膜域、胞内共刺激结构域、胞内信号转导结构域；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段的来源包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HER2、IL-11Ra、IL-13R-a2、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、NCAM、NY-ESO-1、FLT3、B7-H3、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2Dligands、瘤胎、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF、ROR1、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGEA3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(Fra)、VEGF-R2、GPC3、Wnt1、ROBO1、MesothelinscFv；

优选地，所述抗体或其抗原结合片段的来源为HER2scFv；

优选地，所述铰链区和和跨膜区包括以下分子的铰链区和和跨膜区：IgG1、IgG4、CD8、CD28、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体、PD-1、CD34；

优选地，所述铰链区和和跨膜区为CD28的铰链区和跨膜区；

优选地，所述胞内共刺激结构包括以下分子的胞内信号传导结构域：CD27、CD28、4-1BB、OX-40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LFA-1、CD-2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3；

优选地，所述胞内共刺激结构域为CD28的胞内共刺激结构域；

优选地，所述胞内信号转导结构域包括以下分子的胞内信号传导结构域：FcγR、FcεR、FcαR、FcRn、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d、Zap70；

优选地，所述胞内信号转导结构域为CD3ζ胞内信号转导结构域。

4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1所述的IL-2变体多肽、权利要求2所述的融合蛋白或权利要求3所述的CAR。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求4所述的核酸分子；

优选地，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、病毒载体；

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体；

优选地，所述病毒载体为逆转录病毒载体。

6.一种经工程改造的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞包含权利要求1所述的IL-2变体多肽、权利要求2所述的融合蛋白、权利要求3所述的CAR、权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体；

优选地，所述CAR的靶向抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HER2、IL-11Ra、IL-13R-a2、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、NCAM、NY-ESO-1、FLT3、B7-H3、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2Dligands、瘤胎、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF、ROR1、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGEA3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(Fra)、VEGF-R2、GPC3、Wnt1、ROBO1、Mesothelin；

优选地，所述CAR的靶向抗原为HER2；

优选地，所述免疫细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及其任意组合；

优选地，所述免疫细胞为T细胞。

7.一种药物组合物或试剂盒，其特征在于，所述药物组合物或试剂盒包含权利要求1所述的IL-2变体多肽、权利要求2所述的融合蛋白、权利要求3所述的CAR、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的免疫细胞；

优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。

8.如下任一种方法：

1)一种制备IL-2变体多肽的方法，其特征在于，所述方法包括在促进权利要求1所述的IL-2变体多肽或权利要求2所述的融合蛋白表达的条件下培养权利要求6所述的免疫细胞，使得所述免疫细胞分泌IL-2变体多肽；

2)一种制备权利要求2所述融合蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括在促进权利要求1所述的IL-2变体多肽或权利要求2所述的融合蛋白表达的条件下培养权利要求6所述的免疫细胞，使得所述免疫细胞分泌融合蛋白；

3)一种制备权利要求6所述经工程改造的免疫细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的表达载体引入到所述的免疫细胞中。

9.如下任一种应用：

1)权利要求1所述的IL-2变体多肽在制备权利要求2所述的融合蛋白、权利要求3所述的CAR、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的免疫细胞、权利要求7所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

2)权利要求2所述的融合蛋白在制备权利要求3所述的CAR、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的免疫细胞、权利要求7所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

3)权利要求3所述的CAR在制备权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的免疫细胞、权利要求7所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

4)权利要求4所述的核酸分子在制备权利要求5所述的载体、权利要求6所述的免疫细胞、权利要求7所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

5)权利要求5所述的载体在制备权利要求6所述的免疫细胞、权利要求7所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

6)权利要求6所述的免疫细胞在制备权利要求7所述的药物组合物或试剂盒中的应用；

7)权利要求6所述的免疫细胞在制备分泌权利要求1所述的IL-2变体多肽的产品中的应用；

8)权利要求6所述的免疫细胞在制备分泌权利要求2所述的融合蛋白的产品中的应用；

9)权利要求1所述的IL-2变体多肽、权利要求2所述的融合蛋白、权利要求3所述的CAR、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的表达载体、权利要求6所述的免疫细胞、权利要求7所述的药物组合物或试剂盒在制备诊断或治疗肿瘤的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、BCMA、CAIX、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B2，3，4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HER2、IL-11Ra、IL-13R-a2、IL1RAP、CLL1(CLEC12A)PSA、NCAM、NY-ESO-1、FLT3、B7-H3、KDR、LeY、MAGE-A1、MUC1、NKG2Dligands、瘤胎、PSCA、PSMA、TAG-72、VEGF、ROR1、c-Met、糖脂F77、FAP、EGFRvIII、MAGEA3、5T4、WT1、KG2D配体、叶酸受体(Fra)、VEGF-R2、GPC3、Wnt1、ROBO1、Mesothelin阳性肿瘤；

优选地，所述肿瘤为HER2阳性肿瘤；

优选地，所述HER2阳性肿瘤包括HER2阳性胃癌、HER2阳性乳腺癌、HER2阳性食管癌、HER2阳性结肠癌、HER2阳性直肠癌、HER2阳性胰腺癌、HER2阳性肺癌、HER2阳性子宫颈癌、HER2阳性子宫体癌、HER2阳性卵巢癌、HER2阳性膀胱癌、HER2阳性头颈癌、HER2阳性子宫内膜癌、HER2阳性骨肉瘤、HER2阳性前列腺癌、HER2阳性神经母细胞瘤；

优选地，所述HER2阳性肿瘤为HER2阳性乳腺癌。

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